JP2615013B2 - グリホセート耐性キメラ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、遺伝子工学、生化学及び植物生物学の分野
に関する。

従来の技術 Ｎ−ホスフオノメチルグリシンは次の構造をもつ： この分子は酸で、水溶液中では解離し、植物に有害な
物質である各種の陰イオンを形成する。数種類の陰イオ
ン体が知られている。ここで使用されているように、
「グリホセート」という名称は、酸及びその陰イオンの
双方を指称するものである。イソプロピルアミン塩とし
て製剤化され、活性成分としてグリホセートを含む混合
物は、モンサントカンパニーよりラウンドアツプ（登録
商標）の商品名で除草剤として販売されている。米国特
許第3799758号（フランツ、1974年）及び各種の他の特
許により例証されるように、非常に多くの他の塩も又除
草作用を有している。Ｎ−ホスフオノメチルグリシン及
び水中でＮ−ホスフオノメチルグリシンの溶解性を増加
する塩形成陽イオンからなる組成物が好ましい。

この分野における通常の知識を有する技術者（以下当
業者という）は、科学文献の中に、グリホセートによる
植物の生育の阻害作用の機作について提唱している多数
の論文が含まれていることを承知している。提唱されて
いる機作のうちの一つに、グリホセートが５−エノール
ピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（EPSPS）
と呼ばれる酵素を阻害することを示唆しているものがあ
る；例えば、アムルハイン（1980年）、スタインリユツ
ケン（1980年）、ムスデイル（1984年）及びルービン
（1982年）を参照されたい（参考文献の完全なリストは
実施例の後にまとめて示す。）。このEPSPS酵素は、３
種の必須な芳香族アミノ酸（チロシン、フエニルアラニ
ン及びトリプトフアン）をつくる生化学的経路の中間産
物であるシキメート−３−リン酸を５−エノールピルビ
ル−シキメート−３−リン酸に変換するのを触媒すると
報告されている；例えば、ムスデイル（1984年）を参照
されたい。ロジヤース（1983年）は、大腸菌でのEPSPS
の過剰産生が大腸菌細胞のグリホセート耐性に寄与して
いると報告している。

少なくとも１人の研究者は、EPSPS酵素を暗号化する
細菌の遺伝子を操作することにより、グリホセート耐性
の細菌細胞をつくろうと試みている。米国特許第453506
0号（コマイ；カルジーンInc.;1983年１月５日出願）及
びコマイ（1983年）に述べられているように、サルモネ
ラ属細菌の培養を突然変異誘発物質（エチル・メタンス
ルホン酸）と接触され、グリホセート耐性について細菌
をスクリーニングし、相対的に耐性の培養を選抜した。
ストーカー（1985年）が報告しているように、この培養
を解析し、置換アミノ酸をもつEPSPSの変異体であると
決定した。米国特許第4535060号は、EPSPS変異遺伝子を
植物細胞に挿入して、グリホセート耐性（Gly^R）植物細
胞をつくることができることを示唆した。加えて、低レ
ベルのグリホセート存在下でEPSPSを過剰生産するグリ
ホセートに耐えうる植物細胞を選抜できることも報告さ
れている（ナフツイガー等（1984年）及びスマート等
（1985年））。しかし、そのような方法が分化した植物
に有効であることを示した実験はない。

米国特許第4535060号の出願日以後、外来遺伝子を植
物細胞に挿入するのに使用される方法及びベクターにつ
いて開示された（例えば、フレーリー（1983年）、ヘレ
ラーエストレラ（1983年）、ベーヴアン（1983年）及び
PCT出願WO84/02919及び02920参照）。PCT出願WO84/0291
3では植物細胞で活性のある遺伝子由来の調節配列によ
り支配される細菌のEPSPS解読配列をもつキメラ遺伝子
をつくる方法も又開示された。これらのベクター及び方
法論を使用して、上記のサルモネラEPSPS変異遺伝子の
ような細菌の遺伝子を遺伝子操作し植物細胞中で発現さ
せることができる。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、細胞及びそれより再生させた植物
を、グリホセート及びその除草性の塩に対して耐性とな
るように、遺伝学的に植物細胞を形質転換する方法を提
供することである。

問題点を解決するための手段 この発明には、植物細胞で発現されたとき、５−エノ
ールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（EPSP
S）ポリペプチド又はその酵素的に活性のある部分を植
物細胞の細胞質からクロロプラストへ移させるようなク
ロロプラスト移行（transit）ペプチドを含有し、植物
細胞及びそこから再生された植物に対し、実質的なグリ
ホセート耐性を与える上記ポリペプチドを暗号化する遺
伝子よりなるクローニング又は発現ベクターが含まれ
る。

このEPSPS解読配列は、カリフラワー・モザイク・ウ
イルスの35Sプロモーターのような強力なプロモーター
にリゲートされ、キメラ遺伝子が創出される。そのよう
な遺伝子が植物の形質転換ベクターに挿入され、続いて
植物細胞に導入される。そのような遺伝子を用いて形質
転換された植物細胞及びそこから再生された植物は、実
質的なグリホセート耐性を示すことが明らかにされてい
る。

本発明には、植物細胞及びそこから再生される植物に
グリホセート耐性（Gly^R）を効果的に与えることのでき
るEPSPSの形態を暗号化する遺伝子を含有するクローニ
ング又は発現ベクターが包含される。EPSPS遺伝子は、E
PSPSポリペプチド（又は、その活性部分）を植物細胞内
のクロロプラストに移すことのできるクロロプラスト移
行ペプチド（CTP）を含有するポリペプチドを暗号化す
る。本発明の実施に適当な植物としては、これらに限定
されるわけではないが、大豆、綿、アルフアルフア、ナ
タネ（Brassica napus,Brassica campestis）、亜麻、
トマト、砂糖大根、ヒマワリ、ジヤガイモ、タバコ、ト
ウモロコシ、小麦、米及びレタスなどが挙げられる。

当業者は、科学文献には、EPSPS活性（シキミ酸経
路）がクロロプラスト及び細胞質両者に存在することを
述べた非常に多くの論文が含まれていることを承知して
いる。実際、本発明以前は、グリホセート耐性を与える
ために細胞質またはクロロプラストのうちのいずれでク
ローン化されたEPSPSが必要かどうかは明らかにされて
いなかつた。米国特許第4535060号の教示とは反対に、
本発明によりEPSPS遺伝子がクロロプラスト移行ペプチ
ドを含有しなければならないことが見い出された。クロ
ロプラストは、クロロプラスト内でポリペプチドとして
発現されると信じられているDNAを含有するが、EPSPSポ
リペプチドはクロロプラストDNAよりもむしろ染色体DNA
により暗号化されている。EPSPS遺伝子は核でmRNAに転
写され、mRNAは、細胞質で前駆体ポリペプチド（CTP/成
熟EPSPS）に翻訳される。前駆体ポリペプチド（又はそ
の部分）はクロロプラストに移される。

植物細胞でEPSPS遺伝子の転写を引きおこすことが知
られているか、又は見い出されているプロモーターが本
発明では使用される。そのようなプロモーターは、植物
又はウイルスから得られ、カリフラー・モザイク・ウイ
ルスの35S及び19Sプロモーター、EPSPS、ssRUBISCO遺伝
子のような植物遺伝子から単離されたプロモーターとノ
パリン及びマンノピン・シンターゼのようなアグロバク
テリウム・テユメフアシエンス（Agrobacterium temefa
ciens）のＴ−DNA遺伝子から得られたプロモーターが挙
げられるが必ずしもこれらに限定されるわけではない。
選択された特定のプロモーターは植物細胞及びそこから
再生された植物を実質的にグリホセートに耐性にさせる
ために有効な量のEPSPSポリペプチドを産生できるよう
に十分な発現をさせることが可能でなければならない。
当業者には、耐性を誘導するのに必要なEPSPSポリペプ
チドの量は、植物の種類により変化するものであること
は、自明のことであろう。必要とされる発現の程度は用
いたEPSPS解読配列によつても変わるものである。変異E
PSPSは、耐性のより少くない野生型EPSPS配列よりも低
い発現で良いこととなろう。

CaMV35Sプロモーターは、少なくとも数種の植物で
は、天然のEPSPSプロモーターよりも強力である。即
ち、天然のEPSPSプロモーターと比較してキメラ遺伝子
からかなりの量のmRNAの形成を引き起こす。CaMV35S/EP
SPSキメラ遺伝子の高力価は、研究室において選択マー
カーとしてEPSPS遺伝子を使用する際に大変価値があ
る。しかしながら、キメラ遺伝子が食物生産のための再
生植物を形質転換するのに使用されると、ヌクレオチ
ド、アミノ酸及び基質が細胞内の他の望ましい生化学経
路からはずれてしまうので、EPSPS酵素の産出のレベル
は望ましくないほど高いかもしれない。それ故、EPSPS
の適当なレベルの発現をするキメラ遺伝子を創出するた
めには、CaMV35S/EPSPSキメラ遺伝子の力価を減少させ
るのが望ましい。これには（１）転写開始部位の前の領
域のランダム又は部位特定突然変異誘発（２）遺伝子の
５′未翻訳領域への転写ターミネーターの挿入（３）EP
SPS開始コドン前への擬似開始コドンの挿入又は、
（４）ジシストロニツク解読配列（１個のプロモーター
の支配下で二種の転写配列を有する解読配列）を創出す
るためのEPSPS開始コドンの前に開始コドン及び終止コ
ドンをもつた解読配列の挿入のような各種の方法が用い
られる。

本発明のEPSPS遺伝子に使用するプロモーターの発現
の性質を変えることが望まれる場合は、さらに修飾して
も良い。例えば、葉では活性があるが根では活性のない
プロモーターを創出するために、CaMV35Sプロモーター
に、光がないときにはssRUBISCOの発現を抑制するssRUB
ISCO遺伝子の一部分をリゲートする。得られたキメラプ
ロモーターは本明細書中で後述するように用いられる。
本明細書中では、「CaMV35S」プロモーターには、各種
のCaMV35Sプロモーター、例えば、オペレーター領域の
結合、ランダム又は支配された突然変異誘発等により誘
導されたプロモーターが含まれる。

EPSPS遺伝子により生産されるRNAも又、５′の未翻訳
リーダー配列を含む。この配列は、どんな遺伝子由来で
も良く、mRNAの翻訳を増加するように特異的に修飾され
る。５′未翻訳領域は、ウイルスRNA他の適当な真核細
胞遺伝子又は合成遺伝子配列に由来するものでも差支え
ない。EPSPSポリペプチドの解読配列の未翻訳領域の
５′端の一部であつても良く、又は上述の如く関連性の
ないプロモーターあるいは解読配列に由来するものであ
つても良い。

本発明のEPSPS遺伝子はCTP/EPSPS融合ポリペプチドを
暗号化する。本発明の遺伝子のCTP/EPSPSポリペプチド
が、形質転換された植物細胞の細胞質でmRNAから翻訳さ
れた後は、天然のEPSPSポリペプチドでも同様に処理さ
れると信じられている。CTPリーダー配列は、ポリペプ
チドをクロロプラストに移行させ、この植物由来のEPSP
S遺伝子により暗号化されるCTPリーダー配列はポリペプ
チドの残りの部分から除去されて、EPSPSポリペプチド
の活性部分がクロロプラスト内部に存在し機能する。

本発明で使用するのに適当なCTPは各種材料から得ら
れる。最も好ましくは、形質転換する対象の植物の内在
性EPSPS遺伝子から得られるCTPが良い。また他の種類の
植物のEPSPS遺伝子のCTPをしばしば使用可能である。EP
SPS遺伝子とssRUBISCO遺伝子のCTP配列間にはほとんど
相同性はないのだが（例えば、ブログリー（1983年）参
照）、非相同なCTPも特定の具体例では機能することを
見出すことは可能である。本発明に使用するのに適当な
CTP配列は、後述の実施例18に詳述する如くに、興味あ
るCTPを含有するEPSPSポリペプチドのクロロプラストへ
の取り込みを検定することにより容易に決定される。

EPSPSポリペプチドを暗号化する配列は、非常に多く
の材料から得られる。適当な材料には、細菌、カビ及び
植物が含まれる。他の材料からのEPSPS解読配列は、全
長ペチユニアcDNA（第３図参照）又はその適当な断片を
ハイブリダイゼーシヨンのプローブとして使用して、実
施例１及び14から17に述べられているように得られる。

以下の説明で表示する全てのペプチドの構造は、Ｎ−
末端でのアミノ基が左側及びＣ末端でのカルボキシル基
が右側となるように慣用的な図式で示す。同様に、蛋白
に見い出される天然アミノ酸に対するアミノ酸の表示は
以下の通りである：アラニン（Ala;A）、アスパラギン
（Asn;N）、アスパラギン酸（Asp;D）、アルギニン（Ar
g;R）、システイン（Cys;C）、グルタミン酸（Glu;
E）、グルタミン（Gln;Q）、グリシン（Gly;G）、ヒス
チジン（His;H）、イソロイシン（Ile;I）、ロイシン
（Leu;L）、リジン（Lys;K）、メチオニン（Met;M）、
フエニルアラニン（Phe;F）、プロリン（Pro;P）、セリ
ン（Ser;S）、スレオニン（Thr;T）、トリプトフアン
（Trp;W）、チロシン（Tyr;Y）、及びバリン（Val;
V）。

EPSPSの突然変異体及び変種は各種過程によりつくら
れることを当業者ならば自明のことであろう。例えば、
EPSPS蛋白の１個またはそれ以上のアミノ酸残基を変え
るために、クローニング又は発現ベクターを突然変異誘
発しても良い。これは、無作為的に（例えば、Ｘ線、紫
外光又は各種化学薬品のような変異誘発剤に宿主細胞を
さらすことにより）、又は、DNA配列中の塩基の正確に
予想された置換を含む手段によりおこなわれる。また、
細菌やカビのような微生物材料あるいは増加したグリホ
セート耐性を示す変異EPSPSをもつ植物材料を選んでも
良い。

３′未翻訳領域は、植物体中で、EPSPSnRNAの３′端
にポリアデニレートヌクレオチドを付加させる機能のあ
るポリアデニレーシヨン信号を含有する。EPSPS配列が
植物材料由来である場合、特定のEPSPS遺伝子に天然に
付随する３′未翻訳領域を使用することができる。他の
適当な３′領域の例としては、アグロバクテリウムの腫
瘍誘導（Ti）プラスミドのノパリンシンターゼ（NOS）
遺伝子又はコングリシニン（7S）貯蔵蛋白遺伝子のポリ
アデニレーシヨン信号を含む３′の転写され未翻訳の領
域がある。

本発明のEPSPS遺伝子は、適当な方法で植物ゲノムに
挿入される。適当な植物形質転換ベクターは、例えば、
ヘレラーエストレラ（1983年）、ベヴアン（1983年）、
クリー（1985年）及び欧州特許公開公報第120516号（ミ
ルペルート等）で開示されたものと同様に、アガロバク
テリウム・テユメフアシエンスのTiプラスミド由来のも
のを含む。アガロバクテリウムのTi又は根誘導（Ri）プ
ラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、他の代
替方法が、植物細胞に本発明のEPSPS遺伝子を挿入する
のに使用できる。そのような方法は例えば、リポソー
ム、エレクトロポレーシヨン、自由DNAの取り込みを増
加する薬品及びベクターとしてのウイルス又は花粉の利
用を含む。必要に応じて、１個以上のEPSPS遺伝子を、
形質転換と選択のサイクルを１度以上繰り返すような方
法によつて植物の染色体に挿入しても良い。

（好ましくは、成熟EPSPSポリペプチドから除去され
る）機能クロロプラスト移行ペプチドをもつ酵素を暗号
化するEPSPS遺伝子は、形質転換細胞及び非形質転換細
胞が、（植物の種類によりルーチン的に決定することの
できる）適当な濃度のグリホセートに接触したときに、
植物細胞の形質転換に有効な選択マーカー遺伝子を提供
する。グリホセート耐性を授与することのできる特性
は、（例えばカナマイシン、メトトレキセート又はハイ
グロマイシン耐性遺伝子のような）他の選択マーカー遺
伝子を用いるとはつきりした選択性を示さない（アルフ
アルフア、大豆及び他の豆類のような）特定の種類の植
物には特に有効である。

更に、EPSPS遺伝子で形質転換されたグリホセート耐
性植物細胞は、選ばれた芽誘導又は根誘導ホルモンを補
強した標準的な栄養培地を用い、PCT出願WO84/02920に
述べられている方法あるいは当業者には周知の他の方法
で、分化植物に再生することができる。

本明細書中では、形質転換された植物細胞の培養の選
抜しうる画分が、同一条件下で、同一型の植物の全ての
非形質転換細胞を殺す濃度のグリホセートで生存させう
るならば、EPSPS遺伝子、“植物細胞に実用的なグリホ
セート耐性度を賦与する”ことを意味するものとする。

本明細書中では、「クローニング又は発現ベクター」
は、１種又はそれより多くの微生物細胞で複製すること
ができるDNA又はRNA分子をさす。ベクターには、プラス
ミド、コスミド、ウイルスDNA又はRNA、ミニ染色体等が
含まれる。

本明細書中では、「複製型」は、植物DNA又はmRNAか
らの直接的な複製と同様に、（例えば中間体ベクターの
複製のような）間接的複数を含む。これは又、公表さ
れ、あるいは実験的に決定された塩基配剤を用いて、
（例えばアダムス（1983年）の方法で）合成されたDNA
を含む。

次の略図は、本発明の好ましい実施例で使用された主
たる操作を示す。

以上の実施例はさらに本発明のいくつかの好ましい実
施態様を示す。ここに述べている特異的な実施態様に対
して多数の同等物を当業者は容易に推考しうるであろ
う。そのような同等物はこの発明の特許請求の範囲内に
当然に含まれる。

実施例 実施例1:EPSPSベクターの創出 A.MP4−Ｇ細胞系列の創出 MP4系と命名されている最初の細胞系列は、ミツチエ
ルの２倍体ペチユニアに由来した（例えば、アウスベル
（1980年）参照）。MP4細胞はムラシゲ及びスクーグ（M
S）の培養培地（ギブコ社製、グランド・アイランド・
ニユーヨーク）に懸濁させた。全べての植え継ぎは、10
mlの懸濁培養の50mlの新鮮な培地へ移しかえにより行な
つた。次回の植え継ぎまでの培養期間は10から14日の範
囲で、培養が飽和に達することを目安とした。

（約５×10⁶の細胞を含む）10mlの飽和懸濁培養液を
0.5mMグリホセート（モンサント農業製品（株）製、セ
ントルイス、ミズーリ）を含む50mlのMS培地に移しかえ
た。グリホセートのナトリウム塩がここに述べられてい
る実験を通して使用された。大多数の細胞はグリホセー
ト存在下では再生できなかつた。（最初細胞数の１％未
満と推定される）生き残つた細胞は、0.5mMグリホセー
ト中で培養し、10から14日ごとにグリホセートを含む新
鮮な培地に移しかえた。

２回の移しかえの後、生存細胞は、1.0mMグリホセー
トを含む新鮮な培地に移しかえた。1.0mMで２回の移し
かえた後、生存細胞は順次、2.5mMグリホセート、5.0mM
グリホセート及び10mMグリホセートと移しかえた。

次に、MP4−Ｇ細胞が「遺伝子増幅」と呼ばれる遺伝
的操作により、約15から20コピーのEPSPS遺伝子をもつ
ことが（サザン・ブロツトにより）明らかとされた。
（例えば、シムケ（1982年）参照）自然突然変異はどの
細胞の複製の間におこるのだが、EPSPS遺伝子のいかな
る突然変異又は、他の修飾が遺伝子増幅操作の間におこ
るという徴候はない。唯一知られているMP4とMP4−Ｇ細
胞間の違いは、MP4−Ｇ細胞が、EPSPS遺伝子と恐らく細
胞の染色体上でEPSPS遺伝子の近傍に位置する他の遺伝
子の多重コピーを含有することである。

B.EPSPS酵素の精製及びシークエンシング MP4−Ｇ細胞系列のペチユニア細胞が真空濾過により
集められ、液体窒素で凍結されて、ワーリング・ブレン
ダーで粉砕された。粉末を1mM EDTA及び7.5％（w/v）ポ
リビニル−ポリピロリドンを含む0.2M Tris−HCl pH7.8
に懸濁した。懸濁液を約20000Gで10分間遠心し、細胞残
渣を除去した。核酸は上清に0.1容の1.4％プロタミン硫
酸を添加することにより沈澱させ、除去した。

粗蛋白懸濁液は、（１）硫安沈澱 （２）ジエチルア
ミノエチルセルロースイオン交換クロマトグラフイ
（３）ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフイ
（４）フエニルアガロースゲルによる分画 （５）セフ
アクリルＳ−200ゲルにより分画から成る５工程により
精製された（ムスデイル（1984年）及びスタインリユツ
ケン（1985年）参照）。

精製されたEPSPSポリペプチドは、ハンカピラー（198
3年ａ）に述べられている方法を用いて、モデル470Aプ
ロテイン・シーケンサー（アプライド・バイオシステム
ズ（株）製、フオスター シテイ カルフオルニア州）
により、エドマン分解で、一連の個々のアミノ酸に分解
された。それぞれのアミノ酸誘導体は、22000以上の理
論段数のシアノプロピルカラム（IBMインストルメン
ツ）製、ウオーリングフオードコネチカツト州）を用い
て、ハンカピラー（1983年ｂ）により述べられたように
逆相高速液体クロマトグラフイにより分析された。ペチ
ユニアのEPSPSのアミド酸の部分配列を表１に示す。

C.プローブの合成 当該遺伝コードを使用し、表１に示されたアミノ酸配
列を用いて、各々示されたアミノ酸をコードできる可能
なDNAコドンを決定した。この情報を用いて、３種の異
なるプローブ混合物が作製されて、表１に示されたよう
に、EPSP−１、EPSP−２及びEPSP−３と命名された。こ
の表で、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ及びＧはヌクレオチド塩基：ア
デニン、チミン、ウラシル、シトシン及びグアニンをあ
らわす。文字Ｐ、Ｑ及びＮは可変的なもので;Nはいずれ
かの各塩基を、Ｐはプリン（Ａ又はＧ）を、そしてＱは
ピリミジン（Ｕ、Ｔ、又はＣ）をあらわす。

全てのオリゴヌクレオチドがアダムス（1983年）の方
法で合成された。不確定のヌクレオチドの位置（Ｐ、Ｑ
又はＮ）に達すると、適当なヌクレオチドの混合物が反
応液に添加された。プローブは、使用直前に50mM Tris
−HCl pH7.5、10mM MgCl₂、5mM DTT、0.1mM EDTA及び0.
1mMスペルミジン中で100μ Ciγ−［³²P］−ATP（アマ
シヤム）及び10単位のポリヌクレオチド・キナーゼを用
い20pmolに標識された。１時間37℃で保温後、プローブ
は２％アクリルアミド8M尿素ゲル上あるいは、0.1M Nac
l、10mM Tris−HCl pH7.5、1mM EDTAのセフアデツクスG
25の5mlカラムを通すことにより再精製された。

D.mRNAの調製及びプローブの基礎的な試験 （ａ）ポリＡ mRNA ゴールドバーグ（1981年）により述べられたようにMP
4（グリホセート感受性）及びMP4−Ｇ（グリホセート耐
性）の細胞系列から全RNAを分離した。全RNAはさらに、
デピツカー（1982年）により述べられたように、塩化セ
シウム緩衝剤により沈降させた。ポリ−Ａ mRNAはオリ
ゴdTセルロースクロマトグラフイにより選択した。ポリ
−Ａ RNAの収量はMP4細胞1gあたり1.1μｇあたりでMP4
−Ｇ細胞では2.5μg/gであつた。

（ｂ）RNAのゲルプロセシング MP4又はMP4−Ｇ細胞系列のポリ−Ａ RNA10μｇをエ
タノールで沈澱させ、50％ホルムアミド及び2.2M ホル
ムアルデヒドを含む１倍のMOPS緩衝液（20mMモルホリノ
プロパンスルホン酸pH7.0、5mM酢酸ナトリウム及び1mM
EDTApH8.0）に再懸濁した。RNAを65℃で10分間加熱処理
して変性させた。50％グリセロール、1mM EDTA、0.4％
ブロモフエノールブルー及び0.4％キシレンシアノール
を含む緩衝液を1/5容添加した。RNAは、1.1M ホルムア
ルデヒドを含む1.3％アガロースゲルで、ブロモフエノ
ールブルーが底近くになるまで分画した。³²Pで標識し
たHae III消化のφ×174DNAを大きさの標準として流し
た。DNAマーカーはRNAバンドに対しておよその大きさを
示した。

（ｃ）RNAのニトロセルロースへの移行 移行用緩衝液として20倍SSC（１倍SSCは0.15M NaCl、
0.015M クエン酸ナトリウムpH7.0）を使用して１晩ゲル
を吸い取ることによりRNAをニトロセルース（＃BA85、
シユライヒヤー＆シユエル社、キーン、NH）に移行させ
た。移行後、濾紙を風乾し、80℃で２から３時間真空オ
ーブン中で焼いた。

（ｄ）放射活性のあるプローブを用いた基礎的なハイブ
リダイゼーシヨン 濾紙は６倍SSC、10倍デンハルト溶液（１倍デンハル
ト溶液は、0.02％フイコール、0.02％ポリビニルピロリ
ドン、0.02％牛血清アルブミン）、0.5％NP−40及び200
μg/ml大腸菌tRNA中で、50℃、４時間プレハイブリダイ
ズした。ハイブリダイゼーシヨンは、EPSP−１又はEPSP
−２プローブのいずれかを２×10⁶cpm/ml含む新鮮な溶
液中で、48時間、32℃で実施した。EPSP−３プローブ
は、ペチユニアゲノムでは殆んど用いられないコドン
（ATA）を含んでいるので、試験しなかつた。各場合で
用いられたハイブリダイゼーシヨンの温度（32℃）は、
混合液中で最低のGC含量をもつオリゴヌクレオチドに対
し計算された解離温度（Td）よりも10℃低いものであつ
た。プローブのTdは公式２℃×（Ａ＋Ｔ）＋４℃×（Ｇ
＋Ｃ）により近似させた。

（ｅ）濾紙洗浄 ６倍SSC中で15から20分間室温で２度、それから５分
間37℃でゆるやかに振盪しなから濾紙を洗浄した。それ
から濾紙をプラスチツクフイルムでくるみ、２枚のイン
テンシフアイ・スクリーンを用いて、−70℃で12から14
時間オートラジオグラフをおこなつた。先に用いたより
も５℃高い温度でゆるやかに振盪しながら５分間再び濾
紙を洗浄した。濾紙について再び12から14時間オートラ
ジオグラフをおこなつた。オートラジオグラフの結果、
プローブEPSP−１はMP4−Ｇ細胞系列のポリ−Ａ RNAを
含むレーンで約1.9kbのRNAとハイブリダイズした。この
RNAに対するハイブリダイゼーシヨンは、MP4−４細胞系
列のポリ−Ａ RNAを含むレーンでは検出されなかつ
た。この結果は、MP4−Ｇ細胞系列によるEPSPS mRNAの
過剰産生によるものであつた。１個のヌクレオチドがEP
SP−１と異なるプローブEPSP−２は、MP4−Ｇ細胞系列
の1.9kb mRNAとわずかに検出可能なハイブリダイゼー
シヨンを示したが、両細胞系列の1.0kb mRNAとは強く
ハイブリダイズした。しかしながら、1.0kb DNAは5000
0ダルトンのポリペチドを暗号化するには充分ではなか
つた、そしてEPSP−２プローブの配列の１つが、ライブ
ラリーの全く異なる配列とハイブリダイズしたと信じら
れている。これらの結果は。同義性のプローブ混合物EP
SP−１がEPSPSの正確な配列を含むことを示唆した。こ
の混合物を次の全ての同義性のプローブハイブリダイゼ
ーシヨン実験に使用した。

E.λgt10cDNAライブラリーの調製 （ａ）使用材料 AMV逆転写酵素は生化学アメリカ社（セントピータス
バーグ、フロリダ州）から入手した;DNAポリメラーゼＩ
のラージフラグメント（クレノウ・ポリメラーゼ）は、
ニユーイングランド・ヌクレアー（ボストン、マサチユ
ウセツツ州）から、S1ヌクレアーゼ及びtRNAはシグマか
ら、AcA34カラム担体樹脂はLKB社（ガイサースバーグ、
メリーランド州）から、EcoR I、EcoR Iメチラーゼ及び
EcoR Iリンカーはニユーイングランド・バイオラボ社
（ベバリー、マサチユウセツツ州）から、RNasin（リボ
ヌクレアーゼ阻害剤）は、プロメガ・バイオテツク社
（マジソン、ウイスコンシン州）から、そして、全ての
放射活性化合物はアマシヤム社（アーリントンHrs、イ
リノイ州）から入手した。

λgt10ベクター（ATCC No.40179）及び付随する大腸
菌細胞系列は、スタンフオード大学医学部のサン・ヒユ
ーン及びロナルド・デイビスにより提供された（ヒユー
ン（1985年）参照）。このベクターは３つの重要な性質
を有する：（１）新しいDNAを挿入する前にフアージDNA
からDNAの中央部分を除去する必要を避ける唯一のEcoR
I挿入部位をもつ。（２）０から約8000塩基の範囲のDNA
をこのベクターを用いてクローニングできる。（３）ラ
イブラリーをDNA挿入を有しないクローンを除去するた
めに大腸菌MA150細胞（ATCC No.53104）を用いてプロセ
スできる。

（ｂ）cDNA第１鎖の合成 ポリ−Ａ mRNAを例1.D.aに述べられているように調
製し、50mM Tris（pH8.5）、10mM MgCl₂、4mM DTT、
40mM KCl、500μM d（AGCT）TP、10μg/ml dT_12-18プ
ライマー及び27.5単位/ml RNasinに再懸濁した。120μ
の反応容量で、70単位の逆転写酵素を５μｇのポリ−
Ａ RNAに対して添加した。１本の反応試験管には、cDN
Aの大きさと収量を監視し、その後の反応をモニターす
るための最初の鎖の標識を提供するためにα−³²P−dCT
P（５μCi/120μ反応系）を含有させた。mRNAの２次
構造を破壊するため、H₂O中でRNAを70℃３分間保温し、
試験管を氷中で冷却した。逆転写酵素を添加し、cDNA合
成を42℃で60分間実施した。反応は、EDTAを50mMまで添
加することにより停止させた。cDNAの収量は、反応開始
時及び60分後に除去した試料のTCA沈澱によりモニター
した。cDNA合成の後、cDNAはcDNA−RNA雑種（ハイブリ
ツド）として存在した。このcDNA−RNAハイブリツドを
沸騰湯浴中で1.5分間混合物を熱処理することにより変
性させ、次いで氷で冷却した。

（ｃ）第２の鎖DNA合成 単鎖cDNAを第２鎖合成のためにセルフ・プライムさせ
た。クレノウ・ポリメラーゼ及び逆転写酵素の両者を使
用して、単鎖cDNAを二重鎖cDNAに変換した。クレノウポ
リメラーゼはその３′−５′オキソヌクレアーゼ修復機
能がセルフ・プライミングにより生じたDNAの非平滑末
端を消化し、それから、そのポリメラーゼ活性でこれら
の平滑末端をひろげることができると信じられているの
で、最初に用いる。逆転写酵素は１度鋳型鎖に結合する
と未成熟に止まつてしまうことは殆んどないと信じられ
ているので、クレノウ・ポリメラーゼに添加して使用す
る。クレノウ・ポリメラーゼの反応は、酵素を除いて最
終容量100μで行なつた。反応系は、50mM HEPES、pH
6.9、10mM MgCl₂、50mM KCl、dNTP及びcDNAをそれぞ
れ500mM含んでいた。反応開始の為に、20から40単位の
クレノウ・ポリメラーゼ（通常５μ未満）を添加し、
試験管を15℃で５時間インキユベートした。反応は、ED
TAを50mMまで添加することにより停止させた。混合液を
フエノールで抽出し、核酸を沈澱、遠心次いで乾燥し
た。

さらに抗相補DNA鎖を拡張するための逆転写酵素の反
応を、dT_10-18プライマー及びRNasin含まず、32単位の
逆転写酵素を120μの反応液中で使用して本来は合成c
DNAのための反応と同様にして実施した。反応はEDTAを5
0mMまで添加することにより停止させた。混合液を等量
のフエノールで抽出し、核酸を沈澱、遠心及び乾燥し
た。

（ｄ）S1ヌクレアーゼ処理 ２倍のS1緩衝液（１倍のS1緩衝液は、30mM酢酸ナトリ
ウム、pH4.4、250mM NaCl、1mM ZnCl₂）200μ、H₂O
（水）175μ及び525単位のS1ヌクレアーゼを第２鎖合
成反応生成物125μを含む試験管に添加した。試験管
を37℃で30分間保温し、反応は、EDTAを50mMまで添加す
ることにより停止させた。混合液を等量のフエノール／
クロロホルム（1:1）で抽出した。水層を残存フエノー
ルを除去するためにエーテルで抽出した。DNAをエタノ
ールで沈澱させて、風乾した。

（ｅ）EcoR Iメチル化反応 二重鎖（以下dsという）cDNAは、多種のmRNAから複写
されるので二重鎖cDNAの多くは内部にEcoR I制限部位を
多分含んで居つたのであろう。そのようなEcoR I切断部
位をEcoR I切断から保護し、順次EcoR Iで切断して末端
に付着突出部をつくる平滑端のEcoR Iリンカーを使用で
きるようにすることが望まれた。

内部EcoR I部位での望まざる切断を防止するために、
dscDNAをEcoR Iメチラーゼを用いて、メチル化した。DN
Aの遠沈分離物を50mM Tris、pH7.5、1mM EDTA、5mM
DTT40μに溶解した。100μM S−アデノシル−Ｌ−メ
チオニン４μ及びEcoRIメチラーゼ２μ（80単位）
を添加した。試験管を37℃で15分間インキユベートし、
次いでメチラーゼを殺滅するため70℃で10分間加温し
た。

その後、以下に述べられているメチル化反応は明らか
に不活性なメチル化反応試薬のために、EPSPS解読領域
内部の部位でのEcoR I切断を妨げられずに失敗したこと
が見い出された。以下に述べるように、内部EcoR I部位
の切断は、全長cDNAを単離するための付加的工程を必要
した。別のライブラリーが作製されるときにこれらの付
加的工程を回避するためには、メチル化試薬及び反応条
件がCDNA及び対照のDNA断片について同時に使用されな
ければならず、消化がcDNAについて実施される前に、対
照の断片の保護がEcoR I消化により確かめられなければ
ならない。

（ｆ）DNAポリメラーゼＩ補充反応 （上述のように調製された）cDNA45μを含む試験管
に対して、0.1M MgCl₂5μ、0.2mM ｄ（ACGT）TP5μ
及び10単位のDNAポリメラーゼＩを添加した。試験管
を室温で10分間インキユベートした。反応はEDTAを25mM
まで添加して停止させた。１μｇの未切断のλgt10DNA
を運搬体として添加して、混合液は、フエノール／クロ
ロホルム（1:1）で抽出した。混合液中の核酸はフエノ
ール／クロロホルム（1:1）で沈澱させた。混合液中の
核酸をエタノールで沈澱させ、遠心乾燥させた。

（ｇ）メチル化dscDNAへのEcoR Iリンカーのリゲーシヨ
ン 約400pmoleのEcoR Iリンカー（５′CGGAATTCCG
３′）を、50μCiのα−³²P−ATP（5000Ci/mmole）及び
２単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを含む20mM Tri
s、pH8.0、10mM MgCl₂、10mM DTT9μに溶解させ
た。オリゴヌクレオチドは、２本鎖の平滑端リンカーを
つくるよう互いにアニール化するまで37℃で30分間イン
キユベートした。２単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ
及び10mM ATP1μを添加し、さらに30分間37℃でイン
キユベートした。リンカーは−20℃で保存した。メチル
化DNAペレツトを400pmoleのキナーゼ処理したリンカー
を含む試験管中に再懸濁させた。メチル化DNAへのEcoR
IリンカーのリゲーシヨンをT4リガーゼ１μを添加
し、反応系を12から14℃で２日間インキユベートするこ
とにより実施した。

（ｈ）付着末端作製のためのEcoR I消化 実施例1.E.（ｇ）の反応産物11μに対して、50mM
Tris、pH7.5、10mM MgSO₄、200mM NaClを含む溶液10
μを添加した。T4DNAリガーゼを、70℃で10分間イン
キユベートすることにより加熱不活性化した。40単位の
EcoR Iを添加し、37℃で３時間インキユベートした。反
応はEDTAを50mMまで添加して停止させた。試料を遠心に
より浄化し、AcA34カラムに充填した。

（ｉ）AcA34カラムクロマトグラフイ （dscDNAに連結されていない）自由な（未結合）リン
カーは、クローニング・ベクターへ所望のdscDNAの挿入
の妨げとならないようにするために、付着リンカーをも
つdsDNAから除去した。2mMクエン酸緩衝液及び0.04％窒
化ナトリウム水溶液で予め膨潤させたAcA34樹脂（アク
リルアミド及びアガロースビーズの混合物、通常大きさ
測定に使用される）を、グラスウールで栓をした１μ
プラスチツク製注射器の1mlの目盛のところまで添加し
た。カラムを、10mM TrisHCl、pH7.5、1mM EDTA、400
mM NaClで平衡化した。連結されたリンカー及び自由な
リンカーをもつdscDNA混合液（〜45μ）を400mM NaC
lとなるよう調製した。0.5％ブロモフエノール・ブルー
色素（BPB）１μを添加し、試料を、室温で平衡化緩
衝液を流したカラムに充填した。200μずつ10本の画
分が集められた。BPB色素は通常６本目の試験管あるい
はそれ以降にカラムから溶出した。試験管１及び２を合
わせ、クローニングのdscDNAの材料として使用した。

（ｊ）λgt10クローンの集合 dscDNAを１μｇのEcoR I切断λgt10DNAと混合し、エ
タノールにより沈澱させ、遠心分離した。70％エタノー
ルで１度ペレツトを洗浄した後、当該DNAペレツトを風
乾し、10mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl₂、50mM N
aCl4.5μに再懸濁した。λgt10DNAの左腕及び右腕へ
のcDNA挿入をアニールするために、混合液を70℃で３分
間加熱し、更に、50℃で15分間加熱した。混合液を氷中
で冷却し、少なくとも90％の完成を確実にするために、
10mM ATP、0.1M DTT及び十分なT4DNAリガーゼをそれ
ぞれ0.5μ添加した。反応液を14℃で１晩インキユベ
ートし、dscDNAのλgt10DNAのEcoR I部位への挿入をお
こなわせた。得られたDNAは、シエラー（1981年）によ
り述べられた方法を用いて試験管内でフアージ粒子へ包
み込んだ。

（ｋ）挿入をもたないフアージの除去 λgt10DNAのEcoR I部位へのcDNAの挿入は、C1遺伝子
の不活化を招来する。不活化されたC1遺伝子をもつ（即
ち、挿入をもつ）λgt10フアージは、通常大腸菌MA150
細胞で複製する。対照的に、挿入をもたないλgt10フア
ージは大腸菌MA150株では複製できない。これは、挿入
をもたないλgt10クローンを除去する方法を提供するこ
ととなる。

ライブラリー中のフアージはまず、フアージを大腸菌
MA150の制限系から保護するために、λgt10DNAを修飾し
た大腸菌C600（M⁺R^-）細胞で複製させた。相対的に小数
の大腸菌C600細胞が感染し、それから、20倍に過剰のMA
150（（M⁺R⁺）細胞と平板培養した。それ故、最初の感
染は、全てのフアージが生育するM⁺R^-細胞で起こつた
が、挿入なしのフアージの複製を妨げるMA150細胞中で
複製を連続して行なつた。増幅されたフアージ・ライブ
ラリーを平板から集め、遠心により寒天及び他の混入物
を除去した後、組換えフアージを検索試験に使用するた
めに用意した。

F.cDNAライブラリーの検索;pMON9531の選択 （各平板）約6000のフアージを、0.7％アガロースの
固形NZY寒天（マニアテイス、1982年）の10cm×10cmの
角形平板に塗布した。半透明の大腸菌MA150細胞が平板
上で生育した。フアージが感染し、大腸菌細胞を殺減し
た領域は、37℃で１晩平板をインキユベートすることに
より叢生した細菌に対して、肉眼判別できる「プラー
グ」と呼ばれる透明な領域とし示された。この方法で６
枚の平板を調製した。プラークを約30分間予め切断して
あるニトロセルロース濾紙におしつけた。これは、プラ
ークの対称的なレプリカを形成した。フアージDNAを押
し付けるために、濾紙は５分間0.5M NaOH及び2.5M NaC
lで処理した。次いで、濾紙を順次、NaOHを中和するた
めに、1.0M Tris−HCl pH7.5及び2.5M NaClを含む0.5M
TrisHCl pH7.5で処理した。その後濾紙を細胞残渣の除
去のためにクロロホルムに浸漬した。その後、濾紙を風
乾し、真空下80℃で２時間焼き、室温で冷却した。更に
濾紙を実施例1.D（ｅ）に述べたように³²P標識EPSP−１
プローブとハイブリダイズした（２×10⁶cpm/濾紙）。
ハイブリダイゼーシヨンの48時間後、濾紙を６倍のSSC
で、室温20分間を２回、それから37℃で５分間洗浄し
た。この洗浄により非特異的に結合したプローブ分子が
除去され、一方（その時点では未知の）正確に対応する
配列をもつプローブ分子は、濾紙上のフアージDNAに結
合したままであつた。最終洗浄の後、濾紙をオートラジ
オグラフイにより分析した。最初の検索工程の後、７個
の陽性ハイブリダイズ信号がオートラジオグラム上に黒
い点として出現した。これらのプラークを平板から取り
出して、平板あたり100から200プラーグの密度で再度新
鮮な平板に塗布した。これらのプレートを、上述の手法
を用いて検索した。４個の陽性なハイブリダイズしたフ
アージが選抜された。DNAをこれらの４個のクローンそ
れぞれから分離して、cDNA挿入部の大きさを測定するた
めにEcoR Iで消化した。最も大きなcDNA挿入、約330bp
を含むクローンを選択して、λE3と命名した。λE3のcD
NA挿入部をプラスミドpUC9（ヴイーラ1981年）に挿入
し、得られたプラスミドをpMON9531と命名した。

pMON9531クローンが所望のEPSPS配列を含むことを確
認するために、EcoR I消化により挿入をpMON9531クロー
ンから除去した。次いで、このDNA断片を、マキサム（1
977年）の化学分解法によりシーケンスした。ヌクレオ
チド配列から予想されるアミノ酸配列は、表１に示され
たEPSPSの部分的なアミノ酸配列と一致した。

G.λE7ゲノムDNAクローンの創出 完全なEPSPS遺伝子を得るために、MP4G細胞系の染色
体DNAをBamH Iで消化し、ライブラリー創出のためにフ
アージベクターにクローン化して、プローブとしてpMON
9531のEPSPS部分配列を用いてスクリーニングした。

（ａ）MP4−Ｇ染色体DNA断片の調製 MP4−Ｇ細胞を液体窒素存在下で凍結し、粉砕ガラス
と共に乳鉢中で粉砕した。粉末細胞は、8.0M尿素、0.35
M NaCl、0.05M Tris−HCl（pH7.5）、0.02M EDTA、２
％サルコシル及び５％フエノールを含む冷却した融解緩
衝液と1gあたり8mlで混合された。混合液を大きな塊が
こわれるまで、ガラス棒で撹拌した。５％イソアミルア
ルコールを含むフエノール及びクロロホルムの3:1混合
液を等量添加した。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を
終濃度0.5％まで添加した。混合液を室温で10から15分
間回転台上で撹拌した。6000gで15分間の遠心により相
の分離を行なつた。フエノール／クロロホルム抽出を繰
り返した。酢酸ナトリウムを終濃度0.15Mまで水層に添
加して、DNAをエタノールで沈澱させた。DNAを遠心によ
り回収して、１倍のTE（10mM Tris HCl、pH8.0、0.1m
M EDTA）に溶解し、CsCl−臭化エチジウム密度勾配で
バンドを形成させた。DNAを16ゲージ針で試験管の横に
細孔をあけて回収した。臭化エチジウムをCsCl飽和のイ
ソプロパノールで抽出し、DNAを１倍TEで充分に透析し
た。約400μｇのDNAが12gの細胞から分離された。

MP4−Ｇ染色体DNA（10μｇ）を10mM Tris、pH7.8、1
mM DTT、10mM MgCl₂、50mM NaClを含む緩衝液で、30
単位のBamH Iを用いて、２時間37℃で完全に消化させ
た。DNAをフエノール続いてクロロホルムで抽出して、
エタノールで沈澱させた。DNA断片を１倍のTEに0.5μg/
μ濃度で懸濁させた。

（ｂ）MP4−Ｇ染色体DNA断片のλMG14へのクローニング （ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部の
メイナード・オルソン博士より得た）フアージλMG14の
DNAをマニアテイス（1982年）が述べている方法により
調製した。10mM Tris−HCl、pH7.8、1mM DTT、10mM
MgCl₂、50mM NaClを含む緩衝液で150μｇのDNAをBamH
Iを用いて完全に消化した。消化の完全度を0.5％アガロ
ースゲルによる電気泳動により検査した。次いでフアー
ジDNAを、フエノールクロロホルム−イソアミルアルコ
ール（25:24:1）で２度抽出し、エタノールで沈澱させ
た。DNAを１倍のTEに150μg/mlの濃度で再懸濁させた。
MgCl₂を10mMまで添加し、λDNAの付着端を再アニーリン
グさせるために42℃で１時間インキユベートした。アニ
ーリングはアガロースゲル電気泳動で検査された。

アニーリング後、DNAをベツクマンSW27超遠心チユー
ブ中の（10から40％、w/v）シヨ糖勾配38mlに重層させ
た。勾配溶液は1M NaCl、20mM Tris HCl（pH8.0）、5
mM EDTAを含む緩衝液で調製した。75μｇのDNAを各勾
配上に充填した。試料を、ベツクマンSW27ローターで、
26000回転、24時間、15℃で遠心した。画分（0.5ml）を
遠心チユーブの上部から集め、ゲル電気泳動によりDNA
の存在について分析した。λDNAの焼きなました（アニ
ールした）左腕及び右腕を含む画分を一緒に集め、TEに
対して透析し、エタノールで沈澱した。沈澱を70％エタ
ノールで洗浄し、乾燥させた。DNAをTEに500μg/mlの濃
度で溶解させた。

精製されたベクターDNAの腕及びMP4−GDNAのBamH I断
片を4:1及び2:1の分子比で混合し、66mM Tris−HCl p
H7.5、5mM MgCl₂、5mM DTT及び1mM ATPを含むリガー
ゼ緩衝液でT4 DNAリガーゼを用いてリゲートさせた。
リゲーシヨンは１晩15℃で実施した。リゲーシヨンはア
ガロースゲル電気泳動により検査した。MP4−Ｇ DNAの
挿入をもつリゲートされたフアージDNAは、市販のパツ
ケージングエクストラクト（プロメガ・バイオテク社
製、マジソン、ウイスコンシン州）を用いて、試験管内
でフアージの殻に包み込ませた。パツケージングされた
フアージを、大腸菌C600細胞を用いて、平板あたり約60
00プラークの密度で0.7％アガロースのNZY寒天の10cm×
10cm角形平板に塗布した。37℃で１晩インキユベーシヨ
ン後、プラーグが形成された。次いで、平板を恒温器か
ら取り出し、４℃で少なくとも１時間冷却された。寒天
平板をフアージを濾紙に移すために30分間ニトロセルロ
ース濾紙におしつけた。そして、先に述べたようにフア
ージDNAが濾紙に固定された。各濾紙は40時間42℃で、
マニアテイス（1982年）が述べている手法を用いて、ニ
ツクトランスレーシヨンされたpMON9531クローンから単
離された330bpのcDNA挿入部分と濾紙あたり約1.0×10⁶c
pmでハイブリダイズした。プローブの比活性はDNA1μｇ
あたり２から３×10⁸cpmであつた。ハイブリダイゼーシ
ヨンは、50％ホルムアミド、５倍のSSC、５倍のデンハ
ルト溶液、200μg/ml tRNA及び0.1％SDSを含む溶液中で
おこなつた。濾紙を50℃で、１倍のSSC、0.2％SDS中で
洗浄し、オートラジオグラフにかけた、数個の陽性信号
が観察され、相当する平板上のプラークと一致した。選
択されたプラークはつり上げられ、SM緩衝液に懸濁さ
せ、NYZ寒天上に塗布した。レプリカ平板スクリーニン
グ工程は、平板上の全てのプラークが陽性信号を示すま
で、低密度で繰り返された。１個のプラークをさらに解
析するために選択し、λF7フアージクローンと命名し
た。

H.pMON9543及びpMON9556の創出 λF7DNAをBamH I、Bgl II、EcoR I及びHind IIIで
（別々に）消化した。DNAをサザン・ブロツト法を用い
て、pMON9531のニツクトランスレーシヨンされたEPSPS
配列とハイブリダイズした。これからλF7の相補配列は
4.8kbのBgl II断片上にあることが判明した。この断片
をプラスミドpUC9（ヴイーラ、1982年）に挿入、複製、
ニツクトランスレーシヨンさせ、実施例1.Gに述べられ
ているようなハイブリダイゼーシヨンの条件下で、濾紙
あたり10⁶cpmを用いて、ペチユニアのcDNAライブラリー
のスクリーニングに使用した。λF7配列に結合した配列
をもつcDNAクローンを確認し、pMON9543と命名した。

DNA配列解析（マキサム、1977年）から、pMON9543はE
PSPS遺伝子の終止コドン又は３′非翻訳領域を含まない
ことが判明した。それ故、EPSPS配列をpMON9543からは
ずし、ニツクトランスレーシヨンし、再度cDNAライブラ
リーを検索するためのプローブとして使用した。EPSPS
配列とハイブリダイズしたクローンを確認しpMON9556と
命名した。DNA配列解析から、このクローンの挿入はポ
リアデニル化された尾部を含むEPSPS遺伝子の完全な
３′領域を含むことが判明した。この挿入の５′EcoR I
端は、pMON9531のEPSPS挿入の３′EcoR I端と一致し
た。完全にEPSPS解読配列をpMON9531とpMON9556のEPSPS
挿入をリゲートすることにより創出した。

I.GaMV35S/EPSPS遺伝子をもつpMON546ベクターの創出 pMON9531の中のEPSPS挿入部を、EPSPS遺伝子の５′非
翻訳領域にBgl II部位を作製するために、M13ベクター
（メツシング、1981年及び1982年）を用いて、部位特異
的突然変異誘発（ツオラー等、1983年）により修飾させ
た。修飾されたEPSPS配列はEcoR I及びBgl II消化によ
り分離され、植物形質転換ベクターpMON530に挿入さ
れ、その結果、第１図に示したようなpMON536が得られ
た。35S−NOSカセツトをもつpMON505の誘導体pMON530
が、pMON526へpMON316の2.3kbのStu I−Hind III断片を
移すことにより創出された。プラスミドpMON316（第４
図参照）は、５′リーダー及びNOSポリアデニレーシヨ
ン信号の間に、制限エンドヌクレアーゼBgl II、Cla
I、Kpn I、Xho I及びEcoR Iの単一の切断部位をもつ共
統合型中間ベクターである。これらの切断部位は、CaMV
35S転写リーダー配列にすぐ隣接するそれ自身の翻訳開
始信号をもつ解読配列の挿入を保証する。316プラスミ
ドは、形質転換された植物組織の選択のためのキメラの
カナマイシン遺伝子（NOS/NPT II/NOS）及び子孫におけ
る形質転換体及び遺伝的形質を簡単に区別するためのノ
パリン・シンターゼ遺伝子同様、大腸菌及びアグロバク
テリウム・テユメフアシエンスの選択のためのスペクチ
ノマイシン耐性を含むpMON200の全ての性質を保持して
いる。プラスミドpMON526は、Sma I部位がXma Iによる
消化、クレノウ・ポリメラーゼ処理及びリゲーシヨンに
より除去された単純なpMON505の誘導体である。得らた
れプラスミドpMON530（第１図）は、pMON505の性質を保
持しており、35S−NOS発現カセツトは、プロモーター及
びポリアデニレーシヨン信号の間にSma Iの唯一の切断
部位を含む。pMON9556由来の1.62kbのEcoR I−EcoR I断
片は、pMON546を得るために、pMON536に挿入された。pM
ON530がすでにBgl II部に隣接してカリフラワー・モザ
イク・ウイルス（CaMV）の35Sプロモーターを含んでい
たので、これは、pMON546の中にキメラのCaMV/EPSPS遺
伝子を創出した。

第１図に示されたように、プラスミドpMON546は
（１）CaMV35S/EPSPS遺伝子（２）カナマイシン耐性（K
an^R）の選択マーカー遺伝子 （３）計測可能マーカー
としてのノパリン・シンターゼ（MOS）遺伝子及び
（４）アグロバクテリウム・テユメフアシエンスによ
り、効果的に全プラスミドが「転移DNA」（Ｔ−DNA）領
域として処理されるようにＴ−DNAの右側の境界を含ん
でいた。このプラスミドを、補助プラスミドpGV3111SE
を含むアグロバクテリウム・テユメフアシエンス細胞に
挿入した。補助プラスミドは、pMON546DNAが植物細胞染
色体に挿入されるのに必要なある種の酵素を暗号化す
る。それは又、細菌で機能するカナマイシン耐性遺伝子
を含む。

pMON546及びpGV3111−SEを含むアグロバクテリウム・
テユメフアシエンスの培養はアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨン（ATCC）に寄託され、その寄託信
号はATCC第53213号である。必要に応じて、これらのプ
ラスミドのどちらか一方は標準的方法論を用いて細胞の
培養から分離される。例えば、これらの細胞をpRK2013
（デイツタ、1980年）のような流動プラスミドをもつ大
腸菌で培養する。Spc/str^R、kan^Sになつた細胞はpMON54
6を含み、一方、kan^R、spc/str^Sになつた細胞はpGV3111
−SEを含む。

実施例2:GLY^Rペチユニア細胞 直径6mm（1/4インチ）の葉デイスクを表面を滅菌した
ペチユニアの葉から切り取つた。それらを、２日間MS10
4寒天培地上で、傷ついた表面のところでの部分的な細
胞壁形成を促進するために培養した。その後、葉デイス
クを予じめルリア・ブロース中28℃でゆるやかに１晩振
盪培養しておいたpMON546及びpGV3111−SEの両者を含む
アグロバクテリウム・テユメフアシエンス細胞の培養液
の中に浸漬した。細胞を細菌懸濁液から除去し、吸い取
り紙を用いて乾燥し、ホルシユ（1981年）により述べら
れているように、タバコ細胞の「育成」培養培地上に置
かれた濾紙の上に逆さまにしてインキユベートされた。
２ないし３日後に、デイスクを500μg/mlカルベニシリ
ン及び０、0.1、0.25、又は0.5mMグリホセート（ナトリ
ウム塩）を含み、育成培養を含まないMS培地のペトリ皿
に移した。

対照組織は、補助プラスミドpGV3111−SE及びNOS/NPT
II/NOSカナマイシン耐性遺伝子及びpMON546と同じNOS選
択マーカー遺伝子をもつがCaMV/EPSPS遺伝子をもたない
Ｔ−DNA領域を含む別の植物形質転換ベクターpMON505を
含むアグロバクテリウム・テユメフアシエンス細胞を用
いて作製した。

グリホセートを含む培地に移行して10日以内に、活発
に生育するカルス組織がグリホセートを含まない対照平
板上の全てのデイスクの周辺で出現した。0.1mMグリホ
セートを含む培地で、対称デイスクと形質転換組織の間
に検出できる違いはほとんどなかつた。0.25mMグリホセ
ートでは、対照デイスクからのカルスの生育は殆んどな
かつた。一方、形質転換組織の実質的生育が見られた。
0.5mMグリホセートで、対照デイスクからのカルスの生
育は全くなく、一方、かなりの数のカルスが形質転換デ
イスクから生育した。このことによりCaMV/EPSPS遺伝子
が形質転換細胞にグリホセート耐性を賦与したことが確
認できる。

実施例3:Gly^Rタバコ細胞 葉デイスクをタバコ植物（ニコチアナ・タバカム）か
ら切り出し、上述のようにpMON546（又は対照細胞ではp
MON505）及び補助プラスミドpGV3111−SEをもつアグロ
バクテリウム・テユメフアシエンス細胞で処理した。遺
伝子を含まない細胞は検出できるカルス組織をつくらな
かつたのに対して、CaMV/EPSPS遺伝子で形質転換された
細胞は0.5mMグリホセートで、かなりの量のカルス組織
をつくつた。

実施例4:Gly^R大豆細胞 滅菌した大豆の１種、グリシン・カネセンスの胚軸切
片を実施例２に述べられているように、キメラのEPSPS
遺伝子を含むアグロバクテリウム・テユメフアシエンス
で感染させた。通常のレベルの10％のMS塩（ギブコ）の
培地、B5ビタミン、3g/シヨ糖、2mg/ナフタリン酢
酸、1mg/ベンジルアデニン及び0.5mMアルギニンを含
む育成培養平板を調製した。pHはオートクレーヴ前に5.
7に調整した。

感染された大豆胚軸を26℃で２日間インキユベート
し、（MS塩が希釈されていないことを除いて）類似の培
地にさらに500mg/カルベニシリン、100mg/セフオタ
キシム及び100mg/カナマイシンを含んでいるものに移
しかえた。これらの条件下では、形質転換された大豆カ
ルスのみが生育できた。

対照組織は、補助TiプラスミドpTiT37−SE及び植物形
質転換ベクターpMON200をもつアグロバクテリウム・テ
ユメフアシエンス細胞を用いて産出した。（フレーリー
等、バイオテクノロジー第３巻（1985年）参照）。本明
細書記載の如く共統合のpTiT37−SEは、NOS/NPTII/NOS
カナマイシン耐性遺伝子及びpMON200と同一のNOS計測可
能マーカー遺伝子を有するが、CaMV35S/EPSPS/NOS遺伝
子を有しないＴ−DNA領域を含んでいた。

この武装解除されたノパリン型Tiプラスミドは、フレ
ーリー等（1985年）により述べられているのと類似の方
法でpTiT37からpTiB6S3−SE武装解除オクトパイン型Ti
プラスミドを創出するために創出した。一般的手法は、
pMON200及びその誘導体との組換えのための相同領域を
提供するために、pTiT37T−DNAのほとんどをpMON200の
選択マーカー及びpBR322とLIH部分で置き換えることで
ある。この置換は植物ホルモン生合成遺伝子、ノパリン
・シンターゼ遺伝子及びＴ−DNAの右の境界を含むＴ−D
NAの右側約80％の欠失を招来する。

pTiT37配列の材料は、デフラモンド等（バイオ／テク
ノロジー第１巻:262ページ、1983年）により述べられた
プラスミドMINI−Tiを用いた。このプラスミドは便利な
材料である、しかしながら、これらの同様のTiプラスミ
ド部分は直接的にpTiT37又は関連するpTiC58プラスミド
から、あるいは、ヘツプバーン等（ジヤーナル・オブ・
モレキユラー・アンド・アプライド・ジエネテイクス第
２巻:211から224ページ、1983年）又はツアーム等（モ
レキユラー・アンド・ジエネラル・ジエネテイクス第19
4巻:188から194ページ、1984年）により述べられている
ような他の方法で分離されたこれらのプラスミドのサブ
クローンから得られた。

プラスミドMINI−Tiは、pTiC58Kpn I断片13.3、及び1
2（デピツカー等、プラスミド第３巻:193から211ペー
ジ、1980年）に類似のpTiT37Kpn I断片13b、４及び11
（デフラモンド等、1983年）をもつpBR325の誘導体であ
る。植物ホルモン生合成遺伝子及び右境界を含む内部Ｔ
−DNA配列をpMON284を産生するためにHind III消化及び
再リゲートによりmini−Tiから除去した。pMON284プラ
スミドはKpn I消化及びリンカーの中央部にBamH I部位
（５′−GGATCC）を含む次の合成リンカー： の挿入によりBamH I部位へ変換された唯一のKpn I部位
を含んでいる。このリンカーを含むプラスミドが分離さ
れpMON293と命名された。

pMON293プラスミドは、Tiプラスミド中に方向性に関
して逆向きに互いに隣接し、BamH Iリンカーにより連結
された次のpTiT37断片をもつている。第１は13b断片の
右端のKpn I部位である。この断片はpTiT37T−DNAの左
境界を含む。それから、BamH Iリンカーに連結された13
b断片の左端がくる。Kpn I11断片の右端がこれに連結さ
れている。この断片は、Ｔ−DNAの右に位置するTiプラ
スミドを含み、pTiC58のHind III2断片（デピツカー
等、1980年）の右端であるHind III部位で終わる。これ
はKpn I13b断片の右端でKpn I部位に又融合されているp
BR325誘導体プラスミドに連結されている。

pTiT37部分の間に、pMON200及びアグロバクテリウム
・テユメフアシエンスに対するカナマイシン耐性選択マ
ーカーとの相同性を導入するために、プラスミドpMON29
2を構築した。プラスミドpMON292は、pTiA6のオクトパ
イン型Ｔ−DNAの1.7kbのBgl II（ヌクレオチド1617番）
からHind III（ヌクレオチド3390番バーカー等、プラン
ト・モレキユラー・バイオロジー、第２巻:335ページ、
1983年）の断片に連結された2.6kbのpBR322のPvu IIか
らHind IIIの断片から成るpMON113の誘導体である。LIH
と呼ばれるこの部分は、以前にフレーリー等（1985年）
により述べられている。Bgl II部位がpBR322部分と連結
する前にクレノウ・ポリメラーゼで処理されることにり
平滑末端にされた。

プラスミドpMON113を、Hind IIIで切断、クレノウ・
ポリメラーゼで処理し、合成BamH Iリンカーに連結し、
BamH Iで消化しそして再度クレノウ・ポリメラーゼで処
理したTn903（岡等、ジヤーナル・オブ・モレキユラー
・バイオロジー、第147巻、217ページ（1981年）（60
1））の1.2kb Ava II断片に連結した。LIH部分に隣接し
てTn903のカナマイシン耐性決定因子をもつ得られたプ
ラスミドはpMON292と命名された。

pMON200相同領域及び細菌カナマイシン耐性マーカー
を、pTiT37部分の間に、Hind III切断、クレノウポリメ
ラーゼ処理及びBamH I切断の後に分離されたpMON293由
来の45kbの断片と、2.5kb Pvu II−BamH I断片の２個
の断片とHinc IIで切断することにより線状化されたpMO
N292を混合することにより挿入した。得られたプラスミ
ドpMON313は次の断片をこの順序でもつ。まず、BamH I
リンカー及びそれに続くpTiT37Kpn I断片11の右側由来
の4.5kb Kpn I−Hind III断片。これはpBR322の750bp
Hinc II−Hind III断片とそれに続くカナマイシン耐
性を暗号化する1.2kbのTn903部分に連結される。これ
に、LIH（Hind III−Bg III断片）及び複製開始点をも
つpBR322のPvu II−Hinc II断片が続く。次に、Ｔ−DNA
の左境界を含むpTiT37Kpn I13b断片の左端からの2.5kb
のPvu II−Kpn I断片がある。最後に、これが、最初のB
amH Iリンカーに連結している。

このDNAをアグロバクテリウムに導入するために、pMO
N313をBamH Iで切断し、Bgl IIで切断しDNAリガーゼで
処理したpRK290DNAと混合した。pMON313プラスミドをも
つpRK290の誘導体を分離し、pMON318と命名した。

プラスミドpMON318を、ヘルパー（補助）としてpRK20
13を用いた標準的な細菌の接合方法により、pTiT37及び
染色体のクロラムフエニコール耐性をもつアグロバクテ
リウム・テユメフアシエンスA208株に導入した。この方
法及びそれに続くＴ−DNAをpMON318に運搬される操作さ
れたＴ−DNA断片で置換するための選抜は、武装解除さ
れたオクトパイン型pTiB6S3−SEプラスミドの選抜のた
めフレーリー等（1985年）により述べられているように
正確であつた。

得られた武装解除されたpTiT37SEプラスミドは、vir
領域を完全に含み、Ｔ−DNAの左境界及びＴ−DNAの約1k
bを保持している。Ｔ−DNAとこの領域は、転写物を暗号
化することが報告されていなかつた（ジヨース等、セ
ル、第32巻:1057から1067ページ、1983年）。これに、p
BR322断片、LIH次いでTn903カナマイシン耐性が続く。T
n903断片は、pTiC58Hind III2断片（デピツカー等、198
0年）のpTiT37類似体の左端に連結されるpBR322の750bp
断片に連結される。この断片はpTiT37T−DNAの右端の外
側に位置している。この結果は、根頭癌腫病産生に関す
る植物ホルモン生合成遺伝子を含むＴ−DNAの90％以上
及び右境界がpTiT37−SEプラスミドから欠如しているこ
とを示している。

pTiT37−SEプラスミドは、25μg/mlクロラムフエニコ
ールでの生育で選抜されたA208株の誘導株に運搬されて
居り、武装解除されたプラスミドをもつこの株は、A208
−SE又はASEと呼ばれる。A208−SE株は、3111−SE株と
全く同じ様式（フレーリー等、1985年）で３者接合法の
pMON200中間体ベクターの受容体として使用される。こ
れから、左から右へ、次のものから成る共統合型のハイ
ブリツドＴ−DNAが得られる:pTiT37左境界及び境界の内
側の約1kbの以下の配列、pBR322Hinc II−Pvu II断片、
pTiA6 Bgl II−Hind III LIH領域、pMON200合成多重リ
ンカー、植物中での選択のためのNOS/NPTII/NOSカナマ
イシン耐性遺伝子、Tn7スペクチノマイシン／ストレプ
トマイシン耐性決定部位、植物細胞に対する計測可能な
マーカーとしてのノパリン・シンターゼ遺伝子、pTiT37
T−DNAの右境界。今述べた２つの境界配列の間のDNA及
びpMON200及び誘導体の類似領域に挿入された他のDNA
が、形質転換法により植物細胞に移された。

14から17日後、ベクターだけ（pMON200プラスミド）
又はキメラのEPSPS遺伝子を含むベクターで形質転換さ
れた大豆カルスがMS培地及び0.05mMあるいは1.0mMグリ
ホセートを含むペトリ皿に移された。

グリホセートを含む培地に移行後18から20日以内に、
活発に生育するカルス組織がグリホセートを含まない全
ての皿に出現した。0.5mMグリホセートを含む培地で、
対称カルス、即ちpMON200ベクターのみを含むカルスの
皿では殆んど生育はなかつたが、一方、第１図に述べら
れているキメラのEPSPS遺伝子を含むいくつかのカルス
コロニーが明確な生育を示した。1.0mMグリホセート
で、対照組織のカルス生育は全くなく、一方、キメラEP
SPS遺伝子を含む形質転換細胞の生育が若干認められ
た。このことは、CaMV35S/EPSPS/NOS遺伝子が大豆細胞
にグリホセート耐性を賦与することを確実なものとす
る。

実施例5:Gly^R棉細胞 pMON546に似た植物形質転換ベクターを、棉から得たC
TP/EPSPS解読配列を用いて実施例１に概略した一般方法
に従い調製する。棉の種子（カルチベーター デルター
パイン50）を次亜塩素酸ナトリウムを用いて表面滅菌
し、暗黒下で、基本的培地上で試験管内で発芽させる。
２週間後、胚軸及び子葉を切片に分け、上述の形質転換
ベクター及び補助プラスミドpGV3111を含むアグロバク
テリウム・テユメフアシエンスの腫瘍株を接種する。MS
基本培地での共培養の３日後、組織片は細菌を殺すため
に、500mg/カルベニシリンを含む同一培地に移す。２
から４週間後、腫瘍組織を0.5mMグリホセートを含む同
一培地に移す。

対照組織は、補助プラスミドpGV3111及びpMON200を含
む腫瘍性アグロバクテリウム・テユメフアシエンス細胞
を用いてつくられた。上述形質転換ベクターで形質転換
された組織は、継続的生育によりグリホセート耐性を示
し、一方、pMON200で形質転換した組織（対照）及び非
形質転換組織の生育は阻害される。

実施例6:Gly^Rナタネ種子細胞 pMON546に類似した植物形質転換ベクターをブラシカ
・ナプスのようなナタネ植物から得たCTP/EPSPS解読配
列を用いて、実施例１に概略された方法に従い調製す
る。（実施例17参照）。

ブラシカ・ナプス植物の４個の頂節（グロスチヤンバ
中で土壌を用い生育された）を次亜塩素酸ナトリウムで
表面殺菌し、5mm角に切断する。それぞれの切片の上部
表面に、上述形質転換ベクター及び補助プラスミドpTiT
37−SEを含むアグロバクテリウム・テユメフアシエンス
の１晩培養液を接種し、２から３日間、1mg/ BAの1/
10MS培地を含む育成培養平板上でインキユベートする。
組織片を次いで1mg/BA、500mg/カルベニシリン及び
100mg/カナマイシンを含むMS培地に移しかえる。３か
ら６週間後、分化したキメラ遺伝子を有する芽からの葉
組織を耐性試験のためカナマイシンにかわり0.5mMグリ
ホセートを用いたこと以外は同一の培地へ移す。

対照組織は、補助プラスミドpTiT37−SE及びベクター
pMON200をもつアグロバクテリウム・テユメフアシエン
ス細胞を用いて調製する。EPSPSを発現するキメラ遺伝
子を有する組織は、グリホセート存在下で生育できる
が、一方、形質転換及び非形質転換の対照は阻害され
る。

実施例7:Gly^R亜麻細胞 pMON546類似の植物形質転換ベクターが亜麻から得ら
れたCTP/EPSPS解読配列を用いて実施例１及び14から17
に概略されている方法に従い調製する。

亜麻の種子が70％エタノール、25％クロロツクスで表
面殺菌し、滅菌蒸留水で洗浄する。種子を固形MS培地上
に置き、５から７日間光のもとで発芽させる。胚軸を無
菌的に切除し、上述の形質転換ベクター及び補助プラス
ミドpTiB6S3−SE又はpTiT37−SEをもつアグロバクテリ
ウム・テユメフアシエンス細胞を接種し、２日間、1mg/
ベンジルアミノプリン、0.02mg/ナフタリン酢酸及
び４％シヨ糖を含むMS培地で共培養する。次いで胚軸を
400mg/カナマイシン及び500mg/カルベニシリンを補
給したMS培地上に置く。２週間後、形質転換されたカル
ス及び芽の選択が明白となる。もとの組織片は、褐変し
始め、最初に芽を形成した非形質転換体は白色化する。
選択されたカルス及び芽は緑色でオパイン陽性である。

対照組織は、補助プラスミドpTiB6S3−SE又はpTiT37
−SE及びベクターpMON200をもつアグロバクテリウム・
テユメフアシエンス細胞を用いて調製される。上述EPSP
Sベクターで形質転換された選択されたカルスは、5.0及
び20.0mMの間の濃度でのグリホセートに耐性を示す。こ
れらのグリホセートレベルでは、対照組織は退色し死滅
する。

実施例8:大腸菌の突然変異EPSPS遺伝子の単離 大腸菌ITCC11303株の細胞を培地Ａに移し、37℃でイ
ンキユベートした。

培地 Ａ 10倍MOPS培地 50ml 50％ブドウ糖溶液 2ml 100mMアミノメチルホスフオネート 2ml チアミン（5mg/ml）pH7.4 1ml 100mMグリホセート（ナトリウム塩） 2ml 脱イオン水で500mlとする 10倍MOPS培地 500ml当り 1M MOPS（209.3g/、pH7.4 200ml 1Mトリシン/89.6g/、pH7.4） 20ml 0.01M FeSO₄、7H₂O（278.01mg/100ml） 5ml 1.9M NH₄Cl（50.18g/500ml） 25ml .276M K₂SO₄（4.81g/100ml） 5ml 0.5mMCaCl₂、2H₂O（7.35mg/100ml） 5ml 0.528M MgCl₂（10.73g/100ml） 5ml 5M NaCl（292.2g/） 50ml 0.5％Ｌ−メチオニン（500mg/100ml） 5ml マイクロニユートリエント ５μ ＊マイクロニユートリエント 25mlH₂O ZnSO₄（2.88mg/ml） 25μ MnCl₂（1.58mg/ml） 250μ CuSO₄（1.6mg/ml） 25μ CoCl₂（7.14mg/ml） 25μ H₃BO₃（2.47mg/ml） 250μ NH₄MO₇O₂₄（3.71mg/ml） 25μ １週間後、生育培地中高濃度のグリホセート（10mM又
はそれ以上）の存在下で急速に生育できる培養が得られ
た。この培養の抽出液のEPSPS活性の解析及び大腸菌野
生型のものとのグリホセート感受性の比較から、突然変
異株が変異EPSPSをもつことが明らかとなつた。突然変
異細胞のEPSPSのグリホセート感受性は、野生型のもの
とはかなり異なつていた。この突然変異細胞は大腸菌11
303 SM−１と命名された。この突然変異細菌のEPSPSを
暗号化するaroA遺伝子が次のように分離された。

大腸菌11303 SM−１のEPSPSを暗号化するaroA遺伝子
の単離：この細胞のDNAを分離した（J.マーマー（1961
年）、ジヤーナル・オブ・モレキユラー、バイオロジー
第３巻:208から218ページ）。プローブとして大腸菌Ｋ
−12 aroA遺伝子を用いたサザン・ハイブリダイゼーシ
ヨン（ロジヤース等、1983年）は、突然変異細菌のaroA
遺伝子が3.5kbのBgl II−Hind III断片上にあることを
確定した。この断片はベクターpKC7（R.N.ラオとS.G.ロ
ジヤース（1979年）、ジーン、F.7−９−82）にクロー
ン化され、得られたプラスミドが大腸菌の形質転換に使
用された。形質転換コロニーは、これらの条件で生育す
る能力により検索され、大腸菌Ｋ−12aroA遺伝子とハイ
ブリダイゼーシヨンすることにより、3.5kbのBgl II−H
ind III挿入を含むことが示された。このクローンはpMO
N9538と命名された。突然変異細菌のaroA遺伝子の86％
以上を含むこの挿入のNde I−EcoR I断片が、大腸菌Ｋ
−12及び11303 SM−１の大腸菌Ｋ−12 aroA解読配列
をもつハイブリツドEPSPS解読配列を生じる発現ベクタ
ー（pMON6012、以下に述べるpMON6001の誘導体）にクロ
ーン化された。このクローンは、pMON9540と命名され
た。このハイブリツドaroA遺伝子により産生されるEPSP
Sは、グリホセート耐性を保持しており、11303 SM−１
のEPSPSにグリホセート耐性を賦与する突然変異はアミ
ノ酸53から427の中に位置することを示唆していた。大
腸菌変異EPSPS遺伝子は、次の様式で、クロロプラスト
移行ペプチドをもつ：あるいはもたない植物形質転換ベ
クターに取り込まれた。

プラスミドpMON6001は、合成のフアージラムダ（λ）
のpLプロモーターの２個の１列に並んだコピーから発現
される大腸菌K12EPSPS解読配列をもつpBR327（ソベロン
等、1980年）の誘導体である。プラスミドpMON6001は以
下の様に構築された。まず、pMON4（ロジヤース等、198
3年）がCla Iで消化され、2.5kb断片がやはりCla Iで切
断されたpBR327に挿入された。得られたプラスミドpMON
8は、pBR327のβ−ラクタマーゼと同方向に読まれるEPS
PS解読配列を含む。

大腸菌EPSPS解読配列に隣接して存在する唯一の制限
エンドヌクレアーゼ部位をもつpMON8の誘導体、pMON25
を構築するため、次の工程が取られた。pMON4の欠失誘
導体がBstE II切断及び再連結によりつくられた。得ら
れたプラスミドpMON7は、pMON4の2kbのBstE II断片が欠
落している。次に、EPSPS読み取り枠の５′端を暗号化
する150bpのHinf I−Nde I断片が、pMON7のNde I及びHi
nf Iによる消化及び、アクリルアミドゲルでの電気泳動
分離につづく電気的溶出の後に分離された。この切片
は、EPSPS解読配列の３′部分及び次の配列 ５′−GATCCAGATCTGTTGTAAGGAGTCTAGACCATGG GTCTAGACAACATTCCTCAGATCTGGTACCTTA をもつ合成リンカーを含むpMON8の精製された4.5kbのBa
mH I−Nde I断片に付加された。得られたプラスミドpMO
N25は、合成リボソーム結合部位の唯一のBamH I及びBgl
II部位及び解読配列のATG翻訳開始信号を含む唯一のXb
a IおよびNco I部位に続くEPSPS解読配列を含む。

pMON6601を構築するために、pMON25がBamH Iで消化さ
れ、BamH I平滑端を含む部分的なフアージラムダのpL配
列をもつ合成DNA断片（アダムスとギヤルピ、1986年）
と混合された： ５′−GATCCTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGA
TACTGAGCACATCG GATAGAGACCGCCACAACTGTATTTATGGTGACCGCCACTATGACTCGTG
TAGCCTAG 得られたプラスミドpMON6001は、EPSPS解読配列の転
写を促進するように正確な方向性でpMON25のBamH I部位
に、順方向の繰り返しとして２コピーの合成フアージラ
ムダpLプロモーター断片をもつている。大腸菌Ｋ−12
aroA遺伝子を含むpMON6001のBgl II−Hind III断片がpE
MBU8＋ベクターに挿入され、EcoR I部位が部位特定突然
変異誘発により、アミノ酸27番に挿入された。新しいEc
oR I部位をもつこのクローンはpMON6530と呼ばれた。pM
ON6530の（新しいEcoR I部位を含む）Nde I−Bgl II断
片は、pMON6531をつくるために、Nde I−Bel II消化のp
MON9540に挿入された。

プラスミドpMON6012は、pMON6001のEcoR Iによる切
断、大腸菌DNAポリメラーゼの大クレノウ断片での処理
及び連結により作製されたpMON6001の単純な誘導体であ
る。これからEcoR I切断部位を含まないpMON6010が生じ
た。プラスミドpMON6012がpMON6010のPvu II消化及び合
成EcoR Iリンカー:5′−CCGGAATTCCGGGGCCTTAAGGCC のEPSPS解読配列の端近くの唯一のPvu II部位への挿入
により創出された。

pMON9531の330bpのEcoR I断片がM13mp9にクローン化
され新しいプラスミドM8017が作製された。クロロプラ
スミド移行ペプチドのリーダー配列の５′にBgl II部位
を導入するために、変異誘発プライマー５′−CCATTCTT
GAAAGATCTAAAGATTGAGGAを用いて、部位特異的突然変異
誘発がおこなわれた。得られた変異誘発クローンはM13
M8020と呼ばれる。Bal II−EcoR I断片がBgl II−Eco
R I消化のpMON530にクローン化され、pMON536が創出さ
れた。pMON530は、pMON316の2.3kbのStu I−Hind II断
片をpMON526へ移すことにより創出された35S−NOSカセ
ツトをもつpMON505の誘導体（ホルシユとクリー、1985
年）である。プラスミドpMON526は、Sma I部位がXma I
消化、クレノウポリメラーゼ処理及びリゲーシヨンによ
り削除されたpMON505の単純な誘導体である。得られた
プラスミド、pMON530（第１図）は、pMON505の性質を保
持しており、35S−NOS発現カセツトは、プロモーター及
びポリアデニレーシヨン信号の間にSma Iの唯一の切断
部位を含む。pMON6031のaroA遺伝子を含むEcoR I断片が
pMON536のEcoR I部位にクーロン化されpMON542が創出さ
れた。

CTPなしでハイブリツドのK12−SM1 EPSPSを暗号化す
るpMOS9540のBgl II−EcoR I断片がpMON530のBgl IIとE
coR I部位にクローン化され、pMON8078が創出された。

実施例３で述べたように、pMON542（CTPをもつ構築
物）を用いたタバコ細胞の形質転換はグリホセート耐性
をもたらした。逆に、pMON8078（CTPをもたない構築
物）でのタバコの形質転換はグリホセート耐性を賦与し
なかつた。

実施例9:Gly^Rジヤガイモ細胞 ジヤガイモ−ウイルスのいないラセツト・バーバンク
の芽の先端部をMS塩、0.17g/リン酸１ナトリウム0.4m
g/チアミン塩酸塩、0.1g/イノシトール、３％シヨ
糖、1.5g/ゲルライト^TM（ケルコンCo）pH5.6の培地で
継代培養する。培養物は16時間の光周期で24℃で生育さ
せる。芽は継代培養後約３ないし４週間で使用する。茎
節間を約8mmの長さに切り取り、縦にわり、そして切断
表面に、LB寒天平板上で数日間生育された２元ベクター
pMON542及び補助プラスミドpTiT37−SEをもつアグロバ
クテリウムを塗布する。茎切片を、MS塩、MS有機物、３
％シヨ糖、2.25mg/ BA、0.1186mg/ NAA、10mg/
GA、1.5g/ゲルライトpH5.6の培地の表面に切断面を
下にして置く。４日後、茎の組織片をカルベニシリン50
0mg/及び選択試薬として０又は300mg/カナマイシン
を含む同一培地に移す。接種後２週間で、組織片はNAA
なしの同一組成の培地上に移される。300mg/カナマイ
シンは、組織を殺すことなしに感染組織片の腫張及びカ
ルス形成を妨げるのに充分であつた。形質転換組織は、
通常組織片の末端に関してわずかな生長としてあらわれ
る。形質転換組織はグリホセートに対して実質的な耐性
を示す。

実施例10:Gly^Rヒマワリ細胞 形質転換されたヒマワリの組織及び芽を得るために以
下の方法が使用される。滅菌したヒマワリの苗を腫瘍で
刺激する。ヒマワリの種子は40％クロロツクスで表面を
滅菌し、蒸留水で洗浄する。種子を135塩、0.5％シヨ糖
及び0.8％寒天を含む寒天培地上で培養する。７日令の
苗にpTiB6S3−SEをもつアグロバクテリウム株の１晩培
養液が、シリンジで茎に傷をつけたり刺したりすること
により又は傷に細菌を導入するために別のシリンジを用
いることにより接種される。腫瘍が２から３週間で形成
される。腫瘍が苗から削除され、ホルモンなしのMS培地
上で別に生育される。形質転換されたカルス及び芽が
又、異なる方法に従つて得られる。種子の表面が滅菌さ
れ、上記の生育培地上に置かれる。発芽は光のもとで10
日間おこなわれる。２から3mmの胚軸の断片が切り取ら
れて、操作された構築物を含むアグロバクテリウム株が
接種された。胚軸は、MS塩とビタミン、5g/ KNO₃、1
00mg/イノシトール、40mg/アデニン硫酸塩、500mg/
カザミノ酸、1mg/ NAA、1mg/ BA、0.1mg/ G
A3、30mg/シヨ糖及び8g/寒天を含む培地で２日間共
培養される。共培養の後、胚軸は、300mg/カナマイシ
ン及び500mg/カルベニシリンを含む同一培地に置かれ
る。２週間後、カナマイシン耐性遺伝子を含む株を接種
された胚軸は、カルスを産生し、カナマイシンを含む培
地で再生するが、一方、他の胚軸はそうではない。

２元ベクターpMON546及び補助プラスミドpTiB6S3−SE
をもつアグロバクテリウム・テユメフアシエンスが、腫
瘍及びカルスを産生するのに使用され、植物が再生され
る。腫瘍は、グリホセート耐性遺伝子を含まない対照の
腫瘍を退色死滅させる濃度で、グリホセートに対し耐性
を示す。非腫瘍性カルスは同様にグリホセート耐性遺伝
子をもたないカルスを殺すグリホセートのレベルに対し
耐性を示す。形質転換されたヒマワリ植物は、野生型植
物を殺す濃度で噴霧されたグリホセートに耐性を示す。

実施例11:Gly^Rペチユニア植物 形質転換されたヘチユニア植物は、ホルシユ等（1985
年）により述べられた方法により、実施例２の形質転換
された葉デイスクからの再生により産生された。得られ
た形質転換植物は、既に述べられている野生型ペチユニ
アEPSPS遺伝子に融合されたCaMV35Sプロモーターを含む
pMON546ベクターを含んでいた。

４つの別々の代表的なトランスジエニツクの（ニキメ
ラ遺伝子を有する）苗が選択され生育されて、以下に述
べる試験方法で、４つの別の非形質転換（野生型）ペチ
ユニアの苗と共に試験された。

グロスチヤンバーの中で26℃、１日あたり12時間の光
照射で植物を生育培地中で生育させた。植物には可溶性
肥料が週ごとに施され、必要に応じて水が与えられた。
植物には、自動トラツク噴霧器を使用することにより、
均一で再現性のある到達速度で除草剤を噴霧した。

使用されたグリホセート溶液は、グリホセートイソプ
ロピルアミン塩としてイオン性界面活性剤と混合された
１エーカーあたりのグリホセート酸等価量のポンドとし
て測定された。

４つの別々の野生型（非形質転換）ペチユニア植物が
対照植物として使用するために選択された。pMON546を
含む、４つの個々の形質転換植物がホルシユ等（1985
年）が述べているようにカナマイシン耐性により選択さ
れた。

対照植物及び形質転換植物に、以下の表２にあげられ
ている添加レベルで、グリホセートのイソプロピルアミ
ン塩が噴霧された；得られた実験結果も又表２に要約さ
れている。

表２に示されたように、対照植物は、0.4ポンド／エ
ーカーのグリホセートが噴霧されたときに死滅した。対
照的に、形質転換されたペチユニアは、0.8ポンド／エ
ーカーを噴霧した後健康で生存していた。形質転換植物
は、非形質転換対照植物よりも高いグリホセート耐性で
ある。

実施例12:Gly^Rトマト 形質転換トマト、VF36種が以下に述べられているよう
に滅菌苗から産生される。

VF36トマトの滅菌苗を水寒天で生育する。胚軸及び子
葉を切り取り、２日間、B5ビタミン、30g/シヨ糖、1m
g/、ベンジルアデニン、及び0.1mg/インドール酢酸
を含むMS培地で培養する。その後、苗に実施例２に述べ
られているキメラのEPSPS遺伝子を含むアグロバクテリ
ウム・テユメフアシエンスのベクターが10⁷細菌/mlまで
希釈されたキメラのEPSPSシニターゼ遺伝子を含むアグ
ロバクテリウム・テユメフアシエンスの培養液に約30秒
間浸すことにより感染させる。組織片が苗から部分を切
ることにより得られる。組織片からは吸い取り紙で水分
をとり去りMS塩の標準濃度のほんの10％を含む培地を用
いて実施例２で述べているように培養する。共培養の２
日後、組織片を、100μg/mlカナマイシンを含む選択培
地に移す。形質転換トマト植物は組織片から生育する。
これらの植物の葉が、以下に述べられている葉カルス試
験を用いてグリホセート耐性の試験をされる。

ベクターだけ（pMON200）又はpMON546キメラEPSPS遺
伝子を含む植物のトマト葉断片が、上述の0.5mMグリホ
セートを含むカルス培地で培養される。10日後、対照の
葉は完全に阻害され、カルス生育の徴候は全く示されな
い；一方、キメラEPSPS遺伝子ベクターで形質転換され
た植物の葉はカルスを産生した。

実施例13:Gly^Rタバコ植物 形質転換タバコ植物（サムソン種）が、形質転換ペチ
ユニア葉デイスクを形質転換タバコ葉デイスクの代りに
用いて実施例４に述べられている方法により産生され生
育された。タバコ植物は、実施例５のトマト植物に対し
て述べられた方法を用いてグリホセート耐性について試
験された。ベクターだけ（pMON200）又はpMON546キメラ
EPSPS遺伝子を含むタバコ植物の葉の断片は0.5mMグリホ
セートを含むカルス培地で培養された。

10日後、対照のタバコの葉は完全に阻害され、カルス
生育の徴候を全く示さなかつた；一方、キメラのペチユ
ニアEPSPS遺伝子のキメラEPSPSで形質転換された植物の
葉は、タバコ植物にグリホセート耐性を賦与する。

実施例14:ペチユニアEDSPSゲノムクローンの単離 完全なペチユニアのEPSPS遺伝子を単離するために、
ペチユニアゲノムDNAのライブラリーが実施例１−Ｇに
述べられているように構築された。略述すればMP4−Ｇ
細胞の染色体DNAがライブラリーを創出するために、Bam
H Iで消化され、フアージベクター、λMG14にクローン
化された。実施例１−Ｇに述べられているように、pMON
9531 cDNAクローンに相補される4.8kbのBgl II断片を
含む１つのフアージクローンλL7が分離された。遺伝子
の残りを単離するため。ゲノムのライブラリーが再度、
pMON9556の1.6kbのcDNA挿入部分をプローブとして用い
ることにより検索された。ライブラリーのプレーテイン
グ及びハイブリダイゼーシヨンの方法は実施例１−Ｇに
述べられているようにおこなわれた。いくつかの陽性信
号が得られた。さらに解析することで、１つの単離物が
選択され、λF10フアージクローンと命名された。

λF10DNAは、BamH I、Bgl II、EcoR I及びHind IIIで
個々に消化された。DNAは、サザン・ブロツト法で、pMO
N9531及びpMON9556のニツクトランスレーシヨンされたE
PSPS配列とハイブリダイズされた。このことは、λF10
の相補配列が4.8kb、2.0kb及び3.8kbのBgl II断片上に
あることを示していた。これらの断片のDNA配列解析
は、これら３つの断片が一緒に、ペチユニアDNAの約9kb
にわたる完全な遺伝子を含み、７個のイントロンにより
隔てられていることを示している（第５図）。ゲノムの
クローン、λF10に含まれるEPSPS遺伝子のプロモーター
断片は、キメラEPSPScDNA又は、ゲノム配列を発現する
のに用いることができる。イントロンを含む断片は又、
mRNAレベルを増強させるために付加的キメラEPSPS遺伝
子を構築するのに用いられるかもしれない。

実施例15:アラビドプシス・タリアナのゲノムのクロー
ンの単離 アラビドプシス・タリアナのゲノムバンクは、大きさ
で分画された（15から20kb）Mbo I部分消化DNAをBamH I
切断したラムダEMBL3にクローン化することにより構築
された。このライブラリーのフアージの約10000のプラ
ークがニツクトランスレーシヨンされたペチユニアEPSP
Sプローブ（pMON9566）で検索された。強くハイブリダ
イズするプラークE1が精製された。EPSPSプローブのフ
アージDNA消化断片へのサザン・ブロツトは非常に強く
ハイブリダイズした２個の断片と一致した。これらの一
方は、1.0kbのHind III断片で、他方は、700bpのBamH I
断片であつた。これらの断片は両者ともpUC119にサブク
ローン化され、挿入部分のDNA配列が決定された。

配列のデータはフアージがアラビドプシスEPSPS遺伝
子を含むことを示した。酵素は、配列が得られた範囲で
ペチユニア酵素と高度に相同である。BamH I断片は、完
全な遺伝子をクローニングするのに適した制限エンドヌ
クレアーゼ断片を同定するために、フアージ及びアラビ
ドプシスゲノムのDNAに対してハイブリダイゼーシヨン
のプローブとして使用された。１つにまとめて完全なEP
SPS遺伝子を含む、6.0及び3.2kbの２個のBgl II断片がE
1フアージクローンから同定された。第５図にアラビド
プシスクローンの構成を要約しペチユニアEPSPS遺伝子
の構成との比較をしてある。

蛋白のアミノ末端を暗号化するDNAは、6.0kbのBgl II
断片の内側にある。正確な翻訳開始部位がペチユニア酵
素のアミノ酸配列とヌクレオチド配列から予想されるア
ミノ酸配列を比較することにより決定される。その後、
翻訳開始コドンのすぐ上流に唯一のEcoR I部位を導入す
るために部位特異的突然変異誘発が用いられる。完全な
遺伝子がそれからEcoR I断片として分離される。このEc
oR I断片は、発現ベクター、pMON530に挿入され、得ら
れたベクターは、植物でアラビドプシスのEPSPS酵素を
過剰発現するのに使用された。

実施例16:トマトEPSPcDNAクローンの単離 cDNAライブラリーがトマト（リコペルシクム・エクス
レンタムVF36種）の成熟めしべから分離されたRNAか
ら、ヒユーン等（DNAクローニング・テクニクス：プラ
クテイカル・アプローチ IRLプレス、D.グローバー編1
985年）及びグブラーとホフマン（ジーン、第25巻:263
から269ページ、1985年）の方法により構築された。ラ
イブラリーが大腸菌BNN102株にプレーテイングされ、濾
紙レプリカがつくられた。濾紙は、³²Pで標識されたpMO
N9563の1.9kbのBgl II/Cla I断片とハイブリダイズされ
た（フアインバーグとフオーゲルスタイン、アナリテイ
カル・バイオケミストリー第132巻:6から13ページ、198
3年）。ハイブリダイズしたプラークが分離され、EPSPS
cDNAの存在を確かめるためのと同一の方法により再検索
された。全長をもつトマトのEPSPScDNAは、cDNAクロー
ンの１つ（P1）の250及び1700bpの２個のEcoR I断片に
存在していた。250bp断片は、pUC119のEcoR I部位にク
ローン化され、pMON9596がつくられた。1700bp断片はpU
C19にクローン化されpMON9589がつくられた。pMON9596
の挿入部分は、突然変異誘発を容易にするために開始コ
ドン周辺の配列を決定するためアマシヤムから入手した
ジデオキシ・シーケンシング・キツトを用いてシーケン
スされた。pMON9596の翻訳開始コドンの13塩基上流のBg
l II部位が、クンケル（プロシーデイングス・オブ・ナ
シヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブUSA第8
2巻:488から492ページ、1985年）の方法により、化学的
に合成されたオリゴヌクレオチド:GCCATTTCTTGTGAAAAAG
ATCTTCAGTTTTTCを用いて操作された。得られたプラスミ
ドpMON9710の挿入部分が正確な変異を確かめるためにシ
ーケンスされた。pMON9710の70bpのBgl II/EcoR I断片
がBgl II及びEcoR Iで消化されたpMON316に挿入され、p
MON9720が作製された。pMON9589の1700bpのEcoR I断片
がpMON9720のEcoR I部位にEPSPS解読配列を再構成する
ために順方向で挿入され、その結果pMON9721が得られた
（第６図参照）。

このプラスミドは補助プラスミドpGV3111−SEをもつ
アグロバクテリウム・テユメフアシエンス細胞に挿入さ
れた。補助プラスミドは、pMON9721DNAを植物細胞染色
体に挿入させるのに必要なある酵素を暗号化している。
それは又、細菌で機能するカナマイシン耐性遺伝子を含
む。pMON9721を含むアグロバクテリウム・テユメフアシ
エンス細胞は実施例12で述べたように、グリホセート耐
性細胞及び植物を産生するために植物形質転換実験に使
用される。

実施例17:ブラシカ・ナプスcDNAクローンの単離 全RNAが以下のようにブラシカ・ナプス（ウエスター
変種）の花から分離された。花が液体窒素で凍結され
た。液体窒素を蒸発させた後、抽出緩衝液（１％Tris−
イソプロピルナフタレン硫酸、６％ｐ−アミノサリチル
酸、100mM Tris−HCl、pH7.6、50mM EGTA、pH7.5、10
0mM NaCl、１％SDS及び50mM ２−メルカプトエタノー
ル）中で花はホモジナイズされ、等量のフエノール／ク
ロロホルムの1:1混合液で抽出された。水層の核酸は、
エタノールで沈澱された。沈澱は水に溶解され、RNAが
最終濃度2Mの塩化リチウムで２度沈澱された。最終RNA
ペレツトは水に溶解され、RNAはエタノールで沈澱され
た。ポリARNAがオリゴdTセルロースクロマトグラフイに
より選択された。ポリARNAの収量は花1gあたり1.0μｇ
であつた。

ライブラリーがブラシカ・ナプスの花のポリARNAを用
いて構築され、用いられた方法は実施例16に述べられて
いる。ライブラリーの収量は、３μｇポリARNAあたり90
000プラークであつた。ライブラリーは、平板あたり500
0プラークの密度で平板にひろげられた。フアージDNAは
ニトロセルロースの濾紙に移された。濾紙は、35％ホル
ムアミド、５倍のSSC、300μg/ml＋RNA、0.1％SDS中、3
7℃で低厳重さでハイブリダイズされた。pMON9556の挿
入部分は、ニツクトランスレーシヨンにより³²Pで標識
され、２×10⁶cpm/mlでハイブリダイゼーシヨン溶液に
添加された。濾紙は、２倍のSSC中室温で２度それぞれ1
5分間そして37℃で30分間１度洗浄された。かなりのハ
イブリダイズ陽性のフアージが得られた。これらのフア
ージはつり上げられ、低プラーク密度で２度再検索され
た。ハイブリダイズ陽性フアージが選択され、全長をも
つブラシカ・ナプスのEOSPScDNAクローンを含むフアー
ジが、さらに解析され選ばれた。全長をもつブラシカ・
ナプスのEPSPScDNAクローンは修飾され、キメラのCaMV3
5S/ブラシカ・ナプスEPSPS遺伝子を作製するために植物
発現ベクターpMON530に挿入される。

実施例18:ペチユニアEPSPSのクロロプラスト取り込みは
CTP配列を必要とする ペチユニア・ハイブリダのEPSPSの全長cDNAクローン
は、実施例１に述べられているようにして得られた。こ
のcDNAクローンは、５′非翻訳リーダーの27ヌクレオチ
ド、72アミノ酸移行ペプチド＋成熟酵素の444アミノ酸
をコードする1.5kb及び完全な３′隣接配列の0.4kbを含
む。全長EPSPScDNAは、プラスミドpMON6140を与えるた
めにプラスミドpGEM1のBamH I/Sal I部位に、そして、p
MON6145を与えるためにpGEN2に2.1kbのBgl II−Sal I断
片としてクローン化された。EPSPS解読領域は、それぞ
れ、T7及びSP6プロモーターから５′から３′へ転写さ
れる。

全長EPSPScDNAを含むプラスミドDNA（pMON6140及びpM
ON6145）は、３′非翻訳領域に存在する唯一のPvu I部
位で線状化された。線状化されたプラスミドDNAは本質
的にはクリーグ等（1984年）に述べられているようにSP
6及びT7ポリメラーゼで試験管内で（未キヤツピングの
まま）転写された。標準的な反応緩衝液は、最終反応容
量100μで40mM Tris−HCl（pH7.9）、6mM MgCl₂、1
0mMジチオスレイトール、2mMスパルミジン、80単位のRN
asinリボヌクレアーゼ阻害剤、ATP、GTP、CTP、UTPが各
0.5mM含まれていた。最終RNAペレツトは20μの滅菌水
に再懸濁され、−80℃で保存された。標準的な翻訳反応
は、100μのヌクレアーゼ処理したウサキ網状赤血球
リセート、5.7μのそれぞれ1mMでの19アミノ酸混合液
（メチオニンを除く）、5.7μのRNA（0.63μｇのプラ
スミドDNA由来の全RNA転写物）、16μのRNasin（20単
位／μ）リボヌクレアーゼ阻害剤、及び58.3μの［
³⁵S］メチオニン（14から15mG/ml）を含んでいた。試験
管内翻訳反応は、30℃で90分間おこなわれた。翻訳産物
は−80℃で凍結保存された。

完全なクロロプラストがレタス（ラツカ・サテイバ、
var.ロンギフオリア）から、バーＳレツト等（1982年）
の改良方法によるハーコール／フイコール密度勾配遠心
により分離された。完全なクロロプラストの最終ペレツ
トは50mM Hepes−KOH pH7.7中で滅菌された330mMソル
ビトール0.5mlに懸濁され、クロロフイルの試験がおこ
なわれ（アーノン、1949年）、クロロフイルの最終濃度
が4mg/mlに（ソルビトール/Hepesを用いて）調整され
た。レタス１個の完全なクロロプラストの収量は３から
6mgクロロフイルであつた。これらのクロロプラスト
は、フエーズ・コントラスト及び透過型電顕に基づいて
均一であると考えられた。

典型的な300μの取り込み実験は、5mM ATP.8.3mM
未標識のメチオニン、322mMソルビトール、58.3mM Hep
es−KOH（pH8.0）、50μ網状赤血球リセート翻訳産物
及び完全なL.サテイバのクロロプラスト（200μｇクロ
ロフイル）を含んでいた。取り込み混合液は、室温で
（10×75mmガラスチユーブの中で）直接的に、フアイバ
ー・オプテイツク・イルミネーター・セツトの前で最高
光度で（150ワツト球）ゆるやかに固定された。取り込
み混合液（50から125μ）が各時間で取り出され、110
00×g30秒間の遠心による（150μポリエチレン・チユ
ーブ中で）100μシリコン油密度勾配で分画された。
これらの条件下で、完全なクロロプラストは、シリコン
油層の下にペレツトを形成し、（網状赤血球リセートを
含む）インキユベーシヨン培地は表面に浮遊する。遠心
後、シリコン油密度勾配はすぐにドライアイスで凍結さ
れた。クロロプラストのペレツトは、それから、50から
100μの融解緩衝液（10mM Hepes−KOH pH7.5、1mM
PMSF、1mMベンズアミジン、5mMε−アミノ−ｎ−カプ
ロン酸及び30μアプロチニン）に再懸濁され、チラコ
イド膜をおとすために、15000×ｇで20分間遠心され
た。この遠心の透明上清（ストロマ蛋白）及びそれぞれ
の取り込み実験の網状赤血球リセート保温培養液は、電
気泳動のために等量の２倍SDS−PAGE試料緩衝液と混合
された（以下参照のこと）。

SPS−PAGEはレムリ（1970年）に従い、３％（w/v）ア
クリルアミド濃縮ゲル（5mm×1.5mm）をもつ12％（w/
v）アクリルアミドスラブゲル（60mm×1.5mm）でおこな
われた。ゲルは30％メタノール及び10％酢酸で固定さ
れ、真空下で乾燥され、コダツクXAR−5X線フイルムを
用いた直接的なオートラジオグラフイがおこなわれた。
Ｘ線フイルム上のバンドの定量は、スペクトラ−フイジ
スクSP4100レコーデイング／コンピユーター・インテグ
レーターを接続したヘーフアーGS−300スキヤニング・
デンシトメーターを用いておこなわれた。

前駆体EPSPS（＋CTP）がクロロプラストにより取り込
まれ、プロセシングされることを確かめるために、［³⁵
S］メチオニンで標識したプレ−EPSPSを含む前翻訳産物
が新たに分離された完全なL.サテイバのクロロプラスト
とインキユベートされた。プレEPSPS（＋CTP）は急速に
クロロプラスト中へ移行され、分子量48kDaの成熟EPSPS
に切断された。SDS−PAGEオートラジオグラフから、イ
ンキユベーシヨン培地からの前駆体EPSPSの消失とクロ
ロプラスト画分中の低分子量の成熟形の出現が明らかと
なつた。成熟EPSPSのあるものは又、クロロプラスト融
解のため15分間でインキユベーシヨン培地中に存在して
いた。インキユベーシヨン混合液の取り込み後のトリプ
シン及びキモトリプシンでの処理は、保温培地中のプレ
EPSPSは完全に分解されており、一方、クロロプラスト
画分中の成熟EPSPSは十分に保護されていたことを示し
た。これらの結果は、EPSPSがクロロプラスト被膜を横
切りプロテアーゼが寄りにくい空間の転移されたことを
示している。さらに、再分離されたクロロプラストの分
画は、成熟EPSPSがチラコイドとは全く異なり、ストロ
マ画分に存在することを示した。ヌクレオチド配列に基
づいて、成熟P.ハイブリダEPSPSの予想される分子量
は、47790ダルトンである。再分離されたクロロプラス
ト画分に存在する分子量48kDaのポリペプチドは、SDS−
PAGEの間、P.ハイブリダの精製された成熟EPSPSと共に
移動した。

CTPが取り込みに必要であることを示すために、（CTP
を欠落した）成熟酵素が最初の15分の取り込み実験の
後、クロロプラスト・ストロマから分離それる。（標識
された成熟酵素を含む）ストロマ蛋白の混合液が未標識
の網状赤血球リセートで希釈され、完全なクロロプラス
トを用いた第２の取り込み実験に使用された。（CTPを
欠く）成熟EPSPSは15分のインキユベーシヨンの間に
は、クロロプラストに転移をせず又、外被膜に結合もし
なかつた。対照実験として、プレEPSPSのクロロプラス
トへの取り込み速度は、インキユベーシヨン混合液への
ストロマ蛋白の添加のにより影響されないことが判明し
た。これらのデータから、EPSPSのCTP、酵素のクロロプ
ラストへの取り込みに必要とされると結論された。

実験例19:ペチユニアEPSPSのCTPは異種蛋白のクロロプ
ラストへの取り込みを促進する 次のEPSPSの実験はCTPがストロマ区分に対する異種蛋
白を標的にできることを示している。EPSPSの72アミノ
酸移行ペプチドが小麦の成熟ssRUBISCOに融合された。
小麦の成熟ssRUBISCO cDNA（プログリー等、1983年）
が〜0.6kbのSph I/Pst I断片として得られた。このSph
I/Pst I断片は（Ｎ未端メチオニンで始まる）128アミノ
酸の小麦の完全な成熟ssRUBISCO解読領域及び200bpの
３′非翻訳領域を含む。成熟ssRUBISCO cDNA断片はP.
ハイブリダEPSPS CTP cDNA断片のうしろに融合され
た。この融合は、pMON6242のEcoR I/Sph I断片を小麦ss
RUBISCO cDNAと連結することによりおこなわれた。構
築物pMON6242は、pMON6140の誘導体で、操作されたssRU
BISCOと一致した切断部位をもつP.ハイブリダEPSPSを含
む。pMON6140EPSPSの切断部位（ser−val−ala−thr−a
la−glh/lys）がpMON6242では、gly−gly−arg−val−s
er−cys/metに変えれた。この変化は、CTPがssRUBISCO
とEPSPSの間でスイツチするような枠内Sph I部位を導入
する。構築物pMON6242は、先にpGEM−２にクローン化さ
れ、試験管内でクロロプラストへ移行し、正しい様式で
蛋白分解によりプロセシングされるキメラの前駆体酵素
を与えることが示されている。

pMON6242のEcoR I/Sph I断片が小麦のssRUBISCOのSph
I部位へ融合され、pMON6149を与えるためにプラスミド
pIBIにクローン化された。pMON6149の試験管内転写／翻
訳は、融合蛋白に対して予想される分子量の単一ポリペ
プチド（〜23kD）を与えた。試験管内でのクロロプラス
ト移行試験は、キメラ蛋白がストロマへ移行され、蛋白
分解により、〜15kDの最終産物まで切断されることを示
した（ssRUBISCOは分子量15kD）。

これらの結果は、EPSPS CTPだけがクロロプラスト・
ストロマに異種蛋白を標的にする十分な情報を賦与する
ことを示している。

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0巻:468ページ

【図面の簡単な説明】

第１図は、キメラのCaMV/EPSPS遺伝子を含む植物形質転
換ベクターであるプラスミドpMON546の創出を示す。こ
れは又、pMON546のCaMV/EPSPS遺伝子が植物染色体に挿
入するのを助けるvir遺伝子をもつ無毒化したTiプラス
ミドpGV3111−SEの構造を示す。 第２図は、ペチユニアのEPSPS遺伝子と酵素のクロロプ
ラスト移行ペプチドのDNA配列及びアミノ酸配列を示
す。 第３図は、ペチユニアのEPSPSの全cDNAのヌクレオチド
・アミノ酸配列及び制限地図を示す。 第４図は、pMON316のプラスミド地図を示す。 第５図は、ペチユニア及びアラビドプシスのEPSPS遺伝
子の制限地図を示す。 第６図は、pMON9721のプラスミド地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート トーマス フラリイ アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，トツピング イーステイツ ドライ ブ 12917 (56)参考文献 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ ｎｇ Ｌｅｔｔｅｒ，Ｖｏｌ．５，Ｎ ｏ．４（1985．２）Ｐ．３−４ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（1985) Ｐ．329−338 ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ. Ａ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏ ｌ．83（1984）Ｐ．479−487 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, Ｖｏｌ．４、Ｎｏ．１（1985．１）Ｐ. 25−32 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．313（1985. １）Ｐ．358−363 Ｗｏｒｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅ ｐ．，Ｖｏｌ．２（1985）Ｐ．97−108

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ａ）植物細胞内で５−エノールピルビルシ
   キメート−３−リン酸シンターゼ（EPSPS）遺伝子を転
   写させるプロモーター配列、 ｂ）クロロプラスト移行ペプチド/EPSPS融合ポリペプチ
   ドをコードするコード配列、及び ｃ）植物細胞内でEPSPSmRNAの３′端にポリアデニレー
   トヌクレオチドを付加する機能を有する３′非翻訳ポリ
   アデニレーション配列を含むキメラ遺伝子であって、前
   記クロロプラスト移行ペプチドにより植物細胞内での発
   現の際に融合ポリペプチドが細胞のクロロプラストに導
   入され得、前記プロモーターはコード配列とは異種であ
   り、植物細胞またはそれから再生される植物に実質的な
   グリホセート耐性を付与するに十分な程度融合ポリペプ
   チドを発現させ得るものであることを特徴とするキメラ
   遺伝子。
2. 【請求項２】プロモーター配列が植物ウィルスのプロモ
   ーター配列である特許請求の範囲第１項記載のキメラ遺
   伝子。
3. 【請求項３】プロモーター配列がカリフラワー・モザイ
   ク・ウィルス（CaMV）由来のプロモーター配列である特
   許請求の範囲第２項記載のキメラ遺伝子。
4. 【請求項４】プロモーター配列がCaMV35Sプロモーター
   配列である特許請求の範囲第３項記載のキメラ遺伝子。
5. 【請求項５】コード配列が変更EPSPSをコードする特許
   請求の範囲第１項記載のキメラ遺伝子。
6. 【請求項６】EPSPSコード配列が細菌、カビ及び植物か
   らなる群から選択される材料に由来するEPSPSをコード
   する特許請求の範囲第１項記載のキメラ遺伝子。
7. 【請求項７】クロロプラスト移行ペプチドが植物EPSPS
   遺伝子由来である特許請求の範囲第１項記載のキメラ遺
   伝子。
8. 【請求項８】キメラ遺伝子を含むクローニングベクター
   又は発現ベクターであって、前記キメラ遺伝子が、 ａ）植物細胞内で５−エノールピルビルシキメート−３
   −リン酸シンターゼ（EPSPS）遺伝子を転写させるプロ
   モーター配列、 ｂ）クロロプラスト移行ペプチド/EPSPS融合ポリペプチ
   ドをコードするコード配列、及び ｃ）植物細胞内でEPSPSmRNAの３′端にポリアデニレー
   トヌクレオチドを付加する機能を有する３′非翻訳ポリ
   アデニレーション配列を含み、前記クロロプラスト移行
   ペプチドにより植物細胞内での発現の際に融合ポリペプ
   チドが細胞のクロロプラストに導入され得、前記プロモ
   ーターはコード配列とは異種であり、植物細胞またはそ
   れから再生される植物に実質的なグリホセート耐性を付
   与するに十分な程度融合ポリペプチドを発現させ得るも
   のであることを特徴とするベクター。
9. 【請求項９】キメラ遺伝子を含む植物の形質転換ベクタ
   ーである特許請求の範囲第８項に記載のベクター。
10. 【請求項１０】キメラ遺伝子を含むグリホセート耐性植
    物細胞であって、前記キメラ遺伝子が、 ａ）植物細胞内で５−エノールピルビルシキメート−３
    −リン酸シンターゼ（EPSPS）遺伝子を転写させるプロ
    モーター配列、 ｂ）クロロプラスト移行ペプチド/EPSPS融合ポリペプチ
    ドをコードするコード配列、及び ｃ）植物細胞内でEPSPSmRNAの３′端にポリアデニレー
    トヌクレオチドを付加する機能を有する３′非翻訳ポリ
    アデニレーション配列を含み、前記クロロプラスト移行
    ペプチドにより植物細胞内での発現の際に融合ポリペプ
    チドが細胞のクロロプラストに導入され得、前記プロモ
    ーターはコード配列とは異種であり、植物細胞またはそ
    れから再生された植物に実質的なグリホセート耐性を付
    与するに十分な程度融合ポリペプチドを発現させ得るも
    のであることを特徴とする植物細胞。
11. 【請求項１１】キメラ遺伝子を含むグリホセート耐性植
    物細胞から再生されたグリホセート耐性双子葉植物であ
    って、前記キメラ遺伝子が、 ａ）植物細胞内で５−エノールピルビルシキメート−３
    −リン酸シンターゼ（EPSPS）遺伝子を転写させるプロ
    モーター配列、 ｂ）クロロプラスト移行ペプチド/EPSPS融合ポリペプチ
    ドをコードするコード配列、及び ｃ）植物細胞内でEPSPSmRNAの３′端にポリアデニレー
    トヌクレオチドを付加する機能を有する３′非翻訳ポリ
    アデニレーション配列を含み、前記クロロプラスト移行
    ペプチドにより植物細胞内での発現の際に融合ポリペプ
    チドを細胞のクロロプラストに導入され得、前記プロモ
    ーターはコード配列とは異種であり、植物細胞またはそ
    れから再生される植物に実質的なグリホセート耐性を付
    与するに十分な程度融合ポリペプチドを発現させ得るも
    のであることを特徴とする植物。
12. 【請求項１２】植物がトマト、タバコ、ナタネ、亜麻、
    大豆、ヒマワリ、砂糖大根、アルファルファ、綿又はジ
    ャガイモである特許請求の範囲第11項に記載の植物。
13. 【請求項１３】ａ）キメラ遺伝子を含むアグロバクテリ
    ウム形質転換ベクターを使用して植物細胞を形質転換
    し、ｂ）上記形質転換植物細胞からグリホセート耐性植
    物を再生することから成るグリホセート耐性双子葉植物
    を生産する方法であって、前記キメラ遺伝子が、 ａ）植物細胞内で５−エノールピルビルシキメート−３
    −リン酸シンターゼ（EPSPS）遺伝子を転写させるプロ
    モーター配列、 ｂ）クロロプラスト移行ペプチド/EPSPS融合ポリペプチ
    ドをコードするコード配列、及び ｃ）植物細胞内でEPSPSmRNAの３′端にポリアデニレー
    トヌクレオチドを付加する機能を有する３′非翻訳ポリ
    アデニレーション配列を含み、前記クロロプラスト移行
    ペプチドにより植物細胞内での発現の際に融合ポリペプ
    チドを細胞のクロロプラストに導入され得、前記プロモ
    ーターはコード配列とは異種であり、植物細胞またはそ
    れから再生される植物に実質的なグリホセート耐性を付
    与するに十分な程度融合ポリペプチドを発現させ得るも
    のであることを特徴とするグリホセート耐性双子葉植物
    を生産する方法。