JPS6332488A - グリホセート耐性キメラ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、遺伝子工学、生化学及び植物生物学の分野に
関する。

従来の技術 Ｎ−ホスフォツメチルグリシンは次の構造をもつ： この分子は酸で、水溶液中では解離し、植物に有害な物
質である各種の陰イオンを形成する。数種類の陰イオン
体が知られている。ここで使用されているように、「グ
リホセート」という名称は、酸及びその陰イオンの双方
を旧称するものである。

イソプロピルアミン塩として製剤化され、活性成分とし
てグリホセートを含む混合物は、モンサンドカンパニー
よりラウンドアップ（登録商標）の商品名で除草剤とし
て販売されている。米国特許第３７９９７５８号（フラ
ンツ、１９７４年）及び各種の他の特許により例証され
るように、非常に多くの他の塩も又除草作用を有してい
る。Ｎ−ホスフォノメチルグリシン及び水中でＮ−ホス
フォツメチルグリシンの溶解性を増加する塩形成陽イオ
ンからなる組成物が好ましい。

この分野における通常の知識を有する技術者（以下当業
者という）は、科学文献の中に、グリホセートによる植
物の生育の阻害作用の機作について提唱している多数の
論文が含まれていることを承知している。提唱されてい
る機作のうちの一つに、グリホセートが５−エノールビ
ルビルツキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ
）と呼ばれる酵素を阻害することを示唆しているものが
ある：例えば、アムルハイン（１９８０年）、スタイン
リュツケン（１９８０年）、ムスデイル＜１９８４年）
及びルーピン（１９８２年）を参照されたい（参考文献
の完全なリストは実施例の後にまとめて示す。）。この
ＥＰＳＰＳ＃３素は、３種の必須な芳香族アミノ酸（チ
ロシン、フェニルアラニン及びトリプトファン）をつく
る生化学的経路の中間産物であるクキメート−３−リン
酸を５−エノールビルビルーシキメート−３−リン酸に
変換するのを触媒すると報告されている；例えば、ムス
デイル（１９８４年）を参照されたい。

ロジャース（１９８３年）は、大腸菌でのＥＰＳＰＳの
過剰産生が大腸菌細胞のグリホセート耐性に寄与してい
ると報告している。

少なくとも１人の研究者は、ＥＰＳＰＳ酵素を暗号化す
る細菌の遺伝子を操作することにより、グリホセート耐
性のｉ菌ｉｎをつくろうと試みている。米国特許第４５
３５０６０号（コマイ：力ルジーンＩｎｃ、　：　１９
８３年１月５日出願）及びコマイ（１９８３年）に述べ
られているように、サルモネラ属細菌の培養を突然変異
誘発物質（エチル・メタンスルホン酸）と接触され、グ
リホセート耐性について細菌をスクリーニングし、相対
的に耐性の培養を選扱した。ストーカ−（１９８５年）
が報告しているように、この培養を解析し、置換アミノ
酸をもつＥＰＳＰＳの変異体であると決定した。米国特
許第４５３５０６０号は、ＥＰＳＰＳ変異遺伝子を植物
細胞に挿入して、グリホセート耐性＜ａ　＋　ｙＲ＞植
物細胞をつくることができることを示唆した。加えて、
低レベルのグリホセート存在下でＥＰＳＰＳを過剰生産
するグリホセートに耐えうる植物細胞を選汰できること
も報告されている（ナツツイガ−等（１９８４年）及び
スマート等（１９８５年））。しかし、そのような方法
が分化した植物に有効であることを示した実験はない。

米国特許第４５３５０６０号の出願日以後、外来遺伝子
を植物細胞に挿入するのに使用される方法及びベクター
について開示された（例えば、フレーリー（１９８３年
）、ヘレラーエストレラ（１９８３年）、ベーヴアン（
１９８３年）及びＰＣＴ出願ＷＯ３４１０２９１９及び
０２９２０参照）。ＰＣＴ出願ＷＯ３４１０２９１３で
は植物細胞で活性のある遺伝子由来の調節配列により支
配される細菌のＥＰＳＰＳ解読配列をもつキメラ遺伝子
をつくる方法も又開示された。これらのベクター及び方
法論を使用して、上２のサルモネラＥＰＳＰＳ変異遺伝
子のような細菌の遺伝子を遺伝子操作し植物細胞中で発
現させることができる。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、ｍ胞及びそれより再生させた植物を、
グリホセート及びその除草性の塩に対して耐性となるよ
うに、遺伝学的に植物細胞を形質転換する方法を提供す
ることである。

問題点を解決するための手段 この発明には、植物細胞で発現されたとき、５−エノー
ルビルビルツキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳ
ＰＳ）ポリペプチド又はその酵素的に活性のある部分を
植物細胞の細胞質からクロロプラストへ移させるような
りロロプラスト移行（ｔｒａｎｓｉｔ　）ペプチドを含
有し、植物細胞及びそこから再生された植物に対し、実
質的なグリホセート耐性を与える上記ポリペプチドを暗
号化する遺伝子よりなるクローニング又は発現ベクター
が含まれる。

このＥＰＳＰＳＩ読配列は、カリフラワー・モザイク・
ウィルスの３５８プロモーターのような強力なプロモー
ターにリゲートされ、キメラ遺伝子が創出される。その
ような遺伝子が植物の形質転換ベクターに挿入され、続
いて植物１１１胞に導入される。そのような遺伝子を用
いて形質転換された植物細胞及びそこから再生された植
物は、実質的なグリホセート耐性を示すことが明らかに
されている。

本発明には、植物１胞及びそこから再生される植物にグ
リホセート耐性（ＧｌｙＲ〉を効果的に与えることので
きるＥＰＳＰＳの形態を略号化する遺伝子を含有するク
ローニング又は発現ベクターが包含される。ＥＰＳＰＳ
ｍ仏子は、ＥＰＳＰＳポリペプチド（又は、その活性部
分）を植物細胞内のクロロプラストに移すことのできる
クロロプラスト移行ペプチド（ＣＴＰ）を含有するポリ
ペプチドを暗号化する。本発明の実施に適当な植物とし
ては、これらに限定されるわけではないが、大豆、綿、
アルファルファ、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕ
ｓ、　Ｂｒａｓｓｉｃａ　Ｃａ１ｌ）ｅｓｔｉｓ）　、
亜麻、トマト、砂糖大根、ヒマワリ、ジャガイモ、タバ
コ、トウモロコシ、小麦、米及びレタスなどが挙げられ
る。

当業者は、科学文献には、ＥＰＳＰＳ活性（シキミ酸経
路）がクロロプラスト及び細胞質両者に存在することを
述べた非常に多くの論文が含まれていることを承知して
いる。実際、本発明以前は、グリホセート耐性を与える
ために細ＩＩａ質またはクロロプラストのうちのいずれ
でクローン化されたＥＰＳＰＳが必要かどうかは明らか
にされていなかった。米国特許第４５３５０６０号の教
示とは反対に、本発明によりＥＰＳＰＳ遺伝子がクロロ
プラスト移行ペプチドを含有しなければならないことが
見い出された。クロロプラストは、クロ０プラスト内で
ポリペプチドとして発現されると信じられているＤＮＡ
を含有するが、ＥＰＳＰＳポリペプチドはクロロプラス
トＤＮＡよりもむしろ染色体［）ＮＡにより１１８号化
されている。ＥＰＳＰｓｉ伝子は核でｍＲＮＡに転写さ
れ、ｍＲＮＡは、細胞質で前駆体ポリペプチド（ＣＴＰ
／成熟ＥＰＳＰＳ）に翻訳される。前駆体ポリペプチド
（又はその部分）はクロロプラストに移される。

植物細胞でＥＰＳＰＳ遺伝子の転写を引きおこすことが
知られているか、又は見い出されているプロモーターが
本発明では使用される。そのようなプロモーターは、植
物又はウィルスから得られ、カリフラー・モザイク・ウ
ィルスの３５８及び１９ＳブＯモーター、ＥＰＳＰＳ、
５ｓＲＬＪＢ　ｌ５ＣＯ遺伝子のような植物遺伝子から
単離されたプロモーターとツバリン及びマンノビン・シ
ンターゼのようなアグロバクテリウム・テユメファシエ
ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ　）のニーＯＮＡ遺伝子から得られたプロモータ
ーが挙げられるが必ずしもこれらに限定されるわけでは
ない。選択された特定のプロモーターは植物ｍ胞及びそ
こから再生された植物を実質的にグリホセートに耐性に
させるために有効な働のＥＰＳＰＳポリペプチドを産生
できるように十分な発現をさせることが可能でなければ
ならない。当業者には、耐性を誘導するのに必要なＥＰ
ＳＰＳポリペプチドの量は、植物の種類により変化する
ものであることは、自明のことであろう。必要とされる
発現の程度は用いたＥＰＳＰＳ解読配列によっても変わ
るものである。変異ＥＰＳＰＳは、耐性のより少くない
野生型ＥＰＳＰＳ配列よりも低い発現で良いこととなろ
う。

ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、少なくとも数種の植物
では、天然のＥＰＳＰＳプロモーターよりも強力である
、即ち、天然のＥＰＳＰＳプロモーターと比較してキメ
ラ遺伝子からかなりの量のｍＲＮＡの形成を引き起こす
。ＣａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰＳキメラ遺伝子の高力価は
、研究室において選択マーカーとしてＥＰＳＰＳｍ伝子
を使用する際に大変価値がある。しかしながら、キメラ
遺伝子が食物生産のための再生植物を形質転換するのに
使用されると、ヌクレオチド、アミノ酸及び基質が細胞
内の他の望ましい生化学経路からはずれてしまうので、
ＥＰＳＰＳＭ素の産出のレベルは望ましくないほど高い
かもしれない。それ故、ＥＰＳＰＳの適当なレベルの発
現をするキメラ遺伝子を創出するためには、ＣａＭＶ３
５Ｓ／ＥＰＳＰＳキメラ遺伝子の力価を減少させるのが
望ましい。これには（１）転写開始部位の前の領域のラ
ンダム又は部位特定突然変異誘発（′２Ｊ遺伝子の５′
未翻訳Ｉｔ域への転写ターミネータ−の挿入（３）モー
ターの支配下で二種の転写配列を有する解読配列）を創
出するためのＥＰＳＰＳ開始コドンの前に開始コドン及
び終止コドンをもった解読配列の挿入のような各種の方
法が用いられる。

本発明のＥＰＳＰＳ遺伝子に使用するプロモーターの発
現の性質を変えることが望まれる場合は、さらに條施し
ても良い。例えば、葉では活性があるが根では活性のな
いプロモーターを！１１１出するために、ＣａＭＶ３５
Ｓプロモーターに、光がないときには５ｓＲｔＪＢｌｓ
ｃｏの発現を抑制する５ｓＲＬＩＢＩｓｃＯ遺伝子の一
部分をリゲートする。得られたキメラプロモーターは本
明細書中で後述するように用いられる。本明細書中では
、ｒｃａＭＶ３５ｓＪプロモーターには、各種のＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター、例えば、オペレーター領域の結
合、ランダム又は支配された突然変異誘発等により誘導
されたプロモーターが含まれる。

ＥＰＳＰＳ遺伝子により生産されるＲＮＡも又、５′の
未翻訳リーダー配列を含む。この配列は、どんな遺伝子
由来でも良く、ｍＲＮＡの翻訳を増加するように特異的
に修飾される。５′未翻訳領域は、ウィルスＲＮＡ他の
適当な真核ＩＩ胞遺伝子又は合成遺伝子配列に由来する
ものでも差支えない、ＥＰＳＰＳポリペプチドの解読配
列の未翻訳領域の５′端の一部であっても良く、又は上
述の如く関連性のないプロモーターあるいは解読配列に
由来するものであっても良い。

本発明のＥＰＳＰＳ遺伝子はＣＴＰ／ ＥＰＳＰＳ融合ポリペプチドを暗号化する。本発明の遺
伝子のＣＴＰ／ＥＰＳＰＳポリペプチドが、形質転換さ
れた植物細胞の細胞質でｍＲＮＡから翻訳された後は、
天然のＥＰＳＰＳポリペプチドでも同様に処理されると
信じられている。ＣＴＰリーダー配列は、ポリペプチド
をクロロプラストに移行させ、この植物由来のＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子により暗号化されるＣＴＰリーダー配列はポリ
ペプチドの残りの部分から除去されて、ＥＰＳＰＳポリ
ペプチドの活性部分がりＯロブラスト内部に存在し機能
する。

本発明で使用するのに適当なＣＴＰは各種材料から得ら
れる。最も好ましくは、形質転換する対象の植物の内在
性ＥＰＳＰＳ遺伝子から得られるＣＴＰが良い。また他
の種類の植物のＥＰＳＰＳ遺伝子のＣＴＰをしばしば使
用可能である。

ＥＰＳＰＳ遺伝子と５ＳＲｔＪＢ　ｌ５ＣＯ遺伝子のＣ
ＴＰ配列間にはほとんど相同性はないのだが（例えば、
プログリ−（１９８３年）参照）、非相同なＣＴＰも特
定の具体例では機能することを見出すことは可能である
。本発明に使用するのに適当なＣＴＰ配列は、後述の実
施ＩＭ１８に詳述する如くに、興味あるＣＴＰを含有す
るＥＰＳＰＳポリペプチドのクロロプラストへの取り込
みを検定することにより容易に決定される。

ＥＰＳＰＳポリペプチドを暗号化する配列は、非常に多
くの材料から得られる。適当な材料には、細菌、カビ及
び植物が含まれる。他の材料からのＥＰＳＰＳＩＩＮ読
配列は、全長ベチーＬニア’ＣＤＮＡ（第３図参照）又
はその適当な断片をハイブリダイゼーションのプローブ
として使用して、実施例１及び１４から１７に述べられ
ているように得られる。

以下の説明で表示する全てのペプチドの構造は、Ｎ−末
端でのアミノ基が左側及びＣ末端でのカルボキシル基が
右側となるように慣用的な図式で示す。同様に、蛋白に
見い出される天然アミノ酸に対するアミノ酸の表示は以
下の通りである：アラニン（Ａｌａ：Ａ＞、アスパラギ
ン（ＡＳｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、ア
ルギニン（Ａｒｑ　ニーＲ）　、システィン＜Ｃｙｓ：
Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、グルタミン（Ｇｌ
ｎ：Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｌ
Ｓ；Ｈ）、イソ０イシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、ロイシン（Ｌ
ｅｕ：Ｌ）、リジン（ＬｙＳ二Ｋ）、メチオニン（Ｍｅ
ｔ：Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、ブＯリン
（Ｐｒｏ：Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、スレオニン（
Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、チロシ
ン（Ｔｙｒ：Ｙ）、及びバリン（Ｖａｔ：Ｖ）。

ＥＰＳＰＳの突然変異体及び変種は各種過程によりつく
られることを当業者ならば自明のことであろう。例えば
、ＥＰＳＰＳ蛋白の１個またはそれ以上のアミノ酸残基
を変えるために、り〇−二ソングは発現ベクターを突然
変異誘発しても良い。

これは、無作為的に（例えば、Ｘ線、紫外光又は各種化
学薬品のような変異誘発剤に宿主細胞をさらすことによ
り）、又は、ＤＮＡ配列中の塩基の正確に予想された置
換を含む手段によりおこなわれる。また、細菌やカビの
ような微生物材料あるいは増加したグリホセート耐性を
示す変異ＥＰＳＰＳをもつ植物材料を選んでも良い。

３′未翻訳領域は、植物体中で、ＥＰＳＰＳｎＲＮＡの
３′端にポリアデニレートヌクレオチドを付加させる機
能のあるポリアゾニレ−ジョン信号を含有する。ＥＰＳ
ＰＳ配列が植物材料由来である場合、特定のＥＰＳＰＳ
３！ｉ伝子に天然に付随する３′未翻訳ｆ！４域を使用
することができる。

他の適当な３′領域の例としては、アガロバクテリウム
の腫瘍誘１　（Ｔ　＋　）プラスミドのツバリンシンタ
ーゼ（ＮＯ８）遺伝子又はコングリシニン（７Ｓ）貯蔵
蛋白遺伝子のポリアゾニレ−ジョン信号を含む３′の転
写され未翻訳の領域がある。

本発明のＥＰＳＰＳ遺伝子は、適当な方法で植物ゲノム
に挿入される。適当な植物形質転換ベクターは、例えば
、ヘレラーエストレラ（１９８３年）、ベヴアン（１９
８３年）、クリ−（１９８５年）及び欧州特許公開公報
第１２０５１６号（ミルベルート等）で開示されたもの
と同様に、アガロバクテリウム・テユメファシエンスの
Ｔｉプラスミド由来のものを含む。アガロバクテリウム
のＴｉ又は根誘導（Ｒｉ　）プラスミド由来の植物形質
転換ベクターに加えて、他の代替方法が、植物細胞に本
発明のＥＰＳＰＳ遺伝子を挿入するのに使用できる。そ
のような方法は例えば、リポソーム、エレクトロポレー
ション、自由ＤＮＡの取り込みを増加する薬品及びベク
ターとしてのウィルス又は花粉の利用を含む。必要に応
じて、１個以上のＥＰＳＰＳ３ｆｉ伝子を、形成転換と
選択のサイクルを１度以上繰り返すような方法によって
植物の染色体に挿入しても良い。

（好ましくは、成熟ＥＰＳＰＳポリペプチドから除去さ
れる）機能クロロプラスト移行ペプチドをもつ酵素を暗
号化するＥＰＳＰＳ遺伝子は、形質転換ｌｌＩ胞及び非
形質転換細胞が、（植物の種類によりルーチン的に決定
することのできる）適当な濃度のグリホセートに接触し
たときに、植物細胞の形質転換に有効な選択マーカー遺
伝子を提供する。グリホセート耐性を授与することので
きる特性は、（例えばカナマイシン、メトトレキセート
又はハイグロマイシン耐性遺伝子のような）他の選択マ
ーカー遺伝子を用いるとはつきりした選択性を示さない
（アルファルファ、大豆及び他の豆類のような）特定の
種類の植物には特に有効である。

更に、ＥＰＳＰＳ遺伝子で形質転換さ−れだグリホセー
ト耐性植物細胞は、選ばれた芽誘導又は根誘導ホルモン
を補強した標準的な栄養培地を用い、ＰＣＴ出願ＷＯ３
４１０２９２０に述べられている方法あるいは当業者に
は周知の他の方法で、分化植物に再生することができる
。

木用１１１ｍ中では、形質転換された植物細胞の培養の
選択しうる画分が、同一条件下で、同−型の植物の全て
の非形質転換細胞を殺す濃度のグリホセートで生存させ
うるならば、ＥＰＳＰＳ遺伝子、“植物細胞に実質的な
グリホセート耐性度を賦与する”ことを意味するものと
する。

本川１１１ｓ中では、「クローニング又は発現ベクター
」は、１種又はそれより多くの微生物細胞で？Ｉ製する
ことができるＤＮＡ又はＲＮＡ分子をさす。ベクターに
は、プラスミド、コスミド、ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡ
、ミニ染色体等が含まれる。

木用細店中では、「複製型」は、植物ＤＮＡ又はｍＲＮ
Ａからの直接的な複製と同様に、（例えば中間体ベクタ
ーの複製のような）間接的複製を含む。これは又、公表
され、あるいは実験的に決定された塩基配列を用いて、
（例えばアダムス（１９８３年）の方法で）合成された
ＤＮＡを含む。

次の略図は、本発明の好ましい実施例で使用さ机た主た
る操作を示す。

以上の実施例はさらに本発明のいくつかの好ましい実施
態様を示す。ここに述べている特異的な実施態様に対し
て多数の同等物を当業者は容易に推考しうるであろう。

そのような同等物はこの発明の特許請求の範囲内に当然
に含まれる。

実施例 ＭＰ４系と命名されている最初のＩｌｌ胞系列は、ミツ
チェルの２培体ペチユニアに由来した（例えば、アウス
ベル（１９８０年）参照）。ＭＰ４細胞はムラシゲ及び
スクーグ（ＭＳ）の培養培地（ギブコ社製、グランド・
アイランド、ニューヨーク）に懸濁させた。全ぺての植
え継ぎは、１０〆の懸濁培養の５０ｄの新鮮な培地へ移
しかえにより行なった。次回の植え継ぎまでの培養期間
は１０から１４日の範囲で、培養が飽和に達することを
目安とした。

（約５Ｘ１０６の細胞を含む）１０ｍの飽和懸濁培養液
を０．５ｅＨグリホセート（モンサンド農業製品＠製、
セントルイス、ミズーリ）を含む５０ｄのＭＳ培地に移
しかえた。グリホセートのナトリウム塩がここに述べら
れている実験を通して使用された。大多数の細胞はグリ
ホセート存在下では再生できなかった。（最初細胞数の
１％未満と推定される）生き残った細胞は、０．５ａＭ
グリホセート中で培養し、１０から１４日ごとにグリホ
セートを含む新鮮な培地に移しかえた。

２回の移しかえの後、生存細胞は、ｌ、３ｍＭグリホセ
ートを含む新鮮な培地に移しかえた。

１．０ＩＩＨで２回の移しかえた後、生存細胞は順次、
２．５ｍＨグリホセート、５．０ｍＨグリ４ｉセード及
び１０＋ｌＨグリホセートと移しかえた。

次に、ＭＰ４−Ｇ１１１胞が「遺伝子増幅」と呼ばれる
遺伝的操作により、約１５から２０コピーのＥＰＳＰＳ
遺伝子をもつことが（サザン・プロットにより）明らか
とされた。（例えば、シムケ（１９８２年）参照）自然
突然変異はどの細胞の複製の間におこるのだが、ＥＰＳ
ＰＳ遺伝子のいかなる突然変異又は、他の修飾が遺伝子
増幅操作の間におこるという徴候はない。唯−知られて
いるＭＰ４とＭＰ４−Ｇ細胞間の違いは、ＭＰ４−Ｇ細
胞が、ＥＰＳＰＳ遺伝子と恐らく細胞の染色体上でＥＰ
ＳＰＳ遺伝子の近傍に位置する他の遺伝子の多重コピー
を含有することである。

Ｂ、ＥＰＳＰＳＮ素の精製及びシークエンシングＭＰ４
−Ｇ細胞系列のベデュニア細胞が真空濾過により集めら
れ、液体窒素で凍結されて、ワーリング・ブレンダーで
粉砕された。粉末を１　ｍＨＥＤＴＡ及び７．５％（ｗ
／ｖ　）ポリビニル−ポリピロリドンを含む０．２８　
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！ＤＨ７，８に懸濁した。懸濁液
を約２００００Ｇで１０分間遠心し、細胞残漬を除去し
た。核酸は上清に０．１容の１．４％プロタミン硫酸を
添加することにより沈澱させ、除去した。

粗蛋白懸濁液は、（１）　ｉ安沈澱　（２）ジエチルア
ミンエチルセルロースイオン交換クロマトグラフィ（３
）ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィ（４）フ
ェニルアガロースゲルによる分画　（５）セファクリル
Ｓ−２００ゲルにより分画から一成る５工程により精製
された（ムスデイル（１９８４年）及びスタインリュツ
ケン（１９８５年）参照）。

精製されたＥＰＳＰＳポリペプチドは、バンカピラー（
１９８３年ａ）に述べられている方法を用いて、モデル
４７０Ａプロテイン・シーケンサ−（アプライド・バイ
オシステムズ■製、フォスター　シティ　カルフォルニ
ア州）により、エドマン分解で、一連の個々のアミノ酸
に分解された。

それぞれのアミノ酸誘導体は、２２０００以上の理論段
数のシアノプロピルカラム（ＩＢＭインストルメンツ）
製、ウオーリングフオードコネチカット州）を用いて、
バンカピラー（１９８３年ｂ）により述べられたように
逆相高速液体クロマトグラフィにより分析された。ペヂ
ュニアのＥＰＳＰＳのアミノ酸の部分配列を表１に示す
。

Ｃ，ブＯ−ブの合成 当該遺伝コードを使用し、表１に示されたアミノ酸配列
を用いて、各々示されたアミノ酸をコードできる可能な
りＮＡコドンを決定した。この情報を用いて、３種の異
なるプローブ混合物が作製されて、表１に示されたよう
に、ＥＰＳＰ−１、ＥＰＳＰ−２及びＥＰＳＰ−３と命
名された。この表で、ＡＳＴ、Ｕ、Ｃ及びＧはヌクレオ
チド塩基：アデニン、チミン、ウラシル、シトシン及び
グアニンをあられす。文字Ｐ、Ｑ及びＮは可変的なもの
で；Ｎはいずれかの各塩基を、Ｐはプリン（Ａ又はＧ）
を、モしてＱはピリミジン（ＵｌＴ。

又はＣ）をあられす。

全てのオリゴヌクレオチドがアダムス（１９８３年）の
方法で合成された。不確定のヌクレオチドの位置（Ｐ、
Ｑ又はＮ）に達すると、適当なヌクレオチドの混合物が
反応液に添加された。プローブは、使用直前に５０１８
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪＤＨ７，５，１０ｉ＋ＨＭＱＣＪ
！　　、５ｓＨＤＴＴ、０．１ｓＨＥＤＴＡ及び０．１
ｍＭスペルミジン中で１００μ　Ｃｉγ−［３”Ｐ］−
ＡＴＰ　（アマジャム）及び１０単位のポリヌクレオチ
ド・キナーゼを用い２０Ｐｍｏｌに標識された。１時間
３７℃で保温後、プローブは２％アクリルアミド８ＭＦ
２素ゲル上あるいは、０．１ＨＮａｃ！、１０ｍ１４Ｔ
ｒ　ｔ　５−ＨＣｊ！　　Ｉ）Ｈ７，５，１１１８ＥＤ
ＴＡのセファデックスＧ２５の５Ｉｄ、カラムを通すこ
とにより再精製された。

Ｄ、ｍＲＮＡの調製及びブ０−ブの基礎的な試験（２）
ポリＡ　　ｍＲＮＡ ゴールドバーブ（１９８１年）により述べられたようＫ
ＭＰ４（グリホセート感受性）及びＭＰ４−Ｇ　（グリ
ホセート耐性）の細胞系列から全ＲＮＡを分離した。全
ＲＮＡはさらに、デビツカ−（１９８２年）により述べ
られたように、塩化セシウム緩衝剤により沈降させた。

ポリ−ＡｍＲＮＡはオリゴｄＴセルロースクロマトグラ
フィにより選択した。ポリ−Ａ　　ＲＮＡの収量はＭＰ
４ｉｔＢ胞１ｇあたり１．１μ９あたりでＭＰ４−Ｇ細
胞では２．５μ’Ｊ／９であった。

ｔｊＲＮＡのゲルプロセシング ＭＰ４又はＭＰ４−Ｇ細胞系列のポリ−ＡＲＮＡＩ　Ｏ
μ９をエタノールで沈澱させ、５０％ホルムアミド及び
２．２Ｈホルムアルデヒドを含む１倍のＭＯＰＳ！ＩＩ
Ｉ液（２０ＩＩＩＨモルホリノプロパンスルホン酸ｐＨ
７，０，５ｍＨ酢酸ナトリウム及び１ｓＨＥＤＴＡＩ）
８８．０）に再懸濁した。

ＲＮＡを６５℃で１０分間加熱処理して変性させた。５
０％グリセＯ−ル、１１８　　ＥＤＴＡ。

０．４％ブロモフェノールブルー及び０．４％キシレン
シアツールを含む緩衝液を１１５容添加した。ＲＮＡは
、１．１）Ｉホルムアルデヒドを含む１．３％アガＯ−
スゲルで、ブロモフェノールブルーが底近くになるまで
分画した。３２Ｐで標識したＨａｅ■消化のφＸ１７４
ＤＮＡを大きさの標準として流した。ＤＮＡマーカーは
ＲＮＡバンドに対しておよその大きさを示した。

（へ）ＲＮＡのニトロセルロースへの移行移行用緩衝液
として２０倍ＳＳＣ（１倍ＳＳＣは０．１５８　ＮａＣ
１，０，０１５Ｍクエン酸すトリウムｐＨ７，０＞を使
用して１晩ゲルを吸い取ることによりＲＮＡをニドＯセ
ルース（＃ＢＡ８５、シュライヒヤー＆シュエル社、キ
ーン、Ｎ１−１＞に移行させた。移行後、濾紙を風乾し
、８０℃で２から３時間真空オーブン中で焼いた。

ゆ放射活性のあるブＯ−ブを用いた基礎的なハイブリダ
イゼーション 濾紙は６倍ｓｓｃ、ｉｏ倍デンハルト溶液（１倍デンハ
ルト溶液は、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビ
ニルピロリドン、０．０２％牛血清アルブミン）、０．
５％ＮＰ−４０及び２００μｇ／１ｌＩｉ！大腸菌ｔＲ
ＮＡ中で、５０℃、４時間ブレハイブリダイズした。ハ
イブリダイゼーションは、ＥＰＳＰ−１又はＥＰＳＰ−
２７０−ブのいずれかを２×１０６Ｃｐ−／ＩＩｌ含む
新鮮な溶液中で、４８時間、３２℃で実施した。ＥＰＳ
Ｐ−３プＯ−ブは、ペチユニアゲノムでは殆んど用いら
れないコドン（ＡＴＡ）を含んでいるので、試験しなか
った。各場合で用いられたハイブリダイゼーションの温
度（３２℃）は、混合液中で最低のＧＣ含量をもつオリ
ゴヌクレオチドに対し計算された解ｌｌ温度（Ｔｄ）よ
りも１０℃低いものであった。ブＯ−ブのＴｄは公式２
℃Ｘ　（Ａ＋Ｔ）＋４℃ｘ　（Ｇ＋Ｃ）により近似させ
た。

（０）濾紙洗浄 ６倍ＳＳＣ中で１５から２０分間室温で２度、それから
５分間３７℃でゆるやかに振盪しなから濾紙を洗浄した
。それから濾紙をプラスチックフィルムでくるみ、２枚
のインテンシフアイ・スクリーンを用いて、−７０℃で
１２から１４時間オートラジオグラフをおこなった。先
に用いたよりも５℃高い温度でゆるやかに振盪しながら
５分間前Ｔｊａ紙を洗浄した。濾紙について再び１２か
ら１４時間オートラジオグラフをおこなった。オートラ
ジオグラフの結果、プローブＥＰＳＰ−１はＭＰ４−Ｇ
細胞系列のポリ−Ａ　　ＲＮＡを含むレーンで約１．９
ｋｂのＲＮＡとハイブリダイズした。

゛このＲＮＡに対するハイブリダイゼーションは、ＭＰ
−４細胞系列のポリ−Ａ　　ＲＮＡを含むレーンでは検
出されなかった。この結果は、ＭＰ４−Ｇｉｌ胞系列系
列るＥＰＳＰＳ　　ｍＲＮＡの過剰産生によるものであ
った。１個のヌクレオチドがＥＰＳＰ−１と異なるブＯ
−ブＥＰＳＰ−２は、ＭＰ４−Ｇ細胞系列の１．９ｋｂ
　　ｍＲＮＡとわずかに検出可能なハイブリダイゼーシ
ョンを示したが、両細胞系列の１．Ｏｋｂ　　ｍＲＮＡ
とは強くハイブリダイズした。しかしながら、１．０ｋ
ｂＤＮＡは５００００ダルトンのボリベチドを暗号化す
るには充分ではなかった、モしてＥＰＳＰ−２プＯ−ブ
の配列の１つが、ライブラリーの全く異なる配列とハイ
ブリダイズしたと信じられている。これらの結果は。同
義性のプローブ混合物ＥＰＳＰ−１がＥＰＳＰＳの正確
な配列を含むことを示唆した。この混合物を次の全ての
同義性のプローブハイブリダイゼーション実験に使用し
た。

Ｅ、λＣ１ｔ　１０ｃＤＮＡライブラリーの調製（２）
使用材料 ＡＭＶ逆転写酵素は生化学アメリカ社（セントビータス
バーグ、フロリダ州）から入手した：ＤＮＡポリメラー
ゼｌのラージフラグメント（フレノウ・ポリメラーゼ）
は、ニューイングランド・ヌクレアー（ボストン、マサ
チュウセツツ州）から、Ｓ１ヌクレアーゼ及びｔＲＮＡ
はシグマから、ＡｃＡ３４力ラム担体樹脂はＬＫＢ社（
ガイサースバーグ、メリーランド州）から、ＥｃｏＲＩ
、ＥｃｏＲＩメチラーゼ及びＥｃｏＲ１リンカ−はニュ
ーイングランド・バイオラボ社（ベバリー、マサチュウ
セツツ州）から、ＲＮａｓ　ｉ　ｎ　（リボヌクレアー
ゼ阻害剤）は、プロメガ・バイオチック社（マジソン、
ウィスコンシン州）から、そして、全ての放射活性化合
物はアマジャム社（アーリントンＨｒｓ、イリノイ州）
から入手した。

λａｔ１０ベクター（ＡＴＣＣＮα４０１７９）及び付
随する大腸菌細胞系列は、スタンフォード大学医学部の
サン・ヒューン及びロナルド・デイビスにより提供され
た（ヒューン（１９８５年）参照）。このベクターは３
つの重要な性質を有する：（１）新しいＤＮＡを挿入す
る前にファージＤＮＡからＤＮＡの中央部分を除去する
必要を避ける唯一のＥＣＯＲＩ挿入部位をもつ。（２）
Ｏから約５ｏｏｏ塩塁の範囲のＤＮＡをこのベクターを
用いてクローニングできる。（３）ライブラリーをＤＮ
Ａ挿入を有しないクローンを除去するために大腸菌ＭＡ
１５０細胞（ＡＴＣＣＮα５３１０４）を用いてブＯセ
スできる。

（ハ）ＣＤＮＡ第１鎖の合成 ポリ−Ａ　　ｍＲＮＡを例１．Ｄ、ａに述べられている
ように調製し、５０ｍ）４　　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐｔ１
８．５）、１０賜ＨＭｑＣＩ　　、４＋ＨＤＴＴ、４０
ｍ）４ＫＣｌ、５００μＨｄ　ｌ：ＡＧｃＴ）ＴＰ、１
０Ｈｇ／ｄｄＴ　　　　ブライマー及び２７．５単位／
ｄＲＮａｓ　ｉ　ｎに再懸濁した。１２０μＡの反応容
量で、７０単位の逆転写酵素を５μ９のポリ−Ａ　　Ｒ
ＮＡに対して添加した。１本の反応試験管には、ｃＤＮ
Ａの大きさと収量を監視し、その後の反応をモニターす
るための最初の鎖のＷＩ識を提供するためにα−３２Ｐ
−ｄＣＴＰ（５μＣｉ／１２０１１１反応系）を含有さ
せた。ｍＲＮＡの２次構造を破壊するため、Ｈ２Ｏ中で
ＲＮＡを７０℃３分間保温し、試験管を水中で冷却した
。逆転写酵素を添加し、ｃＤＮＡ合成を４２℃で６０分
間実施した。反応は、Ｅ［）Ｔ八を５ＱｍＨまで添加す
ることにより停止させた。ＣＤＮＡの収量は、反応開始
時及び６０分後に除去した試料のＴＣＡ沈澱によりモニ
ターした。ｃＤＮＡ合成の後、ＣＤＮＡはｃＤＮＡ−Ｒ
ＮＡ雑種（ハイブリッド）として存在した。このｃＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドを沸ｍ湯浴中で１．５分間混合
物を熱処理することにより変性させ、次いで氷で冷却し
た。

（へ）第２の鎖ＤＮＡ合成 単鎖ｃＤＮＡを第２鎮合成のためにセルフ・プライムさ
せた。フレノウ・ポリメラーゼ及び逆転写酵素の両者を
使用して、単鎖ＣＤＮＡを二重鎖ｃＤＮＡに変換した。

クレノウボリメラーゼはその３’　−５’　オキソヌク
レアーゼ修復機能がセルフ・ブライミングにより生じた
ＤＮＡの非平滑末端を消化し、それから、そのポリメラ
ーゼ活性でこれらの平滑末端をひろげることができると
信じられているので、最初に用いる。逆転写酵素は１度
鋳型鎖に結合すると未成熟に止まってしまうことは殆ん
どないと信じられているので、フレノウ・ポリメラーゼ
に添加して使用する。フレノウ・ポリメラーゼの反応は
、酵素を除いて最終容量１００μｍで行なった。反応系
は、５ＱｍＨＨＥＰＥＳ、　　ｐＨ６，９、１０賜ＨＭ
ＱＣｊ２　　、５０＋ａＨＫＣｌ、ｄＮＴＰ及びＣＤＮ
Ａをそれぞれ５００ｉＨ含んでいた。反応開始の為に、
２０から４０単位のフレノウ・ポリメラーゼ（通常５μ
オ未満）を添加し、試験管を１５℃で５時間インキュベ
ートした。反応は、ＥＤＴＡを５０−Ｈまで添加するこ
とにより停止させた。混合液をフェノールで抽出し、核
酸を沈澱、遠心次いで乾燥した。

ざらに杭相補［）ＮＡ鎖を拡張するための逆転写酵素の
反応を、ｄＴ　　　　プライマー及びＲＮａｓ　ｉ　ｎ
含まず、３２単位の逆転写ＩＩｌ素を１２０μｌの反応
液中で使用して本来は合成ｃＤＮＡのための反応と同様
にして実施した。反応はＥＤＴＡを５０ｎＨまで添加す
ることにより停止させた。混合液を等量のフェノールで
抽出し、＠酸を沈澱、遠心及び乾燥した。

ゆＳ１ヌクレアーゼ処理 ２倍（７）８１緩衝液（１倍（７）８１　！衝１ａＬｔ
、３０輸Ｈ酢酸ナトリウム、ｏｔ１４．４．２５０μｌ
１ＭＮａＣｊ、１１ＨｚｎＣ１２）２００μｌ、Ｈ２Ｏ
（水）１７５μオ及び５２５単位の８１ヌクレアーゼを
第２鎮合成反応生成物１２５μｌを含む試験管に添加し
た。試験管を３７℃で３０分間保温し、反応は、ＥＤＴ
Ａを５０ｍＭまで添加することにより停止させた。混合
液を等量のフェノール／クロロホルム（１；１）で抽出
した。水層を残存フェノールを除去するためにエーテル
で抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させて、風乾し
た。

（ｅ）ＥＣＯＲＩＣＯＲ化反応 二重鎖（以下ｄｓという）ｃＤＮＡは、多種のｍＲＮＡ
から複写されるので二重鎖ｃＤＮＡの多くは内部にＥＣ
ＯＲＩ制限部位を多分含んで層ったのであろう。そのよ
うなＥＣＯＲＩ切断部位をＥｃｏＲＩ切断から保護し、
順次ＥＣＯＲＩで切断して末端に付着突出部をつくる平
滑端のＥｃｏＲＩリンカ−を使用できるようにすること
が望まれた。

内部ＥＣＯＲＩ部位での望まざる切断を防止するために
、ｄｓｃＤＮＡをＥＣＯＲＩメチラーゼを用いて、メチ
ル化した。ＤＮＡの遠沈分離物を５０ｍＨＴｒ　ｉ　ｓ
、ｐＨ７，５，１ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ、５１８　　ＤＴ
Ｔ４０μｊ！Ｉｃ溶解シタ。１ｏｏμＨ８−アデノシル
−Ｌ−メチオニン４μｌ及びＥＣ０ＲＩメチラ一ゼ２μ
ｍ（ｓｏＩＪｉ位）を添加した。試験管を３７℃で１５
分間インキュベートし、次いでメチラーゼを殺滅するた
め７０’Ｃで１０分間加温した。

その後、以下に述べられているメチル化反応は明らかに
不活性なメチル化反応試薬のために、ＥＰＳＰＳ＠読領
域内部の部位でのＥｃｏＲＩ切断を妨げられずに失敗し
たことが見い出された。

以下に述べるように、内部ＥＣ０Ｒ１部位の切断は、全
長ＣＤＮＡを単離するための付加的工程を必要した。別
のライブラリーが作製されるときにこれらの付加的工程
を回避するためには、メチル化試薬及び反応条件がＣＤ
ＮＡ及び対照のＤＮＡ断片について同時に使用されなけ
ればならず、消化がｃＤＮＡについて実施される前に、
対照の断片の保護がＥＣ０ＲＩ消化により確かめられな
ければならない。

（ｆ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼｌ補充反応（上述のよ
うに調製された）ｃＤＮＡ４５μｌを含む試験管に対し
て、０．１ＨＭａＣ１２５μｍ、０．２ｍＨｄ　（ＡＣ
ＧＴ）ＴＰ５μｌ及び１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ
を添加した。試験管を室温で１０分間インキュベートし
た。反応はＥＤＴＡを２５１８まで添加して停止させた
。１μ９の未切断のλＱ　ｔ　１０ＤＮＡを運搬体とし
て添加して、混合液は、フェノール／クロロホルム（１
：１）で抽出した。混合液中の核酸はフェノール／クロ
ロホルム（１：１）で沈澱させた。混合液中の核酸をエ
タノールで沈澱させ、遠心乾燥させた。

（２）メチル化ｄｓｃＤＮＡへのＥＣＯＲＩリンカ−の
リゲーション 約４００　ＤＩｏｌｅのＥＣＯＲＩリンカ−（５′ＣＧ
ＧＡＡＴＴＣＣＧ　　３’　）を、５０μＣｉのα−３
２Ｐ−ＡＴＰ　（５０００Ｃｉ　／ｇｖｏｌｅ　）及び
２単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む２０１１
１８Ｔｒ　ｉ　Ｓ、　ＤＨ８，０１１０ｍ１４　　Ｍｇ
Ｃｌ　　、１０ｍＨＤＴＴ９μｍに溶解させた。オリゴ
ヌクレオチドは、２本鎖の平ｍ端リンカ−をつくるよう
互いにアニール化するまで３７℃で３０分間インキュベ
ートした。２単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び
１０１ＨＡＴＰＩμｌを添加し、ざらに３０分間３７℃
でインキュベートした。リンカ−は−２０℃で保存した
。メチル化ＤＮＡペレットを４００　ｎｏｔｅのキナー
ゼ処理したリンカ−を含む試験管中に再懸濁させた。メ
チル化ＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカ−のリゲーションを
Ｔ４リガーゼ１μｌを添加し、反応系を１２から１４℃
で２日間インキュベートすることにより実施した。

（へ）付着末端作製のためのＥＣＯＲ［消化実施例１．
Ｅ、　＠の反応産物１１μｌに対して、５０ｍＨＴｒ　
　ｉ　　ｓ、ＤＨ７，５，１０ａＨＭｏｎｏ　　、２０
０ｉＨＮａＣｊ！を含む溶液１０μｌを添加した。Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを、７０℃で１０分間インキュベートす
ることにより加熱不活性化した。４０単位のＥＣＯＲＩ
を添加し、３７℃で３時間インキュベートした。反応は
ＥＤＴＡを５０＋Ｈまで添加して停止させた。試料を遠
心により浄化し、ＡＣＡ３４カラムに充填した。

（ｉ）　Ａ　ＣＡ　３４カラムクＯマドグラフイ（ｄｓ
ｃＤＮＡに連結されていない）自由な（未結合）リンカ
−は、クローニング・ベクターへ所望のｄＳＣＤＮＡの
挿入の妨げとならないようにするために、付着リンカ−
をもつｄｓＤＮＡから除去した。２１１１８クエン酸緩
衝液及び０．０４％窒化ナトリウム水溶液で予め膨潤さ
せたＡｃＡ３４樹脂（アクリルアミド及びアガロースビ
ーズの混合物、通常大きさ測定に使用される）を、グラ
スウールで栓をした１μｌプラスチツク製注射器の１ｍ
の目盛のところまで添加した。カラムを、１　　ｏ　ｌ
ｉ８　　　　Ｔｒ　　　ｉ　　　５Ｈｃｊ！、　　　１
）ｔ１７．　　５　　、　１　ｍＨＥＤＴ八、４００ｍ
ＨＮａＣ１で平衡化１．、　ｆｃ。連結されたリンカ−
及び自由なリンカ−をもつｄ　Ｓ’ＣＤ　Ｎ　Ａ混合液
（〜４５μｆ）を４００　ｍＭＮａＣｊ！どなるよう［
１した。０．５％ブロモフェノール・ブルー色素（ＢＰ
Ｂ）１μｌを添加し、試料を、室温で平衡化緩衝液を流
したカラムに充填した。２００μλずつ１０本の両分が
集められた。ＢＰＢ色素は通常６本口の試験管あるいは
それ以降にカラムから溶出した。試験管１及び２を合わ
せ、クローニングのｄｓｃＤＮＡの材料とし。

て使用した。

Ｏ）λａｔｌｏクローンの集合 ｄｓｃＤＮＡを１μりのＥＣＯＲ［切断λｇｔ１０ＤＮ
Ａと混合し、エタノールにより沈澱させ、遠心分離した
。７０％エタノールで１度ペレットを洗浄した後、当該
ＤＮＡペレットを風乾し、１０ｍＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣ
ｊ！、ＤＨ７，５，１１０ｌ１１＋ＶｔｑＣＪ　　、５
０＋＋ＨＮａＣｊ！４．５μｊ！に再熱濁した。λＱｔ
　１０ＤＮＡの左腕及び右腕へのｃＤＮＡ挿入をアニー
ルするために、混合液を７０℃で３分間加熱し、更に、
５０℃で１５分間加熱した。混合液を水中で冷却し、少
なくとも９０％の完成を確実にするために、１０ｍＨＡ
ＴＰ、０．１８　　ＤＴＴ及び十分なＴ４ＤＮＡリガー
ゼをそれぞれ０．５μｌ添加した。反応液を１４℃で１
晩インキユベートし、ｄｓｃＤＮＡのλｇｔ１０ＤＮＡ
のＥｃｏＲＩ部位への挿入をおこなわせた。得られたＤ
ＮＡは、シェラ−（１９８１年）により述べられた方法
を用いて試験管内でファージ粒子へ包み込んだ。

（ｋ）挿入をもたないファージの除去 λＱｔ　１０ＤＮＡのＥＣＯＲ１部位へのｃＤＮＡの挿
入は、Ｃ°１遺伝子の不活化を旧来する。不活化された
Ｃ１遺伝子をもつ（即ち、挿入をもつ）λｑｔｉｏファ
ージは、通常大腸菌Ｍ△１５０１［１胞で複製する。対
照的に、挿入をもたないλＱｔ１０ファージは大腸菌Ｍ
Ａ１５０株では複製できない。これは、挿入をもたない
λｇｔ１０クローンを除去する方法を提供することとな
る。

ライブラリー中のファージはまず、ファージを大腸菌Ｍ
Ａ１５０の制限系から保護するために、λＱ　ｔ　１０
ＤＮＡを修飾した大腸菌ＣＣ６００（”　Ｒ−）細胞で
複製させた。相対的に小数の大腸菌０６００１Ｂ胞が感
染し、それから、２０倍に過剰のＭＡ１５０（（Ｍ　　
Ｒ）細胞と平板培養した。それ故、最初の感染は、全て
のファージが生育するＭ＋Ｒ−細胞で起こったが、挿入
なしのファージの複製を妨げるＭＡ１５０細胞中で複製
を連続して行なった。増幅されたファージ・ライブラリ
ーを平板から集め、遠心により寒天及び他の混入物を除
去した後、組換えファージを検索試験に使用するために
用意した。

Ｆ、ｃＤＮＡライブラリーの検索：ｐＭＯＮ９５３１の
選択 （各平板）約６０００のファージを、０．７％アガロー
スの固形ＮＺＹ寒天（マニアテイス、１９８２年）の１
００ｍ×１０ｃｍの角形平板に塗布した。半透明の大腸
菌ＭＡ１５０細胞が平板上で生育した。ファージが感染
し、大腸菌細胞を殺減した領域は、３７℃で１晩平板を
インキュベートすることにより叢生したＩ細菌に対して
、肉眼判別できる「プラーク」と呼ばれる透明な領域と
し示された。この方法で６枚の平板を調製した。プラー
クを約３０分間予め切断しであるニトロセルロース濾紙
におしつけた。これは、プラークの対称的なレプリカを
形成した。ファージＤＮＡを押し付けるために、濾紙は
５分間０．５８　　ＮａＯＨ及び２．５）４　ＮａＣｆ
で処理した。次いで、濾紙を順次、ＮａＯＨを中和する
ために、１．０ＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｆｌ）８７．５及
び２．５８　ＮａＣｆを含む０，５８　Ｔｒ　ｉ　５Ｈ
ｃｊ！　　ＤＨ７，５で処理した。その後濾紙を細胞残
漬の除去のためにクロロホルムに浸漬した。その後、濾
紙を風乾し、真空下８０℃で２時間焼き、室温で冷却し
た。更に濾紙を実施例１　、０　Ｃｅ）に述べたように
３２Ｐ標識ＥＰＳＰ−１プローブとハイブリダイズした
（２０）Ｘ１０６ＣＤＩ１１／濾紙）。ハイブリダイゼ
ーションの４８時間後、濾紙を６倍のＳＳＣで、室温２
０分間を２回、それから３７℃で５分間洗浄した。

この洗浄により非特異的に結合したプローブ分子が除去
され、一方（その時点では未知の）正確に対応する配列
をもつプローブ分子は、濾紙上のファージＤＮＡに結合
したままであった。最終洗浄の後、濾紙をオートラジオ
グラフィによ・り分析した。最初の検索工程の後、７個
の陽性ハイブリダイズ信号がオートラジオグラム上に黒
い点として出現した。これらのプラークを平板から取り
出して、平板あたり１００から２００プラークの密度で
再度新鮮な平板に塗布した。これらのプレートを、上述
の手法を用いて検索した。４個の陽性なハイブリダイズ
したファージが選択された。

ＤＮＡをこれらの４個のクローンそれぞれから分離して
、ｃＤＮＡ挿入部の大きさを測定するためにＥＣｏＲＩ
で消化した。＠も大きなｃＤＮＡＷＩ人、約３３０ｂｏ
を含むクローンを選択して、λＥ３と命名した。λＥ３
のｃＤＮＡ挿入部をプラスミドｐＵｃ９　（ダイ−９１
９８１年）に挿入し、得られたプラスミドをｐＭＯＮ９
５３１と命名した。

＄）ＭＯＮ９５３１りＯ−ンが所望のＥＰＳＰ３配列を
含むことを確認するために、ＥｃｏＲＩ消化により挿入
をｐＭＯＮ９５３１クローンから除去した。次いで、こ
のＤＮＡ断片を、マキサム（１９７７年）の化学分解法
によりシーケンスした。ヌクレオチド配列から予想され
るアミノ酸配列は、表１に示されたＥＰＳＰＳの部分的
なアミノ酸配列と一致した。

Ｇ、λＥ７ゲノムＤＮＡクローンの創出完全なＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子を得るために、Ｍ　Ｐ　４　Ｇ＠胞系の染色体
ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、ライブラリー創出のため
にファージベクターにクローン化して、プローブとして
ｐＭＯＮ９５３１のＥＰＳＰＳ部分配列を用いてスクリ
ーニングした。

（２）ＭＰ４−Ｇ染色体ＤＮＡ断片のｙ４製ＭＰ４−Ｇ
細胞を液体窒素存在下で凍結し、粉砕ガラスと共に乳鉢
中で粉砕した。粉末細胞は、８、ＯＨ尿素、０．３５８
　ＮａＣ１，０，０５８Ｔｒ　ｉ　４３−ＨＣＪ　（ｐ
Ｈ７，５）　、０．０２８ＥＤＴＡ１２％サルコシル及
び５％フェノールを含む冷却した融解緩衝液と１ｇあた
り８ｄで混合された。混合液を大きな塊がこわれるまで
、ガラス棒で攪拌した。５％イソアミルアルコールを含
むフェノール及びクロロホルムの３：１混合液を等最添
加した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を終濃度０
．５％まで添加した。混合液を室温で１０から１５分間
回転台上でＷｉ痒した。６０００９で１５分間の遠心に
より相の分離を行なった。

フェノール／クロロホルム抽出を繰り返した。酢酸ナト
リウムを終濃度０．１５８まで水層に添加して、ＤＮＡ
をエタノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心により回収し
て、１倍のＴＥ（１０ｍＨＴｒ　ｉ　ｓ　　ＨＣＪ！、
ｐＨ８，０，１ｍ８　　ＥＤＴＡ）に溶解し、ＣｓＧ１
−臭化エチジウム密度勾配でバンドを形成させた。ＤＮ
Ａを１６ゲージ針で試験管の横に細孔をあけて回収した
。臭化エチジウムをＣ５Ｃｊ！飽和のイソプロパノール
で抽出し、ＤＮＡを１倍ＴＥで充分に透析した。約４０
０μりのＤＮＡが１２９の細胞から分離された。

ＭＰ４−Ｇ染色体ＤＮＡ（１０μ７）を１０＋ＨＴｒｉ
ｓ、ｐＨ７，８，１＋ＨＤＴＴ、１０＋ｎＨＶ（ＣＪＣ
Ｉ　　、５０１１１４　　ＮａＣｆを含む緩衝液で、３
０単位のＢａｍＨＩを用いて、２時間３７℃で完全に消
化させた。ＤＮＡをフェノール続いてクロ０ホルムで抽
出して、エタノールで沈澱させた。

ＤＮＡ断片を１倍のＴＥに０．５μｇ／μｉ濃度で懸濁
させた。

ｔｊＭＰ４−Ｇ染色体ＤＮＡ断片の２ＭＧ１４へのクロ
ーニング （ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部のメ
イナード・オルソン博士より得た）ファージλＭＧ１４
のＤＮＡをマニアテイス（１９８２年）が述べている方
法により調製した。１０＋ａＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！
、ｐＨ７，８，１ｍａＨＤＴＴ、１０ｍＨＭＱＣｊ！　
　、５０＋ｅＨＮａＣ１を含む緩衝液で１５０１１９の
ＤＮＡをＢａｍ）−ＩＩを用いて完全に消化した。消化
の完全度を０．５％アガＯ−スゲルによる電気泳動によ
り検査した。次いでファージＤＮＡを、フェノールクロ
ロホルムーイソアミルアルコール（２５：２４：１）で
２度抽出し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを１倍の
ＴＥに１５０μｇ／ｌｌｌ１！の濃度で再懸濁させた。

ＭｑＣ１２を１０１１１８まで添加し、λＤＮＡの付着
端を再アニーリングさせるために４２℃で１時間インキ
ュベートした。アニーリングはアガロースゲル電気泳動
で検査された。

アニーリング後、ＤＮＡをベックマン５Ｗ２７超遠心チ
ユーブ中の（１０から４０％、ｗ、’ｖ）ショ糖勾配３
８ａｉ２に重層させた。勾配溶液は１ＨＮａＣｊ！、２
０ｓＨＴｒ　ｉ　ｓ　　ＨＣＪ　（＋）Ｈ８、Ｏ）、５
Ｉｌ＋ＨＥＤＴＡを含む緩衝液で調製した。７５μ７の
ＤＮＡを各勾配上に充填した。試料を、ペックマン５Ｗ
２７０−ターで、２６０００回転、２４時間、１５℃で
遠心した。両分（０，５−）を遠心チューブの上部から
集め、ゲル電気泳動によりＤＮＡの存在について分析し
た。

λＤＮＡの焼きなましだ（アニールした）左腕及び右腕
を含む画分を一緒に集め、ＴＥに対して透析し、エタノ
ールで沈澱した。沈澱を７０％エタノールで洗浄し、乾
燥させた。ＤＮＡをＴＥに５００μ９／ｒｔｄｌの濃度
で溶解させた。

精製されたベクターＤＮＡの腕及びＭＰ４−ＧＤＮＡの
３ａｍＨＩ断片を４＝１及び２：１の分子比で混合し、
６６ｓＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　　ｐＨ７，５，５ｍ
ＨＭｑＣｊ　　、５ＩＩＩＨＤＴＴ及び１１ＫＡＴＰを
含むリガーゼ緩衝液でＴ４　　ＤＮＡリガーゼを用いて
リゲートさせた。リゲーションは１晩１５℃で実施した
。リゲーションはアガロースゲル電気泳動により検査し
た。ＭＰ４−ＧＤＮＡの挿入をもつリゲートされたファ
ージＤＮＡは、市販のパッケージングエクストラクト（
プロメガ・バイオチク社製、マジソン、ウィスコンシン
州）を用いて、試験管内でファージの殻に包み込ませた
。パッケージングされたファージを、大島国Ｃ６００細
胞を用いて、平板あたり約６０００プラークの密度で０
．７％アガロースのＮＺＹ寒天の１０１×１０１角形平
板に塗布した。

３７℃で１晩インキユベーシヨン後、プラークが形成さ
れた。次いで、平板を恒温器から取り出し、４℃で少な
くとも１時間冷却された。寒天平板をファージを濾紙に
移すために３０分間ニトロセルロース濾紙におしつけた
。そして、先に述べたようにファージＤＮＡが濾紙に固
定された。各ｍ紙は４０時間４２℃で、マニアナイス（
１９８２年）が述べている手法を用いて、ニックトラン
スレーションされたＤＭＯＮ９５３１クローンから単離
された３３０ｂｐのＣＤＮＡ挿入部分と濾紙あたり約１
．０Ｘ１０６ＣＤｌでハイブリダイズした。プローブの
比活性はＤＮＡ１μりあたり２から３×１０８ＣＤＩで
あった。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミ
ド、５倍の５ＳＣ１５倍のデンハルト溶液、２００μ９
／ｄｔＲＮＡ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中でおこな
った。濾紙を５０℃で、１倍のＳＳＣ，０，２％ＳＤＳ
中で洗浄し、オートラジオグラフにかけた。数個の陽性
信号が観察され、相当する平板上のプラークと一致した
。

選択されたプラークはつり上げられ、ＳＭ緩Ｉｉｉ液に
懸濁させ、ＮＹＺ寒天上に塗布した。レプリカ平板スク
リーニング工程は、平板上の全てのプラークが陽性信号
を示すまで、低密度で繰り返された。１個のプラークを
さらに解析するために選択し、λＦ７フアージクローン
と命名した。

ＬＥ）ＭＯＮ９５４３及びｐＭＯＮ９５５６の創出λＦ
７ＤＮＡをＢａｍ）ｌＩ、ＢｇＡＩＩ、ＥＣ０ＲＩ及び
Ｈｉ　ｎｄＤＩで（別々ニ＞消化シｔ、ニー。

ＤＮＡをサザン・プロット法を用いて、ｐＭＯＮ９５３
１のニックトランスレーションされたＥＰＳＰＳ配列と
ハイブリダイズした。これからλＦ７の相補配列は４．
８ｋｂのＢにｌｉ’　Ｉｔ断片上にあることが判明した
。この断片をプラスミドｐｕｃ９＜ヴイーラ、１９８２
年）に挿入、複製、ニックトランスレーションさせ、実
施例１．０に述べられているようなハイブリダイゼーシ
ョンの条件下で、濾紙あたり１０６ＣＤＩを用いて、ペ
チユニアのＣＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使
用した。λＦ７配列に結合した配列をもつｃＤＮＡりＯ
−ンを確認し、ＣＩＭＯＮ９５４３と命名した。

ＤＮＡ配列解析（マキサム、１９７７年）から、ｐＭＯ
Ｎ９５４３はＥＰＳＰＳ遺伝子の終止コドン又は３′非
翻訳ｆＩ域を含まないことが判明した。

それ故、ＥＰＳＰＳ配列をｐ　Ｍ　ＯＮ　９５４３から
はずし、ニックトランスレーションし、再度ＣＤＮＡラ
イブラリーを検索するためのプローブとして使用した。

ＥＰＳＰＳ配列とハイブリダイズしたクローンを確認し
ｐＭＯＮ９５５６と命名した。ＤＮＡ配列解析から、こ
のクローンの挿入はポリアデニル化された尾部を含むＥ
ＰＳＰＳ遺伝子の完全な３′領域を含むことが判明した
。この挿入の５’　ＥｃｏＲＩ端は、ｐＭＯＮ９５３１
のＥＰＳＰＳ挿入の３’　ＥＣ０ＲＩ端と一致した。

完全にＥＰＳＰＳ解読配列をｐＭＯＮ９５３１とρＭＯ
Ｎ９５５６のＥＰＳＰＳ挿入をリゲートすることにより
創出した。

ｐＭＯＮ９５３１の中のＥＰＳＰＳ挿入部を、ＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子の５′非翻訳領域にＢＱｊＩＩ部位を作製する
ために、Ｍ１３ベクター（メツシング、１９８１年及び
１９８２年）を用いて、部位特異的突然変異誘発（ツオ
ラー等、１９８３年）により修飾させた。修飾されたＥ
ＰＳＰＳ配列はＥＣ０ＲＩ及びＢＱｊ！ＩＩ消化により
分離され、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ５３０に挿入
され、その結果、第１図に示したようなｐＭＯＮ　５３
６が得られた。３５８−ＮＯＳカセットをもつｐＭＯＮ
５０５の誘導体ＤＭＯＮ５３０が、ｐＭＯＮ５２６へｐ
ＭＯＮ３１６の２．３ｋｂの５ｔｕＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ
断片を移すことにより創出された。プラスミドｐＭＯＮ
３１６　（第４図参照）は、５′　リーダー及びＮＯＳ
ポリアゾニレ−ジョン信号の間に、制限エンドヌクレア
ーゼＢＱｊ！　ＩＩ、ＣＩａＩ、　ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ
及びＥｃｏＲＩの単一の切断部位をもつ共統合型中間ベ
クターである。これらの切断部位は、ＣａＭＶ３５８転
写リーダー配列にすぐ隣接するそれ自身の翻訳開始信号
をもつ解読配列の挿入を保証する。３１６ブラスミドは
、形質転換された植物組織の選択のためのキメラのカナ
マイシン遺伝子＜ＮＯ８／ＮＰＴＩＩ／Ｎ０８）及び子
孫における形質転換体及び遺伝的形質を簡単に区別する
ためのツバリン・シンターゼ遺伝子同様、大腸菌及び乙
久旦バクテリウム・テユメファシエンスの選択のための
スペクチノマイシン耐性を含むｐＭＯＮ２００の全ての
性質を保持している。プラスミドｐＭＯＮ５２６は、Ｓ
ｍａ　１部位がＸｍａＩによる消化、フレノウ・ポリメ
ラーゼ処理及びリゲーションにより除去された単純な ｐＭＯＮ５０５の誘導体である。得らたれプラスミドｐ
ＭＯＮ５３０　（第１図）は、ＤＭＯＮ　５０５の性質
を保持しており、３５８−ＮＯ８発現カセットは、プロ
モーター及びポリアゾニレ−ジョン信号の間にＳｍａＩ
の唯一の切断部位を含む。

ｐＭＯＮ９５５６由来の１．６２ｋｂのＥＣ０ＲＩ−Ｅ
ＣＯＲＩ断片は、ｐＭＯＮ５４６を得るために、ｐＭＯ
Ｎ５３６に挿入された。ＣＩＭＯＮ　５３０がすでにＢ
Ｃ１ｊ！ＩＩ部に隣接してカリフラワー・モザイク・ウ
ィルス（ＣａＭＶ）の３５８プロモーターを含んでいた
ので、これは、Ｄ　Ｍ　ＯＮ　５４６の中にキメラのＣ
ａＭＶ／ＥＰＳＰＳ遺伝子を創出した。

第１図に示されたように、プラスミドｐＭＯＮ５４６は
（１）　Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓ　／　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ
　Ｓ遺伝子（クカナマイシン耐性（Ｋａ−ｓＲ）の選択
マーカーハレ 遺伝子　（３）計測可能マーカーとしてのツバリン・シ
ンターゼ（ＭＯＳ）遺伝子及び（４）アグロバクテリウ
ム・テユメファシエンスにより、効果的に全プラスミド
が「転移ＤＮＡＪ　　（Ｔ−ＤＮＡ）領域として処理さ
れるようにＴ−ＤＮＡの右側の境界を含んでいた。この
プラスミドを、補助プラスミドｐＧＶ３１１１ＳＥを含
むアグロバクテリウム・テユメファシエンス細胞に挿入
した。補助プラスミドは、ｐＭＯＮ５４６ＤＮＡが植物
細胞染色体に挿入されるのに必要な茨、８種の鮮素を暗
号化する。それは又、細菌で機能す、カナマイシン耐性
遺伝子を含む。

ｐＭＯＮ５４６及びｐＧＶ３１１１−８Ｅを含むアグロ
バクテリウム・テユメファシエンスの培養はアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクシヨン（ＡＴＣＣ）に寄
託され、その寄託番号はＡＴＣＣ第５３２１３号である
。必要に応じて、これらのプラスミドのどちらか一方は
標準的方法論を用いて細胞の培養から分離される。例え
ば、これらの細胞をｐＲＫ２０１３　（デイツタ、１９
８０年）のような流動プラスミドをもつ大腸菌で培養す
る。ＳＤｃ／ｓｔｒ　　、ｋａｎＳｌ、：なった細胞は
ｐＭＯＮ５４６を含み、一方、ｋａｎＲ１ＳｐＣ／５ｔ
ｒＳになツタ細胞はｐＧ■３１１１−８Ｅを含む。

直径６ａｎ（１／４インチ）の菓デイクスを表面を滅菌
したペチユニアの葉から切り取った。それらを、２日間
ＭＳ１０４寒天培地上で、傷ついた表面のところでの部
分的な細胞壁形成を促進するために培養した。その後、
葉ディスクを予じめルリア・ブロース中２８℃でゆるや
かに１晩１ｔ！盪培養しておいたｐＭＯＮ５４６及びｐ
、ＧＶ３１１１−８Ｅの両者を含むアグロバクテリウム
・テユメファシエンスｉ胞の培養液の中に浸漬した。Ｉ
Ｉｌ胞を細菌懸濁液から除去し、吸い取り紙を用いて乾
燥し、ホルシュ（１９８１年）により述べられているよ
うに、タバコ細胞の「育成」培養培地上に置かれた濾紙
の上に逆さまにしてインキュベートされた。２ないし３
日後に、ディスクを５００μ９／ｍ１カルベニシリン及
びＯ，０，１，０，２５、又はＱ、５ｍＨグリホセート
（ナトリウム塩）を含み、育成培養を含まないＭＳ培地
のベトリ皿に移した。

対照組織は、補助プラスミドｐＧＶ３１１１−８Ｅ及び
ＮＯ３／ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ／ＮＯＳカナマイシン耐性遺伝
子及びｐＭＯＮ５４６と同じＮＯ８選択マーカー遺伝子
をもつがＣａＭＶ／ＥＰＳＰＳ遺伝子をもたないＴ−Ｄ
ＮＡ領域を含む別の植物形質転換ベクター１）ＭＯＮ５
０５を含むアグロバクテリウム・テユメファシエンス細
胞を用いて作製した。

グリホセートを含む培地に移行して１０日以内に、活発
に生育するカルス組織がグリホセートを含まない対照平
板上の全てのディスクの周辺で出現した。０６１１１１
Ｈグリホセートを含む培地で、対称ディスクと形質転換
組織の間に検出できる違いはほとんどなかった。０．２
５ｍＨグリホセートでは、対照ディスクからのカルスの
生育は殆んどなかった。一方、形質転換組織の実質的生
育が見られた。Ｑ、５ｍＨグリホセートで、対称ディス
クからのカルスの生育は全くなく、一方、かなりの数の
カルスが形質転換ディスクから生育した。このことによ
りＣａＭＶ／ＥＰＳＰＳ３！！仏子が形質転換細胞にグ
リホセート耐性を賦与したことが確認できる。

実施例３：ＧｌｙＲタバコ細胞 ム）から切り出し、上述のようにｏＭＯＮ　５４６（又
は対照１１１胞ではｐＭＯＮ　５０５　）及び補助プラ
スミドｐＧＶ３１１１−３Ｅをもつアグロバクテリウム
・テユメファシエンス細胞で処理した。

遺伝子を含まない細胞は検出できるカルス組織をつくら
なかったのに対して、ＣａＭＶ／ＥＰＳＰＳ遺伝子で形
質転換された細胞は０．５−Ｈグリホセートで、かなり
の發のカルス組織をつくった。

滅菌した大豆の１種、グリシン・カネセンスの胚軸切片
を実施例２に述べられているように、キメラのＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子を含むアグロバクテリウム・テユメファシエン
スで感染させた。通常のレベルの１０％のＭＳ塩（ギブ
コ）の培地、Ｂ５ビタミン、３ｇ／ｌショ糖、２■／１
ナフタリン酢酸、１■／ｊ！ベンジルアデニン及びＱ、
５ＩＩＩＨアルギニンを含む育成培養平板をｖＡ製した
。ｐＮはオートクレーヴ前に５．７に調整した。

感染された大豆胚軸を２６℃で２日間インキュベートし
、（ＭＳ塩が希釈されていないことを除いて）類似の培
地にざらに５００ＩＩ！９／ｆカルベニシリン、１１０
ＯＲ／ｌセフオタキシム及び１００１！１９／１カナマ
イシンを含んでいるものに移しかえた。これらの条件下
では、形質転換された大豆カルスのみが生育できた。

対照組織は、補助ＴｉプラスミドｐＴ　ｉ　Ｔ３７−３
Ｅ及び植物形質転換ベクターｐＭＯＮ２００をもつアグ
ロバクテリウム・テユメファシエンス細胞を用いて産出
した。（フレーリー等、バイオテクノロジー第３巻（１
９８５年）参照）。木用細占記載の如く共統合のｐＴ　
ｉ　Ｔ３７−３Ｅは、ＮｏＳ／ＮＰＴＩＩ／ＮＯＳカナ
マイシン耐性遺伝子及びＤＭＯＮ２００と同一のＮＯ８
計測可能マーカー遺伝子を有するが、ＣａＭＶ３５８／
ＥＰＳＰＳ／ＮＯ８遺伝子を有しないＴ−ＤＮＡ領域を
含んでいた。

この武装解除されたツバリン型Ｔｉプラスミドは、フレ
ーリー等（１９８５年）により述べられているのと類似
の方法でｐＴｉＴ３７からｐＴ　ｉ　８６３３−８Ｅ武
装解除オクトパイン型Ｔｉプラスミドを創出するために
創出した。一般的手法は、ｐＭＯＮ２００及びその誘導
体との組換えのための相同領域を提供するために、ｐ”
ｒ　ｉ　Ｔ３７Ｔ−ＤＮＡのほとんどをｐＭＯＮ２００
の選択マーカー及びｐＢＲ３２２と１１８部分で置き換
えることである。この置換は植物ホルモン生合成遺伝子
、ツバリン・シンターぜ遺伝子及びＴ−ＤＮＡの右の境
界を含むＴ−ＤＮＡの右側的８０％の欠失を旧来する。

ＯＴ　ｉ　Ｔ３７配列の材料は、デフラモンド等（バイ
オ／テクノロジー第１巻：２６２ページ、１９８３年）
により述べられたプラスミドＭＩＮＩ−Ｔｉを用いた。

このプラスミドは便利な材料である、しかしながら、こ
れらの同様のＴ１プラスミド部分は直接的にｐＴ　ｉ　
Ｔ３７又は関連するｐＴ　ｉ　Ｃ５８プラスミドから、
あるいは、ヘツブバーン等（ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・アンド・アプライド・ジエネテイクス第２巻：
２１１から２２４ページ、１９８３年）又はツアーム等
（モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイクス
第１９４巻＝１８８から１９４ページ、１９８４年）に
より述べられているような伯の方法で分離されたこれら
のプラスミドのサブクローンから得られた。

プラスミドＭＩＮＩ−Ｔｉは、ｐＴ　ｉ　Ｃ５８Ｋｐｎ
Ｉ断片１３．３、及び１２（デビッカー等、プラスミド
第３巻：１９３から２１１ページ、１９８０年）に類似
のＤＴｉＴ３７ＫＤｎＩ断片１３ｂ１４及び１１（デフ
ラモンド等、１９８３年）をもつｐＢＲ３２５の誘導体
である。植物ホルモン生合成遺伝子及び右境界を含む内
部Ｔ−ＤＮＡ配列をＤＭＯＮ２８４を産生するためにＨ
ｉｎｄｌＩｌ消化及び再すゲートによりｍ１ｎｉ−Ｔｉ
から除去した。ｐＭＯＮ２８４プラスミドはＫｐｎＩ消
化及びリンカ−の中央部にＢａｍ８１部位（５’−ＧＧ
ＡＴＣＣ）を含む次の合成リンカ−＝５’−ＣＧＧＡＴ
ＣＣＧＧＴＡＣ ＣＡＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣ の挿入によりＢａｍＨ１部位へ変換された唯一のＫｐｎ
Ｉ部位を含んでいる。このリンカ−を含むプラスミドが
分離されｐＭＯＮ２９３と命名された。

ｐＭＯＮ２９３プラスミドは、Ｔｉプラスミド中に方向
性に関して逆向きに互いに隣接し、ＢａｍＨ！リンカ−
により連結された次のｐＴ　ｉ　Ｔ３７断片をもってい
る。第１は１３ｂ断片の右端のＫｐｎＩ部位である。こ
の断片はＥ）Ｔ　ｉ　Ｔ３７Ｔ−ＤＮＡの左境界を含む
。それから、ＢａｍＨＩリンカ−に連結された１３ｂ断
片の左端がくる。ＫＤｎ１１１断片の右端がこれに連結
されている。この断片は、Ｔ−ＤＮＡの右に位置するＴ
ｉプラスミドを含み、ｐＴ　ｉ　Ｃ５８のＨｉ　ｎｄＩ
［１２断片（デビツカー等、１９８０年〉の右端である
Ｈｉｎ’ｄｌ［［部位で終わる。これはＫｐｎ１１３ｂ
断片の右端でＫｐｎＩ部位に又融合されているｐＢＲ３
２５誘導体プラスミドに連結されている。

ｐＴ　ｉ　７３７部分の間に、ｐＭＯＮ２００及びアグ
ロバクテリウム・テユメファシエンスに対するカナマイ
シン耐性選択マーカーとの相同性を導入するために、プ
ラスミドｐＭＯＮ２９２を構築した。プラスミドｐＭＯ
Ｎ２９２は、ｐＴ　ｉ　Ａ６のオクトパイン型Ｔ−ＤＮ
Ａの１．７ｋｂのＢＱＪ！ｎ（ヌクレオチド１６１７番
）から）１　ｉ　ｎｄｌｌｌ　（ヌクレオチド３３９０
番バーカー等、プラント・モレキュラー・バイオロジー
、第２巻：３３５ページ、１９８３年）の断片に連結さ
れた２０）６ｋｂのｐＢＲ３２２のＰｖｕＩＩからＨｉ
ｎｄｌｌｌの断片から成るＤＭＯＮｌ　１３の誘導体で
ある。ＬＩＨと呼ばれるこの部分は、以前にフレーリー
等（１９８５年）により述べられている。ＢＱｆＩＩ部
位が１）ＢＲ３２２部分と連結する前にフレノウ・ポリ
メラーゼで処理されることにり平滑末端にされた。

プラスミドｐＭＯＮ１１３を、＠　ｉ　ｎｄｌｌ［で切
断、フレノウ・ポリメラーゼで処理し、合成りａｍＨＩ
リンカ−に連結し、ＢａｍＨＩで消化しそして再度フレ
ノウ・ポリメラーゼで処理したＴｎ９０３　（岡等、ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１４
７巻、２１７ページ（１９８１年）（６０１））の１，
２ｋｂＡｖａＩＩ断片に連結した。ＬＩＨ部分に隣接し
てＴｎ９０３のカナマイシン耐性決定因子をもつ得られ
たプラスミドはＤＭＯＮ２９２と命名された。

ｏＭＯＮ２００相同領域及び細菌カナマイシン耐性マー
カーを、ｐＴ　ｉ　Ｔ３７部分の間に、＠　ｉ　ｎｄＩ
ＩＩ切断、クレノウボリメラーゼ処理及び３ａｍＨＩ切
断の後に分離されたｐＭ　ＯＮ　２９３由来の４５ｋｂ
１７）断片と、２．５ｋｂ　　ＰｖｕＩ［−ＢａｍＨＩ
断片の２個の断片とＨ＋　ｎｃＩ［で切断することによ
り線状化されたｐＭＯＮ２９２を混合することにより挿
入した。得られたプラスミドｐＭＯＮ３１３は次の断片
をこの順序でもつ。まず、Ｂａｍ）−ＩＩリンカ−及び
それに続くｐＴｉＴ３７ＫｐｎＩ断片１１の右側由来の
４、５ｋｂ　　Ｋｌ）ｎＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ１ｇｉ片。

これはｐＢＲ３２２の７５０ｂＤ　　Ｈｉｎｃｌ［−Ｈ
１ｎｄｌｌｌ断片とそれに続くカナマイシン耐性を暗号
化する１、２ｋｂのＴｎ９０３部分に連結される。これ
に、ＬＩＨ（ＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＢＱＩＩＩ断片）及び複
製開始点をもつｐＢＲ３２２のｐｖｕ■−Ｈｔｎｃｎ断
片が続く。次に、Ｔ−ＤＮＡの左境界を含むｐＴｉＴ３
７ＫｐｎＩ　１３ｂ断片の左端からの２．５ｋｂのＰｖ
ｕＩ［−）（ｐｎＩ断片がある。

最優に、これが、最初のＢａｍＨＩリンカ−に連結して
いる。

このＤＮＡをアグロバクテリウムに導入するために、ｐ
ＭＯＮ３１３を３８ｍＨ１で切断し、ＢＱＩＭで切断し
ＤＮＡリガーゼで処理したｐＲＫ２９０ＤＮＡと混合し
た。ｐＭＯＮ３１３プラスミドをもつｏＲＫ２９０の誘
導体を分離し、ｐＭＯＮ３１８と命名した。

プラスミドｐＭＯＮ３１８を、ヘルパー（補助）として
ＤＲＫ２０１３を用いた標準的な細菌の接合方法により
、ｐＴ　ｉ　Ｔ３７及び染色体のクロラムフェニコール
耐性をもつアグロバクテリウム・テユメファシエンスＡ
２０８株に導入した。この方法及びそれに続＜Ｔ−［）
ＮＡをｐＭＯＮ３１８に運搬される操作されたＴ−ＤＮ
Ａ断片で置換するための選抜は、武装解除されたオクト
パイン型ｐＴ　ｉ　Ｂ６Ｓ３−８Ｅプラスミドの選抜の
ためフレーリー等＜１９８５年）により述べられている
ように正確であった。

得られた武装解除されたｐＴ　ｉ　Ｔ３７３Ｅプラスミ
ドは、ｖ　ｉ　ｒｆｉｂｉｌを完全に含み、Ｔ−（）Ｎ
Ａの左境界及びＴ−ＤＮＡの約１ｋｂを保持している。

Ｔ−ＤＮＡのこの領域は、転写物を暗号化することが報
告されていなかった（ジョース等、セル、第３２巻：１
０５７から１０６７ページ、１９８３年）。これに、ｐ
ＢＲ３２２断片、ＬＩＨ次いでＴｎ９０３カナマイシン
耐性が続く。Ｔｎ９０３断片は、ｐＴｉＣ５８Ｈｉｎｄ
ｌｌ！２断片（デピツカー等、１９８０年）の１）Ｔｉ
Ｔ３７類似体の左端に連結されるｐＢＲ３２２の７５０
ｂ１１断片に連結される。この断片はｐＴ　ｉ　Ｔ３７
Ｔ−ＤＮＡの右端の外側に位置している。この結果は、
根頭癌腫病産生に関する植物ホルモン生合成遺伝子を含
むＴ−ＤＮＡの９０％以上及び右境界がｐＴＩＴ３７−
８Ｅプラスミドから欠如していることを示している。

ｐＴｉＴ３７−８Ｅプラスミドは、２５μｇ／−クロラ
ムフェニコールでの生育で選抜されたＡ２０８株の誘導
株に運搬されて居り、武装解除されたプラスミドをもつ
この株は、Ａ２０８−８Ｅ又はＡＳＥと呼ばれる。Ａ２
０８−３Ｅ株は、３１１１−８Ｅ株と全く同じ様式（フ
レーリー等、１９８５年）で３者接合法のｐＭＯＮ２０
０中間体ベクターの受容体として使用される。これから
、左から右へ、次のものから成る共統合型のハイブリッ
ドＴ−ＤＮＡが得られる：ｐＴｉＴ３７左境界及び境界
の内側の約１ｋｂの以下の配列、ｐＢＲ３２２Ｈｉ　ｎ
ｃＩＩ−ＰｖｕＩ［断片、ｐＴｉＡ６ＢＱｊ！ｌｌ−Ｈ
ｌｎｄＩ［［ＬＩＨ領域、ｐＭＯＮ２００合成多重リン
カ−１植物中での選択のためのＮＯ８／ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ
／ＮＯＳカナマイシン耐性遺伝子、Ｔｎ７スベクヂノマ
イシン／ストレプトマイシン耐性決定部位、植物細胞に
対する計測可能なマーカーとしてのツバリン・シンター
ゼ遺伝子、ｐＴ　ｉ　Ｔ３７Ｔ−ＤＮＡの右境界。今述
べた２つの境界配列の間のＤＮＡ及びｐＭＯＮ２００及
び誘導体の類似領域に挿入された他のＤＮＡが、形質転
換法により植物１１１胞に移された。

１４から１７日後、ベクター・たけ（ｐＭＯＮ２００プ
ラスミド）又はキメラのＥＰ、５ＰＳＩ伝子を含むベク
ターで形質転換された大豆カルスがＭＳ培地及び０．０
５ｍＨあるいは１．０ｍＨグ°１ノホセートを含むペト
リ朋に移された。

グリホセートを含む培地に移行後１８から２０日以内に
、活発に生育するカルス組織がグリホセートを含まない
全ての皿に出現した。Ｑ、５ｍＨグリホセートを含む培
地で、対称カルス、即ちｐＭＯＮ２００ベクターのみを
含むカルスの皿では殆んど生育はなかったが、一方、第
１図に述べられているキメラのＥＰＳＰＳ遺伝子を含む
いくつかのカルスコロニーが明確な生育を示した。

１．０Ｉ１１８グリホセートで、対照１１１１のカルス
生育は全くなく、一方、キメラＥＰＳＰＳ遺伝子を含む
形質転換細胞の生育が若干認められた。このことは、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰＳ／ＮＯ３遺伝子が大豆細胞に
グリホセート耐性を賦与することを確実なものとする。

ｐＭＯＮ５４６に似た植物形質転換ベクターを、棉から
得たＣＴＰ／ＥＰＳＰＳ解読配列を用いて実施例１に概
略した一般方法に従い調製する。棉の種子（カルチベー
ター　デルタ−パイン５０）を次亜塩素酸ナトリウムを
用いて表面滅菌し、暗黒下で、基本的培地上で試験管内
で発芽させる。

２週間後、胚軸及び子葉を切片に分け、上述の形質転換
ベクター及び補助プラスミドｐＧＶ３１１１を含むアグ
ロバクテリウム・テユメファシエンスの腫瘍株を接種す
る。ＭＳ基本培地での共培養の３日後、組織片は１１１
菌を殺すために、５００１１９／１カルベニシリンを含
む同一培地に移す。２から４週間後、腫瘍組織を０．５
ｍＨグリホセートを含む同一培地に移す。

対照組織は、補助プラスミドｐＧＶ３１１１及びｐＭＯ
Ｎ２００を含む腫瘍性アグロバクテリウム・テユメファ
シエンス細胞を用いてつくられた。

上述形質転換ベクターで形質転換された組織は、継続的
生育によりグリホセート耐性を示し、一方、ＤＭＯＮ２
００で形質転換した組織（対照）及び非形質転換組織の
生育は阻害される。

ｐＭＯＮ５４６に類似した植物形質転換ベクターをブラ
シカ・ナブスのようなナタネ植物から得たＣＴＰ／ＥＰ
ＳＰＳ解読配列を用いて、実施例１に概略された方法に
従い調製する。（実施例１７参照）。

ブラシカ・ナブス植物の４個の頂部（グロスチャンバ中
で土壌を用い生育された）を次亜塩素酸ナトリウムで表
面殺菌し、５Ｍ角に切断する。それぞれの切片の上部表
面に、上述形質転換ベクター及び補助プラスミドｐＴｉ
Ｔ３７−３Ｅを含むアグロバクテリウム・テユメファシ
エンスの１晩培養液を接種し、２から３日間、１η／Ｉ
　　ＢＡの１／　１０Ｍ　Ｓ培地を含む育成培養平板上
でインキュベートする。ｖＡ織片を次いで１１１１９／
ｊ！Ｂ八、５００ａ９／Ｊカルベニシリン及び１００■
／１カナマイシンを含むＭＳ培地に移しかえる。３から
６遍間後、分化したキメラ遺伝子を有する芽からの葉組
織を耐性試験のためカナマイシンにかわりＱ、５ｍＨグ
リホセートを用いたこと以外は同一の培地へ移す。

対照組織は、補助プラスミドＤＴｉＴ３７−３Ｅ及びベ
クターＤＭＯＮ２００をもつアグロバクテリウム・テユ
メファシエンス細胞を用いて調製する。ＥＰＳＰＳを発
現するキメラ遺伝子を有する組織は、グリホセート存在
下で生育できるが、一方、形質転換及び非形質転換の対
照は阻害される。

実施例７；ＧｌｙＲ亜麻細胞 ｐＭＯＮ５４６類ケの植物形質転換ベクターが痺 亜麻から轡られたＣＴＰ／ＥＰＳＰＳ解読配列を用いて
実施例１及び１４から１７に概略されている方法に従い
調製する。

亜麻の種子が７０％エタノール、２５％クロロツクスで
表面殺菌し、滅菌蒸留水で洗浄する。種子を固形ＭＳ培
地上に買き、５から７日間光のもとで発芽させる。胚軸
を無菌的に切除し、上述の形質転換ベクター及び補助プ
ラスミドｏＴｉＢ６Ｓ３−８Ｅ又はＤＴｉＴ３７−８Ｅ
をもつアグロバクテリウム・テユメファシエンス細胞を
接種し、２日間、１＃ｉＦ／１ベンジルアミノプリン、
０．０２ｔｕｙ／１ナフタリン酢酸及び４％ショ糖を含
むＭＳ培地で共培養する。次いで胚軸を４００■／１カ
ナマイシン及び５００！Ｉ１ｇ／Ｊ！カルベニシリンを
補給したＭＳ培地上に置く。２週間後、形質転換された
カルス及び芽の選択が明白となる。

もとの組織片は、褐変し始め、最初に芽を形成した非形
質転換体は白色化する。選択されたカルス及び芽は緑色
でオバイン陽性である。

対照組織は、補助プラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３−８Ｅ又は
ＤＴｉＴ３７−３Ｅ及びベクターｐＭＯＮ２００をもつ
アグロバクテリウム・テユメファシエンス細胞を用いて
調製される。上述ＥＰＳＰＳベクターで形質転換された
選択されたカルスは、５．０及び２０．０ｆｆｌＨの間
の濃度でのグリホセートに耐性を示す。これらのグリホ
セートレベルでは、対照組織は退色し死滅する。

実施例８：大腸菌の突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子の単離 大腸菌ＡＴＣ０１１３０３株の細胞を培地Ａに移し、３
７℃でインキュベートした。

α〕 Ｃす １週間後、生育培地中高濃度のグリホセート（１ＱｍＨ
又はそれ以上）の存在下で急速に生育できる培養が得ら
れた。この培養の抽出液のＥＰＳＰＳ活性の解析及び大
腸菌野生型のものとのグリホセート感受性の比較から、
突然変異株が変異ＥＰＳＰＳをもつことが明らかとなっ
た。突然変異細胞のＥＰＳＰＳのグリホセート感受性は
、野生型のものとはかなり異なっていた。この突然変異
細菌は大腸菌１１３０３　８Ｍ〜１と命名された。この
突然変異細菌のＥＰＳＰＳを暗号化するａｒＯＡ遺伝子
が次のように分離された。

大腸菌１１３０３　８Ｍ−１のＥＰＳＰＳを暗号化する
ａｒｏＡ遺伝子の単ａ：この細菌のＤＮＡを分離した（
Ｊ、マーマー（１９６１年）、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー第３巻：２０８から２１８ペー
ジ）。プローブとして大腸菌に−１２８ｒＯＡ遺伝子を
用いたサザン・ハイブリダイゼーション（ロジャース等
、１９８３年）は、突然変異細菌のａｒＯＡｌ伝子が３
．５ｋｂのＢＱＩＩ［−ＨｌｎｄＩ［［断片上にあるこ
とを確定した。この断片はベクターＣＩＫＣ７（Ｒ，Ｎ
、ラオとＳ、Ｇ、ロジャース（１９７９年）、ジーン、
Ｆ、７−９−８２）にクローン化され、得られたプラス
ミドが大腸菌の形質転換に使用された。形質転換コロニ
ーは、これらの条件で生育する能力により検索され、大
腸菌に一１２ａｒＯＡ遺伝子とハイブリダイゼーション
することにより、３，５ｋｂのＢｇＩＩ［−ＨｌｎｄＩ
［Ｉ挿入を含むことが示された。このクローンはＤＭＯ
Ｎ９５３８と命名された。突然変異細菌のａｒＯＡ遺伝
子の８６％以上を含むこの挿入のＮｄｅｌ−ＥＣＯＲＩ
断片が、大腸菌に−１２及び１１３０３　８Ｍ−１の大
腸菌に−１２ａｒｏＡ解読配列をもつハイブリッドＥＰ
ＳＰＳ＠読配列を生じる発現ベクター（ｐＭＯＮ６０１
２０）以下に述べるＣ）ＭＯＮ６００１の誘導体）にク
ローン化された。このクローンは、ｐＭＯＮ９５４０と
命名された。このハイブリッドａｒＯＡ遺伝子により産
生されるＥＰＳＰＳは、グリホセート耐性を保持してお
り、１１３０３　８Ｍ−１のＥＰＳＰＳにグリホセート
耐性を賦与する突然変異はアミノ酸５３から４２７の中
に位置することを示唆していた。大腸菌変異Ｅ　ＰＳ　
ＰＳ３！伝子は、次の様式で、クロロプラスト移行ペプ
チドをもつ：あるいはもたない植物形質転換ベクターに
取り込まれた。

プラスミドｐＭＯＮ６００１は、合成のファージラムダ
（λ）のｐしプロモーターの２個の１列に並んだコピー
から発現される大腸菌に１２ＥＰＳＰＳｗＩｔｆＥ配列
をもつｐＢＲ３２７（ソベ。

ン等、１９８０年）の誘導体である。プラスミドＤＭＯ
Ｎ６００１は以下の様に構築された。まず、ｐＭＯＮ４
　（ロジャース等、１９８３年）がＣ１ａＩで消化され
、２．５ｋｂ断片がやはりＣＩａＩで切断されたｐＢＲ
３２７に挿入された。

得られたプラスミドＤＭＯＮ８は、ｐＢＲ３２７のβ−
ラクタマーゼと同方向に読まれるＥＰＳＰＳ！読配列を
含心配 列腸菌ＥＰＳＰＳ解読配列に隣接して存在する唯一の制
限エンドヌクレアーゼ部位をもつＤＭＯＮ８（７）誘導
体１．ｐＭＯＮ２５を構築するため、次の工程が取られ
た。ｏＭＯＮ４の欠失誘導体がＢＳｔＥＩ切断及び再連
結によりつくられた。

得られたプラスミドｐＭＯＮ７は、ｐＭＯＮ４の２ｋｂ
のＢｓｔＥＩＩ断片が欠落している。次に、ＥＰＳＰＳ
読み取り枠の５′端を暗号化する１５０ｂｐ（７）Ｈｉ
ｎｆＩ−ＮｄｅＩ断片が、ｐＭＯＮ７のＮｄｅＩ及びＨ
ｉｎｆＩによる消化及び、アクリルアミドゲルでの電気
泳動分離につづく電気的溶出の後に分離された。この切
片は、Ｅ　ＰＳ　ＰＳ解読配列の３′部分及び次の配列 ５′−Ｇ＾ＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＡＧ
ＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＣＡＴ
ＴＣＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＴ八をもつ合成
リンカ−を含むＤＭＯＮ８の精製された４、５ｋｂのＢ
ａｍＨＩ−ＮｄｅＩ断片に付加された。得られたプラス
ミドＩ）ＭＯＮ　２５は、合成リポソーム結合部位の唯
一の３ａｍＨＩ及びＢＩ１１部位及び解読配列のＡＴＧ
翻訳開始信号を含む唯一のＸｂａＩおよびＮｃｏＩ部位
に続くＥＰＳＰＳ解読配列を含む。

ｐＭＯＮ６００１を構築するために、ｐＭＯＮ２５が３
ａｍＨＩで消化され、ＢａｍＨＩ平滑端を含む部分的な
ファージラムダのｐし配列をもつ合成りＮＡ断片（アダ
ムスとギヤルビ、１９８６年）と混合された： 得られたプラスミドｐＭＯＮ６００１は、ＥＰＳＰＳｗ
？読配列の転写を促進するような正確な方向性でｐＭＯ
Ｎ２５のＢａｍＨＩ部位に、順方向の繰り返しとして２
コと−の合成ファージラムダｌ）Ｌブロモ−ター断片を
もっている。大腸菌に−１２ａｒｏＡ遺伝子を含むｐＭ
ＯＮ６００１のＢＧＩＭ−Ｈｉｎｄｌ［［断片がｐＥＭ
ＢＵ８十ベクターに挿入され、ＥＣｏＲＩ部位が部位特
定突然変異誘発により、アミノ酸２７番に挿入された。

新しいＥＣｏＲＩ部位をもつこのクローンはｐＭＯＮ６
５３０と呼ばれた。ｐＭＯＮ　６５３０の（新しいＥＣ
ｏＲＩ部位を含む＞ＮｄｅＩ−ＢＱＩＩＩＩｌｉ片は、
ｐＭＯＮ　６５３１をつくるため−に、ＮｄｅＩ−Ｂｅ
ｌＩＩ消化のｐＭＯＮ９５４０に挿入された。

プラスミドｏＭＯＮ６０１２は、ｐＭＯＮ６００１のＥ
Ｃ０ＲＩによる切断、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの大り
レノウ断片での処理及び連結により作製されたｐＭＯＮ
６００１の単純な誘導体である。これからＥＣ０ＲＩ切
断部位を含まないｐＭＯＮ６０１０が生じた。プラスミ
ドｐＭＯＮ６０１２がｐＭＯＮ６０１０のＰｖｕＴ［消
化及び合成ＥＣ０ＲＩリンカー：　５　’　−ＣＣＧＧ
ＡＡＴＴＣＣＧＧＧＧＣＣＴＴ＾ＡＧＧＣＣ のＥＰＳＰＳ解読配列の喘近くの唯一のｐｖｕＩＩ部位
への挿入により創出された。

ｐＭＯＮ９５３１の３３０ｂｐのＥＣ０ＲＩ断片がＭ１
３＋ｌａ９にクローン化され新しいプラスミドＭ８０１
７が作製された。クロロプラスミド移行ペプチドのリー
ダー配列の５′にＢｑｌＩ［部位を導入するために、変
異誘発プライマー ５　’　−ＣＣＡＴＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡ
ＧＡＴＴＧＡＧＧ八を用いて、部位特異的突然変異誘発
がおこなわれた。得られた変異誘発クローンはＭ１３　
　Ｍ８０２０と呼ばれる。Ｂ１１１−ＥｃｏＲＩ断片が
ＢＱＩＩＩ−ＥＣに）ＲＩ消化のｐＭＯＮ５３０にクロ
ーン化され、ｐＭＯＮ５３６が創出された。ｐＭＯＮ５
３０は、ｐＭＯＮ３１６の２．３ｋｂの５ｔｕｘ−Ｈｉ
　ｎｄｌｆｌ断片をｏＭＯＮ５２６へ移すことにより創
出された３５８−ＮＯＳカセットをもつｐＭＯＮ５０５
の誘導体（ホルシュとクリ−１１９８５年）である。プ
ラスミドｐＭＯＮ５２６は、ＳｍａＩ部位がＸｍａＩ消
化、フレノウポリメラーゼ処理及びリゲーションにより
削除されたｐＭＯＮ５０５の単純な誘導体である。得ら
れたプラスミド、ｐＭＯＮ５３０　（第１図）　は、ｐ
ＭＯＮ５０５の性質を保持しており、３５Ｓ−ＮＯ８発
現カセットは、プロモーター及びポリアゾニレ−ジョン
信号の間にＳｍａＩの唯一の切断部位を含む。ｐＭＯＮ
６０３１のａｒｏＡ遺伝子を含むＥＣ０ＲＩ断片がｐＭ
ＯＮ５３６のＥｃｏＲＩ部位にクローン化されｐＭＯＮ
　５４２が創出された。

ＣＴＰなしでハイブリッドのに１２−８ＭＩＥＰＳＰＳ
を暗号化１ルｐＭＯＮ　９５４０（ＤＢＩＩ［−Ｅｃｏ
ＲＩ断片がｐＭＯＮ５３０のＢＩＩ［とＥＣｏＲＩ部位
にクローン化され、＄）ＭＯＮ８０７８が創出された。

実施例３で述べたように、ｐＭＯＮ　５４２（ＣＴＰを
もつ構築物）を用いたタバコ細胞の形質転換はグリホセ
ート耐性をもたらした。逆に、ｐＭＯＮ８０７８　（Ｃ
ＴＰをもたない構築物）でのタバコの形質転換はグリホ
セート耐性を賦与しなかった。

ジャガイモ−ウィルスのいないカセット・バーバンクの
芽の先端部をＭＳ塩、０．１７９／ｊ！リンＭ１ナトリ
ウム０．４Ｒｇ／ｌチアミン塩酸塩、０、１９／１＜／
シトール、３％ショ糖、１．５９／１ゲルライトＴｌ４
（ケル：１ＣＯ）ｌ）Ｈ５，６（Ｆ）培地で継代培養す
る。培養物は１６時間の光同期で２４℃で生育させる。

芽は継代培落後約３ないし４週間で使用する。茎節間を
約８Ｍの長さに切り取り、縦にねり、そして切断表面に
、ＬＢ寒天平根土で数日間生育された２元ベクターｐＭ
ＯＮ５４２及び補助プラスミドｐＴｉＴ３７−８Ｅをも
つアグロバクテリウムを塗布する。茎切片を、ＭＳ塩、
ＭＳ有機物、３％ショ糖、２．２５■／Ｉ　　ＢＡ、０
．１１８６Ｒｇ／ｊ！　　ＮＡＡ、１０１９／Ｉ　　Ｇ
Ａｌｌ、５９／１ゲルライトｐＨ５，６の培地の表面に
切断面を下にして置く。４日後、茎の組織片をカルベニ
シリン５００ｊＩ！Ｊ／１及び選択試薬としてＯ又は３
００Ｉ１ｇ／ｊ！カナマイシンを含む同一培地に移す。

接種後２週間で、組織片はＮＡＡなしの同一組成の培地
上に移される。３００Ｒｇ／ｌカナマイシンは、組織を
殺すことなしに感染組織片の腫張及びカルス形成を妨げ
るのに充分であった。形質転換組織は、通常組織片の末
端に関してわずかな生長としてあられれる。形質転換。

組織はグリホセートに対して実質的な耐性を示す。

形質転換されたヒマワリの組織及び芽を得るために以下
の方法が使用される。滅菌したヒマワリの苗をｎ瘍で刺
激する。ヒマワリの種子は４０％クロロツクスで表面を
滅菌し、蒸留水で洗浄する。

種子を１３５塩、０．５％ショ糖及び０．８％寒天を含
む寒天培地上で培養する。７日令の苗にｐＴ　ｉ　Ｂ６
Ｓ３−　ＳＥをもつアグロバクテリウム株の１晩培養液
が、シリンジで茎に傷をつけたり刺したりすることによ
り又は傷に細菌を導入するために別のシリンジを用いる
ことにより接種される。腫瘍が２から３週間で形成され
る。腫瘍が苗から削除され、ホルモンなしのＭＳ培地上
で別に生育される。形質転換されたカルス及び芽が又、
異なる方法に従って得られる。種子の表面が滅菌され、
上記の生育培地上に置かれる。発芽は光のもとで１０日
問おこなわれる。２から３酬の胚軸の断片が切り取られ
て、操作された構築物を含むア　ロバクテリウム株が接
種された。胚軸は、ＭＳ塩とビタミン、５’Ｊ／Ｉ　　
ＫＮＯ，１００ａ９／１イノシトール、４０＃Ｊ／１ア
デニン５ＡＢ塩、５００１１ｇ／Ｊ！カザミノ酸、１Ｒ
９／Ｉ　　ＮＡＡ、１１１１／Ｉ　　ＢＡ、０．１１１
ｇ／ｆ　　ＧＡ３．３０■／ｌシヨ糖及び８ｇ／ｌ寒天
を含む培地で２日間共培養される。共培養の後、胚軸は
、３００■／１カナマイシン及び５００Ｉ１９／１カル
ベニシリンを含む同一培地に置かれる。２週間後、カナ
マイシン耐性遺伝子を含む株を接種された胚軸は、カル
スを産生し、カナマイシンを含む培地で再生するが、一
方、他の胚軸はそうではない。

２元ベクターｐＭＯＩ’Ｌｌ　５４６及び補助ブラスミ
生するのに使用され、植物が再生される。Ｉｌｉ瘍は、
グリホセート耐性遺伝子を含まない対照の腫瘍を退色死
滅させる濃度で、グリホセートに対し耐性を示す。非腫
瘍性カルスは同様にグリホセート耐性遺伝子をもたない
カルスを殺すグリホセートのレベルに対し耐性を示す。

形質転換されたヒマワリ植物は、野生型植物を殺す濃度
で噴霧されたグリホセートに耐性を示す。

形質転換されたペチユニア植物は、ホルシュ等（１９８
５年）により述べられた方法により、実施例２の形質転
換された葉ディスクからの再生により産生された。得ら
れた形質転換植物は、既に述べられている野生型ペチユ
ニアＥＰＳＰＳｉ伝子に融合されたＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターを含むｐＭＯＮ５４６ベクターを含んでいた。

４つの別々の代表的なトランスジェニックのにキメラ遺
伝子を有する）苗が選択され生育されて、以下に述べる
試験方法で、４つの別の非形質転換（野生型）ペチユニ
アの苗と共に試験された。

グロスヂャンバーの中で２６℃、１日あたり１２時間の
光照射で植物を生育培地中で生育させた。

植物には可溶性肥料が週ごとに施され、必要に応じて水
が与えられた。植物には、自動トラック噴霧器を使用す
ることにより、均一で再現性のある到達速度で除草剤を
噴霧した。

使用されたグリホセート溶液は、グリホセートイソプロ
ピルアミン塩としてイオン性界面活性剤と混合された１
ニーカーあたりのグリホセート酸等価石のボンドとして
測定された。

４つの別々の野生型（非形質転換）ペチユニア植物が対
照植物として使用するために選択された。

ｐＭＯＮ５４６を含む、４つの個々の形質転換植物がホ
ルシュ等（１９８５年）が述べているようにカナマイシ
ン耐性により選択された。

対照植物及び形質転換植物に、以下の表２にあげられて
いる添加レベルで、グリホセートのイソプロピルアミン
塩が噴霧された；得られた実験結果も又表２に要約され
ている。

表　　２ グリホセート噴霧に対する植物の応答 対照　　　　　０．４＃／ニーカー　植物は急速な白化
現象及び 漂白を示し、 しおれそして 死亡した。

対照　　　　　０．８＃／ニーカー　完全に死滅、植物
は非常に 急速な白化現 家及び漂白を 示し、しおれ 死滅した。

キメラＥＰＳＰＳ　　　０．８＃　／ニーカー　生育良
好、形質転換体　　　　　　　　　　　正常形態で生育
する新しい 薬でわずかに 白化現象、 植物は健康体 のようにみえ 開花しはじめ た。

傘酸等価固 表２に示されたように、対照植物は、０．４ボンド／ニ
ーカーのグリホセートが噴霧されたときに死滅した。対
照的に、形質転換されたペチユニアは、０．８ボンド／
ニーカーを噴霧した後健康で生存していた。形質転換植
物は、非形質転換対照植物よりも高いグリホセート耐性
である。

形質転換トマト、ＶＦ３６種が以下に述べられているよ
うに滅菌苗から産生される。

ＶＦ３６トマトの滅菌苗を水寒天で生育する。

胚軸及び子葉を切り取り、２日間、８５ビタミン、３０
９／ｊ−ショ糖、１Ｗｊ／１、ベンジルアデニン、及び
０．１１１９／１インドール酢酸を含むＭＳ培地で培養
する。その後、苗に実施例２に述べられているキメラの
ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むアグロバクテリウム・テユメフ
ァシエンスのベクターが１０７細菌／ＭＩｌまで希釈さ
れたキメラのＥＰＳＰＳシニターゼ遺伝子を含むアグロ
バクテリウム・テユメファシエンスの培養液に約３０秒
間浸すことにより感染させる。組織片が苗から部分を切
ることにより得られる。組織片からは吸い取り紙で水分
をとり去りＭＳ塩の標準濃度のほんの１０％を含む培地
を用いて実施例２で述べているように培養する。共培養
の２日後、組織片を、１００μ９／ｍカナマイシンを含
む選択培地に移す。形質転換トマト植物は組織片から生
育する。

これらの植物の葉が、以下に述べられている葉カルス試
験を用いてグリホセート耐性の試験をされる。

べ’ｙ９−だけ（ｐＭＯＮ２００）　又はｐＭＯＮ５４
６キメラＥＰＳＰＳｍ伝子を含む植物のトマト葉衛片が
、上述の０．５ｍ）Ｉグリホセートを含むカルス培地で
培養される。１０日後、対照の葉は完全に阻害され、カ
ルス生育の徴候は全く示されない；一方、キメラＥＰＳ
ＰＳ３ｆｉ伝子ベクターで形質転換された植物の葉はカ
ルスを産生じた。

形質転換タバコ植物（サムソン種）が、形質転換ペチユ
ニア葉ディスクを形質転換タバコ簗ディスクの代りに用
いて実施例４に述べられている方法により産生され生育
された。　タバコ植物は、実施例５のトマト植物に対し
て述べられた方法を用いてグリホセート耐性について試
験された。ベクターだけ（ｐＭＯＮ２００）又はｌ）Ｍ
ＯＮ　５４６キメラＥＰＳＰＳ遺伝子を含むタバコ植物
の葉の断片はＱ、５ｍＨグリホセートを含むカルス培地
で培養された。

１０日後、対照のタバコの葉は完全に阻害され、カルス
生育の徴候を全く示さなかったニ一方、キメラのペチユ
ニアＥＰＳＰＳ３１伝子のキメラＥＰＳＰＳで形質転換
された植物の葉は、タバコ植物にグリホセート耐性を賦
与する。

実施例１４：ペチユニアＥＤＳＰＳゲノムクローンの単
離 完全なペチユニアのＥＰＳＰＳ遺伝子を単離するために
、ペチユニアゲノムＤＮＡのライブラリーが実施例１−
Ｇに述べられているように構築された。略述すればＭＰ
４−Ｇ細胞の染色体ＤＮＡがライブラリーを創出するた
めに、３ａｍＨＩで消化され、ファージベクター、２Ｍ
Ｇ１４にクローン化された。実施例１−　Ｇに述べられ
ているように、ｐＭＯＮ９５３１　　ｃＤＮＡクローン
に相補される４、８ｋｂのＢｑｌＩＩ断片を含む１つの
ファージクローンλＦ７が分離された。遺伝子の残りを
単離するため。ゲノムのライブラリーが再度、ｐＭＯＮ
９５５６の１．６ｋｂのｃＤＮＡ挿入部分をプローブと
して用いることにより検索された。

ライブラリーのブレーティング及びハイブリダイゼーシ
ョンの方法は実施例１−ＧにｉＬべられているようにお
こなわれた。いくつかの陽性信号が得られた。さらに解
析することで、１つの単離物が選択され、λＦＩＯファ
ージクＯ−ンと命名された。

λＦ１０ＤＮＡは、Ｂａｍｔ−ｌｌ５ＢＱ　Ｉ　ＩＩ、
ＥＣ０ＲＩ及びＨｉ　ｎｄｌ［Ｉで個々に消化された。

ＤＮＡは、サザン・プロット法で、ｐＭＯＮ９５３１及
びｐＭＯＮ　９５５６のニックトランスレーションされ
たＥＰＳＰＳ配列とハイブリダイズされた。このことは
、λＦ１０の相補配列が４．８ｋｂ、　２．　Ｏｋｂ及
び３．８ｋｂのＢＱＩＩＩ断片上にあることを示してい
た。これらの断片のＤＮＡ配列解析は、これら３つの断
片が一緒に、ペチユニアＤＮＡの約９ｋｂにわたる完全
な遺伝子を含み、７個のイントロンにより隔てられてい
ることを示している（第５図）。ゲノムのクローン、λ
Ｆ１０に含まれるＥＰＳＰＳ遺伝子のプロモーター断片
は、キメラＥＰＳＰＳｃＤＮＡ又は、ゲノム配列を発現
するのに用いることができる。イントロンを含む断片は
又、ｍＲＮＡレベルを増強させるために付加的キメラＥ
ＰＳＰＳ遺伝子を構築するのに用いられるかもしれない
。

アラとドブシス・タリアナのゲノムバンクは、大きさで
分画された（１５から２０ｋｂ）ＭｂｏＩ部分消化ＤＮ
ＡをＢａｍ）−ＩＩ切断したうムダＥＭＢＬ３にクロー
ン化することにより構築された。このライブラリーのフ
ァージの約１００００のプラークがニックトランスレー
ションされたペチユニアＥＰＳＰＳプローブ（ｐＭＯＮ
９５６６）で検索された。強くハイブリダイズするプラ
ークＥ１が精製された。ＥＰＳＰＳプローブのファージ
ＤＮＡ消化断片へのサザン・プロットは非常に強くハイ
ブリダイズした２個の断片と一致した。

これらの一方は、１．ＯｋｂのＨｉ　ｎｄＩ［Ｉ断片で
、他方は、７００ｂｐの３ａｍＨＩ断片であった。これ
らの断片は両者ともｐｔＪＣｌ　１９にサブクローン化
され、挿入部分のＤＮＡ配列が決定された。

配列のデータはファージがアラビドブシスＥＰＳＰＳ遺
伝子を含むことを示した。酵素は、配列が得られた範囲
でペチユニア酵素と高度に相同である。３ａｍＨＩ断片
は、完全な遺伝子をクローニングするのに適した制限エ
ンドヌクレアーゼ断片を同定するために、ファージ及び
アラビドプシスゲノムのＤＮＡに対してハイブリダイゼ
ーションのプローブとして使用された。１つにまとめて
完全なＥＰＳＰＳｍ伝子を含む、６．０及び３．２ｋｂ
の２個のＢＱＩＩＩ断片がＥ１ファージクローンから同
定された。第５図にアラビドブシスクローンの構成を要
約しペチユニアＥＰＳＰＳ遺転子の構成との比較をしで
ある。

蛋白のアミノ末端を略号化するＤＮＡは、６、Ｏｋｂの
ＢＱＩＩＩ断片の内側にある。正確な翻訳開始部位がペ
チユニア酵素のアミノ酸配列とヌクレオチド配列から予
想されるアミノ酸配列を比較することにより決定される
。その後、翻訳開始コドンのすぐ上流に唯一のＥＣｏＲ
Ｉ部位を導入するために部位特異的突然変異誘発が用い
られる。

完全な遺伝子がそれからＥＣ０ＲＩ断片として分離され
る。このＥＣ０ＲＩ断片は、発現ベクター、ｐＭＯＮ５
３０に挿入され、得られたベクターは、植物でアラピド
プシスのＥＰＳＰＳ′ＷＩ素を過剰発現するのに使用さ
れた。

実施例１６：トマトＥＰＳＰｃＤＮＡクローンの単離 ｃＤＮＡライブラリーがトマト（リコベルシクム・エス
クレンタムＶＦ３６種）の成熟めしべから分離されたＲ
ＮＡから、ヒューン等（ＤＮＡクローニング・テクニク
ス：ブラクテイカル・アプローチ　ＩＲＬプレス、Ｄ、
グローバー編１９８５年）及びグブラーとホフマン（ジ
ーン、第２５巻：２６３から２６９ページ、１９８５年
）の方法により構築された。ライブラリ、−が大腸菌Ｂ
ＮＮ１０２株にブレーティングされ、濾紙レプリカがつ
くられた。濾紙は、３２ｐで標識されたｐＭＯＮ９５６
３の１．９ｋｂの８Ｑ　Ｉ　ＩＩ／Ｃ１ａＩ断片とハイ
ブリダイズされた（ファインバーブとフォーゲルスタイ
ン、アナリテイカル・バイオケミストリー第１３２巻二
６から１３ページ、１９８３年）。ハイブリダイズした
プラークが分離され、ＥＰＳＰＳｃＤＮＡの存在を確か
めるためのと同一の方法により再検索された。全長をも
つトマトのＥＰＳＰＳｃＤＮＡは、ｃＤＮＡクローンの
１つ（Ｐｌ）の２５０及び１７００ｂｐの２個のＥＣ０
ＲＩ断片に存在していた。２５０ｂｐＨｉ片は、ｐＵｃ
１１９のＥｃｏＲＩ部位にり〇−ン化され、ｐＭＯＮ９
５９６がつくられた。１７００　ｂＤ断片はｐＵＣ１９
にクローン化されｐＭＯＮ９５８９がつくられた。ｐＭ
ＯＮ９５９６の挿入部分は、突然変異誘発を容易にする
ために開始コドン周辺の配列を決定するためアマジャム
から入手したジデオキシ・シーケンシング・キットを用
いてシーケンスされた。ｐＭＯＮ９５９６の翻訳開始コ
ドンの１３塩基上流のＢＱＩＩ［部位が、クンケル（プ
ロシーデインゲス・オプ・ナショナル・アカデミ−・オ
プ・サイエンス・オブＬＪＳＡ第８２巻：４８８から４
９２ページ、１９８５年）の方法により、化学的に合成
されたオリゴヌクレオチド： ＧＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＣ
ＡＧＴＴＴＴＴＣを用いて操作された。得られたプラス
ミドｐＭＯＮ９７１０の挿入部分が正確な変異を確かめ
るためにシーケンスされた。ＤＭＯＮ９７１０の７０ｂ
ｐのＢｑ　Ｉ　ＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片がＢＱＩＩ［及び
ＥＣ０ＲＩで消化されたｐＭＯＮ３１６に挿入され、ｐ
ＭＯＮ９７２０が作製された。ｐＭｏ肉９５８９の１７
００ｂｌ）のＥＣ０ＲＩ断片がｐＭＯＮ９７２０（７）
ＥｃｏＲＩ部位１．−ＥＰＳＰＳｊＮ読配列を再構成す
るために順方向で挿入され、その結果ＤＭＯＮ９７２１
が得られた（第６図参照）。

このプラスミドは補助プラスミド０ＧＶ３１１１−８Ｅ
をもつアグロバクテリウム・テユメファシエンス細胞に
挿入された。補助プラスミドは、ｐＭＯＮ９７２１ＤＮ
Ａを植物細胞染色体に挿入させるのに必要なある酸素を
暗号化している。それは又、細菌で機能するカナマイシ
ン耐性遺伝子を含む。ｐＭＯＮ９７２１を含むアグロバ
クテリウム・テユメファシエンス細胞は実施例１２で述
べたように、グリホセート耐性細胞及び植物を産生ずる
ために植物形質転換実験に使用される。

実施例１７：ブラシカ・ナブスＣＤＮＡクローンの単離 全ＲＮＡが以下のようにブラシカ・ナブス（ウェスター
変種）の花から分離された。花が液体窒素で凍結された
。液体窒素を蒸発させた後、抽出緩衝液（１％Ｔｒｉｓ
−イソプロピルナフタレン硫酸、６％ｐ−アミノサリチ
ル酸、１００ｍＨ７ｒ　ｉ　Ｓ　−ＨＣｌ２．１）１１
７．６．５０ｍＨＥＧＴＡ。

ｐＨ７，５，１００ＩＩＨＮａＣｊ！、１％ＳＤＳ及び
５０１１８２−メルカプトエタノール）中で花はホモジ
ナイズされ、等量のフェノール／クロロホルムの１：１
混合液で抽出された。水層の核酸は、エタノールで沈澱
された。沈澱は水に溶解され、ＲＮＡが最終濁度２Ｍの
塩化リチウムで２度沈澱された。最終ＲＮＡペレットは
水に溶解され、ＲＮＡはエタノールで沈澱された。ポリ
ＡＲＮＡがオリゴｄＴセルロースクＯマドグラフィによ
り選択された。ポリＡＲＮＡの収量は花１ｇあたり１．
０μグであった。

ライブラリーがブラシカ・ナブスの花のポリＡＲＮＡを
用いて構築され、用いられた方法は実施例１６に述べら
れている。ライブラリーの収量は、３μタボリＡＲＮＡ
あたり９００００プラークであった。ライブラリーは、
平板あたり５０００プラークの密度で平板にひろげられ
た。ファージＤＮＡはニトロセルロースの濾紙に移され
た。

濾紙は、３５％ホルムアミド、５倍の５ＳＣ１３００μ
ｇ／ａｄ！＋ＲＮＡ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で低厳
重さでハイブリダイズされた。ｐＭＯＮ９５５６の挿入
部分は、ニツクトランスレーションにより　Ｐで標識さ
れ、２Ｘ　１０６ＣｐＨｌ　／＃ｌｉ！でハイブリダイ
ゼーション溶液に添加された。濾紙は、２倍のＳＳＣ中
室温で２度それぞれ１５分間そして３７℃で３０分間１
度洗浄された。かなりのハイブリダイズ陽性のファージ
が得られた。これらのファージはつり上げられ、低プラ
ーク密度で２度再検索された。ハイブリダイズ陽性ファ
ージが連環され、全長をもつブラシカ・ナプスのＥ　Ｐ
　Ｓ、９　Ｓ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンを含むファージ
が、さらに解析され選ばれた。全長をもつブラシカ・ナ
ブスのＥＰＳＰＳｃＤＮＡクローンは修飾され、キメラ
のＣａＭＶ３５８／ブラシカ・ナブスＥＰＳＰＳ遺伝子
を作製するために植物発現ベクターｐＭＯＮ５３０に挿
入される。

ＣＤＮＡクローンは、実施例１に述べられているように
して得られた。このｃＤＮＡクローンは、５′非翻訳リ
ーダーの２７ヌクレオチド、７２アミノ酸移行ペプチド
＋成熟酵素の４４４アミノ酸をコードするｉ、５ｋｂ及
び完全な３′隣接配列の０．４ｋｂを含む。全長ＥＰＳ
ＰＳｃＤＮΔは、プラスミドｐＭＯＮ６１４０を与える
ためにプラスミドｐＧＥＭ１のＢａｍＨＩ／Ｓａ　Ｉ　
ＩＩ位に、そして、ｐＭＯＮ６１４５を与えるためにｐ
ＧＥＭ２に２．１ｋｂのＢａ１Ｉ［−８ａｌＩ断片とし
てクローン化された。ＥＰＳＰＳ解読領域は、それぞれ
、Ｔ７及びＳＰ６プロモーターから５′から３′へ転写
される。

全長ＥＰＳＰＳｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ｐＭ
ＯＮ６１４０及びｐＭＯＮ６１４５）は、３′非翻訳領
域に存在する唯一のＰｖｕＩ部位で線状化された。線状
化されたプラスミドＤＮＡは本質的にはクリーブ等（１
９８４年）に述べられているように５ｐｉｅ及びＴ７ボ
リメラーゼで試験管内で（未キャッピングのまま）転写
された。標準的な反応１衝液は、最終反応容量１００１
１１で４０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，９）、
６ｍＨＭｑＣｉ！　　、１０ｍＭジチオスレイトール、
２１Ｈスバルミシン、８０単位のＲＮａｓｉｎリボヌク
レアーゼ阻害剤、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰが各
０．５ｍＨ含まれていた。最終ＲＮＡペレットは２０μ
ｌの滅菌水に再懸濁され、−８０℃で保存された。標準
的な翻訳反応は、１００μｌのヌクレアーゼ処理したウ
サギ網状赤血球リセート、５．７μｌのそれぞれｉｎ＋
Ｈでの１９アミノ酸混合液（メチオニンを除＜）、５．
７μｌのＲＮＡ　（０，６３μ９のプラスミドＤＮＡ由
来の全ＲＮＡ転写物）、１６μｊｌのＲＮａｓ　ｉ　ｎ
　（２０単位／μｌ）リボヌクレアーゼ阻害剤、及び５
８．３μｌの［３５Ｓ］メチオニン（１４から１５ｍＧ
／ｄ）を含んでいた。試験管内翻訳反応は、３０℃で９
０分間おこなわれた。翻訳産物は一８０℃で凍結保存さ
れた。

完全なり口Ｏブラストがレタス（ラッカ・ＷＴ＜１＜、
ｖａｒ、　ｏンギフオリア）から、バーＳレッド等（１
９８２年）の改良方法によるパーコール／フィコール密
度勾配遠心により分離された。完全なクロロプラストの
最終ペレットは５０ｍＨＨｅｐｅＳ−ＫＯＨＤＨ７，７
中で滅菌された３３ＱｍＨソルビトール０．５ｍに懸濁
され、り００フイルの試験がおこなわれ（アーノン、１
９４９年）、クロロフィルの最終濃度が４■／Ｉｄに（
ソルビトール／Ｈｅ１）ｅＳを用いて＞ｍ整された。

レタス１個の完全なクロロプラストの収量は３から６ａ
９クロロフイルであった。これらのりｎｏブラストは、
フェーズ・コントラスト及び透過型電顕に基づいて均一
であると考えられた。

典型的な３００μｍの取り込み実験は、５ａ＋ＨＡＴＰ
、８．３醜Ｈ未標識のメチオニン、３２２■Ｈソルビト
ール、５８，３ｍＨＨｅｏｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８，０）
、５０μｌ網状赤血球リセート翻訳産物及び完全なし、
サテイバのクロロプラスト・　　（２００μ９クロロフ
イル）を含んでいた。取り込み混合液は、室温で（１０
Ｘ７５ｊｗ＋ガラスチューブの中で）直接的に、ファイ
バー・オプティック・イルミネーター・セットの前で最
高光度で（１５０ワット球）ゆるやかに固定された。取
り込み混合液（５０から１２５μｌ）が各時間で取り出
され、１１００１００Ｏｘ秒間の遠心による（１５０μ
ｌボリエヂレン・チューブ中で）１００μｌシリコン油
密度勾配で分画された。これらの条件下で、完全なりＯ
ロブラストは、シリコン油層の下にペレットを形成し、
（網状赤血球リセートを含む）インキュベーション培地
は表面に浮遊する。遠心後、シリコン油密度勾配はすぐ
にドライアイスで凍結された。クロロプラストのベレッ
トは、それから、５０から１００μｍの融解緩衝液（１
０ｍＨＨｅｐｅｓ−ＫＯＨｐＨ７，５，１ｍＨＰＭＳＦ
、１ａ＋Ｈベンズアミジン、５ｍＨ６−アミノ−ｎ−カ
ブロン酸及び３０μｍアブＯチニン）に再懸濁され、チ
ラコイド膜をおとすために、１５０００Ｘ９で２０分間
遠心された。この遠心の透明上清（ストロマ蛋白）及び
それぞれの取り込み実験の網状赤血球リセート保温培地
液は、電気泳動のために等母の２倍ＳＯ３−ＰＡＧＥ試
料緩衝液と混合された（以下参照のこと）。

５ＰＳ−ＰＡＧＥはレムリ（１９７０年）に従い、３％
（ｗ／ｖｌアクリルアミド濃縮ゲル（５ｇｘｉ、５ｍｓ
＋）をもつ１２％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミドスラブゲル
（６０ａｇｔＸ１．５■）でおこなわれた。ゲルは３０
％メタノール及び１０％酢酸で固定され、真空下で乾燥
され、コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムを用いた直接的
なオートラジオグラフィがおこなわれた。Ｘ線フィルム
上のバンドの定量は、スペクトラ−フィックス５Ｐ４１
００レコーデイング／コンピユーター・インチグレータ
ーを接続したヘーブアーＧ５−３００スキャニング・デ
ンシトメーターを用いておこなわれた。

前駆体ＥＰＳＰＳ　（＋ＣＴＰ）がクロロプラストによ
り取り込まれ、プロセシングされることを確かめるため
に、［３５Ｓ］メチオニンでｍ識したプレーＥＰＳＰＳ
を含む前ｌ＠訳産物が新たに分離された完全なり、サテ
イバのり０ロブラストとインキュベートされた。プレＥ
ＰＳＰＳ　（＋ＣＴＰ）は急速にクロロプラスト中へ移
行され、分子量４８　ｋＤａの成熟ＥＰＳＰＳに切断さ
れた。５ＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフから、イン
キュベーション培地からの前駆体ＥＰＳＰＳの消失とク
ロロプラスト画分中の低分子量の成熟形の出現が明らか
となった。成熟ＥＰＳＰＳのあるものは又、クロロプラ
スト融解のため１５分間でインキュベーション培地中に
存在していた。インキュベーション混合液の取り込み後
のトリプシン及びキモトリプシンでの処理は、保温培地
中のブレＥＰＳＰＳは完全に分解されており、一方、り
Ｏロブラスト画分中の成熟ＥＰＳＰＳは十分に保護され
ていたことを示した。これらの結果は、ＥＰＳＰＳがク
ロロプラスト被膜を横切りプロテアーゼが寄りにくい空
間の転移されたことを示している。さらに、再分離され
たクロロプラストの分画は、成熟ＥＰＳＰＳがチラコイ
ドとは全く異なり、ストロマ両分に存在することを示し
た。ヌクレオチド配列に基づいて、成熟旦、ハイブリダ
ＥＰＳＰＳの予想される分子量は、４７７９０ダルトン
である。再分離されたりＯロブラスト画分に存在する分
子ｍ　４８　ｋＤａのポリペプチドは、ＳＯ３−ＰＡＧ
Ｅの間、Ｐ、ハイブリダの精製された成熟ＥＰＳＰＳと
共に移初した。

ＣＴＰが取り込みに必要であることを示すために、（Ｃ
ＴＰを欠落した）成熟酵素が最初の１５分の取り込み実
験の後、クロロプラスト・ストロマから分離それる。、
（標識された成熟酵素を含む）ストロマ蛋白の混合液が
未標識の網状赤血球リセートで希釈され、完全なクロロ
プラストを用いた第２の取り込み実験に使用された。（
ＣＴＰを欠く）成熟ＥＰＳＰＳは１５分のインキュベー
ションの間には、り００ブラストに転移をせず又、外被
膜に結合もしなかった。対照実験として、ブレＥＰＳＰ
Ｓのクロロプラストへの取り込み速度は、インキュベー
ション混合液へのストロマ蛋白の添加のにより影響され
ないことが判明した。これらのデータから、ＥＰＳＰＳ
のＣＴＰ、　ＷＩ素のりＯロブラストへの取り込みに必
要とされると結論された。

次のＥＰＳＰＳの実験はＣＴＰがストロマ区分に対する
異種蛋白を標的にできることを示している。ＥＰＳＰＳ
の７２アミノ酸移行ペプチドが小麦の成熟５ｓＲＬＩＢ
Ｉｓｃｏに融合された。小麦の成熟５ｓＲＵＢＩｓｃｏ
　　ｃＤＮＡ（プログリ−等、１９８３年）が〜０．６
ｋｂの５ｐｈＩ／ＰｓｔＩ断片として得られた。この５
ｐｈＩ／ＰｓｔＩ断片は（Ｎ末端メチオニンで始まる）
１２８アミノ酸の小麦の完全な成熟 ５ｓＲＬＪＢＩｓｃｏ解読領域及び２００　ｂｐの３′
非翻訳領域を含む。成熟５ｓＲＵＢ　ｌ５ＣＯｃＤＮＡ
断片はＰ、ハイブリダＥＰＳＰＳＣＴＰ　　ｃＤＮＡ断
片のうしろに融合された。この融合は、ｐＭＯＮ　６２
４２のＥＣ０ＲＩ／５ｐｈＩ断片を小麦５ｓＲＵＢ　ｌ
５ＣＯｃＤＮＡと連結することによりおこなわれた。構
築物ｐＭＯＮ６２４２は、ｐＭＯＮ６１４０の誘導体で
、操作された５ｓＲ１ＪＢ　ｌ５ＣＯと一致した切断部
位をもつＰ、ハイブリダＥＰＳＰＳを含む。ｐＭＯＮ６
１４０ＥＰＳＰＳの切断部位（ｓｅｒ−ｖａｌ−ａｌａ
−ｔｈｒ−ａｌａ−Ｑｌｈ／ＩＹＳ）がＤＭＯＮ６２４
２では、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｖａｌ−ｓｅｒ−ｃ
ｙｓ／ｗｅｔに変えれた。この変化は、ＣＴＰが５ｓＲ
ＵＢ　ｌ５ＣＯとＥＰＳＰＳ（７）ｔｆｆｉ’ｔ−スイ
’／チするような枠内５ｐｈＩ部位を導入する。構築物
ＤＭＯＮ６２４２は、先にｐＧＥＭ−２にクローン化さ
れ、試験管内でクロロプラストへ移行し、正しい様式で
蛋白分解によりプロセシングされるキメラの前駆体酵素
を与えることが示されている。

ｐＭＯＮ６２４２のＥｃｏＲＩ／５ｔ）ｈＩ断片が小麦
の５ｓＲｔＪＢ　ｌ５ＣＯの５ｐｈＩ部位へ融合され、
ｐＭＯＮ６１４９を与えるためにプラスミドｐＩＢＩに
クローン化された。ＤＭＯＮ　６１４９の試験管内覧写
／翻訳は、融合蛋白に対して予想される分子量の単一ポ
リペプチド（〜２３ｋＤ）を与えた。試験管内でのりＯ
ｏプラスト移行試験は、キメラ蛋白がストＯ′マヘ移行
され、蛋白分解により、〜１５ｋＯの最終産物まで切断
されることを示した（ｓｓＲＵＢ　ｌ５ＧＯは分子量１
５ｋＤ）。

これらの結果は、ＥＰＳＰＳ　　ＣＴＰだけがクロ０ブ
ラスト・ストロマに異種蛋白を標的にする十分な情報を
賦与することを示している。

参考文献 ｓ、ｐ、アダムス等（１９８３年）ジャーナル・オブ・
アメリカン争ケミカル・ソサイエテイ第１０５巻二６６
１ページ Ｎ、アムルハイン等（１９８０年）ナヂュアヴイツセン
シャフテン第６１５：３５６〜３５７ページ Ｄ、１．アーノン（１９４９年）プラント・フイジオＯ
ジー第２４巻、１〜１５ペ一ジ １巻：２６〜３２ページ Ｍ、Ｒ，バリナガ等（１９８１年）ｒＤＮＡ、ＲＮＡ及
び蛋白のニトロセルロース及びジアゾ紙固形支持体への
転写の方法］シュライヒヤー・アンド・シュエル・Ｉｎ
ｃ、　にューハンプシャーキーン）刊。

Ｓ、Ｂ、バートレット、Ａ、Ｒ，グロスマンとＮ。

ロロブラスト・モレキュラー・バイオロジーエルゼヴイ
ア・バイオメディカル・ブレスにニューヨーク）、１０
８１〜１０９１ページ Ｍ、ベヴアン等（１９８３年）ネイチャー第３０４巻：
１８４ページ Ｒ，プログリ−等（１９８３年）バイオ／テクノロジー
第１巻：５５〜６１ページ Ｌ、コマイ等（１９８３年）サイエンス第２２１巻＝３
７０〜３７１ページ Ｒ，Ｗ、デイビス等（１９８，０年）アドバンスト・バ
クチリアル・ジエネテイクス　コールド・スプリング・
ハーバ−研究所にニューヨーク） Ｍ、デクリーンとＪ、プレイ（１９７６年）ボタニカル
・レビュー第４２巻＝３８９〜４６６ページ エネテイクス第１巻：５６１ページ Ｇ、デイツタ等（１９８０）プロシーディング・エンス
・ｕＳＡ第７７巻：　７３４７ペ一ジＭ、ニーデルマン
、Ｒ，Ｂ、ハリツクとＮ、Ｈ。

チュア（エルゼヴイア・バイオメディカル・プレス、ニ
ューヨーク）１０８１〜１０９１ページ Ｒ，Ｔ、フレーリー等＜１９８３年〉プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス・
ＵＳＡ第８０巻：　４８０３ページ Ｒ，Ｂ、ゴールドバーク等（１９８１年）　Ｄｅｖｅｌ
壮虹第８３巻：２０１〜２１７ページ Ｊ、Ｐ、ハーナルスティーンズ等（１９８５年）ＥＭＢ
Ｏジャーナル第３巻：　３０３９〜３０４１ページ Ｌ、ヘレラーエストレラ等（１９８３年）ネイチｙ二第
３０３巻：２０９ページ Ｇ、Ｍ、Ｓ、ホイカースーヴアン・ス０グテレン等（１
９８４年）ネイチャー第３１１巻ニア６３〜７６４ペー
ジ Ｒ，Ｂ、ホルシュとＧ、Ｅ、ジョーンズ（１９８０年）
（）ゴー１−０第１６４Ｊｔ：１０３〜１０８ページ Ｒ，Ｂ、ホルシュ等（１９８５年）サイエンス第２２７
巻：１２２９〜１２３１ベージ Ｒ，Ｂ、ホルシュとＨ，Ｊ、クリ−（１９８６年）４４
２８〜４４３２ページ Ｍ、Ｗ、バンカピラー等（１９８３年ａ）メソド・エン
チモＯジー第９１巻：３９９〜４１３ページ Ｍ、Ｗ、バンカピラー等（１９８３年ｂ）メソド・エン
チモロジー第９１巻：４８６〜４９３ページ Ｔ、Ｖ、ヒューン等（１９８５年）ＤＮＡ・クローニン
グ・テクニクス：アブラクテイカル・アプローチ　Ｄ、
グローバー（編）　　ＩＲＬブレス（オックスフォード
、英国） Ｐ、Ａ、クリーブとり、Ａ、メルトン（１９８４年）ヌ
クレイツク・アミド・リサーチ第１２巻ニア０５７〜７
０７０ページ Ｕ、に、レムリ−（１９７０年）ネイチャー第２２フ Ｐ．Ｍ．リザルデイ（１９８２年）ｒＮＡ−４５ＤＥＡ
ＥＩＩを利用したＤＮＡ及びＲＮＡの結合と回収」シュ
ライヒヤー・アンド・シュエル◆ｓｎｃ．　＜キーン・
ニューハンプシャー）■．マニアテイス等（１９８２年
）モレキュラー・クローニング；ラボラトリ−・マニュ
アルコールド・スプリング・ハーバ−研究所にニューヨ
ーク） Ａ．Ｍ．マキサムとＷ．ギルバート（１９７７年）５６
０〜５６４ページ Ｒ．Ｂ．メーガー等（１９７７年）１工旦旦乏二第８０
巻：３６２〜３７５ページ アシド・リサーチ第９巻＝３０９〜３２１ページ Ｊ、メツシングとＪ、ヴイエイラ（１９８２年）ジーン
、第１９巻：６９〜２７６ベージＤ、Ｍ、ムスデイルと
Ｊ、Ｒ，コギング（１９８４年）プランタ第１６０巻ニ
ア８〜８３ベージ Ｅ、Ｄ、ナツツイガ−等（１９８４年）プラント・フイ
ジオロジー第７６巻二５７１ベージＤ、Ｍ、ムスデイル
とＪ、Ｒ，コギング（１９８５年）プランタ第１６３巻
：２４１〜２９４ページ Ｓ、Ｇ、０ジヤース等（１９８３年）アプライド・アン
ド・エンバイアメンタル・マイクロバイオロジー第４６
巻：３７〜４３ページＪ、ルーピン等（１９８２年）プ
ラント・フイジオロジー第７０巻二８３３〜８３９ベー
ジシェラ−等（１９８１年）デベロブメンタル・バイオ
ロジー第８６巻：４３８〜４４７ページリフイケーシヨ
ン　コールド・スプリング・ハーバ−研究所 Ｃ，Ｃ，スマート等（１９８５年）ジャーナル・オプ・
バイオロジカル・ケミストリー第３０巻：　１６３３８
ページ Ｅ、Ｍ、サザン（１９７５年）ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー第９８巻：５０３〜５１７ペー
ジ Ｄ、Ｍ、ストーカ−等（１９８５年）ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー第２６０巻：４７２４
〜４７２８ページ Ｈ，スタインリュツケンとＮ、アムルハイン（１ジ Ｊ、ヴイエイラ等（１９８２年）ジーン第１９巻：２５
９〜２６８ページ Ｈ，スタインリュツケン等（１９８５年）アーキテクチ
ャ−・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオロジ
クス（印刷中） Ｒ，Ａ、ヤングとＲ，Ｗ、デイビス（１９８３年）１１
９４〜１１９８ページ Ｍ、Ｍ、ツオラー等（１９８３年）メソド・エンチモロ
ジー第１００巻：４６８ベージ

【図面の簡単な説明】

第１図は、キメラ（７）ＣａＭＶ／ＥＰＳＰＳ遺伝子を
含む植物形質転換ベクターであるプラスミドＤＭＯＮ５
４６の創出を示す。これは又、ｐＭＯＮ５４６のＣａＭ
Ｖ／ＥＰＳＰＳ３１伝子が植物染色体に挿入するのを助
けるｖｉｒ遺伝子をもつ無毒化したＴ１プラスミドｐＧ
Ｖ３１１１−８Ｅのｌｌｌ造を示す。 第２図は、ペチユニアのＥＰＳＰＳ３Ｉｌ伝子と酵素の
クロロプラスト移行ペプチドのＤＮＡ配列及びアミノ酸
配列を示す。 第３図は、ペチユニアのＥＰＳＰＳの全ＣＤＮＡのヌク
レオチド・アミノ酸配列及び制限地図を示す。 第４図は、ｌ）ＭＯＮ３１６のプラスミド地図を示す。 第５図は、ペチユニア及びアラビドプシスのＥＰＳＰＳ
遺伝子の制限地図を示す。 第６図は、ｐＭＯＮ９７２１のプラスミド地図を示す。

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物細胞での発現の際、５−エノールピルビルシ
   キメート−３−リン酸シンターゼ （ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドを細胞のクロロプラストに
   移行可能なクロロプラスト移行ペプチドよりなり、かつ
   植物細胞をグリホセート耐性にさせうるポリペプチドを
   適当なプロモーターの支配下で暗号化する遺伝子よりな
   るクローニング又は発現ベクター。
2. （２）クロロプラスト移行ペプチドが植物の染色体に含
   まれるＥＰＳＰＳ遺伝子由来であるところの特許請求の
   範囲第１項記載のクローニング又は発現ベクター。
3. （３）植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを暗号化するところ
   の特許請求の範囲第１項記載のクローニング又は発現ベ
   クター。
4. （４）クロロプラスト移行ペプチドが実質的に第２図に
   示された配列をもつところの特許請求の範囲第１項記載
   のクローニング又は発現ベクター。
5. （５）プロモーターがＥＰＳＰＳポリペプチドとは異種
   で、内在性のＥＰＳＰＳプロモーターよりも高度の植物
   細胞での発現を引きおこすところの特許請求の範囲第１
   記載のクローニング又は発現ベクター。
6. （６）異種プロモーターがウィルスのゲノム由来である
   ところの特許請求の範囲第５項記載のクローニング又は
   発現ベクター。
7. （７）異種プロモーターがカリフラワー・モザイク・ウ
   ィルス（ＣａＭＶ）由来であるところの特許請求の範囲
   第６項記載のクローニング又は発現ベクター。
8. （８）異種プロモーターがＣＡＭＶ３５Ｓプロモーター
   であるところの特許請求の範囲第７項記載のクローニン
   グ又は発現ベクター。
9. （９）ａ）植物細胞で発現させた際にＥＰＳＰＳポリペ
   プチドを細胞のクロロプラストにポリペプチドを移行さ
   せうるクロロプラスト移行ペプチドよりなり、かつ、植
   物細胞をグリセホセート耐性にさせうるポリペプチドを
   適当なプロモーターの支配下で暗号化するＥＰＳＰＳ遺
   伝子；及びｂ）少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界を含む
   植物形質転換ベクター。
10. （１０）ＥＰＳＰＳ遺伝子がＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
    ー及び植物ＥＰＳＰＳ遺伝子由来の ＥＰＳＰＳポリペプチド解読配列を含むところの特許請
    求の範囲第９項記載の植物形質転換ベクター。
11. （１１）ＡＴＣＣ番号５３２１３の細胞の培養に含まれ
    る特許請求の範囲第１０項記載の植物形質転換ベクター
    。
12. （１２）ａ）植物細胞での発現の際、ＥＰＳＰＳポリペ
    プチドを細胞のクロロプラストに移行させるクロロプラ
    スト移行ペプチドよりなり、かつ植物細胞をグリホセー
    ト耐性にするＥＰＳＰＳポリペチドを暗号化する解読配
    列、及びｂ）解読配列とは異種であるプロモーター配列
    を含むキメラ遺伝子。
13. （１３）クロロプラスト移行ペプチドが実質的に第２図
    に示された配列をもつところの特許請求の範囲第１２項
    記載のキメラ遺伝子。
14. （１４）プロモーター配列がウィルスのゲノム由来であ
    るところの特許請求の範囲第１３項記載のキメラ遺伝子
    。
15. （１５）プロモーター配列がカリフラワー・モザイク・
    ウィルス（ＣａＭＶ）由来であるところの特許請求の範
    囲第１４項記載のキメラ遺伝子。
16. （１６）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
    あるところの特許請求の範囲第１５項記載のキメラ遺伝
    子。
17. （１７）特許請求の範囲第９項記載の植物形質転換ベク
    ターにより形質転換された植物細胞。
18. （１８）植物形質転換ベクターがＣａＭＶ３５Ｓプロモ
    ーターと植物のＥＰＳＰＳ遺伝子の ＥＰＳＰＳポリペプチド解読配列から成るＥＰＳＰＳ遺
    伝子を含むところの特許請求の範囲第１７項記載の植物
    細胞。
19. （１９）約０．５ｍＨグリホセート及びその除草性塩に
    対して耐性である特許請求の範囲第１８項記載の植物細
    胞。
20. （２０）特許請求の範囲第１２項記載のキメラ遺伝子を
    発現する植物細胞。
21. （２１）約０．５ｍＨグリホセート及びその除草性の塩
    に対し耐性である特許請求の範囲第２０項記載の植物細
    胞。
22. （２２）ａ）特許請求の範囲第１２項記載のキメラ遺伝
    子を植物細胞のゲノムに挿入することにより植物細胞を
    形質転換すること、及びｂ）上記形質転換植物細胞から
    グリホセート耐性植物を再生することを含むグリホセー
    ト耐性植物を生産する方法。
23. （２３）グリホセート耐性トマト。
24. （２４）グリホセート耐性タバコ。
25. （２５）グリホセート耐性ナタネ。
26. （２６）グリホセート耐性亜麻。
27. （２７）グリホセート耐性大豆。
28. （２８）グリホセート耐性ヒマワリ。
29. （２９）グリホセート耐性砂糖大根。
30. （３０）グリホセート耐性アルフアルフア。
31. （３１）第１の植物種のＥＰＳＰＳ遺伝子を第２の植物
    種のＥＰＳＰＳ解読配列を含むＤＮＡ又はその断片とハ
    イブリダイズすることよりなる ＥＰＳＰＳ遺伝子を単離する方法。
32. （３２）第２の植物種がペチユニアであるところの特許
    請求の範囲第３１項記載の方法。