CZ300208B6

CZ300208B6 - Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a zpusob prípravy takové rostliny

Info

Publication number: CZ300208B6
Application number: CZ0235199A
Authority: CZ
Inventors: Mannerloef@Marie; Peter Tenning@Paul; Steen@Per
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-29
Publication date: 2009-03-18
Also published as: SE9902189D0; HUP0001729A2; CA2279258A1; WO1999023232B1; TR199901515T1; US6531649B1; GB2337263A; DE19881833B4; SE520353C2; HK1025360A1; AU1558099A; JP2001503280A; HUP0001729A3; FI991221A; CN1242803A; CN1148453C; FI991221A0; GB9915068D0; US6204436B1; EP0950109A1

Abstract

Transgenní rostliny cukrové repy, které díky tomu, že exprimují enzymovou aktivitu 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfátsyntázy (gen cp4/epsps), tolerují ošetrení 4 až 18 l/ha herbicidu Roundup®. Rostliny jsou charakteristické specifickým integracním místem. Semena získaná z uvedených rostlin a zpusob prípravy takových rostlin.

Description

Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a způsob přípravy takové rostliny

Oblast techniky

S

Předkládaný vynález se týká transgennich rostlin cukrové řepy, které jsou schopny toleroval ošetření herbicidem, ve kterém je jako účinná látka glyfosat.

to Dosavadní stav techniky

Plevele v poli cukrové řepy představují pro farmáře hlavní problém. Konipetice s plodinou vede ke snížení výnosu. V současnosti není žádný herbicid schopen účinné hubit všechny plevely, aniž by přitom neškodil také samotné plodině, tj. cukrové řepě (Miller et al., J. Sugar Beets Res. 26:

3^4. 1989). V praxi užívají farmáři směs herbicidů, která ale také omezuje růst plodiny. Mezitím ovšem došlo ke vzniku rezistence k těmto herbicidům u mnoha druhů plevelů a jejich počet stále roste (Sehweizer et al.. J. Sugar Beets Res. 28: 1-23, 1991), což problém hubení plevelů v poli s cukrovou řepou dále zhoršuje.

2o Roundup© je herbicid se širokým rozsahem, výhodný z hlediska ochrany prostředím, který' však inhibuje růst jak plevele, tak i plodiny. Z hlediska předkládaného vynálezu I 1 roztoku herbicidu Roundup® obsahuje 360 g účinné složky, tj. glyfosatu (což je triviální název pro N-fosfonometylglycin), která je přijímána listy. Dosud se nevyvinul žádný plevel rezistentní ke glyfosatu i přes 20 let jeho užívání (Holt et al., Annu. Rev. Plant. Physiol. 1993), ale také nebyla zjištěna žádná přirozená tolerance ke glyfosatu u cukrové řepy, Premergentní použití herbicidu Roundup® se zdá být na hubení plevele v poli cukrové řepy mnohem účinnější než při pěstování řepy často užívané kombinace, obsahující phenmediphan, metaní i tron a ethofumesal (Madsen et al., Weeds Res. 35; 105-111, 1995).

Glyfosat inhibuje biosyntézu aromatických aminokyselin tím. že se ireverztbilně váže na 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfátsyntázu (e/zyzvj. V chloroplastu tento enzym katalyzuje reakci, kdy se z šikimál 3 fosfátu a fosfoenolpyruvátu tvoří enolpyruvátšikimát-3-fosfátu a fosfocnolpyruválu tvoří enolpyruvátšikimát-3-fosíát a fosfát. Přibližně asi týden po aplikaci herbicidu se projeví viditelný účinek, což znamená vadnutí, žloutnutí a následně úplné zhnědnutí, degradaci rostlinného pletiva a rozpad kořenů.

Aby kulturní rostliny získaly toleranci ke glyfosatu, výzkum se soustředil na přenesení genu epsps, schopného zvýšit toleranci ke glyfosatu, do rostlin. Kromě rostlin také bakterie a houby přirozeně exprimují enzymovou aktivitu epsps. Bylo zjištěno, že gen cp4/epsps z. Agrohacleriwn io sp. GP4 udílí toleranci ke glyfosatu (Barry et al„ „Inhibitors of Amino Acid Biosynthesis: Strategies for Imparting Glyphosate Tolerance to Crop Planíš“, in: Biosy nthesis and Moleeular Regulation of Amino Aeids in Planíš, Singh et al (eds), American Society of Plant Physiologists, pages

139-145, 1992). Vnesení genu cp4/epsps do sóji a řepky olejky vedlo k toleranci k aplikaci herbicidu na list v polních podmínkách (Delannay et al., Crop Sci. 35: 1461-1467. 1995; Padget45 te et al., Crop Sci. 35: 1451-1461, 1995).

Glyfosatoxidáza-reduktázaígav) izolovaná zAchromobacter sp. kmen LBAA (Barry et af, viz výše) degraduje glyfosat na kyselinu aminomctylfosfonovou, což je sloučenina, která není toxická pro rostliny. Kombinace genů cp4/epsps a glyfosatoxidázy (go.r) bylo úspěšně použito pro

5o získání transgenní pšenice (Zhou ct al, Planí Cell Rep. 15:1 59-163, 1995) tolerantní ke glyfosatu.

C7. 300208 B6

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu jsou tedy transgenní rostliny cukrové řepy. které jsou * tolerantní ke glyfosátu v dávce, která je dostatečně vysoká, aby projevila optimální herbicidní účinnost. Takové rostliny mohou byt dále zlepšeny zpětným křížením s výběrovými liniemi, aby se dosáhlo optimalizace agronomických vlastností jako je výnos, odolnost k palogenůtn apod.

Cukrová řepa může být transformována pomocí metody transformace zprostředkované Agrobacio terium tumefaeiens (Fry et al, Third International eongress of planí mol. biol.. Tureon. Arizona,

USA; DTÍaliuin et al, Bio/Technology 10, 309-314, 1992; Konwar. J, Planí Bioeliem & Bioteeh 3: 37™41, 1994). Transformace zprostředkovaná Agrobacteňimi tirniefaciens vede často k tomu, že do rostlinného genomu je integrováno několik kopií T-DNA. Gen, který má být v integrován, je výhodně vložen do T-DNA, takže je lokalizován v blízkosti pravé hranice T DNA, takže je lokalizován v blízkosti pravé hranice T-DNA. která je, na rozdíl od levé hranice, téměřjistě vždy přenesena do rostliny.

Rostliny podle předkládaného vynálezu tolerují ošetření více než 3x6 Iitry herbicidu Roundup® na hektar (asi 18 l/ha). Celková standardní dávka, umožňující dobré výsledky v hubení plevelů, je

4 až 6 litrů na hektar, v závislosti na množství plevelů, je 4 až 6 litrů na hektar, v závislosti na množství plevelu. V těchto koncentracích neprojevuje herbicid žádný vliv na životaschopnost rostlin a chlorózu listů. Tolerance, kterou vykazují rostliny podle předkládaného vynálezu, je udělována transgenně exprimovanou enzymovou aktivitou cp4/epsps. Výhodné provedení vynálezu bylo uloženo v Národní sbírce průmyslových a mořských bakterií (National Collections of Industrial and Marině Bacteria Limited, 23 St Machar Drive. Aberdeen ΛΒ2 I RY. Scotland UK) 24, října 1997 jako položka č. NC1MB 40905,

Předkládaný vynález se týká rostlin cukrové řepy. včetně jejich potomstva, které exprimují enzymovou aktivitu cp4/epsps. Konkrétné se předkládaný vynález týká rostlin cukrové řepy, včetně

5a jejich potomstva, které tolerují ošetření 4 až 18 litry herbicidu Roundup® na hektar.

Rostliny podle předkládaného vynálezu je možné získat rutinní transformací zprostředkovanou Agrobacferium tumefaciens pomocí transformačního vektoru, který mezi pravou a levou hraniční sekvencí I DNA obsahuje úsek DNA popsaný zde jako sekvence id, é, 5 kódující cp4/epsps.

Bylo překvapivé zjištěno v rámci předkládaného vynálezu, žc transformace (RRMax) bez levé a pravé T-DNA hraniční sekvence v transgenním genomu vedoucí k deleci (odstranění) značné části DNA transformačního vektoru, přičemž však DNA kódující cp4/epsps zůstává, vede k vynikající toleranci ke glyfosátu. Zvláště úsek DNA, popsaný zde jako sekvence id, ě, 1, byl nalezen integrovaný do vysoce repetitivního úseku genomu, a současně nahradil část DNA v této repetil ivní (opakující se) genomové sekvenci.

Genomová DNA bezprostředně sousedící s částí transgenní sekvence, která je v použitém vektoru spojena s pravou T-DNA hraniční sekvencí, má sekvenci zde uvedenou jako sekvence id. č. 2. Genomová sekvence bezprostředně přilehlá k druhému konci integrované transgenní DNA má sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. 3. Upíná DNA sekvence nového uspořádání genomové DNA je zde uvedena jako sekvence id. 4.

Tudíž předkládaný vynález se týká rostlin cukrové řepy, včetně jejich potomstva, ve kterých část rostlinného genomu tvoří DNA charakterizovaná nukleotidovou sekvencí id. č. 1, přičemž uvedená nukleotidová sekvence výhodně nahrazuje vysoce repetit i vn í sekvenci DNA uvnitř rostlinného genomu.

Výhodná podle předkládaného vynálezu je rostlina cukrové řepy, včetně jejího potomstva, ve které části jejího genomu přímo spojené s uvedenou nukleotidovou sekvencí jsou charakterizovány jako sekvence id. č. 2 a sekvence id. č. 3.

? Dalším výhodným řešením podle předkládaného vynálezu je rostlina cukrové řepy. včetně jejího potomstva, kde DNA charakterizovaná nukleotidovou sekvencí id. č. 4 tvoří část rostlinného genomu.

Tolerance k herbicidu vnesená do transgenníeh semen a rostlin zmíněných výše se přenáší při io pohlavním nebo vegetativním rozmnožování a je tedy možné rozšiřovat a udržovat ji v potomstvu. Obecně řečeno, udržování a rozmnožování užívá známé zemědělské techniky jako je obdělávání pudy, setí nebo sklízení. Vzhledem k lomu. že rostoucí plodina je náchylná k poškození způsobeném hmyzem nebo infekcemi, podnikají se opatření k zabránění chorobám a k hubení škodlivého hmyzu a nematod, a další opatření ke zlepšení výnosů. K nim patří i mechanická opatření jako orání půdy nebo odstraňování infikovaných rostlin, a také aplikace agrochemikálií jako jsou fungicidy, gametocidy, nematíeidy. růstové regulátory', insekticidy a Činidla ury chlující zrání.

Transgenní rostliny a semena tolerantní k herbicidu podle předkládaného vynálezu se mohou dále využít ve šlechtění rostlin, s cílem zlepšit toleranci ke škodlivému hmyzu, herbicidů nebo stresu, zlepšení nutričních hodnot, zvýšení výnosu nebo zlepšení struktury, které by vedlo ke zmenšení ztrát v důsledku zničení při skladování a transportu. Jednotlivé kroky šlechtitelského procesu jsou charakterizovány dobře definovanými lidskými zásahy jako je vyber linií ke křížení, řízení opylení rodičovských linií nebo výběr potomstva. V závislosti na požadovaných vlastnostech se z? provádějí různá šlechtitelská opatření. Odpovídající techniky jsou v oboru dobře známy a neomezují se pouze na hybrid izaci, inbreedíng, zpětné křížení, víceliniové křížení, křížení variet, mezídruhovou hybrid izaci, aneuploidní techniky apod. Takže transgenní semena a rostliny podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro šlechtění zlepšených linií rostlin, které např. zvyšují účinnost konvenčních metod jako je ošetření herbicidy nebo pesticidy, nebo se díky svým

3(i modifikovaným genetickým vlastnostem obejdou bez těchto metod. Alternativně je možné získat nové plodiny se zlepšenou tolerancí ke stresu, které díly jejich optimalizované genetické výbavě poskytují produkty v lepší kvalitě než produkty rostlin, které nejsou schopné tolerovat srovnatelně nepříznivé vývojové podmínky.

V semenářství jsou kvalita klíčení a uniformita osiva nezbytnými charakteristikami produktu, zatímco kvalita klíčení a uniformita semen sklízených a prodávaných farmáři nejsou tak důležité. Jelikož je obtížné udržoval plodinu v čistém stavu bez příměsi semen jiné plodiny nebo plevelu, kontrolovat nemoci přenášené semeny, a produkovat osivo s dobrou kvalitou klíčení, značné obsáhlé a dobře definované techniky výroby osiva byly vyvinuty producenty osiva, kteří mají •io zkušenosti a pěstováním, udržováním a prodejem čistého osiva. Je běžnou praxí, že farmář kupuje eertifikované osivo odpovídající kvalitativním standardům, místo aby používal osivo z vlastní úrody. Materiál používaný jako osivo je obvykle ošetřen ochrannou vrstvou obsahující herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy. nematicidy, moluscicidy nebo jejich různé směsi. Obvykle užívané ochranné vrstvy obsahují sloučeniny jako kaptan, karboxin. thiram (TMTD®), metalaxyl •15 (Apron®) a pirimifosmctyl (Aclellíc®). Pokud je to potřeba, tyto sloučeniny tvoří prostředek společně s dalšími pomocnými látkami, nosiči, surfaktanty nebo adjuvans (usnadňujícími aplikaci, což běžně užívá v oboru prostředků pro ochranu před poškozením bakteriálními, houbami nebo živočišnými škůdci. Ochranná vrstva se může aplikovat impregnaci osiva tekutým prostředkem nebo kombinovanou aplikací kapalného a suchého prostředku. Jiné způsoby aplikace lze

5o také použít, např. přímé ošetření pupen nebo plodů.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká nových zemědělských způsobů, jejichž příklady jsou uvedeny v předchozím textu, a které jsou charakterizovány použitím transgenníeh rostlin, transgenního rostlinného materiálu nebo transgenního osiva podle předkládaného vynálezu.

- 3 CZ 300208 B6

Předkládaný vynález se také týká transgenních rostlinných buněk, tání, orgánů, semen nebo části rostlin získaných z transgenních rostlin. Součástí vynálezu je i transgenní potomstvo rostlin včetně transgenních rostlinných buněk, pletiva, orgánů, semen a rostlinných částí získaných z potomstva,

Vynález se dále týká obchodního sáčku, který' obsahuje semena cukrové řepy schopné exprimovat cp4/epsps tolerantní k herbicidu Roundup®. společně s instrukcemi k použití na obalu. Výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je obchodní sáček obsahující semena transgenní rostliny, která obsahuje úsek DNA stabilně integrovaný do svého genomu, který má io nukleotidovou sekvenci id. č. 1.

Použitý transformační postup lze shrnout do následujících kroků:

a) transformace děložních lístků in vitro pěstováni cukrové řepy prostřednictvím Agrohactei? ti um t ume fot. iens pomocí vektoru ob sa h uj í c í h o ú se k DNA kód uj í c í cp4/epsps j a k j e pospán v sekvenci id. č. 5,

b) regenerace výhonků v přítomnosti glyťosátu, e) přenos výhonků do půdy ve skleníku.

2« d) ošetření rostlinek glyfosatem.

e) vizuální hodnocení životaschopnosti rostlin a chlorózy listů, selekce zcela normálních rostlin, u kterých ani životaschopnost ani listy nejsou ovlivněny ošetřením glyfosatem, a

g) množení selektovaných rostlin pomocí obvyklých šlechtitelských technik.

Konkrétně výhonky se regenerují v přítomnosti 0.1 až 10 mM, výhodné 1 mM glylbsatu po 8 až 12 týdnech selekce. Každý transgenní výhonek je dále namnožen do 10 kopií, které lze případně analyzovat na přítomnost transgenu cp4/epsps pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) předtím, než se přenesou do skleníku pro zakořenění. Světelné podmínky ve skleníku byly 16 hodin světla a 8 hodin tmy s teplotou 22 ± 2 °C. Ve stadiu 3 až 4 listů byly rostlinky postříkány vodným roztokem herbicidu Roundup® v dávce 0,1 až 20 litrů na hektar, výhodně v dávce 1 litrech na hektar. Dva týdny po aplikaci glyťosátu bylo provedeno individuálně pro každou rostlinu vizuální hodnocení vitality a chlorózy, založené na stupnici od 0 (odumřelá rostlina) do 9 b (zcela neovlivněná rostlina). Hodnocení 0 až 3 je typické pro citlivé rostliny, hodnocení 3 až 7 ukazuje nízkou až střední míru tolerance a hodnocení 8 až. 9 znamená dobrou úroveň tolerance.

Stupnice hodnocení má tento konkrétní význam:

... neovlivněná rostlina shodná s neošetřenou kontrolou

... velmi malé nekrózy na špičkách listů, kdy méně než 5 % listové plochy je ovlivněno a žloutne

... velmi malé nekrózy na špičkách listů, které se ale začínají kroutit, přičemž méně než 5 % 45 listové plochy jc ovlivněno a žloutne

6, 5, 4 ... zvětšující se nekrózy a kroucení listů, listy jsou menší než normální

3, 2 ... buďto žádný nebo omezený růst listů, všechny listy jsou zkroucené a zasaženy nekrózou

... žádný růst rostliny, nejvýše 5% rostliny je ještě zelené

... odumřelá rostlina.

-4 CZ 300208 B6

Pro získání údajů z polních experimentů byly normální rostliny s normální vitalitou a neovlivněné glyfbsatem (hodnocení 9) množeny nebo dále pěstovány obvyklými způsoby. Transformace se výhodně prováděla pomocí Ti vektoru obsahujícího úsek DNA se sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 5 obsahující geny cp4/epsps a gox, o kterých je známo, že uděluji toleranci ke glyfosatu určitým rostlinným druhům, a reportérový gen itidA kódující enzym β-glukuronidázu. Zesílený promotor 35S (Oděli et al.. Nátuře 313: 810 812, 1985) byl přítomen ke genu uidA, promotor viru mozaiky krticníku (PMV) (Gouwda et al., J. Cell. Biochcm. Suppl. 13D: 301, 1989) byl připojen ke genům cp4/epsps a gox. před geny cp4/epsp a gox („upstream, tj. proti směru κι transkripce) byl vložen transitní peptid (Gasser et al., J. Biol. Chem. 263:4280—1289. 1988), aby se zajistilo zacílení obou proteinů do chloroplastu.

Jedna transformační událost podle předkládaného vynálezu vedla k překvapivému zjištění, že na rostliny nepůsobil Roundup® v dávkách až do 3 x 6 litrů na hektar (18 1/ha). Molekulární analýza ukázala, že • je zde jedna kopie transgenu integrovaná do jediného fokusu • i n te gro v a n á DN A k ód uj e cp 4, epsps a odpo v í dá zkrácené vektorové DN Λ • integrovaná DNA nahradila část genomové DNA a má sekvenci uvedenou zde jako sekven2o ce id. c. 1 • genomová DNA přímou sousedící s integrovanou DNA je charakterizována sekvencí id. ě. 2 a sekvencí id. č. 3, a má nové uspořádání genomových sekvencí uvedené zde jako sekvence id. ě. 4 • geny cp4/epsps a uidA jsou intaktní zatímco gen go.v je zkrácen

2? · jiné vektorové sekvence nejsou v transgenní rostlině přítomny.

Nyní, když jsou tyto informace dostupné, je možné rostliny z jedné specifické transformační události podle předkládaného vynálezu odlišit od jiných rostlin cukrové řepy pomocí PCR. Vhodné kombinace párů oligonukleotidových primerů dovolují specificky identifikovat sekvence io genomové DNA, které jsou přítomné v rostlinách pouze jako přímý či nepřímý důsledek shodných transformačních událostí. Takové transformační události nejsou omezeny na transformace provedené pomocí Agrobacteriu/n tu/nefaciens, ale mohou to být i transformace biolistické (ostřelováním mikročásticemi).

Předkládaný vynález se dále týká rostlin cukrové řepy, včetně potomstva, u kterých amplifikace

PCR na jejich genomové DNA jako templátů vede k amplifíkaeí

DNA fragmentu velikosti 739 bp, pokud se použije pár oligonukleotidových primerů se sekvencemi id. č. B a id. č. a. nebo io

DNA fragmentu velikosti 834 bp, pokud se použije pár oligonukleotidových primerů se sekvencemi id. ě. D a íd. č, e, nebo

DNA fragmentu velikosti 1057 bp. pokud se použije pár oligonukleotidových primerů se 15 sekvencemi id, ě, A a id. č. b, nebo

DNA fragmentu velikosti 1224 bp. pokud se použije pár oligonukleotidových primerů se sekvencemi id. č. C a id. č. f.

- 5 CZ 300208 B6

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady popisují materiály a metody použité při provádění vynálezu a dosažené výsledky. Slouží k ilustraci vynálezu a v žádném případe ho nijak neomezují.

Příklad 1 ni Transformace cukrové řepy

Cukrová řepa genotypu A1012 byla transformována vektorem obsahujícím geny cp4'epsps a go.v schopnými udělit toleranci ke glyfosátu. gen nptll, který udílí rezistenci k antibiotiku kanamyeinu a reportérovy gen uidA kódující β-glukuronidázu (GUS). Geny nptlla uidA jsou funkčně spojeny se zesíleným promotorem 35S (Oděli et al.. Nátuře 313: 810-812, 1985). zatímco geny cp4/cpsps a gox spojeny s transituím peptidem (Gasser et al., J. Biol. Chem. 263: 4280-4289, 1988), umístěným na 5'-konei, aby byly oba proteiny směrovány do ehlorplastu. cp4ďpsps a uidA užívají terminátorovou 3'-sekvcnei R9, zatímco gav a nptll užívají odpovídající 3'-sekvenci NOS.

Rošt 1 i n y c u k r o \ é ře py (Beta vu/garis. L) pe s t o v a né in vitro by ly t ra n s fo rn i o v ány pros t ředn ic t v í ni Agrobacterium tumefaciens. Rostliny byly regenerovány způsobem, který popsali Fry et al. („Genotype-independent transformation of sugarbeet using Agrobucterium tumefaciens'', Third international eongress of planí mol. biol., Tuseon, Arizona. USA.. 1991) a Konwar (J. Plant Biochem & Biotech 3: 37^11, 1994) za použití glyfosátu v koncentraci 1 mM jako selekčního činid25 la. Aby se odstranil Agrobacterium tumefaciens, byly děložní lístky třikrát po sobě inkubovány v MS médiu obsahujícím 500 mg/1 eefotaximu (60 minut při 45 až 50 ot./min). Regenerované výhonky byly analyzovány po 8 až 12 týdnech sclckcc na lmM glyfosátu a 500 mg/1 eefotaximu včetně pasážování do čerstvého média každý třetí týden. Každý transgenní výhonek byl rozdělen a dále pěstován (mikropropagaee) do 10 kopií a analyzován na přítomnost transgenu a pak přenesu sen do skleníku pro zakořenění.

Bol v me rázová řetězová reakce (PC? R) byla použita k ověření přítomnosti genu cp4/epsps. Dvacet mg rostlinného materiálu bylo odebráno z výhonků regenerovaných in vitro do mikrozkumavky eppendorf. Celková DNA byla izolována v podstatě postupem, který popsali l ai et al.. Plant Mol.

.55 Biol. Rep 8: 297303, 1990. Menší modifikací bylo přidání 500 μΐ lOOmM Tris-HCl pH 8,0 obsahujícího 50mM Na EDTA, 1.25% (hmotn./objem) SDS, 0,38% (hmot./objem) siřičitanu sodného a 200 mg/ml proteinázy K, a pak inkubace v 65 °C po 2 hodiny. Nerozpuštěný materiál 7 listu byl odstraněn a celková DNA byla preeipitována zmražením v -20 °C. PCR byla provedena podle návodu k soupravě Genc-Amp PCR kit (Perkin-Llmer Corp.) stíní, že byl použit

4o modifikovaný reakční pufr (l()x) obsahující lOOmM Tris-HCl pH 8,3. 500mM KC1, 30mM MgC12. 1,0% Nonidel P-40 (hmotn,/objem), 0,4μΜ kresolovou červeň ve 24% (hmotn./objem) sacharóze a protilátku faq Start (Taq Start Antibody, Clonleeh).

Pro amplifikaci sekvencí cp4/cpsps byly použity následující primery' (Shah et al.. Science 233:

4? 478-481, 1986):

5-CAC CGG TCT TTT GGA AGG TGA AG 3' (sekvence id. č. 6) a 5'-AAC GAG ACC CAT AAC GAG GAA GC-3' (sekvence id. č. 7).

5o Pro amplifikaci sekvencí genomové vnitrní (surÁ. surB byly použity následující primery:

5' ΛΑΑ CAG TCC CGT GCA TCC CCA AC-3' (sekvence id. č. 8) a 5-GAC GCT CTC CTT GAT TCT GTC CC-3' (sekvence id. Č. 9).

-6C7. 300208 B6

Nebyla patrna žádná varianta v transformační účinnosti při použití různých binárních plazmidu.

Výhonky získané mikropropagací byly přeneseny do půdy ve skleníku. Světelné podmínky ve skleníku byly 200 μιηοΙ-2 s-1 (Osram Power Star HQ1-Z. 400Q). 16 hodin světla a 8 hodin tmy s teplotou 22 + 2 °C. Ve stadiu 3 až 4 listů byly rostlinky pocházející z původních 260 transformovaných rostlin (transťormant) ošetřeny herbicidem Roundup®. Byl použit kalibrovaný postřikovač pro aplikaci vodného roztoku herbicidu v dávce 1 litr na hektar (1 l/ha při 360 g/1 účinné látky). Dva týdny po aplikaci glyfosátu bylo provedeno hodnocení fytotoxického účinku individuálně pro každou rostlinu vizuálně na základě stupnice od 0 (odumřelá rostlina) do 9 (zcela ío neovlivněná rostlina). Fytotoxieký účinek u 75 různých trans formant byl hodnocen skórem 7 a vyšším, což znamenalo, že tyto transformanty projevovaly malé nebo žádné známky účinku ošetření herbicidem. Tyto rostliny byly dále kříženy s normálními, tj. netransgenními rostlinami cukrové řepy pro získání F1 potomstva pro další vyhodnocení polních pokusů.

Polní pokusy se prováděly k vyhodnocení různých transformačních událostí v polních podmínkách. Každá parcelka měla tři řady, každou o délce 9 m, se vzdáleností mezi řadami 0,5 m. Na každé parcelce byla vysazena jedna transformanta. Po počáteční aplikaci prostředku Roundup® v dávce 1 l/ha (360 g/1 účinné látky), ve stadiu děložních lístků, byly rostliny ručně jednoceny. ab\ se eliminovaly segregujíeí nelransgenní rostliny, a to tak, aby zůstala jedna rostlina na

2D 20 cm. Každá parcel ka byla rozdělena na 3 částí, které byly ošetřovány nezávisle. Jedna parcel ka byla ošetřena konvenčními herbicidy metaníitron v dávce 0,1 kg účinné látky/ha, phenmediphan 0.2 kg účinné látky/ha a ethofumesate OJ kg účinné látky/ha. Další parcelka byla ošetřena prostředkem Roundup® 2x2 l/ha (1440 g/1 účinné látky) a třetí parcelka byla ošetřena prostředkem Roundup® 2x4 l/ha (2880 g/1 účinné látky). Rostliny byly ošetřovány ve stadiu 4 listů. Dva

?.5 týdny po aplikaci herbicidu byly rostliny hodnoceny z hlediska fytotoxického účinku herbicidu. Zjištěny byly symptomy v rozsahu od úplné citlivosti až po úplnou toleranci. Byly zjištěny rozdíly mezi hodnocením ve skleníku a na poli. I o bylo zřejmě způsobeno rozdílem ve vnějších podmínkách, mimo jiné i tím, že ve skleníku nebyl použit filtr pro UVB záření. Nebyly zjištěny žádné morfologické nebo fyziologické rozdíly mezi rostlinami z pareelek ošetřených různými dávka30 mi prostředku Roundup® ve srovnání s ošetřením směsí konvenčních herbicidů. Dvě transformanty projevovaly vysokou toleranci k prostředku Roundup® po ošetření 2x2 l/ha a 2 x 4 l/ha.

Po postřiku herbicidem Roundup® byla tolerance vyhodnocena posuzováním vitality rostlin (Tr.vig) a chlorózy listů (Tr. ehl). Jednotlivé stupně ve Škále hodnocení měly následující význam;

... neovlivněná rostlina shodná s neošetřenou kontrolou

... velmi malé nekrózy na špičkách listů, které se ale začínají kroutit, přičemž méně než 5 % listové plochy je ovlivněno a žloutne

6, 5. 4 ... zvětšující se nekrózy a kroucení listů, líšty jsou menší než normální

3, 2 ... buďto žádný nebo omezený růst listů, všechny listy jsou zkroucené a zasaženy nekrózou 1 ... žádný růst rostliny, nejvýše 5% rostliny je ještě zelené

0 ... odumřelá rostlina.

Bylo hodnoceno 22 různých transformačních událostí (č. 1 až 22) a 1 netransgenní kontrola (c. 3) po postřiku 1+4 + 4 l/ha Roundup® (celkem 9 l/ha). Výsledky vizuálního hodnocení poškození jsou uvedeny v následující tabulce.

-7CZ 300208 B6

transform.	hodnocení	hodnocení
událost č.	vitality	chlorózy
1	9	9
2	6	7
3	2	3
4	5	7
5	Q	8
6	3	3
7	7	7
8	7	8
9	4	6
10	5	6
11	5	5
12	4	5
13	9	9
14	3	5
15	4	4
16	2	3
17	1	1
18	2	2
19	6	8
20	7	5
21	4	5
22	5	7
23	0	0

(RRMax) (netransgen.kontrola)

Příklad 2

Počet kopii integrované DNA

Počet kopií transgenní DNA integrované v genomu transformované rostliny (transformanty) io s nej vyšší tolerancí ke glyfosátu (RRMax) byl stanoven metodou Southernova přenosu na restrikčních fragmentech sahajících na levou a pravou hraniční sekvenci použitého transformačního vektoru.

Genomová DNA z RRMax a netransgenní kontrolní rostlinv byla izolována z 250 mg zamraženého pletiva listu cukrové řepy postupem, který publikovali Saghai-Maroof et al.. Proč. Nati. Aead. Sci. USA 81:8014-8018, 1984. DNA transformačního vektoru sloužila jako pozitivní kontrola. 15 pg DNA bylo naštěpeno pomocí 120 jednotek restrikčního enzymu 4 hodiny při 37 °C v celkovém reakčním objemu 400 μΐ. Naštěpená DNA byla precipitována a znovu rozpuštěna v 50 μΙ. Naštěpená DNA, pozitivní plazmidová kontrola a standard velikosti (lambda DNA naštěpená EcoRl and HindiII) byly separovány) clcktroforézou na 0,8% agarózovém gelu. DNA byla vizualizována pomocí etidiumbromidu a vyfotografována společně s měřítkem. Pak byla DNA přenesena na membránu llybond N+ a hybridizována se sondou postupem, který popsali Ausubel el al. (eds.) in: „Current protocols in molecular biology“. Grcen Publishing Associates, lne. and John Wiley & Sons, lne., New York, 1987.

Byly připraveny sondy zahrnující páry bází 975 až 1766 zc sekvence genu cp-Hepsps (sekvence id. ě. 5) a páry bází 7108 až 7535 sekvence genu gox (sekvence id. č. 5) pomocí polymerázovc řetězové reakce (PCR), kdy jako templátová DNA sloužil použitý transformační vektor. Sonda genu cpd/epsps byla užila pro stanovení počtu inzertů sousedících s pravou hraniční sekvencí.

-8CZ 300208 B6

Sonda genu gox byla užita pro stanovení počtu inzertů sousedících s levou hraniční sekvencí. Produkty PCR byly purifikovány pomocí soupravy Geneclean II® Kit firmy BIO 101 (La Jolla, CA). Značení sondy ’²P bylo provedeno pomocí soupravy Megaprime^IM DNA labelling systém firmy Amersham International (Little Chalfont, UK).

Stanovení počtu kopií se provádělo analýzou genomovc DNA obklopující pravou hraniční oblast. Genomová DNA byla naštěpena restrikčním enzymem NcoJ. který štěpí sekvence odvozené z plazili idu mezi promotorem 35S a genem uidA a uvnitř genomu cukrové řepy. Membrána pak byla testována se sondou, kterou byl vnitřní PCR fragment genu ep4^:epsps.

io

Stanovení počtu kopií lze také provést analýzou genomovc DNA sousedící s levou hraniční sekvencí. Genomová DNA se naštěpí restrikčním enzymem 1 lindlll, který stepí sekvence odvozené z plasmidu mezi 3'-terminátorem F9 genu uidA a promotorem FMV genu gox a uvnitř genomu cukrové řepy. Po naštěpení HindllI a hybridizaci se sondou gav byl detekován jediný pás velikosti asi 2.0 kb u transfomianty RRMax. Vzhledem k tomu. že velikost nejmenšího očekávaného fragmentu byla >4 kb. tento výsledek ukazuje na zkrácení plazmidové DNA během přenosu do genomovc DNA rostliny. Nicméně výsledek potvrdil, že pouze jediná kopie přenesené DNA byla integrována do jediného lokusu.

?(.>

Příklad 3

Analýza sekvence integračního místa RRMax

Genomová DNA z RRMax a netransgenní kontrolní rostliny byla izolována z 250 mg zamraženého pletiva listu cukrové řepy postupem, který publikovali Saghai-Maroof (viz výše). Byla připravena knihovna fága ŽFIXII (objednáno u firmy Stratagene) s inzerty velikosti 9 až 23 kb v blokovacím místě Xhol a tato knihovna byla podrobena sereeningu se sondami cp4/epsps a gox pro vyhledávání předpokládaných klonů obsahujících integrační místo. Bylo detekováno celkem

25 fágů. které hybridizovaly s geny cp4!epsps a gox. Jeden z nich byl puntíkován (podle Fritsch et al.. 1987) a dále testován Southernovým přenosem a PCR. Ukázalo se, že obsahuje inzert genomovc DNA velikosti 15 až 16 kb včetně transgenní DNA a přilehlých sekvencí z genomu cukrové řepy. Uvedené přilehlé sekvence byly amplifikovány pomocí PCR s primery komplementárními k promotoru FMV nebo sekvenci klonovatí kazety λΓΊΧΙΙ (sekvence jsou podrobně uvedeny v následující tabulce 1). Usek spojení integrované DNA a genomové DNA cukrové řepy byl sek věncován Sangerovou dideoxy-terminační metodou na přístroji Applied Biosystems, Model 373A, verze 2.1.1. Primery použité k sekvencování jsou uvedeny v následující tabulce 2.

io Tabulka I

Primery použité pro amplifikaei hraničních úseků

Primer č.	Sekvence
3	5’-CAAGAAGGTTGGTATCGCTG-3¹ (	sekvence id. č. 10)
7	5’-TCTTTTGTGGTCGTCACTGCGTT-3’	(sekvence id. č. 11)
8	5’-GCGAGCTCTAATACGACTCACTAT-3	¹ (sekvence id. č. 12)
9	5’-CGCGAGCTCAATTAACCCTCACT-3’	( sekvence id. č. 13)

-9 CZ 300208 B6

Tabulka 2

Primery pro sekvencování

Primer	Sekvence	Popis
SI	5'-TCTGTACCCTGACCTTGTTG-3 '	pro sekvencování	úseku
	(sekvence id. č. 14)	sousedícího s pravou	t hranicí
S3	5’-CGTGGATACCACATCGTGAT-3'	pro sekvencování	úseku
	(sekvence id. č. 15)	sousedícího s levou	hranicí
S4	5’-accttggcttgaagtactc-3'	pro sekvencování	úseku
	(sekvence id. č. 16}	sousedícího s levou	hranicí

Sekvenční analýza ukázala, že transgenní DNA integrovaná v genomu RRMax má sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 1. Počáteční místo integrace leží mezi sekvencí pravé hranice a ío promotorem FMV a končí 897 bp „downstrcam“ (po směru transkripce) od startkodonu genu go.v. Translační stopkodony pro zkrácený gen gox lze najít 130 a 235 bp „downstream“ od míst a spojení. Místo Hindlll bylo identifikováno 210 bp „downstream a transkripční terminační signál (AATAAA) 650 bp „downstream od startkodonu genu gav. Sekvence id. č. 2 popisuje sekvenci genomové DNA bezprostředné spojené s pravým hraničním úsekem transgenní DNA a sekvence id. č. 3 popisuje DNA sekvenci genomové DNA bezprostředně spojené s levým hraničním úsekem transgenní DNA.

Příklad 4

Charakterizace transgenní DNA integrované v RRMax

Pro další charakterizaci pravé hraniční oblasti byla genomová DNA z RRMax a DNA transformačního vektoru naštepena některým z restrikčních enzymů Bánil 1L 1 tindlIE Bell nebo EcoRI.

Naštčpená DNA pak byla Southernovým přenosem testována pomocí sondy, kterou byl PCR fragment genu cp4'epsps popsaný v příkladu 2. Nezávisle na použitém restrikěním enzymu, štěpení vždy vedlo ke vzniku jediného fragmentu, jak ukázala Southemova analýza. Velikost detekovaných fragmentů je uvedena v tabulce 3. Data ukazují, že jediná kopie DNA byla přenesena do rostliny a Že přenos DNA do rostliny cukrové řepy vedl k přenosu úplného genu cp4/~ epsps. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky stanovení počtu kopií v příkladu 2 a s analýzou nukleotidové sekvence v příkladu 3.

Tabulka 3

Velikost fragmentů detekovaných Southernovým přenosem

Enzym	RRMax	Transformační vektor
BamHI	>10 kb	9,7 kb
Hindlll	2,4 kb	2,4 kb
Bell	3,2 kb	2, 9 kb
EcoRI	1,8 kb	1,8 kb

- 10C7. 300208 B6

Pro další charakterizaci úseku integrované transgenní DNA byla genornová DNA z RRMax našlčpena rcstrikčními enzymy Ncol. BamHI a 1 íindlll. Jako kontrola byl stejnými enzymy naštěpen transformační vektor, Southernův přenos byl testován sodnou, kterou byl PCR ainplifi? kovaný fragment DNA zahrnující páry bázi 3796 až 4837 genu uidA sekvence id. ě, 5. Velikost detekovaných fragmentů je uvedena v tabulce 4. Nezávisle na použitém restrikěním enzym ll štěpení vždy vedlo ke vzniku jediného signálu na autoradiografiekém filmu, což ukazuje, žc inzert DNA má stejné vlastnosti jako vnitřní DNA použitého transformačního vektoru.

ID

Tabulka 4

Velikost fragmentů detekovaných Soulhernovým přenosem

En2ym	Transformační vektor	RRMax
Neol	3,4 kb	3, 4 kb
BamHI	3,2 kb	3,2 kb
HindiII	3,2 kb	3,2 kb

Pro další charakterizaci levého hraničního úseku byla genornová DNA z RRMax a DNA transformačního vektoru naštčpeny některým z restrikěníeh enzymů Neol, BamHI, Hindlll nebo EcoRl. Na štěpená DNA pak byla Southernovým přenosem testována pomocí sondy, kterou byl

PCR fragment genu gax popsaný v příkladu 2. Velikost detekovaných fragmentů je uvedena v tabulce 5. Nezávisle na použitém restrikěním enzymu, štěpení vždy vedlo ke vzniku jediného fragmentu na autopradiografickém filmu. Podle očekávání štěpení enzymy Neol. BamHI nebo EcoRl mělo vést ke vzniku vnitřních fragmentů známé velikosti. Avšak žádné štěpení jedním z těchto enzymů nevedlo ke vzniku očekávaného fragmentu známé velikosti. To ukazuje, žc rest2? rikční místa pro Neol. BamHI a EcoRl v transgenní rostlině chybí. Výsledky jsou v souladu se sekvencováním. kdy se ukázalo, že pouze část genu gax se integrovala do rostliny. Štěpení enzymem Hindlll vedlo ke vzniku fragmentu velikosti asi 2 kb, což dodatečné potvrdilo data ze sekvenční analýzy, že místo Hindlll je lokalizováno „downstream od genu go.x uvnitř genomu. Výsledky také ukazují, že do rostliny byla přenesena jediná kopie DNA. To koreluje velmi dobře s primárními výsledky stanovení počtu kopií v příkladu 2 a se sekvencováním nukleotidové sekvence v příkladu 3. V rostlinném genomu je integrována jediná kopie, přičemž část genomu gav je deletována (odstraněna).

b Tabulka 5

Velikost fragmentů detekovaných Southernovým přenosem

Enzym	Transformační vektor	T9100152
Neol	2, 5 kb	3,0 kb
BamHI	2,9 kb	>10 kb
Hindlll	9,5 kb	2,0 kb
EcoRl	1, 6 kb	3, 6 kb

CZ 300208 R6

Příklad 5

Nepřítomnost dalších vektorových sekvencí

Pro ověření absence sekvencí orilý ori-322, aad a nptH po transformační události byla RRMax analyzována pomocí reslrikčních enzymů a sond. pokrývajících geny oriV. ori -322, aad a nptH.

DNA transformačního vektoru byla naštěpena enzymem Nspl. který štěpí plazmid na 17 místech, io Pro účely analýzy byly purifikovány fragmenty zahrnující úseky genů ori\H ori-322. aad a použitý pro Southcmovu analýzu, fragment amplifikovaný PCR sc sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 26 byl použit jako sonda pro sekvenci nptH. Všechny fragmenty byly purifikovány pomocí soupravy Geneclean II® Kit firmy BIO 101 (La Jolla, CA). Značení sondy ^,2P bylo provedeno pomocí soupravy Megaprime^IM DNA labelling systém firmy Amersham International (Little Chalfont, UK).

Genomová DNA RRMax byla naštěpena restrikčním enzymem BamHl. který štěpí DNA transformačního vektoru na 3 místech, a sice v polohách 2321, 5544 a 8413 podle sekvence id. ě. 5. I Ivbridizace odpovídající membrány sc Southemovým přenosem se sondou pokrývající gen

2o oriVnevedla k žádnému signálu. Z toho lze usuzovat, že gen oriCnení přítomen v RRMax.

IIvbridizace odpovídající membrány se Southemovým přenosem se sondami pokrývajícími geny ori 322 a aad nevedla k žádnému signálu. Z toho lze usuzovat, že gen geny ori 322 a aad nejsou přítomny v RRMax.

Hybridizacc odpovídající membrány se Southemovým přenosem se sondou pokrývající gen nptH nevedla k žádnému signálu. Z toho lze usuzovat, že gen nptH také není přítomen v RRMax.

si) Příklad 6

Stabilita linie RRMax

Štěpení genomove DNA enzymem Bell a Southernův přenos se sondou cpdepsps byly prove55 děny stejně jak bylo popsáno v příkladu 2. Čtyři rostliny z generace 2 a 3 a pět rostlin z generace byly použity pro analýzu. Kromě toho byly užity tři netransgenní rostliny jako negativní kontrola. Analýzy primární transformace ukázaly jediný fragment velikosti 3.2 kb. Southemova analýza generací potomstva ukazovala také jediný fragment velikosti 3,2 kb. Pokud je vnesená DNA děděna z generace na generaci, pak lze očekávat e všech rostlinách stejný fragment velikosti

3.2 kb.

Štěpení genomove DNA enzymem HindllI a Southernův přenos s vnitřním fragmentem genu gav jako sondou byly provedeny stejně jak bylo popsáno v příkladu 2. Analýzy primární transformace ukázaly jediný fragment velikosti 2,0 kb. Southemova analýza generací potomstva ukazovala také jediný fragment velikosti 2,0 kb, což ukazuje na stabilní dědičnost tohoto znaku.

Příklad 7

5o PCR charakteristika RRMax

Genomová DNA z linie RRMax byla připravena postupem popsaným v příkladu 2. Přibližně 0.5 pg DNA bvlo užito jako tem plát v PCR reakcí s kombinací primerů, které měly sekvence uvedené v tabulce 6. Specifické kombinace primerů a velikost amplifikovaných fragmentů jsou uvedeny v tabulce 7. V závislosti na kombinaci páru primerů byla teplota pro nasednutí primeru (annealing) mezi 55 °C a 65 °C v každém zc 30 až 35 amplifikačních cyklů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY ll)

1. Rostlina cukrové řepy. včetně jejího potomstva, ex prim ujíeí enzymovou aktivitu 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfátsyntázy zAgrobdcteriwn sp. kmene CP4. která při amplifikaci v polymerázové řetězové reakci (PCR) s genornovou DNA jako templátem poskytne fragment DNA velikosti 739 bp, když se použije dvojice oligonukleotidových primerú charakterizovaných sekvence15 mi id. ě. 18 a id. c. 21.
2. Rostlina podle nároku 1. kde DNA charakterizovaná sekvencí id. č. 27 tvoří část genomu rostliny.

2o
3. Rostlina podle nároku 1, která při amplifikaci v PCR s genornovou DNA jako templátem poskytne fragment DNA velikosti 834 bp, když se použije dvojice oligonukleotidových primerú charakterizovaných sekvencemi id. č. 20 a id. ě, 24,
4. Rostlina podle nároku 1, která při amplifikaci v PCR s genornovou DNA jako templátem

25 poskytne fragment DNA velikosti 1057 bp, když se použije dvojice oligonukleotidových primerú charakterizovaných sekvencemi id. ě. 17a id. ě. 22.
5. Rostlina podle nároku 1. která při amplifikaci v PCR s genornovou DNA jako templátem poskytne fragment DNA velikosti 1224 bp. když sc použije dvojice oligonukleotidových primerú to charakterizovaných sekvencemi id. č. 19 a id. č. 25.

- 39CZ J0U2US B6
6. Rostlina podle nároku 1. kde DNA charakterizovaná sekvencí id. č. 1 tvoří část genomu rostliny.
7. Rostlina podle nároku 6. kde uvedená nukleotidová sekvence nahrazuje sekvence vysoce 5 repetitivní DNA.
8. Rostlina podle nároku 6, kde část genomu přímo spojené s uvedenou nukleotidovou sekvencí jsou charakterizovány sekvencemi id. č. 2 a id. č. 3.

to
9. Rostlina podle nároku 7, kde DNA charakterizovaná sekvencí id. č. 4 tvoří část genomu rostliny.
10. Semena rostliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.

15
11. Způsob přípravy transgenní rostliny cukrové řepy podle nároku 1, vyznačující se tím, že se

a) transformují děložní lístky in vilro pěstované cukrové řepy prostřednictvím Agrobacterium nesoucího vektor obsahující úsek DNA kódující $-enolpyruvál$ikimát-3-fosfátsyntázu

20 z Agrobacteriam sp. kmene CP4,

b) regenerují výhonky v přítomnosti glylosatu,

c) výhonky přenesou do půdy ve skleníku.

d) rostlinky ošetří glyfosatem.

25 e) vizuálně se hodnotí vitalita rostlin a chloróza listů pomocí stupnice 0 az 9.

f) selektují rostliny hodnocené z hlediska vitality a chlorózy listů stupněm 9, a

g) množí selektované rostliny obvyklými šlechtitelskými způsoby.
12. Způsob podle nároku 11, vy zn ac uj íc í se tím, že vektor kódující protein 5-cnol5o pyruválšikiniát 3 Toslálsyntázu z Agrohacferiími sp. kmene CP4 je vektor obsahující úsek DNA.

který' má nukleotidovou sekvenci id. č. 5.
13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím. že regenerované výhonky se analyzují pomocí PCR na přítomnost DNA kódující 5-enolpyruvátšikimál---3-fosfátsyntázu ?.Agr<>55 hacíeriwn sp. kmene CP4.
14. Rostlina cukrové řepy tolerantní ke glyfosatu, včetně jejího potomstva, podle nároku 1, která se získá transformací zprostředkovanou Agrohacterium genem umožňujícím expresi 5-enolpyruvátšikimát-3 fosťálsyntázové aktivity z Agrohacterium sp. kmene CP4 v rostlině, přičemž

40 uvedená rostlina postrádá jak pravou tak i levou hraniční sekvenci T-DNA.