SK88599A3

SK88599A3 - Glyphosate resistant transgenic plants

Info

Publication number: SK88599A3
Application number: SK885-99A
Authority: SK
Inventors: Marie Mannerloef; Paul P Tenning; Per Steen
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-29
Publication date: 2000-03-13
Also published as: HUP0001729A2; JP2001503280A; CZ300208B6; GB2337263A8; EP0950109A1; WO1999023232A1; CA2279258A1; UA85364C2; HUP0001729A3; CN1242803A; RU2224024C2; DE19881833B4; CZ235199A3; US6531649B1; TR199901515T1; SE9902189L; WO1999023232B1; PL197872B1; SE9902189D0; CN1148453C

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka transgénnych rastlín cukrovej repy, ktoré sú schopné tolerovať ošetrenie herbicídom, v ktorom je ako účinná látka glyfozát.

Doterajší stav techniky

Buriny v poli cukrovej repy predstavujú pre farmára hlavný problém. Kompetícia s plodinou vedie k zníženiu výnosu. V súčasnosti nie je žiadny herbicíd schopný účinne ničiť všetky buriny bez toho, aby pritom neškodil taktiež samotnej plodine, t. j. cukrovej repe (Miller a kol., J. Sugar Beets Res. 26: 3-4, 1989.). V praxi farmári používajú zmes herbicídov, ktorá ale taktiež obmedzuje rast plodiny. Medzitým však došlo k vzniku rezistencie k týmto herbicídom pri mnohých druhoch burín a ich počet stále rastie (Schweizer a kol., J. Sugar Beets Res. 28: 1-23, 1991) , čo problém ničenia burín v poli s cukrovou repou ďalej zhoršuje.

Roundup® je herbicíd so širokým rozsahom, výhodný z hľadiska ochrany prostredia, ktorý však inhibuje rast tak burín, ako aj plodiny. Z hľadiska predkladaného vynálezu 1 1 roztoku herbicídu Roundup® obsahuje 360 g účinnej zložky, t. j. glyfozátu (čo je triviálny názov pre N-fosfonometylglycin), ktorá je prijímaná listami. Doposiaľ sa nevyvinula žiadna burina rezistentná ku glyfozátu napriek jeho vyše 20 ročného používania (Holt a kol., Annu. Rev. Plánt Physiol. 1993), ale taktiež nebola zistená žiadna prirodzená tolerancia ku glyfozátu u cukrovej repy. Preemergentné použitie herbicídu Roundup® sa zdá byť na ničenie burín v poli cukrovej repy oveľa účinnejšie ako pri pestovaní repy často používaná kombinácia, obsahujúca phenmediphan, metamitron a ethofumesat (Madsen a kol., Weeds Res. 35: 105-111, 1995).

Glyfozát inhibuje biosyntézu aromatických aminokyselín tým, že sa ireverzibilné viaže na 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfátsyntázu (epsps) . V chloroplaste tento enzým katalyzuje reakciu, kedy sa z šikimát-3-fosfátu a fosfoenolpyruvátu tvorí enolpyruvátšikimát-3-fosfát. Približne asi týždeň po aplikácii herbicídu sa prejaví viditeľný účinok, čo znamená vädnutie, žltnutie a následne úplné zhnednutie, degradáciu rastlinného pletiva a rozpad koreňov.

Aby kultúrne rastliny získali toleranciu ku glyfozátu, výskum sa sústredil na prenesenie génu epsps, schopného zvýšiť toleranciu ku glyfozátu, do rastlín. Okrem rastlín taktiež baktérie a huby prirodzene exprimujú enzýmovú aktivitu epsps. Bolo zistené, že gén cp4/epsps z Agrobacterium sp. CP4 vytvára toleranciu ku glyfozátu (Barry a kol., Inhibitors of Amino Acid Biosynthesis: Strategies f or Imparting Glyphosate Tolerance to Crop Plants, in: Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, Singh a kol.(eds), Američan Society of Plánt Physiologists, pages 139-145, 1992). Vnesenie génu cp4/epsps do sóje a repky olejky viedlo k tolerancii na aplikáciu herbicídu na list v poľných podmienkach (Delannay a kol., Crop Sci. 35: 1461-1467, 1995; Padgette a kol., Crop Sci. 35: 1451-1461, 1995).

Glyfozátoxidáza-reduktáza (gox) izolovaná z Achromobacter sp. kmeň LBAA (Barry a kol., pozri vyššie) degraduje glyfozát na kyselinu aminometylfosfónovú, čo je zlúčenina, ktorá nie je toxická pre rastliny. Kombinácia génov cp4/epsps a glyfozátoxidázy (gox) sa úspešne použila na získanie transgénnej pšenice (Zhou a kol., Plánt Celí Rep. 15: 159-163, 1995) tolerantnej ku glyfozátu.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu sú teda transgénne rastliny cukrovej repy, ktoré sú tolerantné ku glyfozátu v dávke, ktorá je dostatočne vysoká, aby prejavila optimálnu herbicidnu účinnosť. Takéto rastliny môžu byť ďalej zlepšené spätným krížením s výberovými líniami, aby sa dosiahla optimalizácia agronomických vlastností ako je výnos, odolnosť k patogénom a pod. .

Cukrová repa môže byť transformovaná pomocou metódy transformácie sprostredkovanej Agrobacterium tumefaciens (Fry a kol., Third international congress of plánt mol. biol., Tuscon, Arizona, USA; D'Halluin a kol., Bio/Technology 10: 309-314, 1992; Konwar, J. Plánt Biochem & Biotech 3: 37-41, 1994). Transformácia sprostredkovaná Agrobacterium tumefaciens vedie často k tomu, že do rastlinného genómu je integrovaných niekoľko kópií T-DNA. Gén, ktorý má byť integrovaný, je výhodne vložený do T-DNA, takže je lokalizovaný v blízkosti pravej hranice T-DNA, ktorá je na rozdiel od ľavej hranice, takmer istotne vždy prenesená do rastliny.

Rastliny podľa predkladaného vynálezu tolerujú ošetrenie viac ako 3x6 litrami herbicídu Roundup® na hektár (asi 18 1/ha). Celková štandardná dávka, umožňujúca dobré výsledky v ničení burín, je 4 až 6 litrov na hektár, v závislosti od množstva burín. V týchto koncentráciách neprejavuje herbicíd žiadny vplyv na životaschopnosť rastlín a chlorózu listov. Tolerancia, ktorú vykazujú rastliny podľa predkladaného vynálezu, je udeľovaná transgénne exprimovanou enzýmovou aktivitou cp4/epsps. Výhodné uskutočnenie vynálezu bolo uložené v Národnej zbierke priemyselných a morských baktérii (National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1 RY, Scotland UK) 24. októbra 1997 ako položka č. NCIMB 40905.

Predkladaný vynález sa týka rastlín cukrovej repy, vrátane ich potomstva, ktoré exprimujú enzýmovú aktivitu cp4/epsps. Konkrétne sa predkladaný vynález týka rastlín cukrovej repy, vrátane ich potomstva, ktoré tolerujú ošetrenie 4 až 18 litrami herbicídu Roundup® na hektár.

Rastliny podlá predkladaného vynálezu možno získať rutinnou transformáciou sprostredkovanou Agrobacterium tumefaciens pomocou transformačného vektora, ktorý medzi pravou a lávou hraničnou sekvenciou T-DNA obsahuje úsek DNA, opísaný ako sekvencia SEQ ID NO: 5, kódujúci cp4/epsps.

Prekvapivo sa zistilo v rámci predkladaného vynálezu, že transformácia (RRMax) bez lavej a pravej T-DNA hraničnej .* sekvencie v transgénnom genóme vedúca k delécii značnej časti DNA transformačného vektoru, pričom však DNA kódujúca cp4/epsps zostáva, vedie k vynikajúcej tolerancii ku glyfozátu. Zvlášť úsek DNA, opísaný ako sekvencia SEQ ID NO: 1, bol nájdený integrovaný do vysoko repetitivneho úseku genómu, a súčasne nahradil časť DNA v tejto repetitívnej genómovej sekvencii.

Genómová DNA bezprostredne susediaca s časťou transgénnej sekvencie, ktorá je v použitom vektore spojená s pravou T-DNA hraničnou sekvenciou, má sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 2. Genómová sekvencia bezprostredne priľahlá na druhý koniec integrovanej transgénnej DNA má sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 3. Úplná DNA sekvencia nového usporiadania genómovej DNA je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 4.

Predkladaný vynález sa teda týka rastlín cukrovej repy, vrátane ich potomstva, v ktorých časť rastlinného genómu tvorí DNA charakterizovaná nukleotidovou sekvenciou SEQ ID NO: 1, pričom uvedená nukleotidová sekvencia výhodne nahradzuje vysoko , repetitívnu sekvenciu DNA vo vnútri rastlinného genómu.

Výhodná podľa predkladaného vynálezu je rastlina cukrovej repy, vrátane jej potomstva, v ktorej časti jej genómu priamo spojené s uvedenou nukleotidovou sekvenciou sú charakterizované ako sekvencia SEQ ID NO: 2a sekvencia SEQ ID NO: 3.

Ďalším výhodným riešením podľa predkladaného vynálezu je rastlina cukrovej repy, vrátane jej potomstva, kde DNA charakterizovaná nukleotidovou sekvenciou SEQ ID NO: 4 tvorí časť rastlinného genómu.

Tolerancia k herbicídu vnesená do transgénnych semien a rastlín, ktoré už boli uvedené, sa prenáša pri pohlavnom alebo vegetatívnom rozmnožovaní a možno ju teda rozširovať a udržovať v potomstve. Všeobecne povedané, udržovanie a rozmnožovanie využíva známe poľnohospodárske techniky ako je obrábanie pôdy, siatie alebo zber. Vzhľadom na to, že rastúca plodina je náchylná na poškodenie hmyzom alebo infekciami, podnikajú sa opatrenia na zabránenie chorobám a na ničenie škodlivého hmyzu a nematód, a ďalšie opatrenia na zlepšenie výnosov. K nim patria i mechanické opatrenia ako oranie pôdy alebo odstraňovanie infikovaných rastlín, a taktiež aplikácia agrochemikálií ako sú fungicídy, gametocídy, nematocídy, rastové regulátory, insekticídy a činidlá urýchľujúce dozrievanie.

Transgénne rastliny a semená tolerantné k herbicídu podľa predkladaného vynálezu sa môžu ďalej využiť v šľachtení rastlín s cieľom zlepšiť toleranciu na škodlivý hmyz, herbicídy alebo stres, zlepšenie nutričných hodnôt, zvýšenie výnosov alebo zlepšenie štruktúry, ktoré by viedli k zníženiu strát v dôsledku zničenia pri skladovaní a doprave. Jednotlivé kroky šľachtiteľského procesu sú charakterizované dobre definovanými ľudskými zásahmi ako je výber línií na kríženie, riadenie opelenia rodičovských línií alebo výber potomstva. V závislosti od požadovaných vlastností sa uskutočňujú rôzne šľachtiteľské opatrenia. Zodpovedajúce techniky sú v odbore dobre známe a neobmedzujú sa iba na hybridizáciu, inbreeding, spätné kríženie, viaclíniové kríženie, kríženie variet, medzidruhovú hybridizáciu, aneuploidné techniky a pod.. Takže transgénne semená a rastliny podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť na šľachtenie zlepšených línií rastlín, ktoré napr. zvyšujú účinnosť konvenčných metód ako je ošetrenie herbicídmi alebo pesticídmi, alebo sa vďaka svojím modifikovaným genetickým vlastnostiam obídu bez týchto metód. Alternatívne možno získať nové plodiny so zlepšenou toleranciou k stresu, ktoré vďaka ich optimalizovanej genetickej výbave poskytujú produkty v lepšej kvalite ako produkty rastlín, ktoré nie sú schopné tolerovať porovnateľné nepriaznivé vývojové podmienky.

V semenárstve sú kvalita klíčenia nevyhnutnými charakteristikami produktu, a uniformita osiva zatiaľ čo kvalita klíčenia a uniformita zberaných semien a predávaných farmármi nie sú tak dôležité. Pretože je ťažké udržovať plodinu v čistom stave bez prímesí semien inej plodiny alebo burín, kontrolovať choroby prenášané semenami, a produkovať osivo s dobrou kvalitou klíčenia, boli vyvinuté značne obsiahle a dobre definované techniky výroby osiva producentmi osiva, ktorí majú skúsenosti s pestovaním, udržovaním a predajom čistého osiva. Je bežnou praxou, že farmár kupuje certifikované osivo zodpovedajúce kvalitatívnym štandardom, namiesto aby používal osivo z vlastnej úrody. Materiál používaný ako osivo je zvyčajne ošetrený ochrannou vrstvou obsahujúcou herbicídy, insekticídy, fungicídy, baktericídy, nematocídy, moluskocídy alebo ich rôzne zmesi. Obvykle používané ochranné vrstvy obsahujú zlúčeniny ako kaptan, karboxín, tiram (TMTD®), metalaxyl (Apron®) a pirimifosmetyl (Actellic®). Ak je to potrebné, tvoria tieto zlúčeniny prostriedok spoločne s ďalšími pomocnými látkami, nosičmi, surfaktantami alebo adjuvans uľahčujúcimi aplikáciu, čo sa bežne používa v odbore prostriedkov na ochranu pred poškodením bakteriálnymi, hubovými alebo živočíšnymi škodcami. Ochranná vrstva sa môže aplikovať impregnáciou osiva tekutým prostriedkom alebo kombinovanou aplikáciou kvapalného a suchého prostriedku.

Taktiež iné spôsoby aplikácie možno použiť, napr. priame ošetrenie pukov alebo plodov.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka nových polnohospodárskych spôsobov, ktorých príklady sú uvedené v predchádzajúcom texte, a ktoré sú charakterizované použitím transgénnych rastlín, transgénneho rastlinného materiálu alebo transgénneho osiva podlá predkladaného vynálezu.

Predkladaný vynález sa taktiež týka transgénnych rastlinných buniek, pletív, orgánov, semien alebo častí rastlín získaných z transgénnych rastlín. Súčasťou vynálezu je i transgénne potomstvo rastlín vrátane transgénnych rastlinných buniek, pletív, orgánov, semien a rastlinných častí získaných z potomstva.

Vynález sa ďalej týka obchodného vrecka, ktoré obsahuje semená cukrovej repy schopné exprimovať cp4/epsps tolerantné k herbicídu Roundup®, spoločne s inštrukciami na použitie uvedenými na obale. Výhodným uskutočnením podlá predkladaného vynálezu je obchodné vrecko obsahujúce semená transgénnej rastliny, ktorá obsahuje úsek DNA stabilne integrovaný do svojho genómu, ktorý má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 1.

Použitý transformačný postup možno zhrnúť do nasledujúcich krokov:

a) transformácia klíčnych lístkov in vitro pestovanej cukrovej repy prostredníctvom Agrobacterium tumefaciens pomocou vektora obsahujúceho úsek DNA kódujúci cp4/epsps ako je opísaný v sekvencii SEQ ID NO: 5,

b) regenerácia výhonkov v prítomnosti glyfozátu,

c) prenos výhonkov do pôdy v skleníku,

d) ošetrenie rastliniek glyfozátom,

e) vizuálne hodnotenie životaschopnosti rastlín a chlorózy listov,

f) selekcia úplne normálnych rastlín, u ktorých ani životaschopnosť ani listy nie sú ovplyvnené ošetrením glyfozátom, a

g) množenie selektovaných rastlín pomocou obvyklých šľachtitelských techník.

Konkrétne výhonky sa regenerujú v prítomnosti 0,1 až 10 mM, výhodne 1 mM glyfozátu po 8 až 12 týždňoch selekcie. Každý transgénny výhonok sa ďalej namnoží do 10 kópii, ktoré možno prípadne analyzovať na prítomnosť transgénu cp4/epsps pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) predtým, ako sa prenesú do skleníka na zakorenenie. Svetelné podmienky v skleníku boli 16 hodín svetla a 8 hodín tmy s teplotou 22 ± 2 °C. V štádiu 3 až 4 listov boli rastlinky postriekané vodným roztokom herbicídu Roundup® v dávke 0,1 až 20 litrov na hektár, výhodne v dávke 1 liter na hektár. Dva týždne po aplikácii glyfozátu sa uskutočnilo individuálne pre každú rastlinu vizuálne hodnotenie vitality a chlorózy, založené na stupnici od 0 (odumretá rastlina) do 9 (úplne neovplyvnená rastlina). Hodnotenie 0 až 3 ukazuje nízku až strednú mieru tolerancie a hodnotenie 8 až 9 znamená dobrú úroveň tolerancie. Stupnica hodnotenia má tento konkrétny význam:

... neovplyvnená rastlina zhodná s neošetrenou kontrolou

... velmi malé nekrózy na špičkách listov, kedy menej ako 5 % listovej plochy je ovplyvnenej a žltne

... velmi malé nekrózy na špičkách listov, ktoré sa ale začínajú krútiť, pričom menej ako 5 % listovej plochy je ovplyvnenej a žltne

6, 5, 4 ... zväčšujúce sa nekrózy a žltnutie listov, listy sú menšie ako normálne

3, 2 ... buď žiadny alebo obmedzený rast listov, všetky listy sú skrútené a zasiahnuté nekrózou

... žiadny rast rastliny, najviac 5 % rastliny je ešte zelenej

... odumretá rastlina.

Na získanie údajov z poľných experimentov boli normálne rastliny s normálnou vitalitou a neovplyvnené glyfozátom (hodnotenie 9) rozmnožené alebo ďalej pestované obvyklými spôsobmi.

Transformácia sa výhodne uskutočňovala pomocou Ti vektora obsahujúceho úsek DNA so sekvenciou uvedenou ako sekvencia SEQ ID NO:

obsahujúcou gény cp4/epsps a gox, o ktorých je známe, že udeľujú toleranciu ku glyfozátu určitým rastlinným druhom, a reportérový gén uidA kódujúci enzým β-glukuronidázu. Zosilnený promótor 35S (Odeli a kol., Náture 313: 810-812, 1985) bol pripojený ku génu uidA, promótor vírusu mozaiky krtičnika (FMV) (Gouwda a kol., J. Celí. Biochem. Suppl.

13D: 301, 1989) bol pripojený ku génom cp4/epsps a gox. Pred génmi cp4/epsps a gox (upstream) bol vložený tranzitný peptid (Gasser a kol., J. Biol. Chem. 263: 4280-4289, 1988), aby sa zaistilo zacielenie obidvoch proteinov do chloroplastu.

Jedna transformačná udalosť podľa predkladaného vynálezu viedla k prekvapivému zisteniu, že na rastliny nepôsobil Roundup® v dávkach až do 3 x 6 litrov na hektár (18 1/ha) . Molekulárna analýza ukázala, že

-je jedna kópia transgénu integrovaná do jediného lokusu

- integrovaná DNA kóduje cp4/epsps a zodpovedá skrátenej vektorovej DNA

- integrovaná DNA nahradila časť genómovej DNA a má sekvenciu uvedenú ako sekvenciu SEQ ID NO: 1

- genómová DNA priamo susediaca s integrovanou DNA je charakterizovaná sekvenciou SEQ ID NO: 2 a sekvenciou SEQ ID NO: 3, a má nové usporiadanie genómových sekvencií uvedených ako sekvencia SEQ ID NO: 4

- gény cp4/epsps a uidA sú intaktné zatiaľ čo gén gox je skrátený iné vektorové sekvencie nie sú v transgénnej rastline prítomné.

Teraz, keď sú tieto informácie dostupné, možno rastliny z jednej špecifickej transformačnej udalosti podlá predkladaného vynálezu odlíšiť od iných rastlín cukrovej repy pomocou PCR. Vhodné kombinácie párov oligonukleotidových primérov dovoľujú špecificky identifikovať sekvencie genómovej DNA, ktoré sú prítomné v rastlinách iba ako priamy či nepriamy dôsledok zhodných transformačných udalostí. Takéto transformačné udalosti nie sú obmedzené na transformácie uskutočnené pomocou Agrobacterium tumefaciens, ale môžu to byť i transformácie biolistické (ostreľovaním mikročasticami).

Predkladaný vynález sa ďalej týka rastlín cukrovej repy, vrátane potomstva, u ktorých amplifikácia PCR na ich genómovej DNA ako templátu vedie k amplifikácii

- DNA fragmentu	veľkosti	739	bp,	ak	sa použije	pár	oligo-
nukleotidových	primérov	so sekvenciami	SEQ ID NO:	B a	SEQ ID
NO: a, alebo
- DNA fragmentu	veľkosti	834	bp,	ak	sa použije	pár	oligo-
nukleotidových	primérov	so sekvenciami	SEQ ID NO:	D a	SEQ ID
NO: e, alebo
- DNA fragmentu	veľkosti	1057	bp,	ak	sa použije	pár	oligo-
nukleotidových	primérov	so sekvenciami	SEQ ID NO:	A a	SEQ ID
NO: b, alebo
- DNA fragmentu	veľkosti	1224	bp,	ak	sa použije	pár	oligo-
nukleotidových	primérov	so sekvenciami	SEQ ID NO:	C a	SEQ ID
NO: f.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady opisujú materiály a metódy použité pri uskutočňovaní vynálezu a dosiahnuté výsledky slúžia na ilustráciu vynálezu a v žiadnom prípade ho nijako neobmedzujú.

Príklad 1

Transformácia cukrovej repy

Cukrová repa genotypu A1012 bola transformovaná vektorom obsahujúcim gény cp4/epsps a gox schopnými udeliť toleranciu ku glyfozátu, gén nptll, ktorý udeluje rezistenciu k antibiotiku kanamycínu a reportérový gén uidA kódujúci β-glukuronidázu (GUS). Gény nptll a uidA sú funkčne spojené so zosilneným promótorom 35S (Odeli a kol., Náture 313: 810-812, 1985) zatiaľ čo gény cp4/epsps a gox sú riadené promótorom vírusu mozaiky krtičníka (FMV) (Gouwda a kol., J. Celí. Biochem. Suppl. 13D: 301, 1989) Okrem toho sú gény cp4/epsps a gox spojené s tranzitívnym peptidom (Gasser a kol., J. Biol. Chem. 263: 4280-4289, 1988) umiestneným na 5'-konci, aby boli obidva proteíny nasmerované do chloroplastu. cp4/epsps a uidA používajú terminátorovú

3'-sekvenciu E9, zatiaľ čo gox a nptll používajú zodpovedajúcu 3'-sekvenciu NOS.

Rastliny cukrovej repy (Beta vulgaris. L) pestované in vitro boli transformované prostredníctvom Agrobacterium tumefaciens. Rastliny boli regenerované spôsobom, ktorý opísali Fry a kol., (Genotype-independent transformation of sugarbeet using Agrobacterium tumefaciens , Third international congress of plánt mol. biol., Tuscon, Arizona, USA, 1991) a Konwar (J. Plánt Biochem & Biotech 3: 37-41, 1994) s použitím glyfozátu v koncentrácii 1 mM ako selekčného činidla. Aby sa odstránil Agrobacterium tumefaciens, boli klíčne lístky trikrát za sebou inkubované v MS médiu obsahujúcom 500 mg/1 cefotaxímu (60 minút pri 45 až 50 ot./min.). Regenerované výhonky boli analyzované po 8 až 12 týždňoch selekcie na 1 mM glyfozáte a 500 mg/1 cefotaxímu vrátane pasážovania do čerstvého média každý tretí týždeň. Každý transgénny výhonok bol rozdelený a ďalej pestovaný (mikropropagácia) do 10 kópií a analyzovaný na prítomnosť transgénu a potom prenesený do skleníka na zakorenenie.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) sa použila na overenie prítomnosti génu cp4/epsps. Dvadsať mg rastlinného materiálu bolo odobratého z výhonkov regenerovaných in vitro do mikroskúmavky eppendorf. Celková DNA bola izolovaná v podstate postupom, ktorý opísali Tai a kol., Plánt. Mol. Biol. Rep 8: 297303, 1990. Menšou modifikáciou bolo pridanie 500 μΐ 100 mM Tris-HCl s pH 8,0 obsahujúceho 50 mM Na-EDTA, 1,25% (hmotn./objem) SDS, 0,38% (hmotn./objem) siričitanu sodného a 200 mg/ml proteinázy K, a potom inkubácia v 65°C počas 2 hodín. Nerozpustený materiál z listov bol odstránený a celková DNA bola precipitovaná zmrazením v -20°C. PCR sa uskutočnila podľa návodu k súprave Gene-Amp PCR kit (Perkin-Elmer Corp.) s tým, že sa použil modifikovaný reakčný pufor (lOx) obsahujúci 100 mM Tris-HCl s pH 8,3, 500 mM KC1, 30 mM MgCl₂, 1,0% Nonidet P-40 (hmotn./objem), 0,4 μΜ krezolovú červeň v 24% (hmotn./objem) sacharóze a protilátku Taq Štart (Taq Štart Antibody, Clontech).

Na amplifikáciu sekvencií cp4/epsps sa použili nasledujúce priméry (Shah a kol., Science 233: 478-481, 1986):

5' -CAC CGG TCT TTT GGA AGG TGA AG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 6) a

5¹-AAC GAG ACC CAT AAC GAG GAA GC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 7).

Na amplifikáciu sekvencií genómovej vnútornej (surA, surB sa použili nasledujúce priméry:

5'-AAA CAG TCC CGT GCA TCC CCA AC-3’ (sekvencia SEQ ID NO: 8) a

5'-GAC GCT CTC CTT GAT TCT GTC CC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 9).

Nebola zrejmá žiadna variabilita v transformačnej účinnosti použitím rôznych binárnych plazmidov.

Výhonky získané mikropropagáciou boli prenesené do pôdy v skleníku. Svetelné podmienky v skleníku boli 200 pmol m^-2 s^-1(Osram Power Star HQI-Z, 400W), 16 hodín svetla a 8 hodín tmy s teplotou 22 ± 2°C. V štádiu 3 až 4 listov boli rastlinky pochádzajúce z pôvodných 260 transformovaných rastlín (transformantov) ošetrené herbicídom Roundup®. Bol použitý kalibrovaný postrekovač na aplikáciu vodného roztoku herbicídu v dávke 1 liter na hektár (1 1/ha pri 360 g/1 účinnej látky) . Dva týždne po aplikácii glyfozátu sa uskutočnilo hodnotenie fytotoxického účinku individuálne pre každú rastlinu vizuálne na základe stupnice od 0 (odumretá rastlina) do 9 (úplne neovplyvnená rastlina). Fytotoxický účinok pri 75 rôznych transformantoch bol hodnotený výsledkom 0 až 6. Ďalších 185 transformantov bolo hodnotených výsledkom 7 a vyšším, čo znamenalo, že tieto transformanty prejavovali malé alebo žiadne známky účinku ošetrenia herbicídom. Tieto rastliny boli ďalej krížené s normálnymi, t.j. netransgénnymi rastlinami cukrovej repy na získanie F1 potomstva na ďalšie vyhodnocovanie polných pokusov.

Polné pokusy sa uskutočňovali na vyhodnotenie rôznych transformačných udalostí v polných podmienkach. Každá parcelka mala tri rady, každý s dĺžkou 9 m, so vzdialenosťou medzi radmi 0,5 m. Na každej parcelke bol vysadený jeden transformant. Po počiatočnej aplikácii prostriedku Roundup® v dávke 1 1/ha (360 g/1 účinnej látky), v štádiu kličnych listkov, boli rastliny ručne pretrhávané, aby sa eliminovali segregujúce netransgénne rastliny, a to tak, aby zostala jedna rastlina na 20 cm. Každá parcelka bola rozdelená na 3 časti, ktoré boli ošetrované nezávisle. Jedna parcelka bola ošetrená konvenčnými herbicídmi metamitron v dávke 0,1 kg účinnej látky/ha, phenmediphan 0,2 kg účinnej látky/ha a ethofumesate 0,1 kg účinnej látky/ha. Ďalšia parcelka sa ošetrila prostriedkom Roundup® 2x2 1/ha (1440 g/1 účinnej látky) a tretia parcelka bola ošetrená prostriedkom Roundup® 2x4 1/ha (2880 g/1 účinnej látky). Rastliny boli ošetrované v štádiu 4 listov. Dva týždne po aplikácii herbicídu boli rastliny hodnotené z hľadiska fytotoxického účinku herbicídu. Zistili sa symptómy v rozsahu od úplnej citlivosti až po úplnú toleranciu. Zistili sa rozdiely medzi hodnotením v skleníku a na poli. To bolo zrejme spôsobené rozdielom vo vonkajších podmienkach, okrem iného aj tým, že v skleníku nebol použitý filter pre UVB žiarenie. Nezistili sa žiadne morfologické alebo fyziologické rozdiely medzi rastlinami z parceliek ošetrených rôznymi dávkami prostriedku Roundup® v porovnaní s ošetrením zmesou konvenčných herbicídov. Dva transformanty prejavovali vysokú toleranciu k prostriedku Roundup® po ošetrení 2x2 1/ha a 2 x 4 1/ha.

Po postreku herbicídom Roundup® bola tolerancia vyhodnotená posudzovaním vitality rastlín (Tr. vig) a chlorózy listov (Tr. chl) . Jednotlivé stupne v škále hodnotenia mali nasledujúci význam:

... neovplyvnená rastlina zhodná s neošetrenou kontrolou

... veľmi malé nekrózy na špičkách listov, kedy menej ako 5 % listovej plochy je ovplyvnenej a žltne

... veľmi malé nekrózy na špičkách listov, ktoré sa ale začínajú krútiť, pričom menej ako 5 % listovej plochy je ovplyvnenej a žltne

... žiadny rast rastliny, najviac 5 % rastliny je ešte zelenej

... odumretá rastlina.

Hodnotilo sa 22 rôznych transformačných udalostí (č. 1 až 22) a 1 netransgénna kontrola (č. 23) po postreku 1+4+4 1/ha Roundup® (spolu 9 1/ha) . Výsledky vizuálneho hodnotenia poškodenia sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

Tabuľka

transform.	hodnotenie	hodnotenie
udalosť č.	vitality	chlorózy
1	9	9
2	6	7
3	2	3
4	5	7
5	9	8
6	3	3
7	7	7
8	7	8
9	4	6
10	5	6
11	5	5
12	4	5
13	9	9
14	3	5
15	4	4

(RRMax)

Tabuľka - pokračovanie

transform.	hodnotenie	hodnotenie
udalosť č.	vitality	chlorózy
16	2	3
17	1	1
18	2	2
19	6	8
20	7	5
21	4	5
22	5	7
23	0	0

(netransgén.

kontrola)

Príklad 2

Počet kópii integrovanej DNA

Počet kópii transgénnej DNA integrovanej v genóme transformovanej rastliny (transformanty) s najvyššou toleranciou ku glyfozátu (RRMax) bol stanovený metódou Southernovho prenosu na reštrikčných fragmentoch zasahujúcich za ľavú a pravú hraničnú sekvenciu použitého transformačného vektora.

Genómová DNA z RRMax a netransgénne kontrolné rastliny boli izolované z 250 mg zamrazeného pletiva listu cukrovej repy postupom, ktorý publikovali Saghai-Maroof a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 8014-8018, 1984. DNA transformačného vektora slúžila ako pozitívna kontrola. 15 μΐ DNA bolo naštiepených pomocou 120 jednotiek reštrikčného enzýmu 4 hodiny pri 37°C v celkovom reakčnom objeme 400 μΐ. Naštiepená DNA bola precipitovaná a znova rozpustená v 50 μΐ. Naštiepená DNA, pozitívna plazmidová kontrola a štandard velkosti (lambda DNA naštiepená EcoRI a HindlII} boli separované elektroforézou na 0,8% agarózovom géli. DNA sa vizualizovala pomocou etidiumbromidu a vyfotografovala sa spoločne s meradlom. Potom sa DNA preniesla na membránu Hybond N+ a hybridizovala sa so sondou postupom, ktorý opísali Ausubel a kol·., (eds.) v: Current protocols in molecular biology, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, 1987.

Pripravili sa sondy zahŕňajúce páry báz 975 až 1766 zo sekvencie génu cp4/epsps (sekvencia SEQ ID NO: 5) a páry báz 7108 až 7535 sekvencie génu gox (sekvencia SEQ ID NO: 5) pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), keď ako templátová DNA sa použil transformačný vektor. Sonda génu cp4/epsps sa použila na stanovenie počtu inzertov susediacich s pravou hraničnou sekvenciou. Sonda génu gox sa použila na stanovenie počtu inzertov susediacich s lávou hraničnou sekvenciou. Produkty PCR sa purifikovali pomocou súpravy Geneclean II® Kit firmy BIO 101 (La Jolla, CA). Označenie sondy ³²P sa uskutočnilo pomocou súpravy Megaprime™ DNA labelling systém firmy Amersham International (Little Chalfont, UK).

Stanovenie počtu kópií sa uskutočňovalo analýzou genómovej DNA obklopujúcej pravú hraničnú oblasť. Genómová DNA bola naštiepená reštrikčným enzýmom Ncol, ktorý Štiepi sekvencie odvodené z plazmidov medzi promótorom 35S a génom uidA a vo vnútri genómu cukrovej repy. Membrána potom bola testovaná so sondou, ktorou bol vnútorný PCR fragment génu cp4/epsps.

Stanovenie počtu kópií možno taktiež uskutočniť analýzou genómovej DNA susediacej s lávou hraničnou sekvenciou. Genómová DNA sa naštiepi reštrikčným enzýmom HindlII, ktorý štiepi sekvencie odvodené z plazmidu medzi 3¹-terminátorom E9 génu uidA a promótorom FMV génu gox a vo vnútri genómu cukrovej repy. Po naštiepení HindlII a hybridizácii so sondou gox bol detegovaný jediný pás s velkosťou asi 2,0 kb pri transformante RRMax. Vzhľadom na to, že veľkosť najmenšieho očakávaného fragmentu bola >4 kb, tento výsledok ukazuje na skrátenie plazmidovej DNA počas prenosu do genómovej DNA rastliny. Výsledok potvrdil, že iba jediná kópia prenesenej DNA sa integrovala do jediného lokusu.

Príklad 3

Analýza sekvencie integračného miesta RRMax

Genómová DNA z RRMax a netransgénne kontrolné rastliny boli izolované z 250 mg zamrazeného pletiva listu cukrovej repy postupom, ktorý publikovali Saghai-Maroof (pozri vyššie). Bola pripravená knižnica fágu λΠΧΙΙ (objednané u firmy Stratagene) s inzertami veľkosti 9 až 23 kb v klonovanom mieste Xhol a táto knižnica bola podrobená screeningu so sondami cp4/epsps a gox na vyhľadanie predpokladaných klonov obsahujúcich integračné miesto. Detegovalo spolu 25 fágov, ktoré hybridizovali s génmi cp4/epsps a gox. Jeden z nich bol purifikovaný (podľa Fritsch a kol., 1987) a ďalej testovaný Southernovým prenosom a PCR. Ukázalo sa, že obsahuje inzert genómovej DNA veľkosti 15 až 16 kb vrátane transgénnej DNA a priľahlých sekvencií z genómu cukrovej repy. Uvedené priľahlé sekvencie boli amplifikované pomocou PCR s primérami komplementárnymi k promótoru FMV alebo sekvencií genómu gox v kombinácii s primérami komplementárnymi k sekvencii klonovacej kazety λΠΧΙΙ (sekvencie sú podrobne uvedené v nasledujúcej tabuľke 1) . Úsek spojenia integrovanej DNA a genómovej DNA cukrovej repy bol sekvenovaný Sangerovou dideoxy-terminačnou metódou na prístroji Applied Biosystems, Model 373A, verzia 2.1.1. Priméry použité na sekvenovanie sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 2.

Tabuľka 1

Priméry použité na amplifikáciu hraničných úsekov

Primér	Sekvencia
č.
3	5'-CAAGAAGGTTGGTATCGCTG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 10)
7	5’-TCTTTTGTGGTCGTCACTGCGTT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 11)
8	5' -GCGAGCTCTAATACGACTCACTAT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 12)
9	5'-CGCGAGCTCAATTAACCCTCACT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 13)

Tabuľka 2

Priméry na sekvenovanie

Primér	Sekvencia	Opis
SI	5'-TCTGTACCCTGACCTTGTTG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 14)	na sekvenovanie úseku susediaceho s pravou hranicou
S3	5'-CGTGGATACCACATCGTGAT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 15)	na sekvenovanie úseku susediaceho s ľavou hranicou
S4	5'-ACCTTGGCTTGAAGTACTC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 16)	na sekvenovanie úseku susediaceho s ľavou hranicou

Sekvenčná analýza ukázala, že transgénna DNA integrovaná v genóme RRMax má sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 1. Počiatočné miesto integrácie leží medzi sekvenciou pravej hranice a promótorom FMV a končí 897 bp downstream (v smere transkripcie) od štart kodónu génu gox. Translačné stop kodóny pre skrátený gén gox možno nájsť 130 až 235 bp downstream od miesta spojenia. Miesto HindlII bolo identifikované 210 bp downstream a transkripčný terminačný signál (AATAAA) 650 bp downstream od štart kodónu génu gox. Sekvencia SEQ ID NO: 2 opisuje sekvenciu genómovej DNA bezprostredne spojenej s pravým hraničným úsekom transgénnej DNA a sekvencia SEQ ID NO: 3 opisuje DNA sekvenciu genómovej DNA bezprostredne spojenej s ľavým hraničným úsekom transgénnej DNA.

Príklad 4

Charakterizácia transgénnej DNA integrovanej v RRMax

Na ďalšiu charakterizáciu pravej hraničnej oblasti bola genómová DNA z RRMax a DNA transformačného vektora naštiepená niektorým z reštrikčných enzýmov BamHI, HindlII, Beli alebo EcoRI. Naštiepená DNA potom bola Southernovým prenosom testovaná pomocou sondy, ktorou bol PCR fragment génu cp4/epsps opísaný v príklade 2. Nezávisle od použitého reštrikčného enzýmu, štiepenie vždy viedlo k vzniku jediného fragmentu, ako ukázala Southernova analýza. Veľkosť detegovaných fragmentov je uvedená v tabuľke 3. Údaje ukazujú, že jediná kópia DNA bola prenesená do rastliny a že prenos DNA do rastliny cukrovej repy viedol k prenosu úplného génu cp4/epsps. Tieto výsledky sú v súlade s analýzou nukleotidovej sekvencie v príklade 3.

Tabuľka 3

Veľkosť fragmentov detegovaných Southernovým prenosom

Enzým	RRMax	Transformačný vektor
BamHI	>10 kb	9,7 kb
HindlII	2,4 kb	2,4 kb
Beli	3,2 kb	2,9 kb
EcoRI	1,8 kb	1,8 kb

Na ďalšiu charakterizáciu úseku integrovanej transgénnej DNA bola genómová DNA z RRMax naštiepená reštrikčnými enzýmami Ncol, BamHI a HindlII. Ako kontrola bol rovnakými enzýmami naštiepený transformačný vektor. Southernov prenos sa testoval sondou, ktorou bol PCR amplifikovaný fragment DNA zahŕňajúci páry báz 3796 až 4837 génu uidÄ sekvencie SEQ ID NO: 5. Veľkosť detegovaných fragmentov je uvedená v tabuľke 4. Nezávisle od použitého reštrikčného enzýmu, štiepenie vždy viedlo k vzniku jediného signálu na autorádiografickom filme, čo ukazuje, že inzert DNA má rovnaké vlastnosti ako vnútorná DNA použitého transformačného vektora.

Tabuľka 4

Veľkosť fragmentov detegovaných Southernovým prenosom

Enzým	Transformačný vektor	RRMax
Ncol	3,4 kb	3,4 kb
BamHI	3,2 kb	3,2 kb
HindlII	3,2 kb	3,2 kb

Na ďalšiu charakterizáciu lavého hraničného úseku sa genómová DNA z RRMax a DNA transformačného vektora naštiepili niektorým z reštrikčných enzýmov Ncol, BamHI, HindlII alebo EcoRI. Naštiepená DNA sa potom Southernovým prenosom testovala pomocou sondy, ktorou bol PCR fragment génu gox opísaný v príklade 2. Veľkosť detegovaných fragmentov je uvedená v tabuľke 5. Nezávisle od použitého reštrikčného enzýmu, štiepenie vždy viedlo k vzniku jediného fragmentu na autorádiografickom filme. Podľa očakávania štiepenie enzýmami Ncol, BamHI alebo EcoRI malo viesť k vzniku vnútorných fragmentov známej veľkosti. Avšak žiadne štiepenie jedným z týchto enzýmov neviedlo k vzniku očakávaného fragmentu známej veľkosti. To ukazuje, že reštrikčné miesta pre Ncol, BamHI, HindlII a EcoRI v transgénnej rastline chýbajú. Výsledky sú v súlade so sekvenovaním, keď sa ukázalo, že iba časť génu gox sa integrovala do rastliny. Štiepenie enzýmom HindlII viedlo k vzniku fragmentu veľkosti asi 2 kb, čo dodatočne potvrdilo údaje zo sekvenčnej analýzy, že miesto HindlII je lokalizované downstream od génu gox vo vnútri genómu. Výsledky taktiež ukazujú, že do rastliny bola prenesená jediná kópia DNA. To koreluje veľmi dobre s primárnymi výsledkami stanovenia počtu kópií v príklade 2 a so sekvenovaním nukleotidovej sekvencie v príklade 3. V rastlinnom genóme je integrovaná jediná kópia, pričom časť génu gox je deletovaná.

Tabulka 5

Veľkosť fragmentov detegovaných Southernovým prenosom

Enzým	Transformačný vektor	T9100152
Ncol	2,5 kb	3,0 kb
BamHI	2,9 kb	>10 kb
HindlII	9,5 kb	2,0 kb
EcoRI	1,6 kb	3,6 kb

Príklad 5

Neprítomnosť ďalších vektorových sekvencií

Po overení absencie sekvencií oriV, ori-322, aad a nptll po transformačnej udalosti bola RRMax analyzovaná pomocou reštrikčných enzýmov a sond, pokrývajúcich gény oriV, ori-322, aad a nptll.

DNA transformačného vektora bola naštiepená enzýmom NspI, ktorý štiepi plazmid na 17 miestach. Na účely analýzy sa purifikovali fragmenty zahŕňajúce úseky génov sekvencií oriV, ori-322, aad a použité na Southernovu analýzu. Fragment amplifikovaný PCR so sekvenciu uvedenou ako sekvencia SEQ ID NO: 26 bol použitý ako sonda pre sekvenciu nptll. Všetky fragmenty boli purifikované pomocou súpravy Geneclean II® Kit firmy BIO 101 (La Jolla, CA) . Označenie sondy ³²p sa uskutočnilo pomocou súpravy Megaprime™ DNA labelling systém firmy Amersham International (Little Chalfont, UK).

Genómová DNA RRMax sa naštiepila reštrikčným enzýmom BamHI, ktorý štiepi DNA transformačného vektora na 3 miestach, a síce v polohách 2321, 5544 a 8413 podľa sekvencie SEQ ID NO: 5. Hybridizácia zodpovedajúcej membrány so Southernovým prenosom so sondou pokrývajúcou gén oriV neviedla k žiadnemu signálu. Z toho možno usudzovať, že gén oriV nie je prítomný v RRMax.

Hybridizácia zodpovedajúcej membrány so Southernovým prenosom so sondami pokrývajúcimi gény ori-322 a aad neviedla k žiadnemu signálu. Z toho možno usudzovať, že gény ori-322 a aad nie sú prítomné v RRMax.

Hybridizácia zodpovedajúcej membrány so Southernovým prenosom so sondou pokrývajúcou gén nptll neviedla k žiadnemu signálu. Z toho možno usudzovať, že gén nptll taktiež nie je prítomný v RRMax.

Príklad 6

Stabilita línie RRMax

Štiepenie genómovej DNA enzýmom Beli a Southernov prenos so sondou cp4/epsps sa uskutočnili rovnako ako je opísané v príklade 2. Štyri rastliny z generácie 2 a 3 a päť rastlín z generácie 4 sa použili na analýzu. Okrem toho sa použili netransgénne rastliny ako negatívna kontrola. Analýzy primárnej transformácie ukázali jediný fragment veľkosti 3,2 kb. Southernova analýza generácií potomstva ukazovala taktiež jediný fragment veľkosti 3,2 kb. Ak je vnesená DNA dedená z generácie na generáciu, potom možno očakávať vo všetkých rastlinách rovnaký fragment veľkosti 3,2 kb.

Štiepenie genómovej DNA enzýmom HindlII a Southernov prenos s vnútorným fragmentom génu gox ako sondou sa uskutočnili rovnako ako je opísané v príklade 2. Analýzy primárnej transformácie ukázali jediný fragment veľkosti 2,0 kb. Southernova analýza generácií potomstva ukazovala taktiež jediný fragment veľkosti 2,0 kb, čo ukazuje na stabilnú dedičnosť tohto znaku.

Príklad 7

PCR charakteristika RRMax

Genómová DNA z línie RRMax sa pripravila postupom opísaným v príklade 2. Približne 0,5 pg DNA sa použilo ako templát v PCR reakcii s kombináciou primérov, ktoré mali sekvencie uvedené v tabulke 6. Špecifická kombinácia primérov a veľkosť amplifikovaných fragmentov sú uvedené v tabulke 7. V závislosti od kombinácií párov primérov bola teplota pre nasadnutie primérov (annealing) medzi 55°C a 65°C v každom z 30 až 35 amplifikačných cyklov.

Tabuľka 6

Sekvencia primárov

Primér	Sekvencia	Opis
A	5'-TCAACCTACAGCTGATTTGGACC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 17)	blízko spojenia pravej hranice
B	5' -GACCGGAACGACAATCTGATC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 18)	blízko spojenia pravej hranice
C	5'-CTAGGGAAGTCCAAATCAGCCG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 19)	blízko spojenia ľavej hranice
D	5'-TTTGGACCGGAACTTTCCAGAAG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 20)	blízko spojenia ľavej hranice
a	5'-CTAACTTGCGCCATCGGAGAAAC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 21)	vo vnútri génu cp4/epsps
b	5'-GACTTGTCACCTGGAATACGGAC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 22)	vo vnútri génu cp4/epsps
c	5'-ATTCTTGAGCTCATCAAGCAGCC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 23)	vo vnútri génu cp4/epsps
e	5'-AAGGTTGGTATCGCTGGAGCTG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 24)	vo vnútri sekvencie gox
f	5'-TCTCCACAATGGCTTCCTCTATG-3' (sekvencia SEQ ID NO: 25	vo vnútri sekvencie gox

Tabuľka Ί

Špecifické kombinácie primérov

Kombinácia	Veľkosť amplifikovaného fragmentu
A + a	757 bp
A + b	1057 bp
A + c	2352 bp
B + a	739 bp (sekvencia SEQ ID NO: 27)
B + b	1039 bp
B + c	2334 bp
C + e	888 bp
C + f	1224 bp
D + e	834 bp
D + f	1178 bp

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rastlina cukrovej repy, vrátane jej potomstva, ktorá exprimuje enzýmovú aktivitu cp4/epsps, a ktorá pri amplifikácii v PCR s genómovou DNA ako templátom poskytne fragment DNA velkosti 739 bp, keď sa použije dvojica oligonukleotidových primárov charakterizovaných sekvenciami SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 21.
2. Rastlina podlá nároku 1, kde DNA charakterizovaná sekvenciou

SEQ ID NO: 27 tvorí časť genómu rastliny.

Rastlina podľa genómovou DNA ako 834 bp, charakterizovaných sekvenciami
3.

nároku 1, ktorá pri amplifikácii templátom poskytne fragment DNA keď sa použije dvojica oligonukleotidových

SEQ ID NO: 20 a SEQ ID NO:

v PCR s velkosti primárov

24.
4. Rastlina podľa nároku 1, ktorá pri amplifikácii v PCR s genómovou DNA ako templátom poskytne fragment DNA veľkosti 1057 bp, keď sa použije dvojica oligonukleotidových primárov charakterizovaných sekvenciami SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 22.
5. Rastlina podľa nároku 1, ktorá pri amplifikácii v PCR s genómovou DNA ako templátom poskytne fragment DNA veľkosti 1224 bp, keď sa použije dvojica oligonukleotidových primárov charakterizovaných sekvenciami SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 25.
6. Rastlina podľa nároku 1, kde DNA charakterizovaná sekvenciou SEQ ID NO: 1 tvorí časť genómu rastliny.
7. Rastlina podľa nároku 6, kde uvedená nukleotidová sekvencia nahradzuje sekvencie vysoko repetitivnej DNA.
8. Rastlina podľa nároku 6, kde časti genómu priamo spojené s uvedenou nukleotidovou sekvenciou sú charakterizované sekvenciami SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 3.
9. Rastlina podľa nároku 7, kde DNA charakterizovaná sekvenciou SEQ ID NO: 4 tvorí časť genómu rastliny.
10. Semená rastliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
11. Semená rastliny podľa nároku 6 uložené pod číslom NCIMB 40905.
12. Spôsob prípravy transgénnej rastliny cukrovej repy podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa

a) transformujú klíčne lístky in vitro pestovanej cukrovej repy prostredníctvom Agrobacterium nesúceho vektor obsahujúci úsek DNA kódujúci cp4/epsps,

b) regenerujú výhonky v prítomnosti glyfozátu,

c) výhonky prenesú do pôdy v skleníku,

d) rastliny ošetria glyfozátom,

e) vizuálne hodnotí vitalita rastlín a chloróza listov pomocou stupnice 0 až 9,

f) selektujú rastliny hodnotené z hľadiska vitality a chlorózy listov stupňom 9, a

g) množia selektované rastliny obvyklými šľachtiteľskými spôsobmi.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že vektor kódujúci protein cp4/epsps je vektor obsahujúci úsek DNA, ktorý má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 5.
14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že regenerované výhonky sa analyzujú pomocou PCR na prítomnosť DNA kódujúcej cp4/epsps.
15. Rastlina cukrovej repy tolerantná ku glyfozátu, vrátane jej potomstva, ktorá sa získa transformáciou sprostredkovanou Agrobacterium s génom umožňujúcim expresiu cp4/epsps v rastline, pričom uvedená rastlina nemá tak pravú ako aj ľavú hraničnú sekvenciu T-DNA.