JP2001503280A

JP2001503280A - グリフォセート耐性トランスジェニック植物

Info

Publication number: JP2001503280A
Application number: JP52534299A
Authority: JP
Inventors: マナーロエフ，マリー; テニング，パウル・ペーター; スティーン，ペア
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-29
Publication date: 2001-03-13
Also published as: SE9902189D0; HUP0001729A2; CA2279258A1; WO1999023232B1; CZ300208B6; TR199901515T1; US6531649B1; GB2337263A; DE19881833B4; SE520353C2; HK1025360A1; AU1558099A; HUP0001729A3; FI991221A; CN1242803A; CN1148453C; FI991221A0; GB9915068D0; US6204436B1; EP0950109A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、cp4/epsps酵素活性の発現のために、約４から約１８リットル

Description

【発明の詳細な説明】グリフォセート耐性トランスジェニック植物本発明は、活性成分としてのグリフォセートによる除草処理に耐性なトランスジェニックサトウダイコン植物(sugar beet plants)に関する。サトウダイコン畑の雑草は農家にとって大きな問題である。それらは作物と競合し、従って収率を減少させる。今日、サトウダイコン作物自体を傷つけることなく、全ての雑草を有効に制御できる単一除草剤はない(Miller et al.，J.Su gar Beet Res．26:3-4，1989)。実際、農家は除草剤の混合物を使用し、これはまた作物の生育を減少させる。同時に、該除草剤に対する獲得耐性を有する雑草種の数が増加しつづけ(Schweizer et al.，J．of Sugar Beet Research 28:1-23 ，1991)、それによりサトウダイコン畑での雑草の制御の問題が更に悪化している。溶液は３６０ｇの活性成分(a.i.)グリフォセート(一般名Ｎ−ホスホノメチル− グリシン)を含み、それは葉により取りこまれる。現在まで、グリフォセート耐性雑草が２０年の使用でも発現していない(Holt et al.，Annu．Rev．Plant Phy siol.，1993)；更にグリフォセートに対する自然の耐性がサトウダイコンでコン畑での雑草の抑制に、フェンメジファン、メタミトロンおよびエトフメサートから成るサトウダイコン農業でしばしば使用されている除草剤の組み合わせよりも優れているように思える(Madsen et al.，Weed Res．35:105-111，1995)。グリフォセートは、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ(epsps)への不可逆性結合を介して芳香族アミノ酸の合成を阻害する。葉緑体中で、本酵素はシキメート−３−ホスフェートとホスホエノールピルベートの反応を触媒し、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートとホスフェートを形成する。本除草剤の適用約１週間後、立ち枯れ、黄変に続く完全な褐変、植物組織の衰えおよび根の腐敗を含む可視的作用が見られ得る。作物種にグリフォセート耐性を付与するために、グリフォセート耐性を増加させることができるepsps遺伝子の植物への挿入に焦点を絞っている。植物の他に、細菌および真菌がepsps活性を天然に発現する。Agrobacterium sp．CP4由来の cp4/epspsは、グリフォセートへの耐性を付与させることが判明した(Barry et a l.，"Inhibitors of Amino Acid Biosynthesis:Strategies for Imparting Glyh phosate Tolerance to Crop Plants"，in:Biosynthesis aned Molecular Regula tion of Amino Acids in Plants，Singh et al．(eds)，American Society of P lant Physiologist，pages 139-145，1992)。cp4/epsps遺伝子のダイズおよびアブラナへの挿入により、野外条件下で本除草剤の葉への適用への耐性が産生された(Delannay et al.，Crop Sci．35:1461-1467，1995;Padgette et al.，Crop S ci．35:1451-1461，1995)。 Achromobacter sp．LBAAから単離されたグリフォセートオキシダーゼ(gox)(Ba rry et al.，前掲)は、グリフォセートを植物に無毒の化合物であるアミノメチルホスホン酸に分解する。cp4/epspsとグリフォセートオキシダーゼ(gox)遺伝子の組み合わせは、グリフォセートに耐性のトランスジェニック小麦植物を得るのに好結果で使用されている(Zhou et al.，Plant Cell Rep．15:159-163，1995) 。本発明の目的は、最適な除草活性をもたらすのに十分高い投与量のグリフォセートに耐性なサトウダイコン植物の提供である。このような植物は、収率、病原体耐性などのような農学的特徴を最適化するために、優れたサトウダイコン系と戻し交配することにより更に改善できる。サトウダイコンは、Agrobacterium tumefaciens介在形質転換を使用して形質転換し得る(Fry et al.，Third international congres of plant mol．biol.， Tuscon，Arizona，USA;D'Halluin et al.，Bio/Technology 10:309-314，1992;K onwar，J．Plant Biochem & Biotech 3:37-41，1994)。Agrobacterium−介在形質転換は、植物ゲノムに統合された１コピー以上のＴ−ＤＮＡをしばしばもたらす。統合する遺伝子は、好ましくは、左境界とは反対にほとんど常に植物に移入される右境界の近くに位置するように、Ｔ−ＤＮＡに挿入する。リットル／ヘクタール)より多い処理に耐性である。良好な雑草抑制を得るための総標準投与量は、雑草圧力に依存して、４〜６リットル／ヘクタールの間で変化する。この濃度で、除草剤処理は植物生長力および葉退緑の作用は検出できなかった。本発明の植物により示される耐性は、形質転換的に発現したcp4/epsps 酵素活性により付与される。本発明の好ましい態様は、１９９７年１０月２４日に、受託番号97087006/2で、National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(23 St Machar Drive，Aberdeen AB2 1RY，Scotland UK)に寄託されている。本発明は、従って、cp4/epsps活性を発現する、サトウダイコン(その子孫を含での処理に耐性なサトウダイコン植物(その子孫を含む)に関する。本発明の植物は、右と左Ｔ−ＤＮＡ境界配列の間に、活性成分cp4/epspsをコードする配列番号：５に記載のＤＮＡ１個を含む形質転換ベクターを使用した、慣用のAgrobacterium介在形質転換により得ることができる。本発明の範囲内で、トランスジェニックゲノム内の左および右Ｔ−ＤＮＡ境界配列を欠き、形質転換ベクタ−ＤＮＡのかなりの部分の欠失をもたらすが、ep4/ epspsコードＤＮＡを保持する形質転換事象(RRMax)が、優れたグリフォセート耐性を提供することが、驚くべきことに判明した。特に、配列番号：１により特徴付けられる１個のＤＮＡが、ゲノムの非常に反復性の領域に統合され、同時に該反復性ゲノム配列の一部を置換することがわかる。使用する形質転換ベクター内でＴ−ＤＮＡ右境界配列に結合している、導入遺伝子配列のその部分に直接隣接したゲノムＤＮＡは、配列番号：２に記載の配列である。統合されたトランスジェニックＤＮＡの他端に直接結合したゲノムＤＮＡは、配列番号：３に記載の配列である。新規に形成されたＤＮＡ配置の完全ＤＮＡ配列は、配列番号：４に示す。従って、本発明は配列番号：１のヌクレオチド配列により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成し、該ヌクレオチド配列が好ましくは植物ゲノム内の非常に反復性のＤＮＡ配列と置き換わっている、サトウダイコン植物(その子孫を含む)に関する。本明細書で好ましいのは、ヌクレオチド配列に直接結合したゲノムのこれらの一部が、それぞれ配列番号：２および配列番号：３のヌクレオチド配列により特徴付けられるサトウダイコン植物(その子孫を含む)である。更に好ましいのは、配列番号：４のヌクレオチド配列により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、サトウダイコン植物(その子孫を含む)である。上記のトランスジェニック種子および植物に操作された遺伝特性は、有性生殖または無性生育により継代し、従って、子孫植物に維持され、繁殖され得る。一般的に、該維持および繁殖は、耕作、種蒔きまたは収穫のような、具体的な目的に適合するように開発された農学的方法の使用を可能とする。水耕栽培または温室法のような特異的な方法も適用できる。生育した作物が昆虫または感染による攻撃および傷害および雑草との競争に弱いため、手段は、雑草、植物疾病、昆虫、線虫および他の不利な条件を制御して、収率を改善するために行う。これらは、土壌の耕作または雑草および感染作物の除去、および除草剤、殺菌剤、花粉発育破壊剤、殺線虫剤、生育調節剤、成熟剤および殺虫のような農業化学物の適用のような機械的手段を含む。本発明のトランスジェニック植物および種子の有利な遺伝的特性の使用は、更に、病原体、除草剤、または負荷への耐性、改善された栄養価、増加した収率、または倒伏または不健康による損失を少なくする改善された構造を有する植物の開発の目的の植物育種を更に成し得る。種々の育種工程が、交配する種の選択、親系の受粉の指示または適当な子孫植物の選択のような、十分定義されたヒトの介在により特徴付けられる。所望の特性に依存して、異なる育種手段を行う。関連法は、当分野で既知であり、ハイブリダイゼーション、同系交配、戻し交配、多系交配、種々の交雑、異種ハイブリダイゼーション、異数体法などを含むがこれらに限定されない。ハイブリダイゼーション法は、また機械的、化学的または性化学的手段による雄性または雌性不稔性植物の産生のための植物の不稔性化を含む。雄不稔性植物の、異なる系の花粉による交配は、雄不稔性であるが、雌稔性植物のゲノムが、両方の親系から均質に得られる特性であることを確実とする。従って、本発明のトランスジェニック種子および植物は、例えば、その修飾された遺伝的特性のために、除草剤または農薬処理のような慣用法の作用の増加、または該方法の排除を可能とする。あるいは、改善された負荷耐性は、その最適化された遺伝的“装置”のために、同等な不利な生育条件下に耐性でない産物より、良好な質の産物の収穫を得ることができる。種子生産において、種子の発芽の質および均質性は必須の種子産物の特性であるが、農家により収穫され、蒔かれた種の発芽の質および均質性は重要ではない。穀物の他の穀物および雑草種子と混ざらないようにし、種子由来の疾病を抑制し、良好な発芽の種子を産生することが難しいため、明らかな範囲で、そして十分に定義された種子生産法が、純粋な種子の生育、条件付および販売の専門家である種子生産者により開発されている。従って、農家が、彼自身の穀物から採取した種子を使用する代わりに、具体的な質の標準に合う認定された種子を買うことは慣用である。種子として使用する繁殖材料は、除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤またはこれらの混合物を含む保護コーティングで、慣用的に処理する。慣用的に使用される保護コーティングは、カプタン、カルボで慣用的に使用される更なる担体、界面活性剤または適用促進アジュバントと共に製剤され、細菌、真菌または動物有害生物によりもたらされる傷害に対して保護を提供する。保護剤コーティングは、液体製剤による受精伝達材料により、または合わせた湿潤または乾燥製剤でのコーティングにより適用し得る。また芽または果実の直接処理のような適用の他の方法も可能である。本発明の更なる態様は、本発明のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物材料またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする、上記に例示の方法のような新規農学的方法の提供である。他の態様において、本発明は、トランスジェニック植物から得たトランスジェニック植物細胞、組織、器官、種子または植物部分に関する。植物のトランスジェニック子孫および該子孫から得たトランスジェニック植物細胞、組織、器官、種子および植物部分もまた本発明に含まれる。を含む、その使用指示書がラベルされた市販用袋に関する。本発明で好ましいのは、そのゲノムに安定に統合された、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を有する１個のＤＮＡを含むトランスジェニック植物の種子を含む市販用袋である。用いる形質転換法は下記の通り要約できる： (ａ)配列番号：５に記載のようなcp4/epspsをコードするＤＮＡを１個含むベクターで、Agrobacterium tumefasiensを使用してインビトロで生育させたサトウダイコン子葉を形質転換する； (ｂ)グリフォセート存在下で芽を再生させる； (ｃ)芽を温室内の土壌に移植する； (ｄ)苗木をグリフォセートで処理する； (ｅ)植物の成長力および葉の退緑を肉眼で等級付する； (ｇ)グリフォセート処理で影響を受けていない正常な成長力および葉の完全に正常な植物を選択する；そして (ｈ)慣用の育種法を使用して選択した植物を繁殖させる。特に、芽を約０．１から約１０mM、好ましくは約１mMグリフォセートの存在下で、選択８−１２週間後に再生させる。各トランスジェニック芽を更に１０コピーに繁殖させ、これは所望によりcp4/epsps導入遺伝子の存在に関して、発根のために温室に移す前にポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用して分析する。温室の光条件は１６時間明および８時間暗で、温度は２２±２℃である。３枚から４枚の葉の段階で、苗木に０．１から２０リットル、好ましくは１リットル／ヘけていない植物)を基本にした植物の成長力および植物退緑の可視傷害採点は、グリフォセート投与２週間後、個々の植物で行う。０から３の採点は、感受性植物の特徴である。３から７の採点は低から中程度の耐性を示し、８から９は良好な耐性を示す。特に、採点は以下の意味を有する：９... 非処理植物と同じ影響を受けていない植物８... 葉の頂上に非常に僅かな壊死があり、葉の５％より少ない領域が影響を受け、黄色い７... 葉の頂上に非常に僅かな壊死があり巻きはじめている；葉の５％より少ない領域が影響を受け、黄色い６、５、４...壊死および葉の巻きの増加；葉が正常より小さくなり始めている３、２... 葉の生育が無いか非常に限定されている；全葉が巻き、壊死に冒されている１... 植物の生育無し；５％までの植物が緑のままである０... 死滅植物正常な成長力でグリフォセート処理に影響を受けていない(得点９)野外試験植物のデータを集めるために、慣用の方法で更に繁殖または育種する。形質転換は、好ましくは、両方ともある植物種でグリフォセートに耐性を付与すると報告されているcp4/epspsおよびgox、およびβ−グルクロニダーゼ酵素をコードするレポーター遺伝子uidAを含む、配列番号：５で示す配列を有する１個のＤＮＡを含むTiベクターを使用して行う。亢進された３５Ｓプロモーター(Ode ll et al.，Nature 313:810-812，1985)をuidA遺伝子に、フィグウォース・モザイク・ウイルス(FMV)プロモーター(Gouwda et al.，J．Cell．Biochem．Suppl． 13D:301，1989)をcp4/epspsおよびgox遺伝子に結合させる。cp4/epspsおよびgox 遺伝子の上流に、輸送ペプチド(Gasser et al.，J．Biol．Chem．263:4280-4289 ，1988)を挿入し、両方のタンパク質が葉緑体を標的とするようにする。本発明に従って産生した一つの形質転換事象は、驚くべきことに約３×６リが判明した。分子分析は・一つの座に統合されたトランスジェニックＤＮＡの一つのコピーが存在する；・統合ＤＮＡはcp4/epspsをコードし、切断ベクタ−ＤＮＡに対応する；・統合ＤＮＡはゲノムＤＮＡの１個を置換し、配列番号：１に示す配列を有する；・ゲノムＤＮＡは統合ＤＮＡに直接隣接しており、配列番号：４の新規配列配置をもたらす配列番号：２および配列番号：３の配列により特徴付けられる・cp4/epspsおよびuidA遺伝子はそのままであるが、goxは切断されている；・他のベクター配列はトンラスジェニック植物に存在しないことを確認する。この情報が利用可能であるため、本発明の具体的形質転換の一つ由来の植物を他のサトウダイコン植物からＰＣＲの手段で容易に区別できる。適当なプライマー対組み合わせは、同一の形質転換事象に直接または間接的に由来する植物にのみ存在するゲノムＤＮＡ配列の特異的同定を可能にする。このような事象は、いかなる意味でもAgrobacterium−介在形質転換で得たもののみに限定される、微粒子銃形質転換実験によりもたらされ得る。本発明は更に、そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：Ｂおよび配列番号：ａの配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドプライマーの対を使用した場合、７３９bp ＤＮＡフラグメント；または配列番号：Ｄおよび配列番号：ｅの配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドプライマーの対を使用した場合、８３４bp ＤＮＡフラグメント；または配列番号：Ａおよび配列番号：ｂの配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドプライマーの対を使用した場合、１０５７bp ＤＮＡフラグメント；または配列番号：Ｃおよび配列番号：ｆの配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドプライマーの対を使用した場合、１２２４bp ＤＮＡフラグメントの増幅をもたらすサトウダイコン植物(その子孫を含む)に関する。実施例以下の実施例は本発明を行うために使用する材料および方法および続く結果を更に記載する。それらは説明の意味で提供され、その詳説は請求の発明を限定するものと見なしてはならない。実施例１サトウダイコン形質転換遺伝子型A1012のサトウダイコンを、グリフォセート耐性を付与するcp4/epsps およびgox遺伝子、抗生物質カナマイシンへの耐性を付与するntII遺伝子および β−グルクロニダーゼ(GUS)をコードするレポーター遺伝子uidAを含むベクターで形質転換する。ntIIおよびuidA遺伝子を亢進された３５Ｓプロモーター(Odell et al.，Nature 313:810-812，1985)に機能的に結合させ、一方、cp4/epspsおよびgox遺伝子はフィグウォース・モザイク・ウイルス(FMV)プロモーター(Gouwda et al.，J．Cell．Biochem．Suppl．13D:301，1989)の制御下にある。更に、cp4/epspsおよびgox遺伝子を、両方のタンパク質が葉緑体を標的とするように５'に位置した輸送ペプチド(Gasser et al.，J．Biol．Chem．263:42 80-4289，1988)と結合させる。cp4/epspsおよびuidAはR9 ３'ターミネーター配列の使用をするが、一方goxおよびntIIは対応するNOS ３'配列を使用する。インビトロ生育サトウダイコン(Beta vulgaris．L)を、A．tumefaciensを使用して形質転換する。植物を、１mMの濃度のグリフォセートを選択剤として使用してFry et al.("Genotype-independent transformation of sugarbeet using Agr obacterium tumefaciens"，Third international congress of plant mol．biol .，Tuscon，Arizona，USA.，1991)およびKonwar(J．Plant Biochem．& Biotech 3:37-41，1994)に記載のように再生する。再生芽を、３週毎の新鮮培地への継代を含む１mMグリフォセート、５００mg／リットルセフォタキシムでの選択後８− １２週に分析する。各トランスジェニック芽を更に１０コピーにマイクロ繁殖させ、導入遺伝子の存在に関して分析し、発根させるために温室に移す。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)をcp4/epsps遺伝子の存在を証明するために使用する。２０mgの植物材料を再生インビトロ芽からエッペンドルフ管に回収する。全ＤＮＡを本質的にTai et al.，Plant Mol．Biol．Rep 8:297-303，1990に従って抽出する。小さな修飾は、５０mM Ｎａ−ＥＤＴΛ、１.２５％ＳＤＳ(W/V) 、０．３８％Ｎａ−重亜硫酸(W/V)および２００μｇ/mlプロテアーゼＫを含む５００μｌの１００mM トリス−ＨＣｌｐＨ８.０を添加し、６５℃で２時間インキュベートすることである。不溶性葉材料を掻き出し、総ＤＮＡが沈殿し、２時間−20℃で凍結させる。ＰＣＲをPerkin-Elmer Gene-Amp PCRキット(Perkin -Elmer Corp.)に添付の説明書に従って、２４％スクロース(W/V)中の１００mMトリス−ＨＣｌｐＨ８.３、５００mM ＫＣｌ、３００mM ＭｇＣｌ₂、１.０％ Nonidet P-40(W/V)、０.４μＭクレゾールレッドおよびTaq Start Antibody (Clontech)使用して行う。cp4/epsps配列の増幅のために、以下のプライマーを使用する(Shah et al.，Science 233:478-481，1986)：５'−CAC CGG TCT TTT GGA AGG TGA AG−３'(配列番号：６)および５'−AAC GAG ACC CAT AAC GAG GAA GC−３'(配列番号：７)。ゲノム性内部コントロール配列(surA、surB)の増幅のために、以下のプライマーを使用する：５'−AAA CAG TCC CGT GCA TCC CCA AC−３'(配列番号：８)および５'−GAC GCT CTC CTT GAT TCT GTC CC−３'(配列番号：９)。形質転換効率の変化は異なるバイナリープラスミドの間で見られない。マイクロ繁殖させた芽を温室の土壌に移す。温室の光条件は２００μmol m^-2s ec^-1(Osram Power Star HQI-Z，400W)、１６時間明、８時間暗であり、温度は２２±２℃である。２６０の別々の形質転換体由来の３枚または４枚の葉段階与量での除草剤の水性溶液の適用に、目盛り付噴霧器を使用する。０（完全な葉壊死)から９(可視作用無し)のスケールを基本にした植物毒性作用の可視傷害評価を個々の植物でグリフォセート投与２週間後に行う。７５の異なる形質転換体について、０−６の得点の評価の植物毒性作用が検出される。他の１８５(７１％)形質転換体は得点７またはそれ以上であり、これは、除草剤での処理後に目に見える作用が全く無いか、ほとんど無いことを示すことを意味する。これらを更に非トランスジェニックサトウダイコンと交配させ、野外試験での続く評価のためにＦ１子孫を産生させる。野外試験は、野外条件下での異なる形質転換事象の評価のために行う。区画は３列から成り、各列９メートルの長さであり、列間の距離は０.５メートルである。一つの別々の形質転換体を各区画に条播する。子葉段階で非トランスジェニック分離植物を除去するために、最初の１リットル／ヘクタール（３６０ｇルの最終本数とする。各区画を、別々に処理する３部に分ける。一つの区画は慣用の除草剤メタミトロン０.１kg a.i.ha^-1、フェンメジファン０.２kg a.i.ha^-1 およびエトフメサート０.１kg a.i.ha^-1で処理する。他の区画は２回２リット２枚の葉段階および４枚の葉段階で処理する。最後の適用２週間後、植物を除草剤適用による植物毒性作用を採点する。完全な感受性から完全な耐性の範囲の症状が見られる。温室および野外試験の間の得点の差が見られる。これは、恐らく、ガラス下のＵＶＢ光の欠如を含む温室と野外試験の間の環境的差によるものであ物での処理と比較して、形態学的または物理学的変化はなかった。二つの形質転換体は２回２リットルおよび２回４リットル／ヘクタールでの処理後、付により測定した。種々の等級は以下の意味を有する：９... 非処理植物と同じ影響を受けていない植物８... 葉の頂上に非常に僅かな壊死があり、葉の５％より少ない領域が影響を受け、黄色い７... 葉の頂上に非常に僅かな壊死があり巻きはじめている；葉の５％より少ない領域が影響を受け、黄色い６、５、４...壊死および葉の巻きの増加；葉が正常より小さくなり始めている３、２... 葉の生育が無いか非常に限定されている；全葉が巻き、壊死に冒されている１... 植物の生育無し；５％までの植物が緑のままである０... 死滅植物２２個の異なる形質転換事象(エントリ−１−２２)および１個の非トランスジヘクタール(合計９１／Ha)を噴霧する。可視傷害採点の結果は下記の表に示す。実施例２統合されたトランスジェニックＤＮＡのコピー数最大グリフォセート耐性(RRMax)の形質転換体のゲノムに統合されたトランスジェニックＤＮＡのコピー数を、使用した形質転換ベクターの右および左境界配列を超えて伸びる制限フラグメントのサザンブロット分析により測定する。 RRMaxおよび非トランスジェニック植物由来のゲノムＤＮＡを、Saghai-Maroof et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:8014-8018，1984に従った凍結乾燥サトウダイコン葉材料２５０mgから単離する。１５μｇのＤＮＡを１２０単位の制限酵素で４時間、３７℃で全量４００μｌ中で消化させる。消化ＤＮＡが沈殿し、全量５０μｌに再溶解する。消化ＤＮＡ、陽性プラスミドコントロール、および分子マーカーサイズスタンダード(EcoRIおよびHindIIIで消化させたLambda)を０. ８％アガロースゲルに蒔く。ＤＮＡをエチジウムブロミドで可視化し、目盛り入り写真を撮る。次いでＤＮＡをHybond N+膜に移し、Ausubel et al．(eds.)：" Currenst protocols in molecula biology"，Green Publishing Associates，In c．and John Wiley & Sons，Inc.，New York，1987に記載のプローブとハイブリダイズさせる。 cp4/epsps遺伝子配列の塩基対975-1766(配列番号：５)およびgox遺伝子配列の塩基対7108-7535(配列番号：６)と相補的なプローブをポリメーラーゼ連鎖反応で製造し、ここで使用する形質転換ベクターは反応の鋳型ＤＮＡとして働く。cp 4/epspsプローブを右境界領域の隣の挿入物の数を測定するのに使用する。goxプローブを左境界領域の隣の挿入物の数を測定するのに使用する。ＰＣＲ産物をの³²Ｐでの標識は、Amersham International(Little Chalfontm，UK)のMegaprim e^TMＤＮＡラベリングシステムを使用して達成される。コピー数の測定は、右境界領域の隣のゲノムＤＮＡの分析により行い得る。ゲノムＤＮＡは、プラスミド由来配列を３５ＳプロモーターとuidA遺伝子の間で切断し、サトウダイコンゲノム内である制限酵素NcoIで消化する。膜を、cp4/epsp s遺伝子由来の内部ＰＣＲフラグメントでプローブする。ＮcoIでの消化およびco 4/epspsプローブとのハイブリダイズ後、４.７kbの単一バンドがRRMaxで検出される。これは、１つの座の移入ＤＮＡの１コピーを証明する。コピー数の証明はまた左境界領域の隣のゲノムＤＮＡの分析によりまた行い得る。ゲノムＤＮＡは、プラスミド由来配列をuidA遺伝子のE9 ３'ターミネーターとgox遺伝子のFMVプロモーターの間で切断し、サトウダイコンゲノム内である制限酵素HindIIIで消化する。HindIIIでの消化およびgoxプローブとのハイブリダイズ後、約２.０kbの単一バンドが形質転換体RRMaxで検出される。予期されるＮＡへの移入中のプラスミドＤＮＡの切断を示す。それにもかかわらず、結果は移入ＤＮＡの一つのコピーのみが一つの座に統合されることを確認する。実施例３ RRMax統合部位の配列分析ゲノム性RRMaxＤＮＡを、Saghai-Maroof et al.前掲に従って凍結乾燥サトウダイコン葉材料２５０から単離する。Xholクローニング部位に９−２３kbの挿入物サイズを有するλFIXIIファージライブラリーを作り(Stratageneに依頼)、cp4 /epspsおよびgoxプローブで探索し、統合事象をカバーする推定クローンをスクリ−ニングする。cp4/epspsまたはgoxプローブとハイブリダイズする全部で２５個のファージを検出する。二つのクローンがcp/epsosプローブおよびgoxプローブとそれぞれハイブリダイズすることがわかる。その一つを精製し(Fritsch et al.，1987)、更にサザンブロット分析およびＰＣＲで評価する。これは、トランスジェニックＤＮＡおよびフランキングサトウダイコン配列を含む１５−１６kb 挿入物を含む。フランキング配列を、ＦＭＶプロモーターまたはgox遺伝子配列を適合するプライマーとλFiXIIクローニングカセット(詳細な配列は下記表１に記載)に適合するプライマーと組み合わせて使用するＰＣＲで増幅させる。統合ＤＮＡ／サトウダイコン連結領域を、Applied Biosystems，Model 373A，Versio n 2.1.1を使用したSangerジデオキシー介在鎖停止法により配列決定する。配列決定に使用するプライマーは表２に示す。表１：境界領域の増幅に使用するプライマ一表２：配列決定用プライマー配列分析は、RRMaxのゲノムに統合されたトランスジェニックＤＮＡが配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を有することを明示する。統合開始点は右境界配列とＦＭＶプロモーターの間に位置し、gox開始コドンの８９７塩基対下流で停止する。切断gox遺伝子の翻訳停止コドンは連結部位の１３０および２３５塩基対下流に見ることができる。HindIII部位は、gox開始コドンの２１０塩基対下流と同定され、転写停止シグナル(AATAAA)は６５０塩基対下流である。配列番号：２はトランスジェニックＤＮＡの右境界領域に直接結合しているゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列を記載し、配列番号：３はトランスジェニックＤＮＡの左境界領域に直接結合するゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列を記載する。実施例４ RRMaxに統合されたトランスジェニックＤＮＡの特徴付け右境界領域を更に特徴付けするために、RRMaxのゲノムＤＮＡおよび形質転換ベクターＤＮＡを、制限酵素BamHI、HindIII、BcIIまたはEcoRIのいずれかで消化させる。サザンブロット分析において、切断ＤＮＡを実施例２に記載のcp4/ep spsＰＣＲフラグメントとプローブする。使用する制限酵素とは無関係に、異なる制限酵素での消化はサザンブロット分析で単一フラグメントを発生させる。検出したフラグメントのサイズは表３に示す。このデータは、単一ＤＮＡが植物に移入され、サトウダイコン植物に移入されたＤＮＡがcp4/epsps遺伝子の完全な移入をもたらすことを証明する。結果は、実施例２で測定したコピー数および実施例３のヌクレオチド配列分析の結果と一致する。表３：サザンブロットフラグメントサイズ統合されたトランスジェニックＤＮＡの断片を更に特徴付けするために、RRMa x由来のゲノムＤＮＡを、制限酵素NcoI、BamHIまたはHindIIIのいずれかで消化する。コントロールとして、形質転換ベクターＤＮＡを同じ制限酵素で消化する。ブロットを、配列番号：５のuidA遺伝子のＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントスパンニング塩基対３７９６−４８３７でプローブする。検出したフラグメントのサイズを表４に示す。使用する制限酵素とは無関係に、異なる制限酵素での消化はオートラジオグラフィーフィルムで単一シグナルを発生させ、ＤＮＡ挿入物が使用した形質転換ベクターの内部ＤＮＡと同じ特徴を有することを証明する。表４：サザンブロットフラグメントサイズ左境界領域を更に特徴付けするために、RRMaxのＤＮＡおよび形質転換ベクターＤＮＡを制限酵素NcoI、BamHI、HindIIIまたはEcoRIで消化する。サザンブロット分析において、切断ＤＮＡを実施例２に記載のgoxＰＣＲフラグメントとプローブする。検出したフラグメントのサイズを表５に示す。使用する制限酵素とは無関係に、異なる制限酵素での消化はオートラジオグラフィーフィルムで単一シグナルを発生させる。各制限酵素NcoI、BamHIまたはEcoRIでの消化は、既知のサイズの内部フラグメントと同一であると予測する。しかしながら、これらの制限酵素は予測したサイズのこのような内部フラグメントを発生させない。これは、NcoI、BamHIおよびEcoRIの制限部位がトランスジェニック植物で欠失していることを示す。この結果は、gox遺伝子が植物内の唯一部分的に統合されていたことが判明した配列決定により得られる結果と一致する。制限酵素HindIIIでの消化は、約２kbのフラグメントを発生させ、更にHindIII部位がゲノムのgox遺伝子の下流に位置する配列決定データを確認する。結果はまたトランスジェニックＤＮＡの単一コピーが植物に移入されていることも示す。それらは実施例２で測定したコピー数および実施例３の配列決定分析の先の結果と相関する。単一コピーが植物ゲノム内に統合され、一方gox遺伝子が部分的に欠失している。表５：サザンブロットフラグメントサイズ実施例５他のベクターＤＮＡ配列の欠失形質転換事象RRMaxにおけるoriV、ori-322、aadおよびntII配列の欠失を確認するために、サザンブロット分析を、oriV、ori-322、aadおよびntIIをカバーする制限酵素／プローブの組み合わせを使用して行うことができる。形質転換ベクターＤＮＡを、１７部位でプラスミドを切断する制限酵素NspIで消化する。分析の目的で、oriVをカバーするNspIフラグメントおよびori-322をカバーするフラグメントおよびaadを精製し、サザンブロット分析に使用する。配列番号：２６に記載のヌクレオチド配列を有するＰＣＲ増幅させたフラグメン BIO 101(La Jol1a，CA)で精製する。プローブの³²Ｐでの標識は、Amersham Inte rnational(Little Chalfontm，UK)のMegaprime^TMＤＮＡラベリングシステムを使用して達成される。 RRMaxのゲノムＤＮＡを、配列番号：５の塩基対２３２、５５４４および８４１３の３個所で形質転換ＤＮＡを切断する制限酵素BamHIで消化する。対応するサザン伝達膜のoriVをカバーするプローブとのハイブリダイゼーションはシグナルの検出ができなかった。これは、oriVがRRMaxに存在しないことを結論付ける。対応するサザン伝達膜のori-322およびaadをカバーするプローブとのハイブリダイゼーションはシグナルの検出ができなかった。これは、ori-322およびaad配列がRRMaxに存在しないことを結論付ける。対応するサザン伝達膜のnptIIプローブとのハイブリダイゼーションはシグナルの検出ができず、これはnptII遺伝子がRRMaxに存在しないことを証明する。実施例６ RRMax系の安定性制限酵素BcIIでのゲノムＤＮＡの消化およびcp4/epsps遺伝子をプローブとして使用するサザンブロット分析を実施例２に記載のように行う。２および３世代由来の４本の植物および４世代由来の５本の植物を本分析に使用する。加えて、３本の非トランスジェニック植物をネガティブコントロールとして使用する。本子孫世代のサザンブロット分析は、また３.２kbの単一フラグメントの結果となる。導入ＤＮＡが世代毎に安定に導入されていれば、同じ３.２kbフラグメントが全植物で予測される。 HindIIIでのゲノムＤＮＡの消化およびcp4/epsps遺伝子をプローブとして使用するサザンブロット分析を実施例２に記載のように行う。先の形質転換事象は２ .０kbの単一フラグメントの結果である。本子孫世代のサザンブロット分析はまた２.０kbの単一フラグメントの結果となり、本性質の安定な相続を示す。実施例７ RRMaxのＰＣＲ特徴付け系RRMaxのゲノムＤＮＡを実施例２に記載のように調製する。約０.５μgのＤＮＡを、表６に示す配列により特徴付けられる特異的なプライマーの組み合わせを使用したＰＣＲ反応で鋳型ＤＮＡとして使用する。該特異的組み合わせおよび増幅されたフラグメントのサイズを表７に示す。プライマー対組み合わせに依存して、５５℃から６５℃の間のアニーリング温度を、３０から３５増幅サイクルの各々で使用する。表６：プライマー配列表７：特異的プライマー組み合わせ

【手続補正書】【提出日】平成１１年９月７日（１９９９．９．７）【補正内容】（１）明細書３頁７行に「受託番号97087006/2」とあるを「受託番号NCIMB40905」と訂正する。（２）請求の範囲別紙の通り。（別紙）請求の範囲１．cp4/epsps酵素活性を発現するサトウダイコン植物(その子孫を含む)。１記載の植物。３．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１８および配列番号：２１の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、７３９bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。４．配列番号：２７により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項３記載の植物。５．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：２０および配列番号：２４の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、８３４bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。６．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１７および配列番号：２２の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、１０５７bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。７．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１９および配列番号：２５の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、１２２４ｂｐＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。８．配列番号：１により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項１記載の植物。９．該ヌクレオチド配列が非常に反復性のＤＮＡ配列を置換する、請求項８記載の植物。１０．該ヌクレオチド配列に直接結合するゲノムの一部が配列番号：２および配列番号：３のヌクレオチド配列により特徴付けられる、請求項８記載の植物。１１．配列番号：４により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項９記載の植物。１２．請求項１から１１のいずれかに記載の植物の種子。１３．受託番号NCIMB40905で寄託されている、請求項８記載の植物の種子。１４．(ａ)cp4/epspsをコードするＤＮＡを１個含むベクターを保持するAgrob acteraで、インビトロで生育させたサトウダイコン子葉を形質転換する； (ｂ)グリフォセート存在下で芽を再生させる； (ｃ)芽を温室内の土壌に移植する； (ｄ)苗木をグリフォセートで処理する； (ｅ)植物の成長力および葉の退緑を肉眼で等級付する； (ｇ)グリフォセート処理で影響を受けていない正常な成長力および葉の完全に正常な植物を選択する；そして (ｈ)慣用の育種法を使用して選択した植物を繁殖させることを含む、請求項１記載のトランスジェニックサトウダイコンの製造法。１５．cp4/epspsタンパク質をコードするベクターが、配列番号：５に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ１個を含むベクターである、請求項１４記載の方法。１６．再生芽のcp4/epspsコードＤＮＡの存在に関してＰＣＲで分析する、請求項１４記載の方法。１７．植物内でのcp4/epspsの発現を可能にする遺伝子でのAgrobacterium介在形質転換により得られ、右および左Ｔ−ＤＮＡ境界配列の両方を欠く植物である、グリフォセート耐性サトウダイコン植物(その子孫を含む)。【手続補正書】【提出日】平成１２年１０月２３日（２０００．１０．２３）【補正内容】請求の範囲１．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１８および配列番号：２１の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、７３９bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、 cp4/epsps酵素活性を発現するサトウダイコン植物(その子孫を含む)。２．配列番号：27により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項１記載の植物。３．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：２０および配列番号：２４の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、８３４bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。４．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１７および配列番号：22の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、１０５７bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。５．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１９および配列番号：２５の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、１２２４bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。６．配列番号：１により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項１記載の植物。７．該ヌクレオチド配列が非常に反復性のＤＮＡ配列を置換する、請求項６記載の植物。８．該ヌクレオチド配列に直接結合するゲノムの一部が配列番号：２および配列番号：３のヌクレオチド配列により特徴付けられる、請求項８記載の植物。９．配列番号：４により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項７記載の植物。１０．請求項１から９のいずれかに記載の植物の種子。１１．受託番号NCIMB40905で寄託されている、請求項６記載の植物の種子。１２．(ａ)cp4/epspsをコードするＤＮＡを１個含むベクターを保持するAgrob acteraで、インビトロで生育させたサトウダイコン子葉を形質転換する； (ｂ)グリフォセート存在下で芽を再生させる； (ｃ)芽を温室内の土壌に移植する； (ｄ)苗木をグリフォセートで処理する； (ｅ)植物の成長力および葉の退緑を肉眼で等級付する； (ｇ)グリフォセート処理で影響を受けていない正常な成長力および葉の完全に正常な植物を選択する；そして (ｈ)慣用の育種法を使用して選択した植物を繁殖させることを含む、請求項１記載のトランスジェニックサトウダイコンの製造法。１３．cp4/epspsタンパク質をコードするベクターが、配列番号：５に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ１個を含むベクターである、請求項１２記載の方法。１４．再生芽のcp4/epspsコードＤＮＡの存在に関してＰＣＲで分析する、請求項１２記載の方法。１５．植物内でのcp4/epspsの発現を可能にする遺伝子でのAgrobacterium介在形質転換により得られ、右および左Ｔ−ＤＮＡ境界配列の両方を欠く植物である、グリフォセート耐性サトウダイコン植物(その子孫を含む)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．cp4/epsps酵素活性を発現するサトウダイコン植物(その子孫を含む)。１記載の植物。３．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１８および配列番号：２１の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、７３９bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。４．配列番号：２７により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項３記載の植物。５．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：２０および配列番号：２４の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、８３４bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。６．そのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１７および配列番号：２２の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、１０５７bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。７．そのゲノムＤＮΛを鋳型としたＰＣＲ増幅で、配列番号：１９および配列番号：２５の配列により特徴付けられるオリゴヌクレオチドの対を使用したとき、１２２４bpＤＮＡフラグメントの増幅がもたらされることを特徴とする、請求項１記載の植物。８．配列番号：１により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項１記載の植物。９．該ヌクレオチド配列が非常に反復性のＤＮＡ配列を置換する、請求項８記載の植物。１０．該ヌクレオチド配列に直接結合するゲノムの一部が配列番号：２および配列番号：３のヌクレオチド配列により特徴付けられる、請求項８記載の植物。１１．配列番号：４により特徴付けられるＤＮＡが植物ゲノムの一部を形成する、請求項９記載の植物。１２．請求項１から１１のいずれかに記載の植物の種子。１３．受託番号NCIMB97087006/2で寄託されている、請求項８記載の植物の種子。１４．(ａ)cp4/epspsをコードするＤＮＡを１個含むベクターを保持するAgrob acteraで、インビトロで生育させたサトウダイコン子葉を形質転換する； (ｂ)グリフォセート存在下で芽を再生させる； (ｃ)芽を温室内の土壌に移植する； (ｄ)苗木をグリフォセートで処理する； (ｅ)植物の成長力および葉の退緑を肉眼で等級付する； (ｇ)グリフォセート処理で影響を受けていない正常な成長力および葉の完全に正常な植物を選択する；そして (ｈ)慣用の育種法を使用して選択した植物を繁殖させることを含む、請求項１記載のトランスジェニックサトウダイコンの製造法。１５．cp4/epspsタンパク質をコードするベクターが、配列番号：５に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ１個を含むベクターである、請求項１４記載の方法。１６．再生芽のcp4/epspsコードＤＮＡの存在に関してＰＣＲで分析する、請求項１４記載の方法。１７．植物内でのcp4/epspsの発現を可能にする遺伝子でのAgrobacterium介在形質転換により得られ、右および左Ｔ−ＤＮＡ境界配列の両方を欠く植物である、グリフォセート耐性サトウダイコン植物(その子孫を含む)。