EA022829B1 - Трансгенное растение или его часть, обладающие устойчивостью к насекомым отряда lepidoptera - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к растению кукурузы или его части, обладающим устойчивостью к заражению насекомыми паразитами отряда Lepidoptera, клетке растения кукурузы, обладающей устойчивостью к заражению насекомыми паразитами Lepidoptera, продукту, полученному из упомянутого растения кукурузы, способу получения устойчивого к насекомым растения кукурузы, способу защиты растения кукурузы от заражения насекомыми паразитами отряда Lepidoptera, паре молекул ДНК, способу обнаружения в биологическом образце растения кукурузы ДНК растения кукурузы, набору для обнаружения ДНК, способу определения в биологическом образце зиготности ДНК растения кукурузы, ДНК-праймеру.

Description

Изобретение относится к случаю трансгенной кукурузы ΜΟΝ89034 и частям растения и его семени. Этот случай проявляет устойчивость к заражению насекомыми отряда ЬерИорЮга. Настоящее изобретение также относится к способам применения растений и семян, содержащих ДНК, которая является диагностической в отношении присутствия трансгенного случая при зондировании на присутствие уникальных нуклеотидных последовательностей трансгенного случая, и способам обнаружения присутствия указанного случая кукурузы в биологическом образце по обнаружению специфических нуклеотидных последовательностей, уникальных для трансгенного случая. Настоящим изобретением предоставляются уникальные нуклеотидные последовательности этого случая.

Предпосылки создания изобретения

Изобретение относится к устойчивому к отряду Ьер|Дор1ега (чешуекрылым) трансгенному сорту растений кукурузы (2еа тауз), упоминаемому в настоящем описании как случай ΜΟΝ89034, и присутствующей уникальной последовательности ДНК, которая при обнаружении в любом образце или сорте кукурузы является диагностической в отношении присутствия случая трансгенного растения кукурузы ΜΟΝ89034 в образце или сорте и также относится к обнаружению области трансгена/геномной вставки в кукурузе ΜΟΝ89034 и растениям потомства и семенам, происходящим из них.

Случай растения кукурузы ΜΟΝ89034, в частности, устойчив к насекомым отряда Ьер1Дор1ега, таким как осенний походный червь (§роДор!ега йгищрегДа), кукурузный мотылек (ΟκΐΓίηΙη пиЬНаПз), хлопковая совка (НеПсоуегра /еа), юго-западная кукурузная огневка (Э|а1гаеа дгапДюзеПа) и совка ипсилон (Лдгойз 1рзйои) и т.п., все из которых являются агрономически важными насекомыми-вредителями.

Кукуруза является важной сельскохозяйственной культурой и основным пищевым источником во многих областях мира. Способы биотехнологии использовали для кукурузы с целью улучшения агрономических признаков и качества продукта. Одним из таких агрономических признаков является устойчивость к насекомым, например генетически созданная устойчивость к видам чешуекрылых и жесткокрылых, которая возникает в растениях кукурузы, генетически созданных так, что они содержат один или несколько генов, кодирующих инсектицидные агенты (см., например, патент США № 6489542 и патент США № 6620988). Полезно обнаружение присутствия конкретного трансгенного случая в биологическом образце для определения того, содержит ли одно или несколько потомств от полового скрещивания трансгенный материал. Например, обнаружение случая в образце является важным для целей лицензирования, для установления и поддержания стандартов степени чистоты, важным для подчинения регуляторным органам, для соответствия стандартам для пищевых ингредиентов, для применения в судопроизводстве для установления того, что один или несколько конкретных индивидуумов или организаций использовали конкретный случай без лицензии от обладателя или лицензиата любых патентов, направленных на трансгенный случай, и для гарантии соответствия различным постановлениям правительства и/или законам.

Кроме того, способы, позволяющие обнаружить конкретное растение, были бы полезны при подчинении регламентам, требующим предпродажного разрешения и маркировки продуктов, получаемых из рекомбинантных растений - сельскохозяйственных культур. Индивидуумы или организации, резистентные к присутствию трансгенного случая в образце, также хотят иметь надежные способы обнаружения присутствия трансгена в образце для осуществления ими возможности капитализации своего бизнеса, в котором используется преимущество отсутствия трансгена в их продуктах.

Несмотря на эти преимущества возможно, что насекомые смогут развить сопротивление растениям, экспрессирующим только один δ-эндотоксин В.ДшппщегМз. Такое сопротивление, при его широком распространении, несомненно, ограничит коммерческую ценность зародышевой плазмы, содержащей только гены Βΐ.

Одним возможным способом увеличения эффективности инсектицидных агентов, предоставляемых через трансгенные растения и направленных на контролирование целевых насекомых-вредителей, и одновременного снижения вероятности появления насекомых-вредителей, устойчивых к таким инсектицидным агентам, могло бы быть обеспечение экспрессии трансгенными сельскохозяйственными культурами высоких уровней этих инсектицидных агентов, таких как дельта-эндотоксины ВасШиз ДшппщегМз (ΜοΟηιΐβΐΒ;}· апД \УНа1оп (1992), §с1епсе 258: 1451-55; КоизЬ (1994) Вюсойго! 8с1 ТесЬпо1. 4: 501-516). Кроме того, наличие депо инсектицидных генов, которые являются эффективными против групп насекомых-вредителей и проявляют свои действия через различные принципы действия, может защитить против развития устойчивости. Возникновение устойчивости можно было бы в значительной степени отсрочить в результате предоставления сельскохозяйственной культуры, которая экспрессирует две или более инсектицидных активностей, проявляя перекрывающуюся токсичность в отношении одного и того же вида насекомых. Одним из способов достижения таких двойственных принципов действия могло бы быть предоставление растения, экспрессирующего ген Βΐ, токсичный в отношении конкретного вида насекомого, вместе с дцРНК, которую предоставляют с целью супрессии существенного гена того же вида

- 1 022829 насекомого, на который направлен токсин Βΐ, при этом дцРНК индуцирует реакцию интерференционной РНК при проглатывании целевым вредителем, что предоставляет способы дублирования в случае развития у насекомого устойчивости или к дцРНК, или к гену Βΐ. В альтернативном случае коэкспрессия в растении двух или более инсектицидных токсинов, оба из которых токсичны в отношении одного и того же вида насекомого, но каждый проявляет различный принцип осуществления своей активности по уничтожению, особенно при экспрессии обоих на высоких уровнях, обеспечивает способ эффективного управления устойчивостью. Примеры таких инсектицидов, применимых в таких комбинациях, включают, но без ограничения, токсины Βΐ, инсектицидные белки видов ХепогйаЬйик или РНоЮгНаЬбщ, десенсибилизированные и дегликозилированные белки пататина и/или пермутеины, лектины растений и т.п.

Известно, что на экспрессию чужеродных генов в растениях оказывает влияние их хромосомное месторасположение, возможно вследствие структуры хроматина (например, гетерохроматина) или близости регулирующих транскрипцию элементов (например, энхансеров) к сайту интеграции (ХУеыпд еΐ а1. (1980 Апп. Кеу. Сепеΐ 22: 421-477). По этой причине часто необходимо скринировать большое количество случаев для идентификации случая, характеризующегося оптимальной экспрессией представляющего интерес введенного гена. Даже тогда, когда в руках имеются дюжины или даже сотни различных трансгенных случаев, нет уверенности в успешном идентифицировании одного трансгенного случая, который обеспечивает оптимальные уровни экспрессии по крайней мере двух различных токсинов или инсектицидных агентов и не имеет каких-либо нежелательных агрономических недостатков или фитотоксических эффектов, или в результате вставки в некоторую существенную или отчасти существенную область генома растения, или в результате токсических эффектов, вызванных уровнями экспрессии трансгенов. Например, в растениях и в других организмах наблюдали, что среди случаев может быть широкая вариация уровней экспрессии введенного гена. Также могут быть различия в пространственных или временных характерах экспрессии, например, различия в относительной экспрессии трансгена в различных тканях растения, которые могут не соответствовать характерам, ожидаемым на основе регулирующих транскрипцию элементов, присутствующих в конструкции вводимого гена. По этой причине обычно получают от нескольких сотен до нескольких тысяч различных случаев и скринируют случаи в отношении одного случая, который обладает желаемыми для коммерческих целей уровнями и характерами экспрессии трансгена. Случай, который обладает желаемыми уровнями или характерами экспрессии трансгена, применим для интрогрессии трансгена в другую генетическую среду с помощью полового ауткроссинга, используя общепринятые способы скрещивания. Потомство от таких скрещиваний сохраняет характеристики экспрессии трансгена исходного трансформанта. Эту стратегию используют для обеспечения надежной экспрессии гена в ряде сортов, которые подходящим образом адаптированы к специфическим локальным условиям роста.

Можно обнаружить присутствие трансгена с помощью любого хорошо известного способа обнаружения нуклеиновой кислоты, такого как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или гибридизация ДНК, используя зонды в виде нуклеиновых кислот. Эти способы обнаружения, как правило, фокусируются на часто используемых генетических элементах, таких как промоторы, терминаторы, маркерные гены или даже последовательности, кодирующие белок, или представляющие интерес дцРНК, экспрессируемые с трансгена(ов) и т.п. В результате такие способы нельзя использовать для проведения различий между различными случаями, в частности теми случаями, которые были получены с использованием одной и той же ДНК-конструкции, если не известна последовательность хромосомной ДНК, примыкающая к вставленной ДНК (фланкирующая ДНК). В зависимости от способа, используемого для введения трансгена(ов) в геном растения, могут наблюдаться аберрантные или необычные эффекты, которые часто существенно осложняют идентификацию последовательностей генома растения, фланкирующих трансгенную ДНК, которая была предназначена для введения в растение. Часто перестройки вставленной ДНК, перестройки фланкирующей геномной ДНК или перестройки и вставленной ДНК, и фланкирующей геномной ДНК преобладают и осложняют анализ оцениваемого случая вставки. Поэтому полезно иметь способ отбора, идентификации и гарантии чистоты и характеристик конкретного трансгенного случая в образце, и единственным способом выполнения этого является идентификация одной или нескольких уникальных последовательностей, связанных только с желаемым трансгенным случаем, и присутствие таких последовательностей в биологическом образце, содержащем ДНК вида растения, в который вставлена трансгенная ДНК для создания этого случая, диагностирует, таким образом, этот случай в таком образце.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к растению кукурузы или его части, обладающему устойчивостью к заражению насекомыми паразитами отряда РерИорЮга, содержащему нуклеотидную последовательность §ЕЦ ГО N0:5.

Настоящее изобретение также относится к клетке растения кукурузы, обладающей устойчивостью к заражению насекомыми паразитами РерИорЮга, содержащей нуклеотидную последовательность §ЕЦ ГО N0:5, и продукту, полученному из упомянутого растения кукурузы, в частности выбранному из группы, состоящей из кукурузного толокна, кукурузного масла, кукурузной лепешки, кукурузного семени, кукурузных ростков, кукурузного крахмала, кукурузной муки, кукурузной пыльцы, кукурузного шелка, жид- 2 022829 кого кукурузного экстракта, кукурузного солода, кукурузного сахара, кукурузного сиропа, маргарина, получаемого из кукурузного масла, сухих продовольственных товаров из барды (ΌΌΟ8).

Объектом настоящего изобретения является способ получения устойчивого к насекомым растения кукурузы, включающий: (а) скрещивание растения кукурузы по любому из пп.1, 2 с другим растением кукурузы; (Ь) получение потомства растения от указанного скрещивания (а); и (с) отбор потомства, которое содержит нуклеотидные последовательности §Е0 ГО N0:1 и §Е0 ГО N0:2, причем указанное отобранное потомство является устойчивым к заражению насекомыми паразитами отряда Ь-срДорЮга.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения устойчивого к насекомым паразитам отряда Ь-срДорЮга растения кукурузы, включающий (а)трансформацию клетки растения кукурузы нуклеотидной последовательностью, содержащей §Е0 ГО N0:5; и (Ь)регенерацию растения кукурузы из указанной трансформированной клетки, причем указанное растение кукурузы содержит указанную нуклеотидную последовательность и является устойчивым к насекомым паразитам отряда Ь-срДорЮга.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ защиты растения кукурузы от заражения насекомыми паразитами отряда Ь-срИорЮга. включающий введение в пищевой рацион вредителя кукурузы отряда Ь-срДорЮга инсектицидно эффективного количества клеток(и) или тканей(и) трансгенного растения кукурузы, или его частей, по любому из пп.1, 2.

Настоящее изобретение также относится к паре молекул ДНК, содержащей первую молекулу ДНК и вторую молекулу ДНК, причем молекулы ДНК содержат по меньшей мере 20 непрерывных нуклеотидов §Е0 ГО N0:5, или §Е0 ГО N0:3, или §Е0 ГО N0:4, или комплементарную им последовательность для функционирования в качестве ДНК-праймеров или зондов, диагностических в отношении ДНК, экстрагированной из растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, или его потомства.

Другим объектом настоящего изобретения является способ обнаружения в биологическом образце растения кукурузы ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, включающий:(а) приведение в контакт указанного биологического образца с парой молекул ДНК, раскрытой в любом из пп.11-18; (Ь) обеспечение условий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты; (с)проведение указанной реакции амплификации с получением молекулы ДНК-ампликона, причем обнаружение ампликона, содержащего по крайней мере одну из 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:2 или комплементарной им последовательности, указывает на наличие искомой молекулы ДНК в указанном биологическом образце.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ обнаружения в биологическом образце растения кукурузы ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, включающий: (а) приведение в контакт указанного биологического образца с ДНК-зондом, который содержит §Е0 ГО N0:1 или §Е0 ГО N0:2 или комплементарную им последовательность и гибридизуется в жестких условиях с одной или несколькими нуклеотидными последовательностями §Е0 ГО N0:1, или §Е0 ГО N0:2, или комплементарным им последовательностям; (Ь) обеспечение жестких условий гибридизации для указанного биологического образца и ДНК-зонда, причем обнаружение гибридизации указывает на наличие искомой молекулы ДНК в биологическом образце.

Настоящее изобретение также относится к набору для обнаружения ДНК, представленной последовательностью 8Е0 ГО N0:5, содержащему по крайней мере две ДНК-молекулы, содержащие по меньшей мере 20 непрерывных нуклеотидов последовательностей §Е0 ГО N0:3, §Е0 ГО N0:4, или §Е0 ГО N0:5, или последовательностей, комплементарных указанным для функционирования в качестве ДНКпраймера или зонда, специфического для растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, и/или его потомства.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ определения в биологическом образце зиготности ДНК растения кукурузы, содержащего 8Е0 ГО N0:5, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, включающий: (а) приведение в контакт указанного образца с набором праймеров, содержащих §Е0 ГО N0:6, §Е0 ГО N0:7 и §Е0 ГО N0:10, который (1) при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, приводит к образованию первого ампликона, который является диагностическим для растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, и (2) при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей геномную ДНК кукурузы, отличную от ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, приводит к образованию второго ампликона, который является диагностическим для геномной ДНК кукурузы, отличной от ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА7455; (Ь) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, причем обнаружение обоих указанных выше ампликонов свидетельствует о том, что образец является гетерозиготным по ДНК растения

- 3 022829 кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, а обнаружение только первого из указанных выше ампликонов свидетельствует о том, что указанный образец является гомозиготным по ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455.

Настоящее изобретение также относится к устойчивому к заражению насекомыми паразитами отряда ЬерМор1ега растению или его потомству, содержащее последовательность §ЕЦ ГО N0:5.

Настоящее изобретение также относится к устойчивому к заражению насекомыми паразитами отряда ЕерМор1ета семени растения, содержащее последовательность §ЕЦ ГО N0:5.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является ДНК-праймер для обнаружения ДНК трансгенного растения кукурузы, содержащего в своем геноме последовательность §ЕЦ ГО N0:5, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, содержащий по меньшей мере 30 непрерывных нуклеотидов последовательности §ЕЦ ГО N0:3 или комплементарной ей последовательности, который используется в способе амплификации ДНК с получением ампликона, содержащего 8ЕЦ ГО N0:1.

Другим аспектом настоящего изобретения является ДНК-праймер для обнаружения ДНК трансгенного растения кукурузы, содержащего в своем геноме последовательность §ЕЦ ГО N0:5, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА7455, содержащий по меньшей мере 30 непрерывных нуклеотидов последовательности §ЕЦ ГО N0:4 или комплементарной ей последовательности, который используется в способе амплификации ДНК с получением ампликона, содержащего 8ЕЦ ГО N0:2.

Другим объектом изобретения является набор для обнаружения ДНК трансгенного растения кукурузы, содержащего в своем геноме последовательность §ЕЦ ГО N0:5, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, содержащий по меньшей мере две молекулы из 30 или более непрерывных нуклеотидов последовательности §ЕЦ ГО N0:3, или §ЕЦ ГО N0:4, или комплементарной им последовательности, который используется в способе амплификации ДНК с получением ампликона, содержащего 8ЕЦ ГО N0:1 или §ЕЦ ГО N0:2.

Настоящее изобретение относится к трансгенному растению кукурузы, обозначенному М0Ж9034. и его потомству, которые неотличимы от случая кукурузы М0Ж9034 (до такой степени, что они также содержат по крайней мере одну аллель, которая соответствует вставленной трансгенной ДНК), имеющему семя, которое депонировано 28 марта 2006 г. в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) под номером поступления РТА-7455. Другим аспектом настоящего изобретения являются растения потомства или семена, или регенерируемые части растения и семена случая кукурузы М0Ж 9034, которые содержат полинуклеотид, выбираемый из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:2, §ЕЦ ГО N0:3, §ЕЦ ГО N0:4 и §ЕЦ ГО N0:5. Настоящее изобретение также включает части растения случая кукурузы М0№9034, которые включают, но без ограничения, пыльцу, семяпочку, цветы, ростки, корни, стебли, шелк, метелки, колоски и листья, пока эти части содержат по крайней мере полинуклеотиды, определенные выше. Новые генетические составы, содержащиеся в геноме М0Ж9034 и продуктах из М0№9034, таких как мука крупного помола, мука, масло, мякоть и биомасса, оставляемая на поле растений кукурузы, соответствующих случаю М0№9034, являются аспектом этого изобретения.

Настоящим изобретением предоставляется устойчивое к насекомым растение кукурузы, обладающее всеми физиологическими и морфологическими свойствами случая кукурузы М0Ж9034.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предоставляются композиции и способы для обнаружения присутствия области трансгена/вставки в геном из нового растения кукурузы, обозначенного М0Ж9034. Предоставляются последовательности ДНК, которые включают по крайней мере одну последовательность стыка случая М0№9034, выбираемую из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:1 (расположенной в положениях 2051-2070 в §ЕЦ ГО N0:5) и §ЕЦ ГО N0:2 (расположенную в положениях 11295-11314) и их комплементов; причем последовательность стыка охватывает стык между гетерологичной ДНК, вставленной в геном, и ДНК клетки кукурузы, фланкирующей сайт вставки, и диагностирует этот случай (фиг. 1). Случай кукурузы М0Ж9034 и семя, включающие эти молекулы ДНК, являются аспектами этого изобретения.

Последовательности ДНК, которые включают область нового трансгена/вставки в геном, §ЕЦ ГО N0:3 и §ЕЦ ГО N0:4 (фиг. 1) из случая кукурузы М0№9034, являются аспектами этого изобретения. Растение кукурузы и семя, включающие эти молекулы, являются также аспектами этого изобретения.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предоставляются две молекулы ДНК для применения в способе обнаружения ДНК, причем первая молекула ДНК включает по крайней мере 11 или более непрерывных полинуклеотидов любой части области трансгена молекулы ДНК §ЕЦ ГО N0:3, а другая молекула ДНК имеет схожую длину любой части области 5' фланкирующей геномной ДНК кукурузы §ЕЦ ГО N0:3, причем эти молекулы ДНК при применении вместе пригодны в качестве ДНК-праймеров в способе амплификации ДНК, с помощью которого образуется ампликон. Ампликон, образованный с использованием этих ДНК-праймеры в способе амплификации ДНК, диагностирует случай кукурузы М0№9034, когда ампликон содержит §ЕЦ ГО N0:1. Любой ампликон, образованный с

- 4 022829 помощью ДНК-праймеров, гомологичных или комплементарных любой части 8ЕО ГО N0:3, и любой ампликон, который включает 8ЕЦ ГО N0:1, является аспектом настоящего изобретения.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предоставляются две молекулы ДНК для применения в способе обнаружения ДНК, причем первая молекула ДНК включает по крайней мере 11 или более непрерывных полинуклеотидов любой части области трансгена молекулы ДНК 8ЕЦ ГО N0:4, а другая молекула ДНК имеет схожую длину любой части 3' фланкирующей геномной ДНК кукурузы 8Е0 ГО N0:4, причем эти молекулы ДНК пригодны в качестве ДНК-праймеров в способе амплификации ДНК. Ампликон, образованный с использованием этих ДНК-праймеров в способе амплификации ДНК, диагностирует случай кукурузы М0Ж9()34. когда ампликон содержит 8Е0 ГО N0:2. Любой ампликон, образованный с помощью ДНК-праймеров, гомологичных или комплементарных любой части 8Е0 ГО N0:4, и любой ампликон, который включает 8Е0 ГО N0:2, является аспектом настоящего изобретения.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предоставляются способы обнаружения присутствия ДНК, соответствующей случаю кукурузы М0№9034, в образце. Такие способы включают (а) приведение в контакт образца, включающего ДНК, с набором праймеров, который при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК из случая кукурузы М0Ж9034 приводит к образованию ампликона, который является диагностическим в отношении случая кукурузы М0Ж9034; (Ь) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, образуя тем самым ампликон; и (с) обнаружение ампликона, причем указанный ампликон включает 8Е0 ГО N0:1 или 8Е0 ГО N0:2.

Предоставляется растение кукурузы или семя, или продукт, получаемый из растения или семени М0№9034, причем геномная ДНК включает молекулу ДНК, по существу состоящую из 8ЕЦ ГО N0:5 и ее комплементов. Предоставляется растение кукурузы или семя, или продукт, получаемый из растения или семени М0№9034, в которых геномная ДНК, выделенная из растения кукурузы или семени, или продукта, включает молекулу ДНК, включающую нуклеотиды 2061-11305 8Е0 ГО N0:5, и их комплементы.

Предоставляется растение кукурузы или семя, или продукт, получаемый из растения или семени М0№9034, в которых геномная ДНК, выделенная из растения кукурузы или семени, или продукта, приводит к образованию ампликона в способе амплификации ДНК, причем в способе амплификации ДНК используются молекулы ДНК-праймеров 8Е0 ГО N0:6 и 8Е0 ГО N0:7.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предоставляются способы обнаружения присутствия ДНК, соответствующей случаю М0№9034, в образце, при этом такие способы включают: (а) приведение в контакт образца, включающего ДНК, с зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с геномной ДНК из случая кукурузы М0Ж9034 и не гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК контрольного растения кукурузы; (Ь) подвергание образца и зонда жестким условиям гибридизации; и (с) обнаружение гибридизации зонда с ДНК случая кукурузы М0№9034, причем указанный зонд включает 8Е0 ГО N0:1 и 8Е0 ГО N0:2.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ определения зиготности потомства случая кукурузы М0№9034, включающий: (а) приведение в контакт образца, включающего ДНК кукурузы, с набором праймеров, включающим 802842 (8ЕЦ ГО N0:6), 802843 (8Е0 ГО N0:7), 806523 (8Е0 ГО N0:10), 8Ц6524 (8ЕО ГО N0:11), РВ880 (8ЕО ГО N0:14) и РВ2931 (8ЕО ГО N0:15), который при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК из случая кукурузы М0Ж9034 приводит к образованию первого ампликона, который является диагностическим в отношении случая кукурузы М0Ж9034; и (Ь) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, образуя тем самым первый ампликон; и (с) обнаружение первого ампликона; и (ά) приведение в контакт образца, включающего ДНК кукурузы, с указанным набором праймеров, который при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК из растений кукурузы приводит к образованию второго ампликона, включающего встречающуюся в природе кукурузную геномную ДНК, гомологичную кукурузной геномной области вставки трансгена, идентифицируемой как случай кукурузы М0Ж9034; и (е) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, образуя тем самым второй ампликон; и (Г) обнаружение второго ампликона; и (д) сравнение первого и второго ампликонов в образце, причем присутствие обоих ампликонов указывает на то, что образец является гетерозиготным по вставке трансгена.

Одним аспектом настоящего изобретении является обеспечение в пище чешуекрылого вредителя инсектицидно эффективного количества случая кукурузы М0Ж9034.

Другим аспектом настоящего изобретении является предоставление композиции или биологического образца в форме продукта или пищевого продукта, получаемого из случая кукурузы М0№9034, продукта или пищевого продукта, включающего колоски кукурузы, очищенную от шелухи кукурузу, кукурузный шелк, кукурузную пыльцу, подвергнутую дроблению кукурузу, кукурузную муку крупного помола, размельченную кукурузу, кукурузную муку, кукурузное масло, кукурузный крахмал, жидкий кукурузный экстракт, кукурузный солод, кукурузный сахар, кукурузный сироп, маргарин, получаемый из кукурузного масла, ненасыщенного кукурузного масла, насыщенного кукурузного масла, кукурузные хлопья, попкорн, этанол и/или напиток, полученные из кукурузы или продуктов кукурузы, включающих ДНК, которая является диагностической в отношении случая кукурузы М0№9034, сухие продовольст- 5 022829 венные товары из барды (ΌΌΟ8), получаемые при ферментации такого случая кукурузы, и корма для животных, включающие такие ΌΌΟ8 и/или кукурузу, независимо от того является она целой, подвергнутой дроблению или измельчению, подвергнутые технологической обработке пищевые продукты, косметическое средство и наполнитель, в которых обнаруживается определяемое количество полинуклеотида, который является диагностическим в отношении присутствия случая трансгенной кукурузы ΜΟΝ89034 в биологическом образце. Альтернативным способом предоставления кукурузы в качестве пищевого продукта является предоставление кукурузы в различных формах зерна для питания, таких как целая кукуруза, подвергнутая дроблению кукуруза, подвергнутая измельчению кукуруза, и различных формах вышеотмеченного в смеси с сорго, почечным салом, просом, подсолнечником, овсом, пшеницей, рисом, бобами и т.п. Определяемые количества в таком продукте или пищевом продукте нуклеотидной последовательности, такой как та, которая определена в ЗЕО ГО N0:1 или ЗЕО ГО N0:2, или их комплементах, диагностируют присутствие ДНК такого трансгенного случая ΜΟΝ89034 в образце, и, следовательно, присутствие клеток трансгенного случая в качестве источника ДНК в образце.

Вышеотмеченные и другие аспекты настоящего изобретения станут более явными из следующего подробного описания.

Чертежи

На чертеже показана организация вставки трансгена, присутствующей в геноме случая трансгенной кукурузы ΜΟΝ89034. Центральная открытая или белая полоса представляет собой вставленную ДНК. Ниже белой полосы находится схема, представляющая собой различные элементы во вставленной ДНК. Концы вставленной ДНК произвольно обозначены как 5' (с левой стороны фигуры) и 3' (с правой стороны фигуры). Правая краевая и левая краевая последовательности или сегменты отмечены под каждым концом схемы, иллюстрирующей различные элементы во вставленной ДНК. Отмеченными элементами в экспрессионных кассетах в пределах вставленной ДНК являются, в следующем порядке, начиная с правого края: промотор е35З, нетраслируемая лидерная последовательность САВ пшеницы, интрон актина риса, кодирующая Сгу1А.105 последовательность, 3' последовательность терминации и полиаденилирования НЗР17 пшеницы, промотор ЕМУ, интрон Ькр70, последовательность, кодирующая пептид для переноса в хлоропласт небольшой субъединицы РнЬЕсо. кодирующая Сту2АЬ последовательность, иначе не указанная 3' последовательность терминации и полиаденилирования и затем левый край. Вертикально огороженные полосы с каждого из двух концов центральной открытой или белой полосы соответствуют произвольно обозначенным 5' и 3' фланкирующим последовательностям генома кукурузы. Самая длинная черная линия над огороженными полосами и открытой или белой полосой представляет собой ЗЕО ГО N0:5 (полноразмерную последовательность, представленную на фигуре, отображающую 5' фланкирующую последовательность, последовательность вставленной ДНК и 3' фланкирующую последовательность). Более короткие черные линии выше и ниже черной линии, отмеченной как ЗЕО ГО N0:5, представляют собой приблизительные местоположения в пределах ЗЕО ГО N0:5, в которых можно обнаружить каждую из специально отмеченных последовательностей (т.е. ЗЕО ГО N0:1, ЗЕО ГО N0:2, ЗЕО ГО N0:3 и ЗЕО ГО N0:4). ЗЕО ГО N0:1 и ЗЕО ГО N0:2 и любая последовательность, происходящая из случая кукурузы М0№9034, содержащая ЗЕО ГО N0:1 и/или ЗЕО ГО N0:2, являются диагностическими в отношении присутствия ДНК случая кукурузы М0Ж9034 в биологическом образце.

Подробное описание изобретения

Следующие определения и способы предоставлены для лучшего определения настоящего изобретения и направления специалистов со средним уровнем компетентности в данной области техники при осуществлении на практике настоящего изобретения. Если не отмечено иное, термины следует понимать в соответствии с общепринятым употреблением специалистами со средним уровнем компетентности в релевантной области техники. Определения общих терминов молекулярной биологии можно также найти у Кшдет и др. (О1оккагу оГ Оеиебск: С1акыса1 аиб Мо1еси1аг, 5'¹' ебйюи, Зргшдег-Уег1ад: №ν Уотк, 1991) и ЬеМи (Оепек V., 0хТотб ишуеткйу Рге88: №ν Уотк, 1994).

Как здесь используется, термин кукуруза означает 2еа таук или маис и включает все сорта растения, которые можно вывести из кукурузы, в том числе дикие виды кукурузы.

Как здесь используется, термин включающий означает включающий, но без ограничения.

Трансгенный случай получают трансформацией клеток растения гетерологичной ДНК, т.е. конструкцией нуклеиновой кислоты, которая включает представляющий интерес трансген, регенерацией популяции растений, являющейся результатом вставки трансгена в геном растения, и отбором конкретного растения, характеризующегося вставкой в конкретное местоположение генома. Термин случай относится к первоначальному трансформанту и потомству трансформанта, которые содержат гетерологичную ДНК. Термин случай также относится к потомству, получаемому с помощью полового ауткроссинга между трансформантом и другим сортом, которое содержит гетерологичную ДНК. Даже после повторного обратного скрещивания до возвратного родителя вставленная ДНК и фланкирующая ДНК из трансформированного родителя присутствует в потомстве от скрещивания в том же самом местоположении в хромосоме. Термин случай также относится к ДНК из первоначального трансформанта, включающей вставленную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно примыкающую к вставленной ДНК, которая, как следовало бы ожидать, передается потомству, получающему вставлен- 6 022829 ную ДНК, включающую представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания родительской линии, содержащей вставленную ДНК, (например, первоначального трансформанта и потомства, являющегося результатом самоопыления) и родительской линией, не содержащей вставленной ДНК. Настоящее изобретение относится к ДНК случая ΜΟΝ89034, клеткам растения, тканям, семенам и подвергнутым технологической обработке продуктам, получаемым из ΜΟΝ89034.

Также следует понимать, что два различных трансгенных растения можно также скрестить с получением потомков, которые содержат два независимо добавленных расщеплением, экзогенных гена. При самоопылении соответствующего потомства можно получить растения, гомозиготные по обоим добавленным, экзогенным генам. В качестве вегетативного размножения также предусматриваются обратное скрещивание до родительского растения и ауткроссинг с нетрансгенным растением. Описания других способов скрещивания, обычно используемых для различных признаков и сельскохозяйственных культур, можно найти в одной из нескольких ссылок, например, Рейт, в Втеейшд Ме!йойк ίοτ СиЙтаг Эсус1ортеп!, ^йсох ί. ей., Атепсап 8ос1е!у о£ Адгопоту, Май1коп XVI (1987).

Зонд представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, к которой присоединена традиционная определяемая метка или репортерная молекула, например, радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентный агент или фермент. Такой зонд комплементарен цепи нуклеиновой кислоты-мишени, в случае настоящего изобретения цепи геномной ДНК случая кукурузы ΜΟΝ89034 или из растения кукурузы, или из образца, который включает ДНК этого случая. Зонды в соответствии с настоящим изобретением включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие зондовые вещества, которые специфически связываются с последовательностью ДНК-мишенью и могут использоваться для обнаружения присутствия этой последовательности ДНК-мишени.

Праймеры представляют собой выделенные нуклеиновые кислоты, которые подвергаются отжигу с комплементарной цепью ДНК-мишенью с помощью гибридизации нуклеиновых кислот с образованием гибрида между праймером и цепью ДНК-мишенью, затем подвергаются удлинению вдоль цепи ДНКмишени полимеразой, например ДНК-полимеразой. Пара праймеров настоящего изобретения относится к их применению для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, например с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других традиционных способов амплификации нуклеиновой кислоты.

Длина зондов и праймеров составляет, как правило, 11 нуклеотидов или более, предпочтительно 18 нуклеотидов или более, более предпочтительно 24 нуклеотида или более и наиболее предпочтительно 30 нуклеотидов или более. Такие зонды и праймеры специфически гибридизуются с последовательностьюмишенью в условиях гибридизации высокой жесткости. Предпочтительно, последовательности зондов и праймеров в соответствии с настоящим изобретением полностью сходны с последовательностьюмишенью, хотя с помощью традиционных способов можно создать зонды, которые отличаются от последовательности-мишени и сохраняют способность гибридизоваться с последовательностями-мишенями.

Способы приготовления и использования зондов и праймеров описаны, например, в Мо1еси1аг С1оп1пд: А йаЬогаЮгу Мапиа1, 2^пй ей., уо1.1-3, ей. 8атЪтоок е! а1., Со1й Зрппд Натйог йаЬогаЮгу Ргекк, Со1й Зртшд НагЪог, ΝΥ, 1989 (ниже ЗатЪтоок е! а1., 1989); СиггеШ Рго!осо1к щ Мо1еси1аг Вю1оду, ей. АикиЪе1 е! а1., Огеепе РиЪйкЫпд апй V^1еу-Iпίе^κс^епсе, №ν Υο^к. 1992) (с периодическими обновлениями) (ниже АикиЪе1 е! а1., 1992) и Ιππίκ е! а1., РСК Рго!осо1к: А дшйе !о Ме!йойк апй Аррйсайопк, Асайепис Ргекк: 8ап П1едо, 1990. Пару ПЦР-праймеров можно получить из известной последовательности, например, с помощью компьютерных программ, предназначенных для этой цели, таких как Рптег (версии 0.5, ©1991, Χνΐιί^Ι^^ 1пкШи1е £от Вютейюа1 Кекеатсй, СатЪпйде, МА).

Праймеры и зонды, основанные на фланкирующих ДНК и последовательностях вставок, раскрытых здесь, можно использовать для подтверждения (и, если необходимо, для корректировки) раскрытых последовательностей с помощью традиционных способов, например с помощью повторного клонирования и секвенирования таких последовательностей.

Зонды и праймеры настоящего изобретения в виде нуклеиновых кислот гибридизуются в жестких условиях с последовательностью ДНК-мишенью. Для установления присутствия ДНК трансгенного случая в образце можно использовать любой традиционный способ гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот. Молекулы нуклеиновых кислот или их фрагменты способны специфически гибридизоваться с другими молекулами нуклеиновых кислот при определенных обстоятельствах. Как здесь используется, говорят, что две молекулы нуклеиновых кислот способны специфически гибридизоваться друг с другом, если две молекулы способны образовывать антипараллельные, двухцепочечные структуры нуклеиновых кислот. Говорят, что молекула нуклеиновой кислоты является комплементом другой молекулы нуклеиновой кислоты, если они проявляют полную комплементарность. Как здесь используется, говорят, что молекулы проявляют полную комплементарность, если каждый нуклеотид одной молекулы комплементарен нуклеотиду другой молекулы. Говорят, что две молекулы в минимальной степени комплементарны, если они гибридизуются друг с другом с прочностью, достаточной для того, чтобы позволить им оставаться подвергнутыми отжигу друг с другом в по крайней мере общепринятых условиях низкой жесткости. Аналогично, говорят, что молекулы комплементарны, если они гибридизуются друг с другом с прочностью, достаточной для того, чтобы позволить им оставаться подвергнуты- 7 022829 ми отжигу друг с другом в общепринятых условиях высокой жесткости. Общепринятые условия жесткости описываются 8атЬгоок и др. 1989, и Наутек и др. в ШсЮс Λοίά НуЬпШ/абоп. А Ргасйса1 Арргоасй, 1КЬ Ргекк, ХУакИтЦогг ΌΟ (1985). Следовательно, отходы от полной комплементарности допустимы, пока такие отходы не исключают полностью способность молекул образовывать двухцепочечные структуры. Для службы молекулы нуклеиновой кислоты в качестве праймера или зонда требуется только, чтобы ее последовательность была достаточно комплементарна для того, чтобы она могла образовывать стабильную двухцепочечную структуру в конкретных используемых растворителе и концентрациях соли.

Как здесь используется, в значительной степени гомологичная последовательность представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая будет специфически гибридизоваться с комплементом последовательности нуклеиновой кислоты, с которой ее сравнивают, в условиях высокой жесткости. Соответствующие условия жесткости, которые содействуют гибридизации ДНК, например 6,0хнатрия хлорид/натрия цитрат (88С) при 45°С с последующей промывкой 2,0 88С при 50°С, хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам, и их можно найти в Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп \УПеу & 8опк, Ν.Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6. Например, концентрацию соли на стадии промывки можно выбрать от низкой жесткости, составляющей приблизительно 2,0х88С при 5°С, до высокой жесткости, составляющей приблизительно 0,2х88С при 50°С. Кроме того, температуру на стадии промывки можно увеличить от условий низкой жесткости при комнатной температуре, приблизительно 22°С, до условий высокой жесткости при приблизительно 65°С. Как температура, так и концентрация соли могут варьировать, или может оставаться постоянной или температура, или концентрация соли, в то время как другая переменная будет меняться. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота настоящего изобретения будет специфически гибридизоваться с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, определенными в 8ЕЦ ГО N0:1 и 2, или их комплементами или фрагментами тех или других в умеренно жестких условиях, например в приблизительно 2,0х88С и при приблизительно 65°С. В особенно предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота настоящего изобретения будет специфически гибридизоваться с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, определенными в 8Е0 ГО N0:1 и 8ЕЦ ГО N0:2 или их комплементами или фрагментами тех или других в условиях высокой жесткости. В одном аспекте настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения имеет последовательность нуклеиновой кислоты, определенную в 8Е0 ГО N0:1 и 8ЕЦ ГО N0:2 или их комплементах или фрагментах тех или других. В другом аспекте настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения идентична на 80-100% или 90-100% последовательности нуклеиновой кислоты, определенной в 8Е0 ГО N0:1 и 8ЕЦ ГО N0:2, или ее комплементу или фрагментам той или другой. В дополнительном аспекте настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения идентична на 95-100% последовательности, определенной в 8Е0 ГО N0:1 и 8ЕЦ ГО N0:2, или ее комплементу или фрагментам той или другой. 8Е0 ГО N0:1 и 8ЕЦ ГО N0:2 можно использовать в качестве маркеров в способах скрещивания растений для идентификации потомства от генетических скрещиваний, схожих со способами, описанными для простого анализа ДНК-маркера в виде повтора последовательности в ^NА-та^ке^к: Рго1осо1к, аррйсайопк, апб оуег\ае\ук: (1997) 172-185, Сгедап, е! а1., ебк., ^Пеу-Пкк NΥ; все из которых полностью включены сюда посредством ссылки. Гибридизацию зонда с молекулой ДНК-мишенью можно обнаружить с помощью любого ряда способов, известных квалифицированным в данной области техники специалистам, они могут включать, но без ограничения, флуоресцентные метки, радиоактивные метки, метки на основе антител и хемилюминесцентные метки.

В отношении амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени (например, с помощью ПЦР) с использованием конкретной пары праймеров для амплификации жесткими условиями являются условия, которые делают возможной гибридизацию пары праймеров только с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишенью, с которой связывался бы праймер, имеющий соответствующую последовательность дикого типа (или ее комплемент), и предпочтительно образование уникального продукта амплификации, ампликона, в термической реакции амплификации ДНК.

Термин специфический для (последовательности-мишени) означает, что зонд или праймер гибридизуется в жестких условиях гибридизации только с последовательностью-мишенью в образце, включающем последовательность-мишень.

Как здесь используется, амплифицированная ДНК или ампликон относится к продукту амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, которая является частью матрицы - нуклеиновой кислоты. Например, для определения того, содержит ли растение кукурузы, являющееся результатом полового скрещивания, геномную ДНК трансгенного случая из растения кукурузы настоящего изобретения, ДНК, экстрагированную из образца ткани растения кукурузы, можно подвергнуть способу амплификации нуклеиновой кислоты с использованием пары праймеров, которая включает праймер, происходящий из фланкирующей последовательности в геноме растения, примыкающей к сайту вставки вставленной гетерологичной ДНК, и второй праймер, происходящий из вставленной гетерологичной

- 8 022829

ДНК, для образования ампликона, который является диагностическим в отношении присутствия ДНК случая. Ампликон имеет длину и последовательность, которые также диагностируют этот случай. Длина ампликона может находиться в диапазоне от объединенной длины пар праймеров плюс одна пара оснований нуклеотидов, предпочтительно плюс приблизительно пятьдесят пар оснований нуклеотидов, более предпочтительно плюс приблизительно двести пятьдесят пар оснований нуклеотидов и даже более предпочтительно плюс приблизительно четыреста пятьдесят пар оснований нуклеотидов. В альтернативном случае пара праймеров может происходить из фланкирующей последовательности с обеих сторон вставленной ДНК для того, чтобы образовать ампликон, который включает нуклеотидную последовательность всей вставки. Член пары праймеров, происходящий из геномной последовательности растения, может находиться на расстоянии от молекулы вставленной ДНК, это расстояние может находиться в диапазоне от одной пары оснований нуклеотидов до приблизительно двадцати тысяч пар оснований нуклеотидов. Использование термина ампликон, в частности, исключает димеры праймеров, которые могут образоваться в термической реакции амплификации ДНК.

Амплификацию нуклеиновой кислоты можно проводить любым из различных способов амплификации нуклеиновых кислот, известных в данной области техники, включающих полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Множество способов амплификации известно в данной области техники и описано, между прочим, в патентах США № 4683195 и 4683202 и в РСК Рго!осо1к: А Ошбе 1о Мебюбк аиб Аррйсаΐΐοηδ, еб. Ιηηίκ е! а1, Асабетю Ргекк, 8аи Э1едо, 1990. Разработаны способы амплификации с помощью ПЦР для амплификации до 22 т.о. геномной ДНК и до 42 т.о. ДНК бактериофага (Сйеид е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А 91: 5695-5699, 1994). Эти способы, а также другие способы, известные в области амплификации ДНК, можно использовать для осуществления на практике настоящего изобретения. Последовательность вставки гетерологичной ДНК или фланкирующую последовательность случая кукурузы ΜΟΝ89034 с образцами семян, депонированными в виде номеров АТСС, можно подтвердить (и скорректировать, если необходимо) с помощью амплификации таких последовательностей указанного случая, используя праймеры, происходящие из последовательностей, предоставленных здесь, с последующим стандартным секвенированием ДНК полученного с помощью ПЦР ампликона или клонированной ДНК.

Ампликон, образованный с помощью этих способов, можно обнаружить с помощью множества методов. Одним из таких методов является анализ генетических двоичных знаков (ШОГогоу, е! а1. №1с1ею Ас1б Кек. 22: 4167-4175, 1994), при котором конструируют ДНК-олигонуклеотид, который перекрывает как примыкающую фланкирующую геномную последовательность ДНК, так и вставленную последовательность ДНК. Олигонуклеотид иммобилизуют в лунках микролуночного планшета. После проведения ПЦР представляющей интерес области (с использованием одного праймера из вставленной последовательности и другого праймера из примыкающей фланкирующей геномной последовательности) одноцепочечный продукт ПЦР может гибридизоваться с иммобилизованным олигонуклеотидом и служить в качестве матрицы для реакции удлинения на одно основание с использованием ДНК-полимеразы и меченных ббКТР, специфичных для следующего ожидаемого основания. Считывание может быть на основе флуоресценции или ЕЬТЗА. Сигнал означает присутствие вставки/фланкирующей последовательности вследствие успешной амплификации, гибридизации и удлинения на одно основание.

Другим методом является метод пиросеквенирования, описанный \Утде (1ииоу. Рйатта. Тесй. 00: 18-24, 2000). В этом методе конструируют олигонуклеотид, который перекрывает стык примыкающей геномной ДНК и ДНК вставки. Олигонуклеотид гибридизуется с одноцепочечным продуктом ПЦР представляющей интерес области (с использованием одного праймера из вставленной последовательности и другого праймера из фланкирующей геномной последовательности) и подвергается инкубации в присутствии ДНК-полимеразы, АТР, сульфурилазы, люциферазы, апиразы, аденозин-5'-фосфосульфата и люциферина. бЭТР добавляют индивидуально, и включение приводит к световому сигналу, который измеряют. Световой сигнал означает присутствие вставки трансгена/фланкирующей последовательности вследствие успешной амплификации, гибридизации и удлинения на одно или несколько оснований.

Поляризация флуоресценции, описанная Сйеи и др. (Оепоте Кек. 9: 492-498, 1999) представляет собой метод, который можно использовать для обнаружения ампликона настоящего изобретения. Используя этот метод, конструируют олигонуклеотид, который перекрывает стык геномной фланкирующей и вставленной ДНК. Олигонуклеотид гибридизуется с одноцепочечным продуктом ПЦР представляющей интерес области (с использованием одного праймера из вставленной последовательности и другого праймера из фланкирующей геномной последовательности ДНК) и подвергается инкубации в присутствии ДНК-полимеразы и флуоресцентно меченных ббКТР. Удлинение на одно основание приводит к включению ббЭТР. Включение можно определить в виде изменения поляризации, используя флуориметр. Изменение поляризации означает присутствие вставки трансгена/фланкирующей последовательности вследствие успешной амплификации, гибридизации и удлинения на одно основание.

Тадтаи® (РЕ Аррйеб Вюкук!етк, Рок!ег Сйу, СА) описывается как метод обнаружения и количественного определения присутствия последовательности ДНК и полностью истолкован в инструкциях, предоставляемых производителем. Вкратце, конструируют олигонуклеотидный зонд РКЕТ, который перекрывает соединение геномной фланкирующей и вставленной ДНК. Зонд РКЕТ и праймеры для ПЦР (один праймер из последовательности ДНК вставки, а другой праймер из фланкирующей геномной по- 9 022829 следовательности) подвергаются процессу циклического повторения в присутствии термостабильной полимеразы и άΝΤΡ. Гибридизация зонда РКЕТ приводит к расщеплению и отделению флуоресцентной составляющей от гасящей составляющей зонда РКЕТ. Флуоресцентный сигнал означает присутствие фланкирующей последовательности/последовательности вставки трансгена вследствие успешной амплификации и гибридизации.

Молекулярные маячки описаны для применения для обнаружения последовательности, как описано Туаи§1 и др. (№Щпс Вю1се1т 14: 303-308, 1996). Вкратце, конструируют олигонуклеотидный зонд РКЕТ, который перекрывает стык фланкирующей геномной и вставленной ДНК. Уникальная структура зонда РКЕТ приводит к тому, что он обладает вторичной структурой, которая удержит флуоресцентную и гасящую составляющие на близком расстоянии. Зонд РКЕТ и праймеры для ПЦР (один праймер из последовательности ДНК вставки, а другой праймер из фланкирующей геномной последовательности) подвергаются процессу циклического повторения в присутствии термостабильной полимеразы и άΝΓΡ. После успешной амплификации с помощью ПЦР гибридизация зонда РКЕТ с последовательностью-мишенью приводит к устранению вторичной структуры зонда и пространственному разделению флуоресцентной и гасящей составляющих, что приводит к продукции флуоресцентного сигнала. Флуоресцентный сигнал означает присутствие фланкирующей последовательности/последовательности вставки трансгена вследствие успешной амплификации и гибридизации.

Другие описанные методы, такие как микроструйная техника (заявка на патент США 2006068398, патент США 6544734), обеспечивают способы и устройства для разделения и амплификации образцов ДНК. Описаны оптические красители, используемые для обнаружения и количественного определения специфических молекул ДНК (^0/05017181). Описаны нанотрубные устройства (^0/06024023), которые включают электронный детектор для обнаружения молекул ДНК, или наночастицы, которые связывают специфические молекулы ДНК и затем могут быть обнаружены.

Используя раскрытые здесь композиции, предоставляются наборы для обнаружения ДНК. Наборы пригодны для идентификации ДНК случая кукурузы Μ0Ν89034 в образце и могут использоваться по крайней мере в способах скрещивания растений кукурузы, содержащих ДНК соответствующего случая. Наборы содержат праймеры и/или зонды в виде ДНК, которые гомологичны или комплементарны сегментам, выбираемым из последовательностей, определенных в §ЕЦ ГО N0:1-7, или праймеры или зонды в виде ДНК, которые гомологичны или комплементарны ДНК, содержащейся в трансгенных генетических элементах ДНК, определенной в списке последовательностей. Эти последовательности ДНК могут использоваться в реакциях амплификации ДНК или в качестве зондов в способе гибридизации ДНК для обнаружения присутствия полинуклеотидов, являющихся диагностическими в отношении присутствия ДНК-мишени, в образце. Образование предопределенного ампликона в термической реакции амплификации ДНК диагностирует присутствие ДНК, соответствующей ДНК генома РТА-7455, в образце. Если гибридизация является избранной, обнаружение гибридизации зонда с биологическим образцом диагностирует присутствие ДНК трансгенного случая Μ0Ν89034 в образце. Как правило, образец представляет собой кукурузу или кукурузные продукты или побочные продукты использования кукурузы.

Настоящим изобретением предоставляется трансгенное растение кукурузы, обозначенное как случай кукурузы Μ0Ν89034, потомство этого растения и клетки этого растения, а также семя, полученное от этого растения. Типичные семена для выращивания этого растения для получения потомства, для получения клетки или для получения сельскохозяйственной культуры из указанных семян, которые включают случай трансгенной кукурузы, были депонированы 28 марта 2006 г. в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) и имеют номер поступления РТА-7455.

Растение, и клетки, и продукты, получаемые из этих вариантов осуществления, и т.п. содержат ДНК, которая является диагностической в отношении присутствия ДНК, происходящей из любой клетки, происходящей из случая трансгенной кукурузы Μ0Ν89034, в биологическом образце. Это происходит потому, что эти две новые последовательности содержатся в клетках случая трансгенной кукурузы Μ0Ν89034. Диагностическая ДНК включает нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО Ν0:1, 8ЕЦ ΙΌ ν0:2, §ЕЦ ΙΌ Ν0:3, 8ЕЦ ΙΌ Ν0:4 и 8ЕЦ ΙΌ Ν0:5. Связь этих последовательностей описывается здесь более конкретно и в надписи к фиг. 1 и со ссылкой на фиг. 1.

Растения кукурузы, развившиеся из семян, которые являются гомозиготными по ДНК, являющейся диагностической в отношении случая трансгенной кукурузы Μ0Ν89034, также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Растения кукурузы, развившиеся из семян, которые являются гетерозиготными по ДНК, являющейся диагностической в отношении случая трансгенной кукурузы Μ0Ν89034, также находятся в пределах объема настоящего изобретения до тех пор, пока эти семена также содержат диагностические последовательности ДНК. Клетки, семена и ткань, полученные из таких растений, содержащие диагностическую ДНК, также находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Растения кукурузы и клетки растения кукурузы и т.п, содержащие ДНК, являющуюся диагностической в отношении случая трансгенной кукурузы Μ0Ν89034, проявляют устойчивость к заражению чешуекрылыми насекомыми. Эти клетки и растения содержат ДНК, кодирующую инсектицидный белок (инсектицид, токсический агент) Сгу2АЬ, и ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность §ЕЦ ГО N0:1 и §ЕЦ ГО N0:2, которые образуют часть генома клеток растения. Эти растения и клетки растений

- 10 022829 также содержат ДНК, кодирующую инсектицидный белок (инсектицид, токсический агент) Сгу1А.1О5. Эти белки могут упоминаться как первый и второй инсектицидные белки, соответственно, или наоборот. Экспрессия этих белков происходит с регуляторных компонентов/генетических элементов, встроенных в экспрессирующие кассеты, обеспечивающие экспрессию каждой из последовательностей ДНК, которые кодируют эти токсины и полностью описаны здесь и в надписи к чертежу и со ссылкой на чертеж, и последовательность, определенную в 5>ЕО ГО N0:5. Для защиты растений от заражения чешуекрылыми насекомыми эффективны растения кукурузы и клетки растения кукурузы, включающие эти последовательности, независимо от того, являются ли они гетерозиготными или гомозиготными по аллелям, в которых эти кодирующие последовательности присутствуют.

Настоящим изобретением также предоставляются ампликоны, которые могут образовываться с описанных здесь последовательностей, которые являются диагностическими в отношении присутствия в биологическом образце ДНК, происходящей из ДНК случая трансгенной кукурузы Μ0Ν89034. Ампликон, который является диагностическим в отношении присутствия ДНК случая трансгенной кукурузы Μ0Ν89034 в биологическом образце, содержит по крайней мере один полинуклеотидный сегмент, состоящий из нуклеотидной последовательности, определенной в 5>Е0 ГО N0: 1 или 5>Е0 ГО N0:2. Эти ампликоны могут образовываться с использованием последовательностей праймеров, описанных здесь ниже, с любого биологического образца, который содержит по крайней мере приблизительно 0,5 фемтомоль или приблизительно 0,5 пикограмм ДНК, происходящей из случая трансгенной кукурузы Μ0Ν89034. Источниками ДНК, соответствующей случаю трансгенной кукурузы Μ0Ν89034, такого биологического образца может быть кукурузная мука крупного помола, кукурузное масло, кукурузная лепешка, кукурузное семя, зародыш кукурузы, кукурузный крахмал и кукурузная мука и т.п., происходящие из этого трансгенного случая.

Настоящим изобретением также предоставляются выделенные полинуклеотидные молекулы, демонстрирующие непрерывные нуклеотидные последовательности, такие как последовательности, определенные в 5>Е0 ГО N0:5. Эти непрерывные нуклеотидные последовательности включают (1) от приблизительно 11 до приблизительно 12000 нуклеотидов и любую промежуточную длину и, кроме того, включают непрерывные нуклеотиды, определенные в положениях нуклеотидов 1-11 или 9-20 в 5>Е0 ГО N0:1 и 1-11 или 9-20, указанных в 5>Е0 ГО N0:2; (2) любую непрерывную нуклеотидную последовательность, определенную в 5>Е0 ГО N0: 3 длиной от приблизительно 11 до приблизительно 2000 нуклеотидов или любой промежуточной длины, и, кроме того, включают непрерывные нуклеотиды, определенные в положениях нуклеотидов 1-11 или 9-20, указанных в 5>Е0 ГО N0:1; любую непрерывную нуклеотидную последовательность, определенную в 5>Е0 ГО N0:4 длиной от приблизительно 11 до приблизительно 914 нуклеотидов и любой промежуточной длины, и, кроме того, включают непрерывные нуклеотиды, определенные в положениях нуклеотидов 1-11 или 9-20, указанных в 5>Е0 ГО N0:2. Эти выделенные полинуклеотидные молекулы пригодны в способах амплификации ДНК для образования одного или нескольких ампликонов с биологического образца, содержащего кукурузную ДНК. Обнаружение такого ампликона диагностирует присутствие ДНК случая трансгенной кукурузы Μ0№9034 в образце. Выделенные полинуклеотидные молекулы также пригодны в различных способах обнаружения нуклеотидов для обнаружения присутствия ДНК, происходящей из случая трансгенной кукурузы Μ0№9034, в биологическом образце. В частности, в качестве зондов в таких способах обнаружения ДНК трансгенного случая Μ0№9034 в образце пригодны полинуклеотидные зонды, включающие по крайней мере приблизительно 11 непрерывных нуклеотидов, определенных в 5>Е0 ГО N0:1 или 5>Е0 ГО N0:2. Комплементарные последовательности этих выделенных полинуклеотидных молекул также пригодны для тех же способов обнаружения и/или амплификации.

Настоящим изобретением также предоставляются наборы, используемые для обнаружения присутствия ДНК, происходящей из случая трансгенной кукурузы Μ0№9034, в биологическом образце. В наборе используется зонд в виде полинуклеотидной молекулы, молекула зонда, содержащая по крайней мере от приблизительно 11 до приблизительно 12000 непрерывных нуклеотидов, в значительной степени гомологичная или в значительной степени комплементарная нуклеотидному сегменту, включающему последовательность, определенную в 5>Е0 ГО N0:5, была бы пригодна для обнаружения присутствия ДНК Μ0№9034 в образце. Молекула зонда должна содержать по крайней мере одну из последовательностей, определенных в 5>Е0 ГО N0:1 и 5>Е0 ГО N0:2. Последовательности, определенные в 5>Е0 ГО N0:1 и 5>Е0 ГО N0:2, могут также упоминаться как последовательности стыка, т.е. последовательности на одном из двух концов трансгенной ДНК, вставленной в растение кукурузы для получения случая трансгенной кукурузы Μ0№9034. Эти последовательности, произвольно упоминаемые как 5'- и 3'концы соответственно, содержат часть вставленной последовательности ДНК и часть фланкирующей геномной последовательности кукурузы. Например, 5>Е0 ГО N0:1 воспроизводит на своей 5'-половине 3'конец геномной последовательности кукурузы, фланкирующей 5'-конец вставленной ДНК, 5'-конец вставленной ДНК, представленный 3'-концевой половиной последовательности, определенной в 5>Е0 ГО N0:1. 5>Е0 ГО N0:2 воспроизводит на своей 5'-половине 3'-конец вставленной ДНК и на своей 3'концевой половине 5'-конец геномной последовательности кукурузы, фланкирующей 3'-конец вставленной ДНК. Во встречающемся в природе геноме кукурузы в положении вставленной последовательности,

- 11 022829 определенной в 8ЕО ГО N0:5, фланкирующая последовательность на 5'-конце вставленной ДНК и фланкирующая последовательность на 3'-конце вставленной ДНК соединены, и молекула первого праймера, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной последовательности, определенной в 8Е0 ГО N0:3, (отличной от 21 нуклеотидов З'-конца 8Е0 ГО N0:3) и молекула второго праймера, которая гибридизуется с последовательностью, определенной в 8Е0 ГО N0:4, (отличной от 20 нуклеотидов 5'-конца 8Е0 ГО N0:4) будут приводить к образованию ампликона в термической реакции амплификации с матрицей, являющейся ДНК, отличной от ДНК М0Ж9034. что диагностирует отсутствие вставленной ДНК в М0Ж 9034, и те же праймеры будут приводить к образованию ампликона, который слегка больше чем 12000 нуклеотидов (в зависимости от положения праймеров во фланкирующих последовательностях, определенных в 8Е0 ГО N0:3 и 8Е0 ГО N0:4) при использовании ДНК М0Ж9034 в качестве матрицы.

Предоставляется набор для обнаружения последовательности стыка 8Е0 ГО N0:1 или 8Е0 ГО N0:2 случая кукурузы М0Ж9034 в биологическом образце. Набор содержит полинуклеотидный зонд, который представляет собой последовательность, выбираемую из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:1 или 8Е0 ГО N0:2 или их комплементов, или полностью комплементарен указанной последовательности, и также содержит пару праймеров для применения в реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Пара праймеров может упоминаться как первый праймер, состоящий из по крайней мере от приблизительно 15 до приблизительно 50 непрерывных нуклеотидов из части генома кукурузы 8Е0 ГО N0:3, и второй праймер, состоящий из по крайней мере от приблизительно 15 до приблизительно 50 непрерывных нуклеотидов, комплементарных части гетерологичной ДНК вставки 8Е0 ГО N0:5. Первый праймер пары полинуклеотидных праймеров специфически гибридизуется с обратно комплементарной последовательностью, соответствующей последовательности, определенной в 8Е0 ГО N0:3 от приблизительно положения нуклеотида 1 по приблизительно положения 2050, а второй праймер указанной пары полинуклеотидных праймеров специфически гибридизуется с последовательностью, определенной в 8Е0 ГО N0:5 от приблизительно положения нуклеотида 2060 по приблизительно положения нуклеотида 12208, и удлиняются в направлении друг к другу с образованием ампликона, который включает 8Е0 ГО N0:1, при этом указанный ампликон является диагностическим в отношении присутствия ДНК случая М0Ж9034 в образце. Отличная пара праймеров может упоминаться как первый праймер, состоящий из по крайней мере от приблизительно 15 до приблизительно 50 непрерывных нуклеотидов, комплементарных части генома кукурузы 8Е0 ГО N0:4, и второй праймер, состоящий из по крайней мере от приблизительно 15 до приблизительно 50 непрерывных нуклеотидов из части гетерологичной ДНК вставки 8Е0 ГО N0:5. Второй праймер пары полинуклеотидных праймеров специфически гибридизуется с обратно комплементарной последовательностью, соответствующей последовательности, определенной в 8Е0 ГО N0:5 от приблизительно положения нуклеотида 1 по приблизительно положения 11305, а первый праймер пары полинуклеотидных праймеров специфически гибридизуется с последовательностью, определенной в 8Е0 ГО N0:4 от приблизительно положения нуклеотида 21 по приблизительно положения нуклеотида 914, и удлиняются в направлении друг к другу с образованием ампликона, который включает 8Е0 ГО N0:2, при этом указанный ампликон является диагностическим в отношении присутствия ДНК случая М0Ж9034 в указанном образце.

Эти пары праймеров пригодны для образования ампликонов, которые включают или 8Е0 ГО N0:1, или 8Е0 ГО N0:2, согласно случаю, и, следовательно, являются диагностическими в отношении присутствия ДНК М0Ж9034 в биологическом образце. Эти ампликоны делают возможным обнаружение присутствия последовательности стыка, являющейся диагностической в отношении случая кукурузы М0№9034, в биологическом образце.

Также предоставляется способ образования и обнаружения ампликона, который является диагностическим в отношении ДНК случая трансгенной кукурузы М0№9034, в биологическом образце, содержащем ДНК кукурузы. Способ включает приведение в контакт биологического образца с двумя или более праймерами в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, затем обнаружение ампликона. Присутствие ампликона диагностирует ДНК указанного случая в образце до тех пор, пока ампликон содержит по крайней мере одну из непрерывных последовательностей, определенных в 8Е0 ГО N0:1 и 8Е0 ГО N0:2, в приблизительно положениях нуклеотидов 1-11 или 9-20, или комплементарные последовательности, соответствующие этим положениям.

Нуклеотидные последовательности, которые являются диагностическими в отношении присутствия случая трансгенной кукурузы М0Ж9034 в биологическом образце, можно также обнаружить, используя другие способы. Например, приведением в контакт биологического образца с подозрением на содержание ДНК М0Ж9034 с зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с одной или более нуклеотидными последовательностями, определенными в 8Е0 ГО N0:1 или 8Е0 ГО N0:2, подверганием образца и зонда жестким условиям гибридизации и затем обнаружением гибридизации зонда с нуклеотидной последовательностью. Обнаружение гибридизации диагностирует присутствие ДНК М0Ж9034 в образце.

Настоящим изобретением также предоставляются праймеры в виде полинуклеотидов для применения в образовании, в термической реакции амплификации, ампликона, который является диагностиче- 12 022829 ским в отношении присутствия ДНК случая кукурузы ΜΟΝ89034 в биологическом образце. Обычно праймеры предоставляются в парах, при этом члены пары праймеров упоминаются, для удобства, как первый праймер и второй праймер. Первый праймер может состоять из по крайней мере приблизительно 15 непрерывных нуклеотидов из части генома кукурузы, определенной в §ЕЦ ГО N0:3, а второй праймер может состоять из по крайней мере приблизительно 15 непрерывных нуклеотидов, комплементарных части гетерологичной ДНК вставки, определенной в §ЕЦ ГО N0:5. Эти два праймера приводили бы к образованию ампликона в термической реакции амплификации с матричной ДНК, полученной из ДНК случая кукурузы ΜΟΝ89034, который содержит полинуклеотидную последовательность, определенную в 8Е0 ГО N0:1. В альтернативном случае первый праймер может состоять из по крайней мере приблизительно 15 непрерывных нуклеотидов из части генома кукурузы, определенной в §ЕЦ ГО N0:4, а второй праймер может состоять из по крайней мере приблизительно 15 непрерывных нуклеотидов, комплементарных части гетерологичной ДНК вставки, определенной в §ЕЦ ГО N0:5. Эти два праймера приводили бы к образованию ампликона в термической реакции амплификации с матричной ДНК, полученной из ДНК случая кукурузы М0Ж9034. который содержит полинуклеотидную последовательность, определенную в §ЕЦ ГО N0:2.

Альтернативный способ обнаружения последовательности стыка случая кукурузы М0Ж9034 в биологическом образце, содержащем ДНК кукурузы, такую как §ЕЦ ГО N0:1 или §ЕЦ ГО N0:2, состоит из приведения в контакт образца с полинуклеотидным зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с одной из последовательностей стыка, подвергания образца и зонда жестким условиям гибридизации и обнаружения гибридизации зонда с последовательностью стыка. Обнаружение связывания/гибридизации зонда с последовательностью стыка является индикатором присутствия ДНК М0Ж9034 в биологическом образце. В пределах объема настоящего изобретения находится стабильно трансформированное растение кукурузы, ДНК из которого приводит к образованию ДНК-ампликона, включающего 8ЕЦ ГО N0:1 или §ЕЦ ГО N0:2, при подвергании способу, указанному здесь. Приводимые в качестве примеров последовательности праймеров, в частности, пары последовательностей праймеров, указаны здесь в примерах и в §ЕЦ ГО N0:6 и §ЕЦ ГО N0:7.

Альтернативный способ обнаружения присутствия ДНК случая кукурузы М0Ж9034 в биологическом образце может состоять из стадий приведения в контакт образца с зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК М0Ж9034 и не гибридизуется в жестких условиях гибридизации с геномной ДНК растения кукурузы, которая не является ДНК М0№9034, подвергания образца и зонда жестким условиям гибридизации и обнаружения гибридизации зонда с ДНК М0Ж9034. Подходящий для этого варианта осуществления зонд является последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:1 и §ЕЦ ГО N0:2, или комплементарен такой последовательности. Обнаружение гибридизации зонда с образцом диагностирует присутствие полинуклеотида случая кукурузы М0Ж9034 в образце. Биологическим образцом может быть любой образец, содержащий ДНК М0№9034, включающий, но без ограничения, кукурузное масло, кукурузную муку крупного помола, кукурузную муку, кукурузную клейковину, кукурузные лепешки, кукурузный крахмал, жидкий кукурузный экстракт, ткань кукурузы, клетки кукурузы, кукурузное зерно, пыльцу кукурузы, корневую ткань кукурузы, ΌΌ08 и даже этанол, продуцируемый в качестве побочного продукта сбраживания такой трансгенной кукурузы, до тех пор, пока образец содержит по крайней мере определяемое количество полинуклеотида, который является диагностическим в отношении присутствия случая М0Ж9034 в образце. Полинуклеотидный зонд может быть любым нуклеотидом, выбираемым из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты, рибонуклеиновой кислоты и аналога нуклеотида, и может быть помечен по крайней мере одним флуорофором, молекулой, содержащей радиоактивный изотоп, или молекулой типа гаптена, которую можно специфически обнаружить с помощью антитела или другой реакцией типа связывания.

Сорт кукурузы, содержащий ДНК, которая является диагностической в отношении присутствия ДНК трансгенного случая М0№9034, можно получить скрещиванием растения кукурузы, содержащего ДНК случая трансгенной кукурузы М0№9034, с растением кукурузы, отличным от случая М0№9034, для получения гибридного растения кукурузы, содержащего ДНК, которая является диагностической в отношении указанного случая. В пределах объема настоящего изобретения находится такое гибридное растение кукурузы, содержащее ДНК, которая является диагностической в отношении случая трансгенной кукурузы М0№9034, например семя, полученное от гибрида (пока оно содержит ДНК, являющуюся диагностической в отношении случая трансгенной кукурузы М0Ж9034) и пыльца, семяпочка, семя, корни или листья гибридного растения кукурузы М0№9034, также пока они содержат диагностические последовательности ДНК, и потомство, получаемое от таких вариантов осуществления настоящего изобретения.

Настоящим изобретением предоставляется способ защиты растения кукурузы от заражения чешуекрылыми насекомыми, включающий обеспечение в пище целевого вредителя - чешуекрылого насекомого одной или нескольких клеток трансгенного растения кукурузы, при этом каждая клетка растения кукурузы содержит в своем геноме полинуклеотид, соответствующий последовательности, определенной и в 8Е0 ГО N0:1, и в §ЕЦ ГО N0:2, и непрерывную нуклеотидную последовательность, определенную в

- 13 022829

8ЕО ΙΌ N0:5 между 8ЕЦ ΙΌ N0:1 и 8ЕЦ ГО N0:2. Дальнейшее кормление целевого чешуекрылого насекомого, которое питается такими клетками трансгенного растения кукурузы, подавляется на растении кукурузы, из которого происходят указанные клетки растения кукурузы.

Настоящим изобретением также предоставляются композиции, являющиеся токсичными для целевых чешуекрылых вредителей растений кукурузы. Композиция клеток трансгенного растения, обеспечиваемая в пище целевого вредителя - чешуекрылого насекомого, в которой каждая клетка трансгенного растения кукурузы содержит в своем геноме полинуклеотид, соответствующий последовательности, определенной и в 8Е0 ГО N0:1, и в 8ЕЦ ГО N0:2, вместе с непрерывной нуклеотидной последовательностью, определенной в 8Е0 ГО N0:5 между 8Е0 ГО N0:1 и 8ЕЦ ГО N0:2, эффективна для обеспечения защиты от заражения чешуекрылыми насекомыми растения кукурузы или клетки растения кукурузы до тех пор, пока растение кукурузы или клетка экспрессируют Сгу1А.1О5 и/или Сгу2АЬ2 с экспрессионных кассет, содержащихся в непрерывной нуклеотидной последовательности. Такие композиции, в форме семян трансгенной кукурузы, были депонированы в Американскую коллекцию типовых культур под номером поступления РТА-7455. Такие устойчивые к насекомым растения кукурузы, или их части, будут содержать ДНК в геноме клеток такого растения, которые имеют по крайней мере одну нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:4 и 8Е0 ГО N0:5. В объем настоящего изобретения также включены потомство и семя устойчивого к насекомым растения кукурузы, у которых имеются упоминаемые здесь диагностические последовательности. Такие устойчивые к насекомым растения кукурузы можно получить способом, включающим скрещивание случая трансгенного растения кукурузы М0Ж9034 с отличным растением кукурузы и отбор устойчивого к насекомым потомства с помощью анализа на по крайней мере одну нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:3, 8ЕЦ ГО N0:4 и 5ЕО ГО N0:5.

Случай устойчивой к насекомым трансгенной кукурузы М0Ж9034 можно объединить с другими трансгенными сортами кукурузы, такими как кукуруза, устойчивая к гербицидам, таким как глифосат, глюфосинат и диакамба и т.п., или кукуруза, устойчивая к уничтожающим корни насекомым в результате вставки последовательностей, кодирующих такие белки, как Р8149В1 и модифицированный Сгу3ВЬ, или другими сортами трансгенной кукурузы, устойчивой к заражению чешуекрылыми насекомыми в результате вставки последовательностей, кодирующих другие токсичные белки, такие как У1Р3а, Сгу1АЬ и Сгу1Ра, и т.п. Различные комбинации всех этих различных трансгенных случаев скрещивают с растениями кукурузы настоящего изобретения, т.е. случаем М0Ж9034. для получения улучшенных сортов гибридной трансгенной кукурузы, устойчивой к заражению жесткокрылыми и чешуекрылыми и устойчивой к выборочным гербицидам. Такие сорта проявляют улучшенные выход и свойства переносить засуху по сравнению с нетрансгенными сортами и трансгенными сортами с индивидуальным признаком.

Предоставляется способ получения растения кукурузы, устойчивого к заражению насекомыми, которое включает инсектицидно эффективное количество кодирующих токсины последовательностей, определенных в 8Е0 ГО N0:5. Способ включает выделение кодирующих токсины последовательностей из случая трансгенной кукурузы М0Ж 9034 и введение этих кодирующих последовательностей, по отдельности или вместе, в одну или несколько клеток кукурузы для получения трансгенных клеток кукурузы, содержащих эту одну или несколько кодирующих токсины последовательностей. Трансгенные клетки кукурузы затем выращивают (регенерируют) в трансгенные растения кукурузы, содержащие одну или несколько кодирующих последовательностей, и трансгенные растения затем проявляют устойчивость к заражению насекомыми.

Настоящим изобретением предоставляется способ определения зиготности ДНК трансгенного растения кукурузы, содержащего ДНК случая кукурузы М0№9034, по ДНК, которая является диагностической в отношении присутствия такой ДНК М0Ж9034 в биологическом образце. Способ состоит из, в качестве первой стадии, приведения в контакт образца с тремя различными праймерами, включающими 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:7 и 8Е0 ГО N0:10, которые при использовании вместе в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, включающей ДНК случая кукурузы М0№9034, приводят к образованию первого ампликона, который является диагностическим в отношении случая кукурузы М0№9034, а при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, включающей геномную ДНК кукурузу, отличную от ДНК М0№9034, приводят к образованию второго ампликона, который является диагностическим в отношении геномной ДНК кукурузы, отличной от ДНК М0Ж9034. Последующие стадии состоят из проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты и сравнения ампликонов, образованных во время термической реакции амплификации. Обнаружение присутствия обоих ампликонов диагностирует зиготность образца. Обнаружение только первого ампликона означает, что образец содержит только ДНК М0№9034, т.е. является гомозиготным образцом. Обнаружение только второго ампликона означает, что образец не содержит ДНК М0Ж9034. Обнаружение и первого ампликона, и второго ампликона вместе в образце означает, что (1) образец содержит гетерозиготную ДНК, что касается чистого образца, содержащего только гетерозиготный исходный материал, или (2) образец содержит и гомозиготную, и гетерозиготную ДНК исходного образца, или (3) образец содержит некоторую комбинацию гомозиготной, гетерозиготной ДНК и/или образцов, отличных от ДНК М0Ж9034.

- 14 022829

Настоящим изобретением также предоставляются растущие растения кукурузы, содержащие ДНК, являющуюся диагностической в отношении трансгенного ДНК-сегмента, вставленного в геном клеток растений кукурузы. ДНК в геноме клеток кукурузы включает какую-либо одну или все последовательности, выбираемые из группы, состоящей из:

(a) нуклеотидной последовательности, определенной в 5>ЕО ГО N0:5;

(b) обеих нуклеотидных последовательностей, определенных в 5>Е0 ГО N0:1 и 5>Е0 ГО N0:2;

(c) нуклеотидной последовательности, определенной в 5>Е0 ГО N0:3; и (б) нуклеотидной последовательности, определенной в 5>Е0 ГО N0:4.

Нижеследующие примеры включены для демонстрации примеров некоторых предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Квалифицированным в данной области техники специалистам должно быть понятно, что методы, раскрытые в нижеследующих примерах, представляют собой подходы, которые, как обнаружено авторами настоящего изобретения, хорошо функционируют при осуществлении на практике настоящего изобретения и поэтому могут считаться примерами предпочтительных вариантов его осуществления на практике. Однако квалифицированным в данной области техники специалистам в свете раскрытия настоящего изобретения должно быть понятно, что в конкретные раскрытые варианты осуществления настоящего изобретения можно внести много изменений, и все еще получить подобный или схожий результат, не выходя за пределы существа и объема изобретения.

Примеры

Пример 1.

В этом примере иллюстрируется конструирование и молекулярное свойство случая трансгенной кукурузы М0№9034.

Растение кукурузы М0Ж9034 получали с помощью процесса опосредуемой АдгоЬас1егшт трансформации линии самоопыляющейся кукурузы плазмидной конструкцией рМ0№8850 (экспрессионная кассета показана на чертеже). Используемый способ трансформации схож со способом, описанным в патенте США № 6603061. Плазмидная конструкция рМ0Ш8850 содержит экспрессирующиеся в растениях кассеты, связанные с регуляторными генетическими элементами, необходимыми для экспрессии инсектицидного белка Сгу1А.105 в клетках растения кукурузы. Клетки кукурузы регенерировали в целые растения кукурузы, состоящие из по крайней мере 23000 различных трансгенных случаев. Из популяции случаев отбирали индивидуальные трансгенные случаи (растения), которые демонстрировали целостность экспрессирующихся в растениях кассет и устойчивость к личинкам насекомых отряда Ьер1бор1ега, поддерживающим повреждение. Растение кукурузы, содержащее в своем геноме связанные экспрессирующиеся в растениях кассеты рМ0№8850, представляет собой аспект настоящего изобретения. После капитального анализа этих трансгенных случаев отобрали трансгенный случай М0Ж9034 на основе молекулярного свойства и отсутствия каких-либо нежелательных фенотипических или агрономических эффектов, вызванных нехваткой.

Последовательности генетических элементов трансгена, содержащиеся в геноме кукурузы М0Ж9034. как проиллюстрировано на чертеже, состоят из следующих элементов, при этом каждый из них находится в функциональной связи с каждым другим элементом. Во-первых, на произвольно определенном 5'-конце последовательности (т.е. около левой центральной части сегмента, изображенного на чертеже) отмечена часть правой краевой области (КБ) из АдгоЬас1егшт ШтеГааеик. За ней следует одна за другой экспрессионная кассета, состоящая из энхансерного промоторного элемента СаМУ.35§ (упоминаемого здесь как Р-СаМУ35§Еи, находящегося в положениях 2350-2651 5>Е0 ГО N0:5); нетранслируемая лидерная последовательность связывающего с хлорофиллом А/В белка пшеницы (упоминаемая здесь как Ь-Та.1ЬсЬ1, находящаяся в положениях 2678-2738 5>Е0 ГО N0:5); последовательность интрона актина риса (упоминаемая здесь как 1-0к.АсН, находящаяся в положениях 2755-3234 5>Е0 ГО N0:5); не встречающаяся в природе последовательность, кодирующая химерный ген Сгу1А.105 (находящаяся в положениях 3244-6777 5>Е0 ГО N0:5); и 3-концевая область из пшеницы (упоминаемая здесь как ТТа.Нкр17-1:1:1, находящаяся в положениях 6809-7018 5>Е0 ГО N0:5). Комбинация упомянутых выше элементов, отличных от краевой последовательности, при нахождении в растении кукурузы функционируют вместе с вызовом экспрессии инсектицидного белка Сгу1А.105. Эти элементы затем связывают одни за другими с другой экспрессионной кассетой, состоящей из следующих элементов: промотора Ещ\уог1 токаю (находящегося в положениях 7086-7649 5>Е0 ГО N0:5), лидерной последовательности Нкр70 2еа таук (упоминаемой здесь как Н8Р70 или 1-Нкр70, находящейся в положениях 7672-8475 5>Е0 ГО N0:5); и последовательности, кодирующей пептид для переноса в хлоропласт 2еа таук (упоминаемой здесь как СТР2 или Т§-§§И-СТР, находящейся в положениях 8492-8892 5>Е0 ГО N0:5). Эти функционально связанные сегменты затем связывают с нуклеотидной последовательностью, кодирующей инсектицидный белок Сгу2АЬ (находящейся в положениях 8893-10800 5>Е0 ГО N0:5), которая связана на своем 3'-конце с 3' нетранслируемой областью гена нопалинсинтазы А§гоЬас1егшт ЩтеГааеик (упоминаемой здесь как Т-АОК1и.иок-1:1:13, находящейся в положениях 10827-11377 5>Е0 ГО N0:5). Эти элементы, фланкирующие кодирующую Сгу2АЬ последовательность, функционируют вместе для управления экспрессии Сгу2АЬ при нахождении в растении кукурузы. За экспрессирующей Сгу2АЬ кассетой затем следует одна за другой нуклеотидная последовательность, состоящая из значительной части левой краевой

- 15 022829 области (ЬВ) из АдгоЬаОегшт ЦннеГаОепк.

ДНК-молекулы, пригодные для применения в качестве праймеров в способах амплификации ДНК, могут происходить из последовательностей генетических элементов вставки трансгена, содержащейся в случае Μ0Ν89034. Эти молекулы праймеров можно использовать в качестве части набора праймеров, который также включает молекулу ДНК-праймера, происходящую из генома случая, фланкирующего вставку трансгена.

Часть ДНК плазмиды μΜ0Ν38850, вставленная в геном кукурузы, приводящая к случаю трансгенного растения кукурузы Μ0Ν89034, состоящая из левого и правого краевых сегментов и двух связанных экспрессирующихся в растениях кассет (первой экспрессионной кассеты, кодирующей Сгу1А.105, и второй экспрессионной кассеты, кодирующей Сгу2АЬ, причем каждая кассета может быть взаимозаменяемой в отношении того, что она может быть предназначена быть первой или второй кассетой), между краевыми сегментами, была охарактеризована с помощью детальных молекулярных анализов. Эти анализы проводили для идентификации случаев, содержащих только один и целый вставленный сегмент, состоящий из краевых областей и двух желательных экспрессионных кассет между краевыми областями, (числа сайтов интеграции в пределах генома кукурузы), числа копий (числа копий используемой для трансформации ДНК в пределах одного локуса) и целостности вставленных генных кассет (т.е. отсутствия любой перестройки или вариации последовательности по сравнению с последовательностью, которая, как известно, присутствует в плазмиде μΜ0Ν38850). Были использованы молекулярные ДНК-зонды, которые включали интактную кодирующую Су1А.105 область и ее соответствующие регуляторные элементы, промоторы, интроны и последовательности полиаденилирования экспрессирующихся в растениях кассет, и ДНК-область основы плазмиды рΜ0N38850. Данные, полученные от анализов всех случаев, продемонстрировали, что Μ0Ν89034 содержит единственную вставку используемой для трансформации ДНК с одной копией экспрессирующей Сгу1А.105 кассетой. В геноме Μ0Ν89034 не обнаружено дополнительных элементов из трансформирующего вектора рΜ0N38850, связанных или несвязанных с интактными генными кассетами. Наконец, были проведены ПЦР и анализы последовательностей ДНК для определения 5' и 3' стыков вставки с геном растения, для подтверждения организации элементов в пределах вставки (см., например, чертеж) и определения полной последовательности ДНК, вставленной в геном растения кукурузы, приводящих к случаю трансгенной кукурузы Μ0Ν89034. Полная вставленная последовательность, вместе с частью фланкирующих последовательностей генома кукурузы с каждого из двух концов вставленной ДНК, изображена в последовательности, определенной в δΕΟ ГО Ν0:5.

Геномную ДНК из Μ0Ν89034 и нетрансгенную ДНК из кукурузы, отличной от Μ0Ν89034, (контрольную ДНК) выделяли из семени кукурузы, сначала, переработкой семени (до 200 семян) в тонкоизмельченный порошок во встряхивателе для краски НагЬй 5Ο-ΗΌ (НагЬП 1пс., СтснтаИ, 0Ыо). Вкратце, порошкообразное семя экстрагировали в буфер для экстракции (№ в каталоге ЕМ §с1епсе - 3700, ЕМ §с1епсе, 01ЬЬ51о\уп, №\у 1ег8еу, США), и ДНК осаждали из раствора изопропанолом (№ в каталоге 81дта - I0398, §1§та, δΐ. Ьошк, МО, США). Осажденную ДНК соскабливали в микроцентрифужную пробирку, содержащую 70% этанола. ДНК осаждали в микроцентрифуге при максимальной скорости (~14000 об/мин) в течение ~ 5 мин, сушили под вакуумом и повторно растворяли в буфере ТЕ (рН 8,0). ДНК затем хранили в холодильнике при 4°С. Квалифицированный в данной области специалист может модифицировать этот способ для выделения ДНК из одного семени кукурузы.

Приводимые в качестве примеров способы, используемые для идентификации случая Μ0Ν89034 в образце, описываются в ПЦР Тасрнап специфического для случая конечного положения, для которой примеры условий описываются в табл. 1 и 2. ДНК-праймерами, используемыми в этом анализе, являются праймеры δΟ2842 (δΕΟ ΙΌ Ν0:6), 8Ц2843 (δΕΟ ΙΌ Ν0:7), меченный 6ΡАΜ™ праймер РВ880 (δΕΟ ΙΌ Ν0:14) и меченный У1С™ праймер РВ2931 (δΕΟ ΙΌ Ν0:15). 6ΕΛΜ и У1С являются продуктами АррйеП Вю5у51ет5 (Ео^ег СПу, СА) в виде флуоресцентных красителей, присоединенными к ДНК-праймерам. В случае зондов ТА^ΜΛN® ΜΟΒ 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы Тад расщепляет зонд с 5'-конца, между флуорофором и гасителем. При гибридизации с цепью ДНК-мишенью гаситель и флуорофор достаточно разделяются в трехмерном пространстве с продуцированием флуоресцентного (длины волны возбуждения флуорофора) сигнала.

δρ2842 (δΕΟ ΙΌ Ν0:6) и δρ2843 (δΕΟ ΙΌ Ν0:7) при использовании в этих способах реакций с РВ880 (δΕΟ ГО Ν0:14) приводят к образованию ДНК-ампликона, который является диагностическим в отношении ДНК случая Μ0Ν89034. Контроли для этого анализа должны включать положительный контроль из кукурузы, содержащей ДНК случая Μ0Ν89034, отрицательный контроль из нетрансгенной кукурузы или из трансгенной кукурузы, отличной от случая Μ0Ν89034, и отрицательный контроль, который не содержит матричной ДНК.

δρ1564 (δΕΟ ΙΌ Ν0:17) и δρ1565 (δΕΟ ΙΌ Ν0:18) при использовании в этих способах реакций с РВ351 (δΕΟ ГО Ν0:21) приводят к образованию ампликона, который является диагностическим в отношении Сгу1А.105 в Μ0Ν89034.

Эти анализы оптимизируют для использования с системой для ПЦР АррПеП ΒΟδ^'Κ^πΐδ ОепеАтр РСК δу8ΐет 9700, или робоциклером δΙηιΕ^Η;, Μ1 Впдте, Регкт-ВНнег 9700, или термоциклером Εр- 16 022829 рспбогГ Ма§!егсус1ег ОгаЛепЬ Другие способы и устройства, известные квалифицированным в данной области техники специалистам, которые позволяют образовать ампликоны, которые идентифицируют ДНК случая М0Ж9034, находятся в пределах знаний в данной области техники.

Любой зонд, который специфически связывается с 8ЕЦ ГО N0:1 или ее идеально комплементарной последовательностью в биологическом образце и содержит по крайней мере 11 непрерывных нуклеотидов, определенных в 8ЕЦ ГО N0:1, или в качестве возможного случая обратно комплементарной последовательности в 8ЕЦ ГО N0:1, пока связывание может быть обнаружено, диагностирует присутствие ДНК случая кукурузы М0Ж9034 в этом образце. Любой зонд, который специфически связывается с 8ЕЦ ГО N0:2 или ее идеально комплементарной последовательностью в биологическом образце и содержит по крайней мере 11 непрерывных нуклеотидов, определенных в 8ЕЦ ГО N0:2, или в качестве возможного случая обратно комплементарной последовательности в 8ЕЦ ГО N0:2, пока связывание может быть обнаружено, диагностирует присутствие ДНК случая кукурузы М0Ж9034 в этом образце.

В пределах объема настоящего изобретения, как считается, находится любая пара праймеров, используемая или предназначенная для использования для образования ампликона с биологического образца, включающего ДНК кукурузы, и ампликон включает или §Е0 ГО N0:1, или §Е0 ГО N0:2, или в качестве возможного случая он включает обе эти последовательности. Любой такой ампликон, включающий или 8ЕЦ ГО N0:1, или §Е0 ГО N0:2, или обе эти последовательности, считается для раскрытых здесь целей настоящего изобретения диагностическим в отношении присутствия ДНК случая кукурузы М0Ж9034 в таком биологическом образце. Предоставляется следующий пример в качестве справки для квалифицированного в данной области техники специалиста.

Таблица 1. ПЦР Тасрпап специфического для случая кукурузы М0Ж9034 конечного положения

Стадия	Реагент	Количество	Комментарии
1	Свободная от нуклеаз вода	Добавить до конечного объема 10 мкл
2	2 X универсальная главная смесь (Αρρίΐεά Вго5у51ет5, каталожный # 4304437}	5 мкл	IX конечная концентрация
3	Праймеры 5р2842 (5Е<2 10 N0:6} и 502843 (5Е0 Ю ПО: 7), ресуспендированные в свободной от нуклеаз воде до концентрации 20 мкМ, каждый)	0,5 мкл	1,0 мкМ конечная концентрация
4	Меченный 6АМ™ праймер РВ380 (ЗЕО ΪΟΝΟΊ4) (ресуспендированный в свободной от нуклеаз воде до концентрации 10 мкМ)	0,2 мкл	0,2 мкМ конечная концентрация
5	Праймер внутреннего контроля 8(^2842 и праймер внутреннего контроля 5<32843	0,2 мкл	0,2 мкМ конечная концентрация
б	Экстрагированная ДНК (матрица): - Анализируемые образцы (индивидуальные листья) - Отрицательный контроль - Отрицательный контроль - Положительный контроль - Положительный контроль	3,0 мкл - 4-80 нг геномной ДНК - 4 нг геномной ДНК нетрансгенной кукурузы - без ДНК-матрицы (раствор, в котором ресуспендирована ДНК) - 4 нг геномной ДНК из известного случая гетерозиготной кукурузы ΜΟΝ89034 - 4 нг геномной ДНК из известного случая гомозиготной кукурузы ΜΟΝ89034	Разведенная в воде
7	Осторожно смешать, добавить !- 2 капли минерального масла на верх каждой реакции

Амплификацию ДНК можно наладить и провести с использованием любого способа термоцикличе- 17 022829 ского повторения, в том числе ручного манипулирования или электронно контролируемого манипулирования температурными стадиями и циклами. Для ведения следующих параметров циклического повторения использовались робоциклер ЗЦаЕщепе, Μ1 Епдше, Регкш-Е1тег 9700, или термоциклер ЕррепДогГ Μазΐе^сус1е^ СгаД|еп1, или система для ПЦР АррПеД Вюзуз1ешз СепеЛтр РСК §узΐет 9700, или термоциклеры Μ1 КезеагсЬ ΌΝΑ Епдте РТС-225. При проведении ПЦР в ЕррепДогГ Μазΐе^сус1е^ СгаД|еп1 или Μ1 Епдше термоциклер работал циклами рассчитанным образом. При использовании Регкш-Е1тег 9700 условия повторения циклов сопровождались скоростью отслеживания нагрузки, установленной на максимум.

Таблица 2. Условия термоциклера для анализа зиготности

Число	Установки: система для ПЦР АррЦес! Вюзулет;
циклов	СепеАтр РСК ЗузГет 9700
1	50“С 2 минуты
1	95°С 10 минут
10	95“С 15 секунд 64“С 1 минута (-1°С/цикл)
30	95“С 15 секунд 54°С 1 минута
1	10°С выдержка

Пример 2.

В этом примере иллюстрируются идентификация растения кукурузы, содержащего ДНК, являющуюся диагностической в отношении случая трансгенной кукурузы ΜΟΝ89034, в своем геноме, и определение зиготности такого растения кукурузы.

Способы, используемые для идентификации гетерозиготного относительно гомозиготного потомства, содержащего ДНК случая ΜΟΝ89034 в своем геноме, описываются в анализе зиготности, для которого условия приводятся в качестве примеров в табл. 3 и 4. Приводимыми в качестве примеров ДНКпраймерами, используемыми в анализе зиготности, являются праймеры 8Ц2842 (8ЕЦ ГО ΝΟ:6), 8Ц2843 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:7), 8Ц6523 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:10), 8Ц6524 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:11), меченый 6ΡΆΜ™ праймер РВ880 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:14) и меченый У1С™ праймер РВ2931 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:15). Как указано выше, 6ΡΆΜ и У1С являются продуктами ЛррНеД Вюзуз1ешз (Еоз1ег СЬу, СА) в виде флуоресцентных красителей, присоединенными к ДНК-праймеру.

8Ц2842 (8ЕЦ ГО ΝΟ:6), 8Ц2843 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:7), 8Ц6523 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:10), 8Ц6524 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:11) при использовании вместе в термической реакцией амплификации, в которой биологический образец, содержащий матричную ДНК, содержит ДНК, являющуюся диагностической в отношении присутствия случая кукурузы ΜΟΝ89034 в образце, приводят к образованию ДНК-ампликона, являющегося диагностическим в отношении ДНК кукурузы, отличной от ДНК случая кукурузы ΜΟΝ89034 (независимо от того, получена ли ДНК кукурузы из нетрансгенного или некоторого другого трансгенного образца). В альтернативном случае в реакции будут образовываться два различных ДНК-ампликона с биологического образца, содержащего ДНК, происходящую их генома кукурузы, который является гетерозиготным по аллелю, соответствующему вставленной ДНК, присутствующей в случае трансгенной кукурузы ΜΟΝ89034. Эти два различных ампликона будут соответствовать первому ампликону, который происходит из локуса генома кукурузы дикого типа, и второму ампликону, который является диагностическим в отношении присутствия ДНК случая кукурузу ΜΟΝ89034. Образец ДНК кукурузы, который приводит к получению только одного ампликона, соответствующего второму ампликону, описанному для гетерозиготного генома, диагностируют присутствие случая кукурузы ΜΟΝ89034 в образце и является диагностическим для определения того, что ДНК кукурузы, использованная в качестве матрицы, происходит из семени кукурузы, которое является гомозиготным по аллелю, соответствующему вставленной ДНК случая трансгенной кукурузы ΜΟΝ89034. Контроли для этого анализа должны включать положительный контроль из гомозиготной и гетерозиготной кукурузы, содержащей ДНК случая ΜΟΝ89034, отрицательный контроль из нетрансгенной кукурузы или любого другого трансгенного сорта кукурузы, и отрицательный контроль, который не содержит матричной ДНК. Этот анализ оптимизируют для использования с робоциклером 81га1адепе, ΜΙ Епдше, Регкш-Е1тег 9700 или термоциклером ЕррепДогГ Μазΐе^сус1е^ СгаД1епЕ Другие способы и устройства, известные квалифицированным в данной области техники специалистам, которые позволяют образовать ампликоны, которые идентифицируют зиготность потомства от скрещиваний, производимых с растениями ΜΟΝ89034, находятся в пределах знаний в данной области техники.

- 18 022829

Таблица 3. Решения реакций для анализа зиготности

Стадия	Реагент	Количество	Комментарии
	Свободная от нуклеаз вода	Добавить до конечного объема 5 мкл
2	2 X универсальная главная смесь (АррНе<1 В1озу51етз, каталожный # 4304437)	2,5 мкл	1 X конечная концентрация
3	Праймеры 5Ер ΪΟ ΝΟ б и 8Ер ΪΒ ΝΟ: 7, (ресуспендированные в свободной от нуклеаз воде до концентрации 20 мкМ)	0,05 мкл	0,25 мкМ конечная концентрация
4	Меченный 6РАМ,М праймер РВ880 (ЗЕО Ю N0:14) (ресуспендированный в свободной от нуклеаз воде до концентрации 10 мкМ)	0,01 мкл	0,4 мкМ конечная концентрация
5	Меченый У!С,М праймер РВ2931 (5Εζ>ΙΟΝΟ: 15) (ресуспендированный в свободной от нуклеаз воде до концентрации 10 мкМ)	0,01 мкл	0,15 мкМ конечная концентрация
6	ДНК-полимераза ЛЕОТая (1 единица/мкл)	1,0 мкл (рекомендуется заменить пипетки до следующей стадии)	1 еди н и ца/реак цию
7	Экстрагированная ДНК (матрица):	2,0 мкл	Разведенная в воде
	- Анализируемые образцы (индивидуальные листья) - Отрицательный контроль	- 4-80 нг геномной ДНК - 4 нг геномной ДНК нетрансгенной кукурузы
	- Отрицательный контроль	- без ДНК-матрицьт (раствор, в котором ресуспенднрована ДНК)
	- Положительный контроль	- 4 нг геномной ДНК из известного случая гетерозиготной кукурузы ΜΟΝ89034
	• Положительный контроль	• 4 нг геномной ДНК из известного случая гомозиготной кукурузы ΜΟΝ89034
»	Осторожно смешать, добавить 1-2 капли минерального масла на верх каждой реакции

Для ведения следующих параметров циклического повторения успешно использовались амплификации ДНК в робоциклере 5>1га1адспс. Μ1 Епдше, Регкт-Е1тег 9700, или термоциклере ЕррепДогГ Μ;·ΐδΙο сус1ег СгаШеШ, или системе для ПЦР АррЬеД Вюкуйетк СепеАтр РСК §у81ет 9700, или термоциклере Μ1 КекеагсЬ ΌΝΑ Епдше РТС-225. При использовании ЕррепДогГ Μа8ΐе^сус1е^ СгаЫеШ или Μ1 Епдше циклы повторяли рассчитанным образом. При использовании Регкш-ЕИтег 9700 циклы повторяли со скоростью отслеживания нагрузки, установленной на максимум.

Таблица 4. Условия термоциклера³ для анализа зиготности

Число циклов в следующем порядке	Температура и продолжительность
1	50°С 2 минуты
1	95°С 10 минут
10	95°С 15 секунд 64°С 1 минута (-1°С/цикл)
30	95°С 15 секунд 54вС 1 минута
1	10йС выдержка

- используя систему для ПЦР АррЬеД В1О5у51етк СепеАтр РСК §ук1ет 9700.

- 19 022829

Семена, соответствующие трансгенному случаю М0Ж9034, были депонированы 28 марта 2006 г. в соответствии Будапештским соглашением в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), 10801 Итуегкйу Вои1еуагб, Мапаккак, Уа. 20110. Номером поступления в АТСС или обозначением патентного депонирования является РТА-7455. Депонированный материал будет сохраняться в депозитарии в течение периода, составляющего 30 лет, или 5 лет после последнего запроса, или в течение срока действия патента, что дольше, и будет заменяться, если необходимо, во время этого периода.

После иллюстрации и описания принципов настоящего изобретения квалифицированным в данной области техники специалистам должно быть понятно, что компоновку и детали настоящего изобретения можно модифицировать, не выходя за пределы таких принципов. Авторы настоящего изобретения заявляют права на все модификации, которые находятся в пределах сущности и объема прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации и опубликованные патентные документы, процитированные в этом описании, включены сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы было специально и индивидуально указано для каждой индивидуальной публикации или заявки на патент, что она включена посредством ссылки.

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Растение кукурузы или его часть, обладающие устойчивостью к заражению насекомыми паразитами отряда Ьер1бор1ега, содержащие нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО N0:5.
2. 2. Растение или его часть по п.1, где образец семян указанного растения депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455.
3. 3. Клетка растения кукурузы, обладающая устойчивостью к заражению насекомыми паразитами Ьер1бор1ега, содержащая нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО N0:5.
4. 4. Клетка растения кукурузы по п.3, где образец семян указанного растения депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455.
5. 5. Продукт, полученный из растения кукурузы, его частей по любому из пп.1, 2, который содержит указанную молекулу ДНК и выбран из группы, состоящей из кукурузного толокна, кукурузного масла, кукурузной лепешки, кукурузного семени, кукурузных ростков, кукурузного крахмала, кукурузной муки, кукурузной пыльцы, кукурузного шелка, жидкого кукурузного экстракта, кукурузного солода, кукурузного сахара, кукурузного сиропа, маргарина, получаемого из кукурузного масла, сухих продовольственных товаров из барды (ЭЭОЗ).
6. 6. Способ получения устойчивого к насекомым растения кукурузы, включающий:

   (a) скрещивание растения кукурузы по любому из пп.1, 2 с другим растением кукурузы;

   (b) получение потомства растения от указанного скрещивания (а);

   (c) отбор потомства, которое содержит нуклеотидные последовательности ЗЕО ГО N0:1 и ЗЕО ГО N0:2, причем указанное отобранное потомство является устойчивым к заражению насекомыми паразитами отряда Ьер1бор1ега.
7. 7. Способ по п.6, в котором указанная стадия отбора (с) включает проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты у указанного потомства растения, полученного на стадии (Ь), причем отбирают потомство, которое продуцирует ампликон, содержащий по крайней мере одну нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО N0:1 или ЗЕО ГО N0:2, или проведение реакции гибридизации нуклеиновых кислот у указанного потомства растения, полученного на стадии (Ь), причем отбирают потомство, которое содержит последовательность ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностями ДНК, выбранными из ЗЕО ГО N0:1 или ЗЕО ГО N0:2.
8. 8. Способ получения устойчивого к насекомым паразитам отряда Ьер1бор1ега растения кукурузы, включающий:

   (a) трансформацию клетки растения кукурузы нуклеотидной последовательностью, содержащей ЗЕО ГО N0:5; и (b) регенерацию растения кукурузы из указанной трансформированной клетки, причем указанное растение кукурузы содержит указанную нуклеотидную последовательность и является устойчивым к насекомым паразитам отряда Ьер1бор1ега.
9. 9. Способ защиты растения кукурузы от заражения насекомыми паразитами отряда Ьер1бор1ега, включающий введение в пищевой рацион вредителя кукурузы отряда Ьер1бор1ега инсектицидно эффективного количества клеток(и) или тканей(и) трансгенного растения кукурузы или его частей, по любому из пп.1, 2.
10. 10. Способ по п.9, в котором указанный вредитель отряда Ьер1бор1ега выбран из группы, состоящей из осеннего походного червя (Зробор1ега Ггидрегба), кукурузного мотылька (0к1г1П1а пиЬПайк), хлопковой совки (НеНсоуегра /еа), юго-западной кукурузной огневки ГО1а1гаеа дгапбюке11а) и совки ипсилон (Адгойк 1ркйоп).
11. 11. Пара молекул ДНК, содержащая первую молекулу ДНК и вторую молекулу ДНК, причем молекулы ДНК содержат по меньшей мере 20 непрерывных нуклеотидов ЗЕО ГО N0:5, или ЗЕО ГО N0:3, или

    - 20 022829

    8ЕЦ ΙΌ N0:4, или комплементарную им последовательность для функционирования в качестве ДНКпраймеров или зондов, диагностических в отношении ДНК, экстрагированной из растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, или его потомства.
12. 12. Пара молекул ДНК по п.11, в которой указанная первая молекула ДНК содержит по меньшей мере 20 непрерывных нуклеотидов участка ДНК-вставки §ЕЦ ГО N0:3, или §ЕЦ ГО N0:5, или комплементарную им последовательность, а указанная вторая молекула ДНК содержит 5' фланкирующую последовательность, входящую в состав §ЕЦ ГО N0:3, или комплементарную ей последовательность схожей длины.
13. 13. Пара молекул ДНК по п.11, в которой указанная первая молекула ДНК содержит по крайней мере 20 непрерывных нуклеотидов, комплементарных участку ДНК-вставки §ЕЦ ГО N0:5, а указанная вторая молекула ДНК содержит по крайней мере 20 непрерывных нуклеотидов из геномного участка 8ЕЦ ГО N0:3.
14. 14. Пара молекул ДНК по п.11, в которой указанная первая молекула ДНК специфически гибридизуется с 8ЕЦ ГО N0:5 от приблизительно нуклеотида 2060 до приблизительно нуклеотида 12208, а указанная вторая молекула ДНК специфически гибридизуется с обратно комплементарной последовательностью, соответствующей §ЕЦ ГО N0:3, от приблизительно нуклеотида 1 до приблизительно нуклеотида 2050.
15. 15. Пара молекул ДНК по п.11, в которой указанная первая молекула ДНК содержит по меньшей мере 20 непрерывных нуклеотидов участка ДНК-вставки §ЕЦ ГО N0:4, или §ЕЦ ГО N0:5, или комплементарной им последовательности, а указанная вторая молекула ДНК содержит 3' фланкирующую последовательность, входящую в состав §ЕЦ ГО N0:4, или комплементарную ей последовательность схожей длины.
16. 16. Пара молекул ДНК по п.15, в которой указанная первая молекула ДНК содержит по крайней мере 20 непрерывных нуклеотидов из участка последовательности §ЕЦ ГО N0:5 от нуклеотида 2072 до нуклеотида 11294, а указанная вторая молекула ДНК содержит по крайней мере 20 непрерывных нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам участка от нуклеотида 11315 до нуклеотида 12208 последовательности §ЕЦ ГО N0:4.
17. 17. Пара молекул ДНК по п.15, в которой указанная первая молекула ДНК специфически гибридизуется с обратно комплементарной последовательностью, соответствующей §ЕЦ ГО N0:5, от приблизительно нуклеотида 1 до приблизительно нуклеотида 11305, а указанная вторая молекула ДНК специфически гибридизуется с 8ЕЦ ГО N0:4 от приблизительно нуклеотида 21 до приблизительно нуклеотида 914.
18. 18. Пара молекул ДНК по любому из пп. 11-17, в которой указанная первая молекула ДНК содержит §ЕЦ ГО N0:6, а указанная вторая молекула ДНК содержит §ЕЦ ГО N0:7.
19. 19. Способ обнаружения в биологическом образце растения кукурузы ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, включающий:

    (a) приведение в контакт указанного биологического образца с парой молекул ДНК, раскрытой в любом из пп. 11-18;

    (b) обеспечение условий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты;

    (c) проведение указанной реакции амплификации с получением молекулы ДНК-ампликона, причем обнаружение ампликона, содержащего по крайней мере одну из 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:2 или комплементарной им последовательности, указывает на наличие искомой молекулы ДНК в указанном биологическом образце.
20. 20. Способ обнаружения в биологическом образце растения кукурузы ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, включающий:

    (a) приведение в контакт указанного биологического образца с ДНК-зондом, который содержит §ЕЦ ГО N0:1, или §ЕЦ ГО N0:2, или комплементарную им последовательность и гибридизуется в жестких условиях с одной или несколькими нуклеотидными последовательностями §ЕЦ ГО N0:1, или §ЕЦ ГО N0:2, или комплементарными им последовательностями;

    (b) обеспечение жестких условий гибридизации для указанного биологического образца и ДНКзонда, причем обнаружение гибридизации указывает на наличие искомой молекулы ДНК в биологическом образце.
21. 21. Способ по п.20, в котором указанный ДНК-зонд содержит §ЕЦ ГО N0:1 или §ЕЦ ГО N0:2 или комплементарную им последовательность.
22. 22. Способ по любому из пп.20 или 21, в котором указанный ДНК-зонд помечен по крайней мере одним флуорофором.
23. 23. Способ по п.19 или 20, в котором указанный биологический образец выбран из группы, состоящей из кукурузного толокна, кукурузного масла, кукурузной лепешки, кукурузного семени, кукурузных ростков, кукурузного крахмала, кукурузной муки, кукурузной пыльцы, кукурузного шелка, жидкого ку- 21 022829 курузного экстракта, кукурузного солода, кукурузного сахара, кукурузного сиропа, маргарина, получаемого из кукурузного масла, сухих продовольственных товаров из барды (ΌΌΟ8).
24. 24. Набор для обнаружения ДНК, представленной последовательностью 8ЕО ГО N0:5, содержащий по крайней мере две ДНК-молекулы, содержащие по меньшей мере 20 непрерывных нуклеотидов последовательностей 8Е0 ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:4, или 8Е0 ГО N0:5, или последовательностей, комплементарных указанным, для функционирования в качестве ДНК-праймера или зонда, специфического для растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, и/или его потомства.
25. 25. Набор для обнаружения ДНК по п.24, в котором указанная по крайней мере одна молекула ДНК содержит 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:2 или комплементарную им последовательность.
26. 26. Набор для обнаружения ДНК по п.25, в котором указанная по крайней мере одна молекула ДНК представляет собой 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:2 или комплементарную им последовательность.
27. 27. Набор для обнаружения ДНК по п.24, который содержит пару молекул ДНК по любому из пп.11-18.
28. 28. Способ определения в биологическом образце зиготности ДНК растения кукурузы, содержащего 8Е0 ГО N0:5, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, включающий:

    (a) приведение в контакт указанного образца с набором праймеров, содержащих 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:7 и 8Е0 ГО N0:10, который (1) при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, приводит к образованию первого ампликона, который является диагностическим для растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, и (2) при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей геномную ДНК кукурузы, отличную от ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, приводит к образованию второго ампликона, который является диагностическим для геномной ДНК кукурузы, отличной от ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455;

    (b) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, причем обнаружение обоих указанных выше ампликонов свидетельствует о том, что образец является гетерозиготным по ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, а обнаружение только первого из указанных выше ампликонов свидетельствует о том, что указанный образец является гомозиготным по ДНК растения кукурузы, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455.
29. 29. Способ по п.28, в котором указанный набор праймеров дополнительно используют вместе с 8ЕО ГО N0:14 и 8ЕО ГО N0:15.
30. 30. Устойчивое к заражению насекомыми паразитами отряда Ьер1бор!ега растение или его потомство, содержащее последовательность 8Е0 ГО N0:5.
31. 31. Устойчивое к заражению насекомыми паразитами отряда Ьер1бор!ега семя растения, содержащее последовательность 8Е0 ГО N0:5.
32. 32. ДНК-праймер для обнаружения ДНК трансгенного растения кукурузы, содержащего в своем геноме последовательность 8Е0 ГО N0:5, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, содержащий по меньшей мере 30 непрерывных нуклеотидов последовательности 8Е0 ГО N0:3 или комплементарной ей последовательности, который используется в способе амплификации ДНК с получением ампликона, содержащего 8Е0 ГО N0:1.
33. 33. ДНК-праймер для обнаружения ДНК трансгенного растения кукурузы, содержащего в своем геноме последовательность 8Е0 ГО N0:5, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, содержащий по меньшей мере 30 непрерывных нуклеотидов последовательности 8Е0 ГО N0:4 или комплементарной ей последовательности, который используется в способе амплификации ДНК с получением ампликона, содержащего 8Е0 ГО N0:2.
34. 34. Набор для обнаружения ДНК трансгенного растения кукурузы, содержащего в своем геноме последовательность 8Е0 ГО N0:5, образец семян которого депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-7455, содержащий по меньшей мере две молекулы из 30 или более непрерывных нуклеотидов последовательности 8Е0 ГО N0:3, или 8Е0 ГО N0:4, или комплементарной им последовательности, который используется в способе амплификации ДНК с получением ампликона, содержащего 8Е0 ГО N0:1 или 8Е0 ГО N0:2.