ES2498976T3 - Planta y semilla de maíz correspondiente al evento transgénico MON89034 y procedimientos para su detección y uso - Google Patents

Abstract

Una planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma o semillas de la misma o progenie de la misma, que comprende una molécula de ADN que codifica Cry2Ab and Cry1A.105 en el genoma en las células de dicha planta de maíz, partes de la misma o progenie de la misma, en la que la molécula de ADN comprende los elementos siguientes: promotor e35S, líder sin traducir CAB de trigo, intrón de la actina del arroz, secuencia de codificación para Cry1A.105, secuencia de terminación y poliadenilación de HSP17 3' de trigo, promotor de FMV, intrón hsp70, secuencia de codificación del péptido dirigido a la subunidad pequeña en el cloroplasto de rubisco, secuencia de codificación de Cry2Ab, secuencia señal de poliadenilación y de terminación de nos en 3`, en la que los extremos colocados opuestos de dicha molécula de ADN son un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2, y en la que dicha molécula de ADN está presente en el evento de maíz MON89034 depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con nº de acceso PTA-7455.

Description

Planta y semilla de maíz correspondiente al evento transgénico MON89034 y procedimientos para su detección y uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a plantas de maíz transgénicas (evento de maíz MON89034) y a partes de plantas y semillas de las mismas que exhiben resistencia a la infestación por insectos con insectos del orden Lepidoptera. La invención también se refiere a procedimientos para usar plantas y semillas que comprenden ADN que son diagnósticos para la presencia del evento transgénico cuando sondan para la presencia de secuencias de nucleótidos que son únicas del evento transgénico, y a procedimientos para detectar la presencia de dicho evento de maíz en una muestra biológica detectando secuencias de nucleótidos específicas que son únicas del evento transgénico. La invención proporciona secuencias de nucleótidos que son únicas del evento.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la variedad transgénica resistente a lepidópteros de la planta de maíz (Zea mays) denominada en el presente documento evento MON89034 y a secuencias de AND únicas presentes que, cuando se detectan en cualquier muestra o variedad de maíz, es diagnóstica de la presencia del evento de la planta de maíz transgénico MON89034 en dicha muestra o variedad, y también se refiere a la detección de la región de inserción transgénica/genómica en MON89034 de maíz y a plantas y semillas de la progenie derivadas de los mismos.

El evento de la planta de maíz MON89034 es particularmente resistente a insectos de la familia de los lepidópteros, tales como cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), taladro europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), gusano elotero del maiz (Helicoverpa zea), talador del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella), y gusano gris (Agrotis ipsilon) y similares, todos os cuales sin plagas de insectos agronómicamente importantes.

El maíz es un cultivo importante y es una fuente de alimentación fundamental en muchas zonas del mundo. Se han aplicado al maíz procedimientos de biotecnología con objeto de mejorar los rasgos agronómicos y la calidad del producto. Uno de estos rasgos agronómicos es la resistencia a los insectos, por ejemplo la resistencia modificada genéticamente a especies de lepidópteros y de coleópteros que emerge en las plantas de maíz modificadas genéticamente para que contengan uno o más genes que codifican agentes insecticidas (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/020636, la patente de EE.UU. 6.489.542 y la patente de EE.UU. 6.620.988). Es ventajoso detectar la presencia de un evento transgénico concreto en una muestra biológica para determinar su una o más progenies de un cruce sexual contienen el material transgénico. Por ejemplo, la detección del evento en una muestra es importante con fines licenciatarios, para establecer y mantener las normas de pureza, importante para cumplir con las agencias reguladoras, para cumplir las normas relacionadas con los ingredientes alimentarios, para usar en procedimientos legales con el fin de establecer si uno o más individuos o entidades ha estado usando el evento concreto sin una licencia del propietario o licenciatario de cualquier patente dirigida al evento transgénico y para asegurar el cumplimiento de varios reglamentos y/o legislaciones gubernamentales.

Además, los procedimientos que permiten la detección de una planta concreta serían útiles para cumplir los reglamentos que requiere la preaprobación para el mercado y etiquetado de alimentos derivados de las plantas de cultivos recombinantes. Los individuos o entidades resistentes a la presencia de un evento transgénico en una muestra también desean procedimientos fiables para detectar la presencia del transgén en una muestra con el fin de poder capitalizar sus negocios, lo que se aprovecha de una ausencia de transgenes en sus productos.

A pesar de estas ventajas, es posible que los insectos puedan desarrollar resistencias a las plantas que solo expresen una endotoxina δ de B. thuringiensis. Dicha resistencia, si se extiende, limitaría claramente el valor comercial del germoplasma que contiene genes únicos de Bt.

Un posible modo de aumentar la eficacia de los agentes insecticidas proporcionados mediante plantas transgénicas y dirigidos al control de plagas de insectos diana y de reducir de forma contemporánea la probabilidad de emergencia de plagas de insectos resistentes a dichos agentes insecticidas sería asegurar que dichos cultivos transgénicos expresan niveles altos de estos agentes insecticidas, tales como endotoxinas delta de Bacillus thuringiensis (McGaughey y Whalon (1992), Science 258:1451-55; Roush (1994) Biocontrol. Sci. Technol. 4:501516). Además, tener un depósito de genes insecticidas que son eficaces contra grupos de plagas de insectos y que manifiestan sus efectos a través de diferentes modos de acción puede proteger contra el desarrollo de resistencia. El inicio de la resistencia podría retrasarse sustancialmente como resultado de proporcionar un cultivo que exprese dos

o más actividades insecticidas que exhiban toxicidad solapante con las mismas especies de insectos. Un medio para alcanzar dichos modos de acción duales podría proporcionar una planta que expresa un gen Bt tóxico para una especie de insecto concreto junto con un ARNds que se proporciona para los fines de dirigir la supresión de un gen esencial de la misma especie de insecto dirigido por la toxina Bt, provocando el ARNds una respuesta de ARNi tras a ingestión por la plaga diana, lo que proporciona un medio para la redundancia del evento que el insecto desarrolle

resistencia al ARNds o al gen Bt. Como alternativa, la coexpresión en una planta de dos o más toxinas insecticidas tóxicas ambas a la misma especie de insecto pero cada una con un modo diferente de efectuar su actividad de destrucción, en particular cuando ambos se expresan a niveles altos, proporciona un medio para el control eficaz de la resistencia. Ejemplos de dichos insecticidas útiles en dichas combinaciones incluyen, entre otros, toxinas de Bt, proteínas insecticidas de Xenorhabdus sp. o Photorhabdus sp, proteínas y/o permuteínas de patatina desalegernizadas y desglucosiladas, lectinas vegetales y similares.

La expresión de genes extraños en plantas se sabe que está influida por su posición en el cromosoma, quizá a causa de la estructura de la cromatina (p. ej., heterocromatina) o la proximidad de elementos de regulación de la transcripción (p. ej, potenciadores) cercanos al sitio de integración (Weising et al.(19880 Ann. Rev. Genet 22:421477). Por esta razón, a menudo es necesario realizar una detección selectiva de un gran número de eventos con el fin de identificar cualquier evento caracterizado por la expresión óptima de un gen de interés introducido. Incluso entonces, con docenas o incluso cientos de diferentes eventos transgénicos a mano, no existe certeza de éxito en la identificación de un único evento transgénico que proporcione los niveles óptimos de expresión de al menos dos toxinas o agentes insecticidas diferentes y carece de deficiencias agronómicas indeseables o de efectos fitotóxicos, bien como resultado de la inserción en alguna región esencial o parcialmente esencial del genoma vegetal o como resultado de efectos tóxicos producidos por los niveles de expresión de los transgenes. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre los eventos. También puede haber diferencias en los patrones de expresión espaciales y temporales, por ejemplo diferencias en la expresión relativa de un transgén en varios tejidos vegetales, que pueden no corresponder con los patrones previstos a partir de elementos reguladores de la transcripción presentes en la construcción génica introducida. Por este motivo, es habitual producir varios cientos o varios miles de eventos diferentes y cribar los eventos para buscar un único evento que tenga los niveles de expresión del transgén deseado y los patrones para fines comerciales. Un evento que tiene los niveles o patrones deseados de la expresión del transgén es útil para la introgresión del transgén en otros fondos genéticos mediante cruzamiento sexual usando métodos de cultivo convencionales. La progenie de dichos cruces mantiene las características de la expresión del transgén del transformante original. Esta estrategia se usa para garantizar una expresión génica fiable en una serie de variedades que están adaptadas adecuadamente a las condiciones de crecimiento local específicas.

Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier procedimiento de detección de ácido nucleico conocido, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Estos procedimientos de detección generalmente se centran en elementos genéticos usados con frecuencia, tales como promotores, terminadores, genes marcadores o incluso la secuencia de codificación que codifica la proteína o ARNds de interés expresada a partir del o los transgenes etc. Como resultado, dichos procedimientos pueden no ser útiles para discriminar entre eventos diferentes, en particular los producidos usando la misma construcción de ADN, a menos que se conozca la secuencia del ADN cromosómico adyacente al ADN insertado (“ADN flanqueante”), Dependiendo del procedimiento usado para introducir el o los transgenes en un genoma vegetal, se pueden observar efectos aberrantes o inusuales, lo que a menudo complica mucho la identificación de las secuencias del genoma vegetal que flanquean el ADN transgénico que se quería introducir en la planta. A menudo, los reordenamientos del ADN insertado, reordenamientos del ADN del genoma flanqueante o reordenaciones del ADN insertado o del ADN del genoma flanqueante son prevalentes y complican el análisis del evento de inserción que se está evaluando. Por tanto, es una ventaja tener un medio para seleccionar, identificar y garantizar la pureza y las características de un evento transgénico concreto en una muestra y el único modo de conseguir esto es identificar una o más secuencias únicas asociadas únicamente con el evento transgénico deseado y la presencia de dichas secuencias en una muestra biológica que contiene el ADN de la especie vegetal en la que se insertó el ADN transgénico para dar lugar al evento son, por tanto, diagnósticos del evento en dicha muestra.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una planta de maíz, o partes de la misma o semillas de la misma o progenie de la misma, resistente a insectos, que comprende una molécula de ADN que codifica Cry2Ab y Cry1A.105 en el genoma en las células de dicha planta de maíz, partes de la misma o progenie de la misma, en la que la molécula de ADN comprende los elementos siguientes: promotor e35S, líder sin traducir CAB de trigo, intrón de la actina del arroz, secuencia de codificación para Cry1A.105, secuencia de terminación y poliadenilación de HSP17 3' de trigo, promotor de FMV, intrón hsp70, secuencia de codificación del péptido dirigido a la subunidad pequeña en el cloroplasto de rubisco, secuencia de codificación de Cry2Ab, secuencia señal de poliadenilación y de terminación de nos en ‘, en la que los extremos colocados opuestos de dicha molécula de ADN son un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2, y en la que dicha molécula de ADN está presente en el evento de maíz MON89034 depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con nº de acceso PTA-7455. Las partes de la planta del evento de maíz MON89034 incluyen polen, óvulos, flores, brotes, raíces, tallos, barbas, panochas , mazorcas y hojas, siempre que estas partes contengan al menos los polinucleótidos tal como se ha indicado anteriormente. Un aspecto de la presente invención son nuevas composiciones genéticas contenidas en el genoma de las plantas de maíz mencionadas anteriormente y productos de la planta de maíz mencionada anteriormente, tales como harina, aceite, pulpa y biomasa que queda en un campo de dichas plantas de maíz.

De acuerdo con un aspecto de la invención se proporcionan composiciones y procedimientos para detectar la presencia de la región de inserción del transgén/genómica de una planta de maíz nueva designado MON89034. Se proporcionan secuencias de ADN que comprenden al menos una secuencia de unión de MON89034 seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 1 (localizada en las posiciones 2051 a 2071 de la SEC ID Nº 5) y la SEC ID Nº 2 (localizada en las posiciones 11295 a 11314) y complementarias de las mismas; en las que una secuencia de unión abarca la unión entre el ADN heterólogo insertado en el genoma y el ADN de la célula de maíz que flanquea el sitio de inserción y es diagnóstica del evento (Figura 1). Un evento de maíz MON89034 y semilla que comprende moléculas de ADN es un aspecto de la presente invención.

Las secuencias de ADN que comprenden la nueva región de inserción del transgén/genómica, SEC ID N º 3 y SEC ID Nº 4 (Figura 1) de un evento de maíz MON89034 se divulgan en el presente documento.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporcionan dos moléculas de ADN para usar en un procedimiento de detección de ADN, en el que dicha primera molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región del transgén de la SEC ID Nº 3 o la SEC ID Nº 5 o complementarias de las mismas, y dicha segunda molécula de ADN comprende una longitud similar de una región de ADN genómico de maíz flanqueante en 5’ de la SEC ID Nº 3 o complementaria de la misma para funcionar como cebadores de ADN o sondas diagnósticas para el ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma, en las que estas moléculas de ADN, cuando se usan juntas, son útiles como cebadores de ADN en un procedimiento de amplificación de ADN que produce un amplicón. El amplicón producido usando estos cebadores de ADN en el procedimiento de amplificación de ADN es diagnóstico del evento de maíz MON89034 cuando el amplicón contiene la SEC ID Nº 1.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporcionan dos moléculas de ADN para usar en un procedimiento de detección de ADN, en el que dicha primera molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región del transgén de la SEC ID Nº 4 o la SEC ID Nº 5 o complementarias de las mismas, y dicha segunda molécula de ADN comprende una longitud similar de una región de ADN genómico de maíz flanqueante en 3’ de la SEC ID Nº 4 o complementaria de la misma para funcionar como cebadores de ADN o sondas diagnósticas para el ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma, en las que estas moléculas de ADN son útiles como cebadores de ADN en un procedimiento de amplificación de ADN. El amplicón producido usando estos cebadores de ADN en el procedimiento de amplificación de ADN es diagnóstico del evento de maíz MON89034 cuando el amplicón contiene la SEC ID Nº 2.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporcionan procedimientos de detección de la presencia de ADN que corresponde al evento de maíz MON89034 en una muestra. Dichos procedimientos comprenden: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores que, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de maíz MON89034, produce un amplicón que es diagnóstico para el evento de maíz MON89034, (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, de modo que se produce el amplicón; y (c) detectar el amplicón, en el que dicho amplicón comprende la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporcionan procedimientos de detección de la presencia de ADN que corresponde al evento de maíz MON89034 en una muestra, comprendiendo dichos procedimientos: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con ADN genómico del evento de maíz MON89034 y no hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas y (c) detectar la hibridación de la sonda con el ADN del evento de maíz MON89034, en el que dicha sonda comprende la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento de determinar la cigosidad de la progenie del evento de maíz MON89034, que comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN de maíz con un conjunto de cebadores que comprende SQ2842 (SEC ID Nº 6), SQ2843 (SEC ID Nº 7), SQ6523 (SEC ID Nº 10), SQ6524 (SEC ID Nº 11), PB880 (SEC ID Nº : 14) y PB2931 (SEC ID Nº 15) que cuando se usan en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de maíz MON89034, produce un primer amplicón que es diagnóstico para el evento de maíz MON89034 y (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, de modo que se produce el primer amplicón; y (c) detectar el primer amplicón; y (d) poner en contacto la muestra que comprende ADN de maíz con dicho conjunto de cebadores que, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de plantas de maíz produce un segundo amplicón que comprende el ADN genómico de maíz nativo homólogo de la región genómica de maíz de una inserción transgénica identificada como evento de maíz MON89034 y (e) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, de modo que se produce el segundo amplicón y (f) detectar el segundo amplicón; y (g) comparar los amplicones primero y segundo en una muestra, en la que la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigota para la inserción del transgén.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición o muestra biológica en forma de un producto o alimento que deriva del evento de maíz MON89034, comprendiendo el producto o alimento mazorcas de maíz, cáscara de maíz, barbas de maíz, polen de maíz, maíz triturado, harina de maíz, maíz molido, harina de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, licor de maceración del maíz, malta de maíz, azúcar de maíz, jarabe de maíz,

margarina producida a partir de aceite de maíz, aceite de maíz insaturado, de maíz saturado, copos de maíz, palomitas de maíz, etanol y/o licor producidos a partir de maíz o productos de maíz que comprenden ADN diagnóstico para el evento de maíz MON89034, sólidos de productos secos de destilación (DDGS) producidos por la fermentación de dicho evento de maíz y piensos animales que comprenden dichos DDGS y/o maíz, alimentos procesados enteros, triturados o molidos, un cosmético y un agente formador de volumen en el que se encuentra una cantidad detectable de un polinucleótido que es diagnóstico de la presencia de un evento de maíz transgénico MON89034 en la muestra biológica. Un medio alternativo de proporcionar maíz como producto alimentario es proporcionar el maíz en arias formas de grano para alimentación, tale como maíz entero, maíz triturado, maíz molido y varias formas de los anteriores en una mezcla con sorgo, sebo, mijo, girasol, avenas, trigo, arroz, judías y similares. Cantidades detectables de una secuencia de nucleótidos en dicho producto o producto alimentario tal como se indica en la SE ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2, o sus complementarias, son diagnósticas de la presencia de dicho ADN de evento transgénico MON89034 en la muestra y, por tanto, la presencia de las células del evento transgénico que han originado el ADN en la muestra,

Los anteriores y otros aspectos de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Figuras

Figura 1. Organización del inserto del transgén presente dentro del genoma del evento de maíz transgénico MON89034. La barra abierta o blanca central representa el ADN insertado. Debajo de la barra blanca hay un diagrama que representa los diversos elementos dentro del ADN insertado. Los extremos del ADN insertado se han designado de forma arbitrario como 5’ (a la izquierda de la Figura) y 3' (a la derecha de la Figura. Las secuencias y segmentos del borde derecho y del borde izquierdo están etiquetados debajo de cada extremo del diagrama que ilustra los diversos elementos dentro del ADN insertado. Los elementos etiquetados en los casetes de expresión dentro del ADN insertado son, en orden consecutivo comenzando desde el borde derecho: Promotor e35S, líder sin traducir de CAB de trigo, intrón de la actina del arroz, secuencia de codificación para Cry1A.105, secuencia de poliadenilación y de terminación de HSP17 3', promotor del FMV, intrón del hsp70, secuencia de codificación de péptido dirigido a la subunidad pequeña de rubisco en cloroplastos, secuencia de codificación Cry2Ab, secuencia señal de poliadenilación y terminación nos 3' y, después, el borde izquierdo. Las barras tramadas verticalmente en cualquiera de los extremos de la barra blanca o abierta central corresponden a las secuencias flanqueantes del genoma de maíz en 5’ y 3’ marcadas arbitrariamente. La línea negra más larga encima de la barra tramada y abierta

o blanca representa la SEC ID nº 5 (la secuencia de longitud completa representada por la figura que representa la secuencia flanqueante en 5’, la secuencia de ADN insertada y la secuencia flanqueante en 3’). Las líneas negras más cortas encima y debajo de la línea negra marcada como SEC ID Nº 5 representan las posiciones aproximadas dentro de la SEC ID Nº 5, en la que se puede encontrar cada una de las secuencias marcadas específicamente (es decir, SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 4). La SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2 y cualquier secuencia derivada del evento de maíz MON89034 que contienen la SEC ID Nº 1 y/o SEC ID Nº 2 son diagnósticas del ADN del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica.

Descripción detallada

Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invención y guiar a los expertos en la materia en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la materia. También se pueden encontrar definiciones de términos habituales en biología molecular en Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5ª edición, Springer-Verlag: New York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994.

Como se usa en el presente documento, el término "maíz” significa Zea mays e incluye todas las variedades vegetales que se pueden cultivar con maíz, incluidas especies de maíz silvestre.

Como se usa en el presente documento, la expresión "que comprende” significa "que incluye, pero sin estar limitado a".

Un “evento" transgénico se produce mediante la transformación de células vegetales con ADN heterólogo, es decir una construcción de ácido nucleico que incluye un transgén de interés, regeneración de una población de plantas resultante de la inserción del transgén en el genoma de la planta y selección de una planta concreta caracterizada por la inserción en una localización genómica concreta. El término “evento” se refiere al transformante original y a la progenie del transformante, que incluyen el ADN heterólogo. El término “evento” también se refiere a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluya el ADN heterólogo. Incluso después de un retrocruzamiento repetido con un padre recurrente, el ADN insertado y el ADN flanqueante del padre transformado está presente en la progenie del cruce en la misma localización cromosómica. El término “evento” también se refiere a ADN del transformante original que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente con el ADN insertado que cabría esperar que se transfiriera a una progenie que reciba el ADN insertado que incluya el transgén de interés como resultado de un cruce sexual de una línea parental que incluye el ADN insertado (p. ej., el transformante original y la progenie resultante de la autofecundación)

y una línea parental que no contiene el ADN insertado. La presente descripción se refiere al ADN del evento MON89034, a células vegetales, tejidos, semillas y productos procesados derivados de MON89034.

También debe entenderse que también se pueden cruzar dos plantas transgénicas para producir descendencia que contenga dos genes exógenos añadidos de segregación independiente. La autofecundación de la progenie adecuada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes exógenos añadidos. El retrocruzamiento con una planta parental y la fertilización cruzada con una planta no transgénica también se contemplan, así como la propagación vegetativa. Se pueden encontrar descripciones de otros procedimientos de cultivo de uso habitual para diferentes rasgos y cultivos en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

Una “sonda” es un ácido nucleico aislado al que está unido un marcador detectable o molécula indicadora convencional, por ejemplo un isótopo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima radioactivo Dicha sonda es complementaria de una hebra de un ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención, de una hebra de ADN genómico del evento de maíz MON89034, ya sea de una planta de maíz o de una muestra que incluya ADN del evento. Se describen sondas que no solo incluyan ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y que se puedan usar para detectar la presencia de dicha secuencia de ADN diana.

Los “cebadores” son ácidos nucleicos aislados que se hibridan a una hebra de ADN diana complementaria mediante hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, después se extienden a lo largo de la hebra de ADN diana mediante una polimerasa, por ejemplo una ADN polimerasa. Los pares de cebadores de la presente invención se refieren al uso de la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico convencionales.

Las sondas y cebadores tienen, generalmente, una longitud de 11 nucleótidos o más, preferentemente 18 nucleótidos o más, más preferentemente 24 nucleótidos o más, y, lo más preferentemente, 30 nucleótidos o más. Dichas sondas y cebadores hibridan específicamente con una secuencia diana en condiciones de hibridación de alta rigurosidad. Preferentemente, las sondas y cebadores de acuerdo con la presente invención tienen una similitud de secuencia completa con la secuencia diana, aunque las sondas que difieren de la secuencia diana y que conservan la capacidad de hibridar con las secuencias diana se pueden diseñar mediante procedimientos convencionales.

Los procedimientos para preparar y usar sondas y cebadores se describen en, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en lo sucesivo en el presente documento "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en lo sucesivo en el presente documento , "Ausubel et al., 1992"); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los pares de cebadores para PCR pueden derivar de una secuencia conocida, usando, por ejemplo, programas de ordenador destinados a tal fin, tales como Primer (Versión 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).

Los cebadores y sondas basadas en el ADN flanqueante y secuencias de inserto divulgadas en el presente documento se pueden confirmar (y en caso necesario, corregir) las secuencias divulgadas mediante procedimientos convencionales, por ejemplo mediante reclonación y secuenciación de dichas secuencias.

Las sondas y cebadores de ácido nucleico descritos en el presente documento hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de ADN diana. Cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico se puede usar para identificar la presencia de ADN a partir de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico, o fragmentos de las mismas, son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico en determinadas circunstancias. Como se usa en el presente documento, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente con otra su las os moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico bicatenario antiparalelo. Se dice que una molécula de ácido nucleico es la “complementaria” de otra molécula de ácido nucleico si exhiben una complementariedad completa. Como se usa en el presente documento, se dice que las moléculas exhiben una “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario de un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son “mínimamente complementarias” si pueden hibridar entre sí con una estabilidad suficiente como para permitirles que permanezcan hibridadas entre sí en, al menos, condiciones de "rigurosidad baja". De un modo similar, se dice que dos moléculas son “complementarias” si pueden hibridar entre sí con una estabilidad suficiente como para permitirles que permanezcan hibridadas entre sí en condiciones convencionales de "rigurosidad alta". Las condiciones de rigurosidad convencionales se describen en Sambrook et al., 1989, y en Haymes et al., en: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Por tanto, se permiten desviaciones de la complementariedad completa, siempre que dichas desviaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura bicatenaria. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, solo tiene que ser suficientemente complementaria en su secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable en las concentraciones de disolvente y de sales concretas usadas.

Como se usa en el presente documento, una secuencia sustancialmente homóloga es una secuencia de ácido nucleico que hibridará específicamente con la complementaria de la secuencia de ácido nucleico con la que se está comparando en condiciones de rigurosidad alta. Los expertos en la técnica conocen las condiciones de rigurosidad adecuadas que estimulan la hibridación de ADN, por ejemplo, 6,0 x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de un lavado de 2,0 x SSV a 50 ºC o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar desde una rigurosidad baja a aproximadamente 2,0 x SSC a 50ºC a una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2 x SSC. Además, la temperatura en la etapa de lavado se puede incrementar desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65ºC. Tanto la temperatura como la sal se pueden variar o la temperatura o la concentración de sales se pueden mantener constantes mientras que se modifica la otra variable. En una realización preferida, un ácido nucleico de la presente invención hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico establecidas en las SEC ID Nº 1 y 2 o complementarias de las mimas o fragmentos de condiciones moderadamente rigurosas, por ejemplo a aproximadamente 2,0 x SSC y aproximadamente 65 ºC. En una realización particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención hibridará específicamente con una o más moléculas de ácido nucleico expuestas en las SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2 o complementarias o fragmentos en condiciones de alta rigurosidad. En un aspecto, una molécula de ácido nucleico marcadora tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID N º1 y la SEC ID Nº 2 o complementarias de las mismas o fragmentos de las mismas. En otro aspecto, una molécula de ácido nucleico marcadora preferida comparte entre el 80% y el 100% o e 90% y el 100% de identidad de la secuencia con la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID N º1 y la SEC ID Nº 2 o complementarias de las mismas o fragmentos de las mismas. En un aspecto adicional, una molécula de ácido nucleico marcadora preferida comparte entre el 95% y el 100% de identidad de la secuencia con la secuencia expuesta en la SEC ID N º1 y la SEC ID Nº 2 o complementarias de las mismas o fragmentos de las mismas. La SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2 se pueden usar como marcadores en procedimientos de cultivos de plantas para identificar la progenie de los cruces genéticos similares a los procedimientos descritos para el simple análisis del marcador de DN de repetición de secuencia, en “DNA markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 173185, Cregan, et al., eds., Wiley-Liss NY. La hibridación de la sonda con la molécula de ADN diana se puede detectar mediante cualquier número de procedimientos conocidos por un experto en la técnica, estos pueden incluir, entre otros, marcadores fluorescentes, marcadores radioactivos, marcadores basados en anticuerpos y marcadores quimioluminiscentes.

Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana (p. ej., mediante PCR) usando un par de cebadores de amplificación concreto, “condiciones rigurosas” son condiciones que permiten que el par de cebadores hibride únicamente con la secuencia de ácido nucleico diana a la que el cebador que tiene la correspondiente secuencia silvestre (o su complementaria) se uniría y, preferentemente, para producir un producto de amplificación único, el amplicón, en la reacción de amplificación térmica de ADN.

La expresión “específico de (una secuencia diana)” indica que una sonda o cebador hibrida en condiciones de hibridación rigurosas únicamente con la secuencia diana en una muestra que comprende la secuencia diana.

Como se usa en el presente documento, “ADN amplificado” o “amplicón” se refiere al producto de la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana que es parte de un molde de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de maíz resultante de un cruce sexual contiene ADN genómico del evento transgénico de la planta de maíz de la presente invención, el ADN extraído de una muestra de tejido de la planta de maíz se puede someter a un procedimiento de amplificación de ácido nucleico usando un par de cebadores que incluye un cebador derivado de la secuencia flanqueante en el genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo insertado para producir un amplicón que es diagnóstico de la presencia del ADN del evento. El amplicón tiene una longitud y una secuencia que también es diagnóstica del evento. El amplicón puede variar de longitud con respecto a la longitud combinada de los pares de cebadores más un par de bases nucleotídicas, preferentemente más aproximadamente cincuenta pares de bases nucleotídicas, más preferentemente más aproximadamente doscientos cincuenta pares de bases nucleotídicas, e incluso más preferentemente más aproximadamente cuatrocientas cincuenta pares de bases nucleotídicas. Como alternativa, un par de cebadores puede proceder de la secuencia flanqueante en ambos lados del ADN insertado para producir un amplicón que incluye la totalidad de la secuencia nucleotídica del inserto. Un miembro de un par de cebadores derivado de la secuencia genómica de la planta se puede localizar a una distancia de la molécula de ADN insertada, esta distancia puede variar desde un par de bases nucleotídicas a aproximadamente veinte mil pares de bases nucleotídicas. El uso del término “amplicón" excluye específicamente dímeros de cebadores que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica del ADN.

La amplificación de ácido nucleico se puede conseguir mediante cualquiera de los procedimientos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la materia, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la materia se conocen varios procedimientos de amplificación y se describen en, entre otros, las patentes de EE.UU. Nº

4.683.195 y 4.683.202 y en los protocolos de PCR: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Se han desarrollado procedimientos de amplificación por PCR para amplificar hasta 22 kb del ADN genómico y hasta 42 kb del ADN del bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). Estos procedimientos, además de otros procedimientos conocidos en la técnica de amplificación del ADN, se pueden usar en la práctica de la presente invención. La secuencia del inserto de ADN heterólogo o la secuencia

flanqueante del evento de maíz MON89034 con muestras de semillas depositadas como los números de la ATCC se pueden verificar (y corregir en caso necesario) mediante amplificación de dichas secuencias desde el evento usando los cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en el presente documento, seguidas de secuenciación de ADN estándar del amplicón de PCR o del ADN clonado.

El amplicón producido mediante estos procedimientos se puede detectar mediante una pluralidad de técnicas. Uno de estos procedimientos es en Análisis Genético de un bit (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994), en el que se diseña un oligonucleótido de ADN que solapa tanto la secuencia de ADN genómica flanqueante adyacente como la secuencia de ADN insertada. El oligonucleótido se inmoviliza en pocillos de una placa de micropocillos. Tras la PCR de la región de interés (usando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), y producto de PCR monocatenario se puede hibridar con el oligonucleótido inmovilizado y servir como molde para una reacción de extensión de una base usando una ADN polimerasa y ddNTP marcados específicos de la siguiente base prevista. La lectura puede ser fluorescente o basarse en un ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia del inserto/flanqueante debido a un amplificación, hibridación y extensión de una base satisfactorios.

Otro procedimiento es la técnica de la pirosecuenciación como describen Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este procedimiento se diseña un oligonucleótido que solapa el ADN genómico adyacente y la unión del ADN del inserto. El oligonucleótido hibrida con un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATO, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosín-5’-fosfosulfato y luciferina. Los dNTP se añaden individualmente y la incorporación tiene como resultado una señal lumínica que se mide. Una señal lumínica indica la presencia de la secuencia del inserto/flanqueante del transgén debido a un amplificación, hibridación y extensión de una o varias base satisfactorios.

La polarización por fluorescencia como describen Chen, et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999) es un procedimiento que se puede usar para detectar el amplicón de la presente invención. Usando este procedimiento se diseña un oligonucleótido que solapa la unión entre el ADN genómico flanqueante y el insertado. El oligonucleótido hibrida con un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y uno en la secuencia de ADN genómico flanqueante) ) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado con fluorescencia . La extensión de una sola base tiene como resultado la incorporación del ddNTP. La incorporación se puede medir como un cambio en la polarización usando un fluorímetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia del inserto/flanqueante del transgén debido a un amplificación, hibridación y extensión de una base satisfactorios.

Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) se describe como un procedimiento de detección y cuantificación de la presencia de una secuencia de ADN y se entiende completamente en las instrucciones proporcionadas por el fabricante. En resumen, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET que solapa la unión entre el ADN genómico flanqueante y el insertado. La sonda FRET y los cebadores para PCR (un cebador en la secuencia de ADN insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET tiene como resultado la escisión y liberación del resto fluorescente lejos del resto de inactivación en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto transgénico/flanqueante del transgén debido a un amplificación, hibridación satisfactorios.

Se han descrito balizas moleculares para su uso en la detección de secuencia, como se describe en Tyangi, et al. (Nature Biotech. 14:303-308, 1996). En resumen, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET que solapa la unión entre el ADN genómico flanqueante y el insertado. La estructura única de la sonda FRET tiene como resultado que contiene una estructura secundaria que conserva los restos fluorescente y de inactivación muy cercanos. La sonda FRET y los cebadores para PCR (un cebador en la secuencia de ADN insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y Dntp. Tras la amplificación por PCR con éxito, la hibridación de la sonda FRET a la secuencia diana tiene como resultado la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de inactivación que tiene como resultado la producción de una señal fluorescente. La señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto transgénico/flanqueante del transgén debido a un amplificación, hibridación satisfactorios.

Otros procedimientos descritos, tales como microfluidos (pub. de patente de EE.UU., 2006068398, patente de EE.UU. Nº 6,544,734) proporcionan procedimientos y dispositivos para separar y amplificar muestras de ADN. Los pigmento ópticos usados para detectar y cuantificar moléculas de ADN específicos (documento WO/05017181). Dispositivos de nanotubos (documento WO/06024023) que comprenden un sensor electrónico para la detección de moléculas de ADN o nanoesferas que se unen a moléculas de ADN específicas y, después, se pueden detectar.

Los kits de detección de ADN se proporcionan usando las composiciones divulgadas en el presente documento. Los kits son útiles para la identificación del ADN del evento de maíz MON89034 en una muestra y se puede aplicar al menos a los procedimientos para cultivar plantas de maíz que contienen el ADN del evento adecuado. Los kits contienen cebadores y/o sondas de ADN que son homólogas o complementarias de segmentos seleccionados de la secuencias como se exponen en las SEC ID Nº 1-7 o cebadores o sondas complementarias del ADN contenidas en los elementos genéticos transgénicos de ADN como se expone en el listado de secuencias. Estas secuencias de

ADN se pueden usar en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un procedimiento de hibridación de ADN para detectar la presencia de polinucleótidos diagnósticos de la presencia del ADN diana en una muestra. La producción de un amplicón predefinido en una reacción de amplificación térmica es diagnóstica de la presencia de ADN correspondiente al ADN del genoma de PTA-7455 en la muestra. Si se selecciona la hibridación, la detección de la hibridación de la sonda con la muestra biológica es diagnóstica de la presencia del ADN del evento transgénico MON89034 en la muestra. Normalmente, la muestra s maíz, o productos de maíz o subproductos del uso de maíz.

La presente invención proporciona una planta de maíz transgénico designada como evento de maíz MON89034, progenie de la planta y células de la planta, así como semillas producidas por la planta. Semillas representativas para cultivar la planta para producir la progenie, para obtener células o para producir un cultivo de dichas semillas que comprendan el evento de maíz transgénico se han depositado el 28 de marzo de 2006 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y con el número de acceso PTA-7455.

La planta y las células y productos producidos por estas realizaciones y similares contienen ADN que es diagnóstico de la presencia de ADN derivado de cualquier célula derivada de evento de maíz transgénico MON89034 en cualquier muestra biológica. Esto es porque estas dos nuevas secuencias están contenidas dentro de las células del evento de maíz transgénico MON89034. El ADN diagnóstico comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5. La relación de estas secuencias se describe, más particularmente en el presente documento y en la leyenda de la Figura 1 y con referencia a la Figura 1.

Las plantas de maíz cultivadas a partir de semillas que son homocigotas para el ADN diagnósticas del evento de maíz transgénico MON89034 también entran dentro del alcance de la presente invención. Las plantas de maíz cultivadas a partir de semillas que son heterocigotas para el ADN diagnósticas del evento de maíz transgénico MON89034 también entran dentro del alcance de la presente invención siempre que estas semillas también comprenden las secuencias de ADN diagnóstico.. Las células, semillas y tejido producidos a partir de dichas plantas que comprenden el ADN diagnóstico también entran dentro del alcance de la presente invención.

Las plantas de maíz y las células de plantas de maíz y similares que comprenden ADN diagnóstico para el evento de maíz transgénico MON89034 exhiben resistencia a la infestación por insectos lepidópteros. Estas células y plantas contienen ADN que codifica la proteína insecticida (insecticida, agente tóxico) Cry2Ab y ADN que tiene las secuencias nucleotídicas de la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2 que forman una parte del genoma de las células de la planta. Estas plantas y células vegetales también contienen un ADN que codifica la proteína insecticida (insecticida, agente tóxico) Cry1A.105. Estas proteínas se pueden denominar primera y segunda proteína insecticida, respectivamente o al contrario. La expresión de estas proteínas se consigue a partir de componentes reguladores/elementos genéticos que están incluidos dentro de los casetes de expresión que proporcionan la expresión de cada una de las secuencias de ADN que codifican estas toxinas y se describen completamente en el presente documento y en la leyenda de la Figura 1 y con referencia a la Figura 1, y la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 5. Las plantas de maíz y las células de plantas de maíz que comprenden estas secuencias son eficaces para proteger a las plantas de la infestación por plagas de lepidópteros, ya sean homocigotos u heterocigotos para os alelos en los que están presentes estas secuencias de codificación.

La presente invención también proporciona amplicones que se pueden producir a partir de las secuencias descritas en el presente documento que son diagnósticas de la presencia en una muestra biológica de ADN derivado de ADN del evento de maíz transgénico MON89034. Un amplicón diagnóstico de la presencia del ADN del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra diagnóstica contiene al menos un segmento polinucleotídico que consiste en la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2. Estos amplicones se pueden producir usando secuencias de cebadores como se describe en el presente documento más adelante a partir de cualquier muestra biológica que contiene al menos aproximadamente 05 femtomoles o aproximadamente 0,5 picogramos de ADN derivado del evento de maíz transgénico MOD89034. Dichas fuentes de ADN de la muestra biológica correspondiente al evento de maíz transgénico MOD89034 pueden ser harina de maíz, aceite de maíz, torta de maíz, semilla de maíz, germen de maíz, almidón de maíz y harina de maíz y similares derivados de dicho evento transgénico.

La descripción también proporciona moléculas de polinucleótidos aislados que exhiben secuencias de nucleótidos contiguas tales como las que se exponen en la SEC ID Nº 5. Estas secuencias de nucleótidos contiguas comprenden: (1) de aproximadamente 11 a aproximadamente12000 nucleótidos y cualquier longitud entremedias y comprenden adicionalmente los nucleótidos contiguos como se exponen en la posición nucleotídica 1-11 o 9-20 en la SEC ID N1 1 y 1-11 i 9-20 como se expone en la SEC ID Nº 2; (2) cualquier secuencia de nucleótidos contiguos como se expone en la SEC ID Nº 3 de aproximadamente 11 a aproximadamente 2000 nucleótidos y cualquier longitud entremedias y comprenden adicionalmente los nucleótidos contiguos como se exponen en la posición nucleotídica 1-11 y 9-20 como se expone en la SEC ID Nº 1; cualquier secuencia de nucleótidos contiguos como se expone en la SEC ID Nº 4 de aproximadamente 11 a aproximadamente 914 nucleótidos y cualquier longitud entremedias, y que además comprende los nucleótidos contiguos como se expone en la posición nucleotídica 1-11 y 9-20 contiguos como se expone en la SEC ID Nº 2. Estas moléculas polinucleotídicas aisladas son útiles en los procedimientos de amplificación de ADN para producir uno o más amplicones de una muestra biológica que contiene ADN de maíz. La detección de dicho amplicón es diagnóstica de la presencia del ADN del evento de maíz

transgénico MON89034 en la muestra. Las moléculas polinucleotídicas aisladas también son útiles en varios procedimientos de detección de nucleótidos para detectar la presencia de ADN derivado del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica. En particular, las sondas polinucleotídicas que comprenden al menos aproximadamente 11 nucleótidos contiguos como se expone en la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 son útiles como sondas en dichos procedimientos para detectar el ADN del evento transgénico MON89034 en una muestra. Las secuencias complementarias de estas moléculas polinucleotídicas aisladas también son útiles en los mismos procedimientos de detección y/o amplificación.

También se proporcionan kits para usar en la detección de la presencia de ADN derivado del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica. Un kit usa una molécula polinucleotídica de sonda, conteniendo la molécula sonda al menos de aproximadamente 11 a aproximadamente 12000 nucleótidos contiguos que exhiben una homología sustancial o que exhiben una complementariedad sustancial con un segmento nucleotídico que comprende una secuencia como se expone en la SEC ID Nº 5 sería útil para detectar la presencia de ADN de MON89034 en una muestra. La molécula sonda debería contener al menos una de las secuencias como se exponen en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2. Las secuencias expuestas en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2 también se pueden denominar secuencias de unión, es decir, las secuencias en cualquiera de los extremos del ADN transgénico insertado en la planta de maíz, para dar lugar al evento de maíz transgénico MON89034. Estas secuencias, denominadas arbitrariamente extremos 5` y 3’ respectivamente, contienen parte de la secuencia de ADN insertada y parte de la secuencia del genoma de maíz flanqueante. Por ejemplo, la SEC ID Nº 1 representa en su extremo 5’ la mitad del extremo 3’ de la secuencia genómica flanqueante del extremo 5’ del ADN insertado, estando representado el extremo 5’ del ADN insertado por la mitad del extremo 30 de la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 1. La SEC ID Nº 2 representa en su extremo 5’ la mitad del extremo 3’ del ADN insertado y en su extremo 3’ la mitad del extremo 5’ de la secuencia del genoma de maíz flanqueante del extremo 3’ del ADN insertado. En el genoma de maíz de origen natural en la posición de la secuencia insertada expuesta en la SEC ID Nº 5, la secuencia flanqueante en el extremo 5’ del ADN insertado y la secuencia flanqueante en el extremo 3’ del ADN insertado están unidas y una primera molécula cebador que hibrida con la secuencia complementaria de la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 3 (aparte de os 21 nucleótidos del extremo 3’ de la SEC ID Nº 3) y una segunda molécula cebador que hibrida con la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 4 (parte de los 20 nucleótidos del extremo 5’ de SEC ID Nº 4) producirá un amplicón en una reacción de amplificación térmica con el molde que es ADN distinto al ADN de MON89034 que es diagnóstico de la ausencia del ADN insertado en MON89034 y los mismos cebadores producirán un amplicón que es ligeramente más largo de 12000 nucleótidos (dependiendo de la posición de los cebadores en las secuencias flanqueantes expuestas en la SEC ID Nº 3 y la SEC ID Nº 4) cuando se usa ADN de MON89034 como molde. También se proporcionan otras realizaciones.

Se proporciona un kit para detectar la secuencia de unión SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2 del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica. El kit contiene una sonda polinucleotídica que está o es completamente complementaria de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2 o complementarias de las mismas, y también contiene un par de cebadores para usar en una reacción de amplificación de ácido nucleico. El par de cebadores se puede denominar primer cebador que consiste en al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos de la porción del genoma de maíz de la SEC ID Nº 3 y un segundo cebador que consiste en al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos complementarios de la porción de ADN heterólogo insertado de la SEC ID Nº 5. El primer cebador del par de cebadores polinucleotídicos hibrida específicamente con la secuencia complementaria inversa correspondiente a la expuesta en la SEC ID Nº 3 de aproximadamente la posición nucleotídica 1 a aproximadamente la posición 2050 t el segundo cebador de dicho par de cebadores polinucleotídicos hibrida específicamente con la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 5 de aproximadamente la posición 2060 a aproximadamente la posición 12208 y se extienden uno hacia otro para formar un amplicón que comprende la SEC ID Nº 1, siendo dicho amplicón diagnóstico de la presencia de ADN del evento MON89034 en la muestra. Un par de cebadores diferente se puede denominar primer cebador que consiste en al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos complementarios de la porción del genoma de maíz de la SEC ID Nº 4 y un segundo cebador que consiste en al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos de la porción de ADN heterólogo insertado de la SEC ID Nº 5. El segundo cebador del par de cebadores polinucleotídicos hibrida específicamente con la secuencia complementaria inversa correspondiente a la expuesta en la SEC ID Nº 5 de aproximadamente la posición nucleotídica 1 a aproximadamente la posición 11305 y el primer cebador del par de cebadores polinucleotídicos hibrida específicamente con la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 4 de aproximadamente la posición 21 a aproximadamente la posición 914 y se extienden uno hacia otro para formar un amplicón que comprende la SEC ID Nº 2, siendo dicho amplicón diagnóstico de la presencia de ADN del evento MON89034 en dicha muestra.

Estos pares de cebadores son útiles en la producción de amplicones que comprenden la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2, según sea el caso, y son, por tanto, diagnósticos de la presencia de ADN de MON89034 en una muestra biológica. Estos amplicones permiten la detección de la presencia de una secuencia de unión diagnóstica del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica.

También se proporciona un procedimiento para producir y detectar un amplicón que es diagnóstico de un ADN de evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica que comprende ADN de maíz. El procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica junto con dos o más cebadores en una reacción de amplificación

de ácido nucleico, realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, después detectar el amplicón. La presencia del amplicón es diagnóstica de dicho ADN del evento en la muestra siempre que el amplicón contenga al menos una de las secuencias contiguas como se expone en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2, de aproximadamente la posición nucleotídica 1-11 o 9-20, o las secuencias complementarias correspondientes a estas posiciones.

Las secuencias nucleotídicas diagnósticas de la presencia del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica también se pueden detectar usando otros procedimientos. Por ejemplo, poner en contacto una muestra biológica que se sospecha que contiene ADN de MON89034 con una sonda que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una o más secuencias de nucleótidos como se exponen en la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2, someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas y, después, detectar la hibridación de la sonda con la secuencia nucleotídica. La detección de la hibridación es diagnóstica de la presencia del ADN de MON89034 en la muestra.

Los polinucleótidos cebadores para usar en la producción, en una reacción de amplificación térmica, la presente invención también proporciona un amplicón que es diagnóstico de la presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica. Normalmente, los cebadores se proporcionan en pares, denominándose los miembros del par de cebadores por comodidad primer cebador y segundo cebador. Un primer cebador puede consistir en al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de la porción de genoma del maíz como se expone en la SEC ID Nº 3 y un segundo cebador puede consistir en al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos complementarios de la porción de ADN insertado heterólogo como se expone en la SEC ID Nº 5. Estos dos cebadores producirían un amplicón en una reacción de amplificación térmica con el ADN molde obtenido del ADN del evento de maíz MON89034 que contiene una secuencia de polinucleótidos como se expone en la SEC ID Nº 1. Como alternativa, un primer cebador puede consistir en al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de la porción del genoma de maíz de SEC ID Nº 4 y un segundo cebador puede consistir en al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos complementarios de la porción de ADN insertado heterólogo de SEC ID Nº 5. Estos dos cebadores producirían un amplicón en una reacción de amplificación térmica con un ADN molde obtenido del ADN de evento de maíz MON89034 que contiene una secuencia de polinucleótidos como se expone en la SEC ID Nº 2.

Un procedimiento alternativo para detectar una secuencia de unión del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica que comprende ADN de maíz, tal como la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2, consiste en poner en contacto la muestra con una sonda polinucleotídica que hibrida en condiciones rigurosas con una de las secuencias de unión, someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas y detectar la hibridación de la sonda con la secuencia de unión. La detección de la unión/hibridación de la sonda a la secuencia de unión es indicativa de la presencia del ADN de MON89034 en la muestra biológica. Una planta de maíz transformado de forma estable, el ADN que produce un amplicón de ADN que comprende la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 cuando se somete a procedimiento expuesto en el presente documento, está dentro del alcance de la presente invención. Ejemplos de secuencias de cebadores, en particular, un par de secuencias de cebadores, se exponen en el presente documento en los ejemplos y en las SEC ID Nº 6 yla SEC ID Nº 7.

Un procedimiento alternativo de detectar la presencia del ADN del evento MON89034 en una muestra biológica puede consistir en las etapas de poner en contacto la muestra con una sonda que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con ADN de MON89034 y no hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con ADN genómico de la planta de la planta de maíz que no es ADN de MON89034, someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas y, después, detectar la hibridación de la sonda con el ADN de MON89034. Una sonda consistente con esta realización es o es complementaria de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2. La detección de la hibridación de la sonda a la muestra es diagnóstica de la presencia del polinucleótido del evento de maíz MON89034 en la muestra. La muestra biológica puede ser cualquier muestra que contiene ADN de MON89034, incluyendo, entre otros, aceite de maíz, harina de maíz, harina de maíz, gluten de maíz, tortas de maíz, almidón de maíz, licor de maceración de maíz, tejido de maíz, células de maíz, grano de maíz, polen de maíz, tejido de raíz de maíz, DDGS e incluso etanol producido como un subproducto de la fermentación de dicho maíz transgénico siempre que la muestra contenga al menos una cantidad detectable de un polinucleótido diagnóstica de la presencia del evento MON89034 en la muestra. Una sonda polinucleotídica puede ser cualquier nucleótido seleccionado del grupo que consiste en un ácido desoxirribonucleico, un ácido ribonucleico y un análogo nucleotídico y puede estar marcado con al menos un fluoróforo, molécula que contiene un isótopo radioemisor, o una molécula de tipo hapteno que se puede detectar específicamente con un anticuerpo u otra reacción de tipo unión.

Una variedad de maíz que comprende un ADN diagnóstico de la presencia de un ADN del evento transgénico MON89034 se puede obtener cultivando una planta de maíz que comprende ADN del evento de maíz transgénico MON89034 junto con una planta de maíz que no sea el evento MON89034 para producir una planta de maíz híbrida que comprende ADN diagnóstico de dicho evento. Dicha planta de maíz híbrida que comprende ADN diagnóstico del evento de maíz transgénico MON89034 está dentro del alcance de la presente invención, como las semillas producidas a partir del híbrido (siempre que comprenda ADN diagnóstico del evento de maíz transgénico MON89034) y polen, óvulos, semillas, raíces u hojas de la planta de maíz híbrida MON89034, también en la medida en que contienen las secuencias de ADN diagnóstico y la progenie producida a partir de dichas realizaciones.

La presente invención proporciona un procedimiento para proteger una planta de maíz frente a la infestación por insectos lepidópteros que comprende proporcionar en la diana de una plaga de insectos lepidópteros diana una o más células de la planta de maíz transgénica, comprendiendo cada célula de la planta de maíz en su genoma un polinucleótido correspondiente a la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2 y la secuencia de nucleótidos contiguos como se expone en la SEC ID Nº 5 entre la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2. Se inhibe la alimentación adicional el insecto lepidóptero diana que se alimenta de dichas células de plantas vegetales transgénicas de la planta de maíz de la que deriva las células de la planta de maíz.

La presente invención también proporciona composiciones que son tóxicas para plagas de lepidópteros diana de plantas de maíz. Una composición de células vegetales transgénicas proporcionada en la dieta de una plaga de insectos lepidópteros diana, en la que cada célula de la planta de maíz transgénico comprende en su genoma un polinucleótido correspondiente a la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2 junto con la secuencia de nucleótidos contiguos como se expone en la SEC ID Nº 5 entre la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2, es eficaz para proporcionar protección contra la infestación por insectos lepidópteros a una planta de maíz o célula de la planta de maíz, siempre que la planta de maíz o la célula exprese Cry1A.105 y/o Cry2Ab2 de los casetes de expresión contenidos dentro de la secuencia de nucleótidos contiguos.. Dichas composiciones, en forma de semillas de maíz transgénico, se han depositado en el Cultivo Americano de Cultivos Tipo con el número de acceso PTA7455. Dichas plantas de maíz resistentes a insectos, o partes de las mismas, contendrán ADN en el genoma de las células de dicha planta que tienen al menos una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5. La progenie y las semillas de la planta de maíz resistente a insectos, en las que la progenie y las semillas tienen las secuencias diagnósticas a las que se hace referencia en el presente documento, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Dichas plantas de maíz resistentes a insectos se pueden producir en un procedimiento que comprende cruzar un evento de planta de maíz transgénico MON89034 con una planta de maíz diferente y seleccionar la progenie resistente al insecto analizando al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5.

El evento de maíz transgénico MON89034 resistente a insectos se puede combinar con otras variedades transgénicas de maíz, tal como maíz resistente a herbicidas, tales como glifosato, glifosinato y diacamba, y similares, o maíz resistente a insectos devoradores de raíces como resultado de la inserción de secuencias que codifican proteínas tales como PS149B1 y Cry3Bb modificada, u otras variedades de maíz transgénico resistente a la infestación por insectos lepidópteros como resultado de la inserción de secuencias que codifican otras proteínas tóxicas, tales como VIP3A, Cry1Ab, y CrylFa y similares. Varias combinaciones de todos estos eventos transgénicos diferentes se cultivan junto con las plantas de maíz de la presente invención, es decir el evento MON89034, para proporcionar variedades mejoradas de maíz transgénico híbrido resistente a la infestación por coleópteros y lepidópteros y resistentes a herbicidas selectivos. Dichas variedades exhiben un rendimiento mejorado y tolerancia a la sequía en comparación con las variedades transgénicas de rasgo individual y no transgénicas.

Se proporciona un procedimiento de producir una planta de maíz resistente a la infestación por insectos, en el que la planta de maíz comprende una cantidad insecticidamente eficaz de las secuencias de codificación de la toxina como se expone en la SEC ID Nº 5. El procedimiento comprende extraer las secuencias de codificación de la toxina del evento de maíz transgénico MON89034 e introducir estas secuencias de codificación, solas o juntas, en una o más células de maíz, para producir células de maíz transgénico que comprenden estas una o más secuencias de codificación de la toxina. Las células de maíz transgénico se cultivan después (regeneran) en plantas de maíz transgénico que comprenden la una o más secuencias de codificación y las plantas transgénicas exhiben después resistencia a la infestación por insectos.

Por la presente invención se proporciona un procedimiento para determinar la cigosidad del ADN de una planta de maíz transgénico que comprende el ADN del evento de maíz MON89034 con respecto al ADN que es diagnóstico de la presencia de dicho ADN de MON89034 en una muestra biológica. El procedimiento consiste en, como primera etapa, poner en contacto la muestra con tres cebadores diferentes que comprenden las SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, and SEQ ID NO:10, que cuando se usan juntas en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN del evento de maíz MON89034, produce un primer amplicón que es diagnóstico del evento de maíz MON89034 y cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN genómico distinto al ADN de MON89034 produce un segundo amplicón que es diagnóstico del ADN genómico de maíz distinto al ADN de MON89034. Las siguientes etapas consisten en realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico y comparar los amplicones producidos durante la reacción de amplificación térmica. La detección de la presencia de ambos amplicones es diagnóstica de la cigosidad de la muestra. La detección de únicamente el primer amplicón es indicativa de la muestra que solo contiene ADN de MON89034, es decir una muestra homocigota. La detección de únicamente el segundo amplicón es indicativa de la muestra que no contiene ADN de MON89034. La detección del primer y el segundo amplicón juntos en una muestra es indicativa de una muestra que contiene (1) ADN heterocigoto con referencia a una muestra pura que solo contiene material de partida heterocigota o (2) una muestra que contiene el ADN de la muestra de partida homocigota y heterocigota o (3) una muestra que contiene alguna combinación de muestras homocigotas, heterocigotas y/o distintas al ADN de MON89034.

La invención también proporciona cultivar las plantas de maíz que comprenden ADN diagnóstico de un segmento de ADN transgénico insertado en el genoma de las células de las plantas de maíz. El ADN en el genoma de las células de maíz comprende una cualquiera o todas las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:

1.

(a) la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº 5,

2.

(b) las dos secuencias de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2;

3.

(c) la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº 3; y

4.

(d) la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº 4.

Los ejemplos siguientes se incluyen para demostrar ejemplos de determinadas realizaciones preferidas de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la construcción y caracterización molecular del evento de maíz transgénico MON89034.

La planta de maíz MON89034 se produjo mediante un proceso de transformación mediada por Agrobacterium de una línea de maíz endogámica con la construcción plasmídica pMON38850 (el casete de expresión se muestra en la Figura 1). El procedimiento de transformación usado es similar al descrito en la patente de EE.UU. Nº 6,603,061. La construcción plasmídica pMON38850 contiene los casetes de expresión vegetal unidos con los elementos genéticos reguladores necesarios para la expresión de la proteína insecticida Cry1A.105 en células de planta de maíz. Las células de maíz se regeneraron en plantas de maíz intactas que consisten en al menos aproximadamente 23.000 eventos transgénicos diferentes. Los eventos transgénicos individuales (plantas) se seleccionaron de la población de eventos que mostraron integridad de los casetes de expresión de la planta y resistencia al daño por la alimentación de larvas de insectos lepidópteros. Una planta de maíz que contiene en su genoma los casetes de expresión vegetal unidos de pMON38850 es un aspecto de la presente invención. Tras el análisis sustancial de estos eventos transgénicos, el evento transgénico MON89034 se seleccionó en base a su caracterización molecular y la ausencia de cualquier efecto de deficiencia fenotípica o agronómica indeseable.

Las secuencias de los elementos genéticos transgénicos contenidas en el genoma de maíz MON89034 como se ilustra en la Figura 1 consiste en los elementos siguientes, cada uno en unión operable entre sí. Primero, en el extremo 5’ definido de forma arbitraria de la secuencia (es decir, cerca de la porción central izquierda del segmento representado en la Figura 1) hay una porción marcada en la región del lado derecho (RB) de Agrobacterium tumefaciens. A esto le sigue en términos de la secuencia un casete de expresión que consiste en un elemento promotor CaMV 35S potenciado (en lo sucesivo denominado P-CaMV35Sen, localizado en las posiciones 2350 a 2651 en la SEC ID Nº 5); una secuencia líder no traducida de la proteína de unión A/B de la clorofila de trigo (en lo sucesivo denominado L-Ta.lhcb1, localizado en las posiciones 2678 a 2738 en la SEC ID Nº 5); una secuencia intrónica de la actina de arroz (en lo sucesivo denominado I-Os.Act1, localizado en las posiciones 2755 a 3234 en la SEC ID Nº 5); una secuencia de origen no natural que codifica el gen quimérico Cry1A.105 (localizado en las posiciones 3244 a 6777 en la SEC ID Nº 5) y una región de terminación en 3’ del trigo (en lo sucesivo denominado T-Ta.Hsp17-1:1:1, localizado en las posiciones 6809 a 7018 en la SEC ID Nº 5). La combinación de los elementos citados con anterioridad, aparte de la secuencia del borde, funcionan juntos cuando están en una planta de maíz para producir la expresión de la proteína insecticida Cry1A.105. Estos elementos se unen después en la secuencia a otro casete de expresión que consiste en los elementos siguientes: un promotor del mosaico de la escrofularia (localizado en las posiciones 7086 a 7649 en la SEC ID Nº 5), una líder de Hsp70 de Zea mays (en el presente documento denominada HSP70 o I-Hsp70, localizada en las posiciones 7672 a 8475 en la SEC ID Nº 5), y una secuencia de codificación del péptido tránsito al cloroplasto de Zea mays (en el presente documento denominado CTP2 o TS-SSU-CTP, localizado en las posiciones 8492 a 8892 en la SEC ID Nº 5). Estos segmentos unidos de forma operable se unen después a una secuencia de nucleótidos que codifican la proteína insecticida Cry2Ab (localizada en las posiciones 8893 a 10800 en la SEC ID Nº 5), que está unida en su extremo 3’ a una región no traducida en 3’ del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (en el presente documento denominado T-AGRtu.nos-1:1:13, localizado en las posiciones 10827 a 11377 en la SEC ID Nº 5). Estos elementos que flanquean la secuencia de codificación Cry2Ab funcionan en conjunto para dirigir la expresión de Cry2Ab cuando están presentes en una planta de maíz. Al casete de expresión de Cry2Ab le sigue en secuencia una secuencia de nucleótidos que consiste en una porción suficiente de la región del borde izquierdo (LB) de Agrobacterium tumefaciens.

Las moléculas de ADN útiles como cebadores en los procedimientos de amplificación de ADN pueden derivar de las secuencias de los elementos genéticos del inserto transgénico contenido en el evento MON89034. Estas moléculas cebadoras se pueden usar como parte de un conjunto de cebadores que también incluye una molécula cebadora de ADN derivada del genoma del evento flanqueante del inserto transgénico.

La porción del ADN plasmídico pMON38850 insertado en el genoma del maíz, que da lugar al evento de la planta de maíz transgénica MON89034, que consiste en los segmentos de los bordes derecho e izquierdo y los dos casetes de expresión vegetal unidos (un primer casete de expresión que codifica Cry1A.105 y un segundo casete de expresión que codifica Cry2Ab, en el que cada casete puede ser intercambiable en lo que respecta a su uno se designa como un casete primero o segundo) entre los segmentos del borde se caracterizó mediante análisis molecular detallado. Estos análisis se realizaron para identificar eventos que contenían únicamente un único segmento insertado intacto que consiste en los bordes y os dos casetes de expresión deseados entre los bordes (número de sitios de integración dentro del genoma de maíz), el número de copias (el número de copias del ADN de transformación (T) dentro de un locus y la integridad de los casetes génicos insertados (es decir, ausencia de reordenamientos o variación de secuencia con respecto a la secuencia que se sabe que está presente en el plásmido pMON38850). Se usaron sondas moleculares de ADN que incluían la región codificadora de Cry1A.105 intacta y sus respectivos elementos reguladores, los promotores, intrones y secuencias de poliadenilación de los casetes de expresión vegetales y la región de ADN de la estructura del plásmido pMON38850. Los datos obtenidos de los análisis de todos los eventos demostraron que MON89034 contiene una única inserción de ADN de transformación (T) con una copia del casete de expresión Cry1A.105. No se detectaron en el genoma de MON89034 segmentos adicionales del vector de transformación pMON38850, unidos o no unidos a casetes génicos intactos. Por último, se realizaron análisis de PCR y de la secuencia de ADN para determinar las uniones en 5' y 3’ del genoma del inserto en la planta, se confirma la organización de los elementos dentro del inserto (véase, por ejemplo, la Figura 1), y para determinar la secuencia completa del ADN insertado en el genoma de la planta de maíz que dio lugar al evento de maíz transgénico MON89034. La secuencia insertada completa, junto con una porción de las secuencias flanqueantes del genoma de maíz en cualquiera de los extremos del ADN insertado, se representa en la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 5.

EL ADN genómico de MON89034 y no se extrajo ADN no transgénico del maíz aparte de MON89034 (ADN control) de la semilla de maíz procesando primero la semilla (hasta 200 semillas) en un polvo fino en un agitador de pintura Harbil 5G-HD (Harbil Inc, Cincinnati, Ohio). En resumen, la semilla en polvo se extrajo en el tampón de extracción (EM Science Nº de Cat., EM Science, Gibbstown, New Jersey, EE.UU.) y el ADN precipitó en una solución con isopropanol (Sigma Nº de Cat. I-0398, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). El ADN precipitado se desenrolló en un tubo de microcentrífuga que contenía 70% de etanol. El ADN se sedimentó en una microcentrífuga a velocidad máxima (aprox.14,000 rpm) durante  5 minutos, se secó al vacío y se volvió a disolver en tampón ET (pH 8,0). Después, el ADN se almacenó en un refrigerador a 4ºC. Un experto en la técnica puede modificar este procedimiento para extraer ADN de una única semilla de maíz.

Ejemplos de procedimientos usados para identificar el evento MON89034 en una muestra se describen en un criterio de valoración específico del evento TAQMAN® PCR del que se describen ejemplos de condiciones en la Tabla 1 y la Tabla 2. Los cebadores de ADN usados en los ensayos son los cebadores SQ2842 (SEC ID Nº 6), SQ2843 (SEC ID Nº 7), cebador PB880 marcado con 6FAM™ (SEC ID Nº 14) y el cebador PB2931 marcado con VIC™ (SEC ID Nº 15), 6FAM y VIC son productos colorantes fluorescentes de Applied Biosystems (Foster City, CA) unidos a los cebadores de ADN. Para las sondas TAQMAN® MGB, la actividad 5'-exonucleasa de la ADN polimerasa Taq escinde la sonda desde el extremo 5’ entre el fluoróforo y el inactivador. Cuando se hibrida con la hebra de ADN diana, el inactivador y el fluoróforo se separan lo suficiente en el espacio tridimensional para producir una señal fluorescente (longitud de onda de excitación del fluoróforo).

SQ2842 (SEQ ID NO:6) y SQ2843 (SEC ID Nº 7), cuando se usan en estos procedimientos de reacción con PB880 (SEC ID Nº 14) producen un amplicón de ADN que es diagnóstico del ADN del evento MON89034. Los controles para este análisis deberían incluir un control positivo del evento que contiene maíz MON89034, un control negativo de maíz no transgénico o de maíz transgénico distinto a MON89034 y un control negativo que no contiene ADN molde.

SQ1564 (SEQ ID NO:17) y SQ1565 (SEC ID Nº 18), cuando se usan en estos procedimientos de reacción con PB351 (SEC ID Nº 21) producen un amplicón que es diagnóstico de Cry1A.105 en MON89034.

Estos ensayos se optimizan para su uso con un sistema Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 o Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 o Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler Otros procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica que producen amplicones que identifican el ADN del evento MON89034 están dentro de la experiencia en la materia.

Cualquier sonda que se une específicamente a la SEC ID Nº 1 o a su secuencia complementaria perfecta en una muestra biológica y contiene al menos 11 nucleótidos contiguos como se expone en la SEC ID Nº 1, o según sea el caso, la complementaria inversa de la secuencia en la SEC ID Nº 1, siempre que la unión se pueda detectar, es diagnóstica de la presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en dicha muestra. Cualquier sonda que se une específicamente a la SEC ID Nº 2 o a su secuencia complementaria perfecta en una muestra biológica y contiene al menos 11 nucleótidos contiguos como se expone en la SEC ID Nº 2, o según sea el caso, la complementaria inversa de la secuencia en la SEC ID Nº 2, siempre que la unión se pueda detectar, es diagnóstica de la presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en dicha muestra.

Cualquier par de cebadores que se use o designe para usar en la producción de un amplicón de una muestra biológica que comprende ADN de maíz y el amplicón comprende la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2, o según sea el caso, comprende ambas secuencias, se considera dentro del alcance de la presente invención. Cualquiera de estos amplicones que comprende la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2, o ambas, se consideran para los fines de la invención divulgadas en el presente documento, que son diagnósticos de la presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en dicha muestra biológica. Los siguientes son ejemplos meramente ilustrativos.

Tabla 1. Criterio de valoración TAQMAN® PCR específico del evento de maíz MON89034

La amplificación del ADN se puede establecer y realizar usando cualquier medio para termociclado, incluyendo manipulaciones manuales o manipulaciones controladas electrónicamente de las etapas y ciclos de temperatura. Se han usad con éxito cicladotes térmicos Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler o Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 o MJ Research DNA Engine PTC-225 para realizar los siguientes parámetros de ciclado. Cuando se realiza la PCR en el Eppendorf Mastercycler Gradient o MJ Engine, el termociclador se cicló en el modo calculado. Al usar el Perkin-Elmer 9700, las condiciones de ciclador se realizaron con la velocidad de pendiente fijada al máximo.

Tabla 2. Condiciones de termociclador del ensayo de cigosidad

Nº de ciclo

Parámetros: Sistema GeneAmp PCR System 9700 de Applied Biosystems

1

50 ºC 2 minutos

1

95 ºC 10 minutos

10

95 ºC 15 segundos

64 ºC 1 minuto (-1ºC/ciclo)

30

95 ºC 15 segundos

54 ºC 1 minuto

1

10 ºC por siempre

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la identificación de una planta de maíz que comprende ADN diagnóstico para el evento de maíz transgénico MON89034 en su genoma y la determinación de la cigosidad de dicha planta de maíz.

Los procedimientos usados para identificar la progenie heterocigota de homocigota que contiene el ADN del evento MON89034 en su genoma se describen en un ensayo de cigosidad para el cual se ilustran las condiciones en la Tabla 3 y la Tabla 4. Los cebadores de ADN ilustrativos usados en el ensayo de cigosidad son cebadores SQ2842 (SEC ID Nº 6), SQ2843 (SEC ID Nº:7), SQ6523 (SEC ID Nº 10), SQ6524 (SEC ID Nº 11), cebador PB880 marcado con 6FAM™ (SEC ID Nº 14) y cebador PB2931 marcado con VIC™ (SEC ID Nº 15). Como se ha indicado anteriormente, 6FAM y VIC son productos colorantes fluorescentes de Applied Biosystems (Foster City, CA) unidos al cebador de ADN.

SQ2842 (SEC ID Nº 6), SQ2843 (SEC ID Nº 7), SQ6523 (SEC ID Nº 10), SQ6524 (SEC ID Nº 11), cuando se usan juntos en una reacción de amplificación térmica en la que una muestra biológica que contiene ADN molde contiene ADN que es diagnóstico de la presencia del evento de maíz MON89034 en la muestra, produce un amplicón de ADN diagnóstico de ADN de maíz distinto al ADN del evento de maíz MON89034 (independiente de su el ADN de maíz deriva de no transgénico de alguna otra muestra transgénica). Como alternativa, a reacción producirá dos amplicones de ADN diferentes de una muestra biológica que contiene ADN derivado de un genoma de maíz que es heterocigoto para el alelo correspondiente al ADN insertado presente en el evento de maíz transgénico MON89034. Estos dos amplicones diferentes corresponderán a un primer amplicón que deriva del locus del genoma de maíz de tipo silvestre y un segundo amplicón que es diagnóstico de la presencia del ADN del evento de maíz MON89034. Una muestra de ADN de maíz que da lugar únicamente a un único amplicón correspondiente al segundo amplicón descrito para el genoma heterocigoto es diagnóstico de la presencia del evento de maíz MON89034 en la muestra y es diagnóstico para determinar que el ADN de maíz usado como molde surge de una semilla de maíz que es homocigota para el alelo correspondiente al ADN insertado del evento de maíz transgénico MON890364. Los controles para este análisis deberían incluir un control positivo del maíz homocigoto y heterocigoto que contiene ADN de maíz MON89034, un control negativo de maíz no transgénico o de cualquier otra variedad de maíz y un control negativo que no contiene ADN molde. Este ensayo se optimiza para su uso con un termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o Eppendorf Mastercycler Gradient. Otros procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica que producen amplicones que identifican la cigosidad de la progenie de cruces realizados con plantas de MON89034 están dentro de la experiencia en la materia.

Tabla 3. Condiciones de reacción del ensayo de cigosidad

La amplificación del ADN en un termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o Eppendorf Mastercycler Gradient o Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 o MJ Research DNA Engine PTC-225 se

han usado con éxito para realizar los siguientes parámetros de ciclado. Cuando se usa Eppendorf Mastercycler Gradient o MJ Engine, los ciclos se realizaron en el modo calculado. Al usar el Perkin-Elmer 9700, los ciclos se realizaron con la velocidad de pendiente fijada al máximo.

Tabla 4. Condiciones de termociclador del ensayo de cigosidad

Nº de ciclos en orden consecutivo

Temperatura y duración

1

50 ºC 2 minutos

1

95 ºC 10 minutos

10

95 ºC 15 segundos

64 ºC 1 minuto (-1ºC/ciclo)

30

95 ºC 15 segundos

54 ºC 1 minuto

1

10 ºC de empapado

a: Usando Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700

La semilla correspondiente al evento transgénico MON89034 se han depositado el 28 de marzo de 2006 según el Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. El número de acceso en la ATCC o designación de depósito de patentes es PTA-7455. El depósito se mantendrá en el depositario durante un periodo de 30 años o 5 años después de la última consulta o para la vida

10 eficaz del patente, lo que sea más largo, y se reemplazará según sea necesario durante dicho periodo.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> MONSANTO TECHNOLOGY LLC Anderson, HEATHER Douglas, Jennifer GROAT, JEANNA JOHNSON, SCOTT KELLY, REBECCA KORTE, JOHN RICE, JAMES

<120> PLANTA Y SEMILLA DE MAÍZ CORRESPONDIENTE AL EVENTO TRANSGÉNICO MON89034 Y SUS 15 PROCEDIMIENTOS DE DETECCIÓN<130> 38-21(53618)0001

<150> 60/808,834

<151> 2006-05-26

<160> 22

<170> PatentIn versión 3.3 20 <210> 1

<211> 21

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> 5' SECUENCIA DE UNIÓN; correspondiente a la SEC ID Nº 5 en 2051-2071

<400> 1 aatgagtatg atggatcagc a 21

<210> 2 5 <211> 20

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> 3' SECUENCIA DE UNIÓN; correspondiente a la SEC ID Nº 5 en 11369-11388

10 <400> 2 actcattgca tccccggaaa 20

<210> 3

<211> 2071

<212> DNA 15 <213> ARTIFICIAL

<220>

<223> 5' SECUENCIA FLANQUEANTE MÁS UNIÓN; correspondiente a la SEQ ID NO:5 en 1-2071

<400> 3

<210> 4

<211> 914

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> 3' SECUENCIA FLANQUEANTE MÁS UNIÓN; correspondiente a la SEC ID Nº 5 en 11369-12282

<400> 4

<210> 5

<211> 12208

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> SECUENCIA DE ADN INSERTADO

<400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA; correspondiente a la SEC ID Nº 5 a 2034-2055

<400> 6

gccaataaaa ggatggtaat ga 22 5 <210> 7

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 10 <223> SECUENCIA SINTÉTICA; correspondiente a la SEC ID Nº 5 en 11345-11367

<400> 7 ctttttctcc atattgacca tca 23

<210> 8

<211> 20 15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 8 20 ggtatccctc cagaccagca 20

<210> 9

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial 25 <220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 9 gtggactcct tctggatgtt gtaa 24

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial 5 <220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 10 gtcagggtgc tgctgctgct a 21

<210> 11 10 <211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

15 <400> 11 ggtttaagaa ccattttgct ccc 23

<210> 12

<211> 24

<212> ADN 20 <213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA; correspondiente a la SEC ID Nº 5 en 2003-2026

<400> 12

tacgtcaggg tgctgctgct acta 24 25 <210> 13

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 13

atratttycg gggatgcaac caac 24 5 <210> 14

<211> 16

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 10 <223> SECUENCIA SINTÉTICA; correspondiente a la SEC ID Nº 5 en 2061-2076

<400> 14 atggatcagc aatgag 16

<210> 15

<211> 26 15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 15 20 ctgtcaagcc aataaaaggg ttgttt 26

<210> 16

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial 25 <220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 16 ctgtcaagcc aataaaaggg ttgttt 26

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 5 <220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 17 caactcgtcc gtgagcatca 20

<210> 18 10 <211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA; complementaria inversa de la secuencia correspondiente a la SEC ID Nº 5 en 15 4605-4628

<400> 18 aactcagcac tacggtgtat ccaa 24

<210> 19

<211> 16 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 19 25 gcctgccgca gaccaa 16

<210> 20

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 20

caatgcagag ctcagcttca tc 22 5 <210> 21

<211> 17

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 10 <223> SECUENCIA SINTÉTICA; correspondiente a la SEC ID Nº 5 en 4587-4603

<400> 21 cagagctcct atgttct 17

<210> 22

<211> 26 15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> SECUENCIA SINTÉTICA

<400> 22 20 tccagtacgt gcagtccctc ctccct 26

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma o semillas de la misma o progenie de la misma, que comprende una molécula de ADN que codifica Cry2Ab and Cry1A.105 en el genoma en las células de dicha planta de maíz, partes de la misma o progenie de la misma, en la que la molécula de ADN comprende los elementos siguientes: promotor e35S, líder sin traducir CAB de trigo, intrón de la actina del arroz, secuencia de codificación para Cry1A.105, secuencia de terminación y poliadenilación de HSP17 3' de trigo, promotor de FMV, intrón hsp70, secuencia de codificación del péptido dirigido a la subunidad pequeña en el cloroplasto de rubisco, secuencia de codificación de Cry2Ab, secuencia señal de poliadenilación y de terminación de nos en 3‘, en la que los extremos colocados opuestos de dicha molécula de ADN son un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2, y en la que dicha molécula de ADN está presente en el evento de maíz MON89034 depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con nº de acceso PTA-7455.

2. 2.

   La planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma o semillas de la misma o progenie de la misma de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 5.

3. 3.

   Una composición derivada de la planta de maíz o partes de la misma como se define en la reivindicación 1 o 2, en la que dicha composición comprende una cantidad detectable de una molécula de ADN que codifica Cry2Ab y Cry1A.105 y ADN que tiene las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº 1 y 2, como se define en las reivindicaciones 1 o 2, y en la que dicha composición es un producto seleccionado de harina de maíz, aceite de maíz, torta de maíz, semilla de maíz, germen de maíz, almidón de maíz, harina de maíz, polen de maíz, barbas de maíz, licor de maceración de maíz, malta de maíz, azúcar de maíz, jarabe de maíz, margarina producida de aceite de maíz, sólidos de productos secos de destilación (DDGS), agente cosmético o formador de volumen.

4. 4.

   Un procedimiento para producir una planta de maíz resistente a insectos, que comprende

   (a)

   transformar una célula de planta de maíz con una secuencia de nucleótidos que comprende la SEC ID Nº 5; Y

   (b)

   regenerar una planta de maíz a partir de dicha célula transformada, en la que dicha planta de maíz comprende dicha molécula de ADN y es resistente a insectos.

5. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, que además comprende:

   (c) seleccionar progenie que comprende secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2, en la que dicha progenie seleccionada es una planta de maíz resistente a insectos, preferentemente dicha etapa de selección (c) incluye someter dicha planta obtenida en (b) a una reacción de amplificación de ácido nucleico, en la que se selecciona la progenie que produce un amplicón que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2, o someter dicha al menos una planta progenie obtenida de (b) a una reacción de hibridación de ácido nucleico, en la que se selecciona la progenie hibrida con una sonda que hibrida en condiciones rigurosas con una o más secuencias de ADN seleccionadas de la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2.

6. 6.

   Un procedimiento de protección de una planta de maíz de la infestación de insectos, que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de lepidópteros del maíz una cantidad insecticidamente eficaz de célula(s) o tejido(s) de la planta de maíz, o partes de la misma, de la reivindicación 1 o 2.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha plaga de lepidópteros se selecciona del cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), taladro europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea), taladro del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella) y gusano gris (Agrotis ipsilon).

8. 8.

   Un par de moléculas de ADN que comprenden: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en el que dicha molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región de ADN de la SEC ID Nº 3 o la SEC ID Nº 5, o complementarias de las mismas, y dicha segunda molécula de ADN comprende una longitud similar de un ADN genómico de maíz flanqueante en 5´ de SEC ID Nº 3 o complementaria de la misma para funcionar como cebadores de ADN o sondas diagnósticas para el ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma.

9. 9.

   El par de moléculas de ADN de la reivindicación 8, en el que:

   (i)

   dicha primera molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos complementarios de la porción de ADN insertada heterólogo de SEC ID Nº 5 y en la que dicha segunda molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de la porción del genoma de maíz de SEC ID Nº 3; o

   (ii)

   dicha molécula de ADN hibrida específicamente con la SEC ID Nº 5 de aproximadamente la posición nucleotídica 2060 hasta aproximadamente la posición nucleotídica 12.208 y en la que dicha segunda molécula de ADN hibrida

   específicamente con la secuencia complementaria inversa correspondiente a la SEC ID Nº 3 de aproximadamente la posición nucleotídica 1 a aproximadamente la posición nucleotídica 2.050.

10. 10.

    Un par de moléculas de ADN que comprenden: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en el que dicha molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región de ADN de la SEC ID Nº 4 o la SEC ID Nº 5, o complementarias de las mismas, y dicha segunda molécula de ADN comprende una longitud similar de un ADN genómico de maíz flanqueante en 3´ de SEC ID Nº 4 o complementaria de la misma para funcionar como cebadores de ADN o sondas diagnósticas para el ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma.

11. 11.

    El par de moléculas de ADN de la reivindicación 10, en el que:

    (i)

    dicha primera molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de la porción de ADN insertada heterólogo de SEC ID Nº 5 y en la que dicha segunda molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de la porción del genoma de maíz de SEC ID Nº 4; o

    (ii)

    dicha molécula de ADN hibrida específicamente con la secuencia complementaria inversa correspondiente a la SEC ID Nº 5 desde aproximadamente la posición nucleotídica 1 hasta aproximadamente la posición nucleotídica

12. 11.305

    y en la que dicha segunda molécula de ADN hibrida específicamente con la SEC ID Nº 4 desde aproximadamente la posición nucleotídica 21 a aproximadamente la posición nucleotídica 914.

13. 12.

    El par de moléculas de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que:

    (i)

    dicha primera molécula de ADN comprende la SEC ID Nº 6 y dicha segunda molécula de ADN comprende la SEC ID Nº 7; o

    (ii)

    dicha primera y segunda molécula de ADN comprende al menos 30 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5.

14. 13. Un procedimiento de detección de la presencia de una molécula de ADN seleccionada de las SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, and SEC ID Nº 5 en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento:

    (a)

    poner en contacto dicha muestra biológica con un par de cebadores de ADN que comprende moléculas de ADN de al menos 18 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 3 o su complementaria, la SEC ID Nº 4 o su complementaria, la SEC ID Nº 5 o su complementaria, para funcionar como cebadores de ADN o sondas diagnósticos del ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma;

    (b)

    proporcionar una condición de reacción de amplificación de ácido nucleico;

    (c)

    realizar dicha reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de este modo una molécula amplicón de ADN; y

    (d)

    detectar dicha molécula amplicón de ADN en la que la detección de un amplicón que comprende al menos una de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2 y complementarias de las mismas es indicativo de dicha molécula de ADN en dicha muestra biológica.

15. 14.

    El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha muestra biológica es una muestra de ADN extraída de una planta de maíz.

16. 15.

    Un procedimiento de detección de la presencia de una molécula de ADN seleccionada de las SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, and SEC ID Nº 5 en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento:

    (a)

    poner en contacto dicha muestra biológica con una sondad de ADN que hibrida en condiciones rigurosas con dicha molécula de ADN y no hibrida en las condiciones rigurosas con una muestra biológica que no contiene dicha molécula de ADN:

    (b)

    someter dicha muestra biológica y sonda de ADN a condiciones de hibridación rigurosas; y

    (c)

    detectar la hibridación de dicha sonda de ADN a dicha muestra biológica, en la que la detección de hibridación es indicativa de la presencia de dicha molécula de ADN en dicha muestra biológica.

17. 16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que:

    (i)

    dicha muestra biológica es una muestra de ADN extraída de una planta de maíz; y/o

    (ii)

    dicha sonda de ADN comprende la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2, o complementaria de las mismas; y/o

    (iii) dicha sonda de ADN está marcada con al menos un fluoróforo.

18. 17.

    El procedimiento de la reivindicación 13 o 15, en la que dicha muestra biológica se selecciona de harina de maíz, aceite de maíz, torta de maíz, semilla de maíz, germen de maíz, almidón de maíz, harina de maíz, polen de maíz, barbas de maíz, licor de maceración de maíz, malta de maíz, azúcar de maíz, jarabe de maíz, margarina producida de aceite de maíz, sólidos de productos secos de destilación (DDGS), agente cosmético o formador de volumen.

19. 18.

    Un kit de detección de ADN que comprenden: al menos una molécula de ADN que comprende al menos 18 nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a las SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, o SEC ID Nº 5, para funcionar como cebador o sonda de ADN específico del evento de maíz MON89034 y/o su progenie.

20. 19.

    El kit de detección de ADN de la reivindicación 18, en el que (i) dicha al menos una molécula de ADN comprende las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, o complementarias de las mismas, preferentemente dicha al menos una molécula de ADN es la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, o complementarias de las mismas; o (ii) dicho kit comprende un par de moléculas de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14.

21. 20.

    Un procedimiento de determinar la cigosidad del ADN de una planta de maíz que comprende el evento de maíz MON89034 en una muestrea biológica que comprende:

    (a)

    poner en contacto dicha muestra con un conjunto de cebadores que comprenden las SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, y SEC ID Nº 10, que (1) cuando se usan juntas en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN del evento de maíz MON89034, produce un primer amplicón que es diagnóstico del evento de maíz MON89034 y (2) cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN genómico distinto al ADN de MON89034 produce un segundo amplicón que es diagnóstico del ADN genómico de maíz distinto al ADN de MON89034.

    (b)

    realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico; y

    (c)

    detectar los amplicones producidos de este modo, en los que la detección de la presencia de ambos amplicones indica que dicha muestra es heterocigota del ADN del evento de maíz MON89034, en el que la detección de sólo el primer amplicón indica que dicha muestra es homocigota para el ADN del evento de maíz MON89034.

22. 21.

    El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dicho conjunto de cebadores se usa adicionalmente con las SEC ID Nº 14 y la SEC ID Nº 15.

23. 22.

    Un procedimiento de detectar la presencia del ADN correspondiente al ADN de planta de maíz MON89034 en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

    (a)

    poner en contacto la muestra que comprende ADN con un par de cebadores que cuando se usan en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de la planta de maíz MON89034, produce un amplicón que comprende las SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2; y

    (b)

    realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, de modo se produce el amplicón; y

    (c)

    detectar al amplicón.

24. 23. Un procedimiento de detectar la presencia del ADN correspondiente al ADN de planta de maíz MON89034 en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

    (a)

    poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con ADN genómico de la planta de maíz MON89034 y no hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una planta de maíz control, en el que dicha sonda es homóloga o complementaria de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2; y

    (b)

    someter la muestra biológica y la sonda de de las condiciones de hibridación rigurosas; y

    (c)

    detectar la hibridación de la sonda al ADN.