CN105229167A

CN105229167A - 从残余的经提取种子样品回收基因组dna

Info

Publication number: CN105229167A
Application number: CN201380072633.7A
Authority: CN
Inventors: B·拉皮尔; C·鲍尔斯; C·斯托尔
Original assignee: Agrigenetics Inc
Current assignee: Agrigenetics Inc
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2016-01-06
Also published as: AR093878A1; AU2013359768A1; WO2014093204A3; CA2892163A1; US20140170651A1; US9631232B2; ZA201503832B; CL2015001601A1; BR112015013425A2; WO2014093204A2; EP2929055A4; EA036151B1; CA2892163C; EP2929055A2; MX2015007370A; EA201591107A1; UY35180A; AU2013359768B2; HK1219114A1

Abstract

本公开涉及从已脱脂的植物种子材料中分离核酸(例如，基因组DNA)。在一些实施方案中，这些核酸具有足够的品质和丰度，使得它们可以用于基于扩增的遗传分析技术；例如但不仅限于，用于在植物育种程序中进行选择。

Description

从残余的经提取种子样品回收基因组DNA

优先权声明

本申请要求获得于2012年12月10日递交的题为“从残余的提取种子样品回收基因组DNA(RECOVERYOFGENOMICDNAFROMREMNANTEXTRACTEDSEEDSAMPLES)的美国临时专利申请系列号61/735,485的申请日的权益。

技术领域

本公开涉及植物生物技术。实施方案涉及用于从残余种子样品分离和分析植物遗传信息，例如以自动化的方式从残余种子样品分离和分析植物遗传信息的系统和/或方法。这样的系统和/或方法可用于，例如但不仅限于，在植物育种程序中进行高效的植物选择。

背景

植物育种的目的是开发新颖、独特并且优良的栽培品种和杂交体。育种者最初选择并杂交两个或多个亲本系，随后重复进行自交和选择，最终产生许多新型的遗传组合。育种者通过杂交、自交和诱变理论上能够产生数以十亿计的不同遗传组合。这样的育种者对该过程没有细胞水平上的直接控制。因此，两个育种者绝不会开发出具有相同性状的相同品系，乃至非常相似的品系。

任何新颖、理想的植物种质的开发都包括许多步骤。植物育种程序将来自两个或多个栽培种的期望性状、或者来自各种广基来源的期望性状组合到育种池中，从中通过对期望表型的自交和选择来开发栽培种。对新栽培种进行评估，以确定哪些具有商业潜力。植物育种最先是分析和确定现有种质的问题和弱点，建立程序目标，并定义具体的育种目的。下一步是选择具有满足程序目标的性状的种质。该目标是将来自亲本种质的期望性状的改良组合合并在单一品种中。这些重要的性状可包括更高的种子产量、抗病性和抗虫性、更好的茎和根、耐旱性和耐热性，以及更好的农艺品质。

育种和选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、被改良性状的可遗传性、和商用栽培种的类型(例如F₁杂交栽培种和纯系栽培种)。对于高度可遗传的性状，在单一地点评估的多个供选择的优良个体植物可能是有效的，而对于可遗传性低的性状，应当基于从相关植物家系的重复评估获得的平均值来进行选择。流行的选择方法一般包括系谱选择、改良系谱选择、混合选择(massselection)、和轮回选择。

遗传的复杂性影响育种和选择方法的选择。例如，回交育种可用于将一个(或少数几个)高度可遗传的性状的有利基因转移到期望的种质中。这种方法被广泛用于选育抗病栽培种。各种轮回选择技术可用于改良被多个基因控制的数量遗传性状。

育种程序通常包括对育种程序的效率进行周期性、客观的评估。评估标准可以随着目标和目的而不同，但是标准可以包括，例如但不仅限于：每年从选择获得的收益(基于与合适的标准的比较)；高级选育品种的总体价值；和每单位输入(例如，每年和花费的每美元)产生的成功栽培种的数量。

然后在可代表产业目标区域的环境中对有前景的高级选育品种进行彻底的测试并与合适的标准进行比较，通常历时3年以上。从最佳的品系中选择新产业栽培种的候选者；少数性状仍存在缺陷者则可以用作亲本以产生用于进一步选择的新群体。这个过程从第一次杂交算起到最终的市场化和销售步骤通常需要8-12年。因此，开发新的栽培种是一个耗时的过程，需要精确的前瞻性规划、有效的资源利用，以及尽可能少的方向变更。

育种程序将来自两个或更多个近交系、或者来自多种广基来源的期望性状组合成育种池，从中通过自交和期望表型的选择开发出新的自交系。杂交品种是两个这样的近交系的杂交：每一个近交系可以具有一种或多种在另一个近交系中不存在的、或者与另一个近交系互补的期望特征。将新的近交植物与其它近交系杂交，并对从这些杂交产生的杂交子进行评估，确定哪些更为优良，或者具有期望的属性。杂交种子是通过选定的雄性可育亲本之间的人工杂交、或者通过使用雄性不育系产生的。根据某些表明种子是真正杂交子的单一基因性状(例如荚色、花色、茸毛色、以及除草剂抗性)对这些杂交子进行选择。亲本系的数据以及杂交子的表型会影响育种者关于是否继续进行特定杂交子的杂交的决定。

因此，开发新的栽培种需要选择亲本品种，使这些品种杂交，和选择优异的杂交体(hybridcross)。鉴定遗传上优异的个体的任务是特别困难的。鉴定优异植物的一种方法是确定植物中的一种或多种表型，例如相对于其它实验植物或者相对于广泛种植的标准栽培种的表型。这个任务是极其困难的，因为(对于大多数性状)，真实的基因型值会被其它干扰性植物性状或环境因素掩盖。因此，通常需要确定特定植物的精确基因型及其表型，以便充分评估和鉴定优异的栽培种和杂交子。

在选择性植物育种过程中开发出的特定植物栽培种的构成是不可预测的。这种不可预测性部分地是由于育种者的选择，育种者的选择发生在独特的环境中，并且不允许DNA水平上的控制(使用环境育种程序的控制)，会产生数百万种不同的可能的遗传组合。具有本领域的普通技术的育种者无法预测其开发的最终所得品系，至多可能是非常粗疏、大概地预测。类似地，同一个育种者不可能使用完全相同的原始亲本和相同的选择技术产生同一栽培种两次。这种不可预测性导致优异的新栽培种的开发需要花费大量的资源、金钱等等。

系谱育种被普遍用于改良自花授粉的作物。在系谱育种中，将两个具备有利的互补性状的亲本杂交以产生F₁后代。通过使来自F₁后代世代的一株或多株植物自交产生F₂群体。最佳个体的选择可以在F₂群体中开始；然后从F₃开始，选择最佳家系中的最佳个体。为了提高对可遗传性低的性状的选择效率，可以在F₄代开始对家系进行反复试验。在近交的高级阶段(例如，F₆或F₇)，对具有相似表型的最佳品系或品系混合物测试作为新的栽培种推出的潜力。

混合和轮回选择可用于改良自交或杂交授粉作物的群体。遗传可变的杂合个体的群体可以通过多种不同亲本的互交加以鉴定或创建。最佳的植物可以根据个体的优势(superiority)、优秀的后代、或优异的组合能力进行选择。使所选植物互交，以产生新的群体，其中可以继续进行进一步轮次的选择。

回交育种已经用于将遗传简单且可遗传性高的性状的基因转移到作为轮回亲本的期望的纯合栽培种或近交系中。待转移的性状的来源是“供体亲本”。所得的植物可望具有轮回亲本(例如栽培种)的属性以及从供体亲本转移而来的期望性状。在最初的杂交之后，选择具有供体亲本表型的个体，并与轮回亲本反复杂交(回交)。所得植物可望具有轮回亲本的属性和从供体亲本转移而来的期望性状。在回交育种过程中，通常在每个世代选择包含期望表型的后代植物。在适当的情况下，还可以根据分子标志(例如遗传标志等位基因和同工酶标志)的存在对后代植物进行选择。

“单粒传过程”(single-seeddescentprocedure)是指种植分离群体，随后收获每个所得植物一个种子样品，并使用收获的一粒种子样品种植下一代。当群体已经从F₂代进展到期望的近交水平时，这些株系的每一个来源植物都可追踪到不同的F₂个体。群体中的植物数量在每一代中均下降，因为一些种子不能萌发，或者一些植物不能产生至少一粒种子。其结果是，当传代推进时，并非群体中初始采样的所有F₂植株均有后代代表。

在多种子过程中，育种者通常从群体的每个植物收获种子，并将它们一起脱粒形成一大批(bulk)。使用该大批的一部分种植下一代，一部分用于储备。这个程序称为改良的单粒传。多种子过程已经被用于节省收获所牵涉的劳力。用机器除去种子比单粒程序中通过手工从每株除去一粒种子要快得多。多种子过程还使得为每一代近交群体播种相同数量的种子成为可能。收获足够多的种子，以补偿没有萌发或没有产生种子的植物数量。

对于油料植物育种者而言，可能会感兴趣的一组性状是油性状(例如，产量和组成)。这在很大程度上是由于这样的事实，即植物来源的油已逐渐取代动物来源的油脂作为膳食脂肪摄入的主要来源。然而，饱和脂肪摄入量在大多数工业化国家中一直保持占总热量消耗的大约15％-20％。为努力促进更加健康的生活方式，美国农业部(USDA)最近建议饱和脂肪占每日热量摄取的少于10％。为了方便消费者认知，由USDA发布的现行标签指南(labelingguideline)现在要求，要获得“低饱和脂肪酸(low-sat)”标签总饱和脂肪酸水平须小于1.0g/14g，要获得“无饱和脂肪酸(no-sat)”标签须小于0.5g/14g。这意味着，植物油的饱和脂肪酸含量需要小于7％和3.5％才能分别获得“低饱和脂肪酸”或“无饱和脂肪酸”的标签。自从发布了这些指南，出现了消费者对“低饱和脂肪酸”或“无饱和脂肪酸”油的需求激增。迄今为止，芥花油(canolaoil)已经大部分满足了这种需求，向日葵油和红花油的满足程度则低得多。

除了直接的人类消费，植物油还具有用于牲畜饲料的附加价值，由于它们具有更高的能量密度，也越来越多地用作生物柴油生产的主要来源，特别是在欧洲。具有高油酸(单不饱和脂肪酸)和/或低水平饱和脂肪酸的植物油与饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸相比，对健康和烹饪相当大的好处。Kinney等.(2002)Biochem.Soc.Trans.30:1099-103；White和Weber(2003)“Lipidsofthekernel,”inCorn:ChemistryandTechnology.第二版,第10卷，White和Johnson编辑,AmericanAssociationofCerealChemists,Inc.,St.Paul,MN,355-95页。

公开

本公开包括系统和方法，用于从残余脱脂植物种子材料中分离高品质的核酸(例如基因组DNA)以供用于基于扩增的遗传分析。据此，实施方案可用于从单粒种子组织来源确定油谱和基因谱二者，其中根据所确定的谱，可以将种子的分离部分保存用于播种或抛弃。在具体实施例中，利用本文系统和/或方法分离和分析的高品质核酸可以提供数据返回大于99％、与叶参考样品的一致性大于大约96％的接合性数据。从单一半种子来源同时鉴定油谱和基因谱可允许育种者仅选择具有期望特征的植物(从含有部分种子的胚种植而得)用于移植，藉此减少田野采样工作量，并提高育种效率。通过利用本文的系统和/或方法以部分非破坏性的方式从单粒种子源获得油和遗传谱，通过仅选择具有优势属性的种质进一步传代，可以大大减少被种植种子的数量。

在一些实施方案中，用于确定植物就至少一个感兴趣的基因而言的基因型的系统可以包括，例如但不仅限于：经过了油提取的种子样品；从脱脂的种子基质溶解DNA；与来自种子样品的核酸结合以产生高品质核酸样品的磁性颗粒(例如磁珠)；用于扩增该高品质核酸样品以产生扩增核酸的手段(例如，聚合酶链反应(PCR))；检测感兴趣的基因或基因座的等位基因的探针(例如，对感兴趣基因的两个等位基因中的每一个特异的寡核苷酸探针)；和根据寡核苷酸探针与扩增核酸杂交或缺乏杂交来确定种子样品的基因型的计算机实现的手段。在特定的实施方案中，用于确定植物就至少一个感兴趣的基因而言的基因型的系统可以是全自动化的，例如通过使用可编程的机器人而全自动化的。

可用于一些实施方案的种子样品包括已被脱脂，例如通过暴露于有机溶剂(例如己烷)脱脂的种子材料。在具体的实施例中，种子材料已经通过正己烷提取而被脱脂。提取的油通过酯交换反应转变成脂肪酸甲酯(FAME)。各种脂肪酸通过气相色谱定量。在具体的实施例中，种子材料可以包括来自油料植物(例如，芸苔属，如芥花(canola)；大豆和向日葵(Helianthusannuus))的种子的样品。

在一些实施方案中，用于确定植物就至少一个感兴趣的基因而言的基因型的方法可包括，例如但不仅限于：自植物提供经过油提取的种子样品；从脱脂的种子样品分离高品质核酸；扩增该高品质核酸；和鉴定扩增的核酸的等位基因组成。在具体的实施方案中，该方法是全自动化的，这可以在整个植物育种程序中的显著地节约成本并提供通量。

通过根据本发明特定实施方案的系统和方法获得的分离核酸样品是足够纯的，使得它们可以用于基于PCR的遗传分析技术。例如，本文的特定系统和方法可以提供和/或包括从脱脂种子材料获得的高品质核酸样品。高品质核酸样品的A₂₆₀/A₂₈₀吸光度比值是大约1.7-大约2.0，并且可能能够通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。

在一些实施方案中，使用通过高品质核酸的遗传分析获得的信息的方法可以包括利用基于PCR的分析技术(例如KASPar分析和分析)。在具体的实施方案中，这样获得的信息可以在包括例如但不仅限于：鉴定栽培种的基因型；在植物育种程序中进行选择；鉴定与感兴趣性状(例如，感兴趣的油性状)连锁的标记；和描述基因与感兴趣性状的关系等应用中使用。

在具体的实施方案中，通过对提取的核酸的遗传分析获得的信息可用于为植物育种程序提供信息和/或指导。这些信息可用于，例如但不仅限于，选择包含至少一种感兴趣的性状与至少一个感兴趣基因的理想组合的种子用于播种和育种。

通过参考附图对下面多个实施方案的详细描述，前述的特征和其它特征将更加不言自明。

附图简述

图1(a-d)包括通过气相色谱分析确定的芥花半种子样品的FAME谱。

图2包括显示从通过溶剂提取脱脂的种子材料分离的芥花DNA的凝胶电泳的图片。一条10kb高分子量条带在所有样品的凝胶上均明显可见，带有一些轻微的拖尾(smearing)。

图3包括从通过溶剂提取脱脂的种子材料(仅Rfo)分离的芥花DNA的RfoTaqman分析的数据。含有纯合(蓝色)、半合(绿色)和空(红色)MagAttract-提取分析对照作为接合性参照。黑色指示无模板对照(NTC)。

图4包括从通过溶剂提取脱脂的种子材料(Rfo,Fad2a,Fad3a,和Fad3c)分离的芥花DNA的RfoTaqman分析的数据。纯合(蓝色)、半合(绿色)和空(红色)分析对照(叶DNA)可以根据菱形(◇)识别。桔黄色指示的样品的接合性不能被确定。NTC用黑色指示。

图5包括从通过FAME提取脱脂的种子材料(Rfo,Fad2a,Fad3a,和Fad3c)回收的芥花DNA的Fad2a、Fad3a、和Fad3cTaqman分析的数据。接合性用MagAttract提取的对照(◇)确定。粉红色指示的样品未能产生可检测的信号。

图6包括从通过溶剂提取脱脂的种子材料(Rfo,Fad2a,Fad3a,和Fad3c)回收的芥花DNA的两个代表性SNP标记(标记1(上)和标记2(下))的KASPar分析数据。每1.3μlKASPar湿反应使用2微升干燥的DNA样品。具有足够品质和产量的样品清晰地聚类为AA、AB或BB基因型，分别用红、绿和蓝色聚类表示。粉色数据点表明没有产生可检测的信号，标识为“失败”。绘出了用稀释的DNA(2X,5X,和10X)检测的两个标志的数据(标志1＝004-05215792；标志2＝040-054761844)。包括了叶参考DNA的图片用于比较。

图7(a-c)包括通过FAME分析确定的芥花半种子样品的油谱和脱脂的残余样品中确定的基因型的比较结果。

图8(a-b)包括可用于种子“分割(sectioning)”以产生可提取的种子材料的示例性设备的照片(图8a；上)，和大豆的照片，其具有指示多个大豆特征的标志(图8b；下)。

图9(a-c)包括通过FAME分析确定的大豆种子样品的油谱。

图10包括显示了从通过溶剂提取脱脂的种子材料分离的大豆DNA的凝胶电泳的图片。一个10kb的条带在所有样品中的凝胶上均明显存在，带有一些轻微的拖尾(smearing)。

图11包括是从通过溶剂提取脱脂的种子材料(群体1)分离的大豆DNA的RR1和RR2Taqman分析的数据。使用用菱形(◇)标识的MagAttract提取的纯合(蓝色)、半合(绿色)和空(红色)叶对照确定接合性。桔黄色指示的样品的接合性未能确定。无模板对照(NTC)用黑色指示。

图12包括从通过溶剂提取脱脂的种子材料(群体2)分离的大豆DNA的RR1和RR2Taqman分析的数据。纯合(蓝色)、半合(绿色)和空(红色)分析对照可通过其菱形辨识。桔黄色指示的样品的接合性未能确定。粉色指示的样品未能产生可检测的信号。NTC同样用黑色指示。

图13包括从通过溶剂提取脱脂的种子材料(B组)分离的大豆DNA的实时AAD12Taqman分析的数据。还从萌发的种子部分提取的叶DNA进行筛选以确认种子样品的接合性。包括了纯合(蓝色)、半合(绿色)和空(红色)MagAttract提取的分析对照用作接合性参照。无模板对照(NTC)用黑色指示。

图14包括用于评估用于从脱脂的向日葵种子材料分离核酸的系统和方法的示例性向日葵种子群体的描述。

图15(a-e)包括通过FAME分析确定的A2组向日葵1/4种子部分的油谱(图15a)和B组向日葵1/4种子部分的油谱(图15(b-e))。生成了品质数据，并且所有油酸值(oleicvalue)均在预期的范围内。标准和品质检查的进行符合预期。

图16包括通过FAME分析确定的向日葵群体1/4种子部分的群体的油谱。

图17包括显示了从通过FAME提取脱脂的种子材料分离的向日葵DNA的凝胶电泳的图片。一个10kb条带在所有样品中的凝胶上均明显存在，带有一些轻微的拖尾，表明存在高分子量和剪切的DNA。

图18包括显示了从通过溶剂提取脱脂的种子材料分离的向日葵DNA的凝胶电泳的图片。

图19包括从通过溶剂提取脱脂的种子材料回收的向日葵DNA的9个代表性(霜霉病特异性)SNP标志的KASPar分析的数据。每4.0μlKASPar反应(384孔格式)使用2微升2X稀释的干燥DNA样品。具有足够品质和产量的样品清晰地聚类为AA、AB或BB基因型，分别用红、绿和蓝色聚类表示。粉色数据点表明没有产生可检测的信号，标识为“失败”。黑色数据点指示“无模板对照”(NTC)。显示了4个测试标志的数据。

图20包括从通过溶剂提取脱脂的种子材料回收的向日葵DNA的9个代表性(霜霉病特异性)SNP标志(与图19所示的相同)的KASPar分析的数据。

图21包括在DNA分离之前在环境温度下长期储存后，从通过FAME提取脱脂的种子材料回收的向日葵DNA的代表性SNP标志的KASPar分析的数据。再次使用与图19和20中所分析的相同的9个霜霉病标志，与5个额外的对“降低饱和脂肪酸”性状高度多态性的SNP(043-0186,043-0568,043-0916,043-1231,和043-1811)组合。DNA被稀释20X，KASParPCR设定为1536孔格式。PCR反应体积(从4μl)减少到1.3μl。包含14个测试标志中4个的数据。

实施本发明的模式

I.数个实施方案的概览

本发明的一些实施方案提供了用于对植物种子样品进行基因分型或表型分型的系统和/或方法，其中种子的残余部分(含有胚)可被选择用于种植和/或栽培。在具体的实施方案中，在这样的种子中确定的植物性状是油性状。

特定植物的油谱是一种复杂的性状，由多个基因的相互作用所产生，关于这些相互作用尚知之甚少。两个具有相似表型的植物可能具有非常不同的基因型，这些基因型通过不同的机制产生该表型。因此，在为了期望的油性状对植物进行育种时，可能期望确定植物个体的基因型，并使用此信息与表型信息相关联以进行育种选择。

例如，某种芥花种质的ω-9油谱取决于fad2,fad3a,和fad3c基因中存在的突变。此外，对于芥花杂种Ogura细胞质雄性不育系的雄性系，Rfo基因(恢复育性)的存在是使种质恢复雄性育性必需的。因此，为了鉴定新的ω-9雄性育种系，应当存在所有4个基因的变异体的适当组合。由于基因之间复杂的相互作用，简单的表型选择有可能会导致被选择的植物中不期望的和未检测到的基因改变，在此情况下，如果在选择过程中没有对后代植物进行基因分型，则可能使得在随后的育种步骤中难以恢复期望的基因型。

与特定的实施方案形成对照的是，油料植物育种中使用的常规方法是这样鉴定含有期望的性状和遗传构造的分离群体的：首先，对半种子材料(含有子叶)进行溶剂提取，随后进行酯交换反应并对脂肪酸甲酯(FAME)进行气相色谱分析，从而鉴定种子的种子油脂肪酸谱；随后从剩余的半种子(含有胚)种植出植物，并对叶组织DNA进行PCR分析以鉴定感兴趣基因的接合性。然后，对于自包含期望油性状的种子种植而得的含有期望基因型的植物可以进行选择，用于进一步的育种和/或栽培。这种常规过程与本文的实施方案相比耗时而昂贵，因为对于在获取了用于表型分析的半种子样品后剩余的半种子，必须将其播种并容许其生长后方能收集叶组织并进行遗传测试。这个额外的步骤植物育种期间耗费相当大的资源成本。VanDeynze&Stoffel(2006)SeedSci.&Technol.34:741-5。

本文提供的实施例涉及用于从残余的脱脂(例如，溶剂提取)的种子材料(例如，不包含种子胚的脱脂种子材料)分离高纯度基因组DNA的系统和方法。在常规的系统和方法中，并不从残余种子材料回收这种适合于扩增和基因分型的高纯度DNA，而是将该材料丢弃。某些实例涉及从来自任何油料植物的残余脱脂种子材料，例如芥花半种子材料、向日葵种子材料和大豆种子材料，自动化地分离基因组DNA。因此，本发明的实施方案已显示具有广泛的跨植物物种的可应用性，而另一方面，甚至从未经处理的种子材料提取DNA都是不可预测的，并且经常会失败。VanDeynze&Stoffel(2006)，前文。例如，人们迄今为止不认为基于珠子的DNA提取方案(Qiagen)能够从芸苔种子材料提取任何DNA(更不用说高品质DNA)，也不认为其能够从残余FAME材料回收DNA。

一些实施方案包括可允许从残余脱脂种子材料提供高品质、可扩增的DNA的系统和/或方法，从而该DNA可以用于，例如但不仅限于，基于PCR的基因分型(例如和KASParSNP基因分型应用)。常规方法不利用脱脂种子材料产生用于遗传学应用例如基因分型的高品质、纯的DNA。这种高纯度DNA的分离不是无关紧要的，因为必须分离足够量的大核酸才可能以低出错率对整个基因组进行分析。

通过从单个种子来源获得油谱和基因谱，可以通过确保只有具有期望基因型或表型谱的植物才被推进到下一代而减少被移植的植物数量。因此，本文的具体实施方案可以通过消除或者大大减少组织采样需求而显著节约时间和资源。利用借助本申请的系统和/或方法分离的高纯度DNA还能够进行基因组范围的标志辅助选择(MAS)，这可以让当前不利用标志数据的基因渗入和转换项目能够更简单、更廉价地利用基因分型数据。

本文的实施方案可对选择性油料植物育种产生显著影响。例如，收集单个半种子就有可能能够在移植之前确定对选择有利的种质必需的脂肪酸谱和基因分型(或接合性)数据。没有期望脂肪酸谱和基因型的种子可以不予播种，或者可以丢弃与这些种子对应的植物，从而最大限度地减少组织取样和移栽工作，并减少推进植物育种项目必需的温室资源。

除了分析杂交材料之外，对用根据本文一些实施方案的系统和/或方法分离的DNA的遗传分析还具有许多其它潜在的应用。例如，从业者可以对从脱脂种子样品分离的DNA进行分析，以确定某个实体(entity)在非法使用专有种质。作为进一步的实例，通过本文系统和/或方法从种子分离的DNA可以被基因分型，从而可以推断或鉴定对应于种子中确定的表型(例如，复杂表型)的新QTL或连锁标志。

II.缩写

CMS细胞质雄性不育

FAM羧基荧光素

FAME脂肪酸甲酯

KASParKBioscience的竞争等位基因特异性PCR

SNP基因分型系统

LIMS实验室信息管理系统

MAS标志辅助选择

MW分子量

QTL数量性状基因座

RS降低的饱和

SNP单核苷酸多态性

SSR简单序列重复

WOSR冬油菜(winteroilseedrape)

III.术语

在下面的说明书和表格中，使用了大量的术语。为了提供对专利说明书和权利要求的清晰而一致的理解，包括要赋予这些术语的范围，提供了如下的定义。

回交：回交方法可用于将核酸序列引入到植物中。回交技术已经被广泛使用了数十年，用于将新的性状引入到植物中。Jensen,N.,Ed.PlantBreedingMethodology,JohnWiley&Sons,Inc.,1988。在典型的回交方案中，将感兴趣的原始品种(轮回亲本)与携带待转移感兴趣基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后，将此杂交所得的后代再次与轮回亲本杂交，重复这个过程直至获得这样的植物，其中除了从非轮回亲本转移的基因之外，在被转化植物中回收了轮回植物基本上全部的期望形态和生理学特征。

细胞质雄性不育：遗传雄性不育是可以在杂交种子生产中使用的方法。在不存在育性恢复基因时，CMS近交植物是雄性不育的，这是由于细胞质基因组而非细胞核基因组所致的因素的结果。因此，雄性不育的特征是完全从母本继承的，因为只有雌性才会向受精的种子提供细胞质。CMS植物被来自另一个非雄性不育近交系的花粉所授精。来自该第二自交系的花粉可以提供或者不提供使杂交植物雄性可育的基因。

高品质的DNA是指

分离的：“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质)是与该组分天然出现的生物体细胞中的其它生物组分(即，其它染色体或染色体外DNA和RNA，和蛋白质)基本上分离的、与所述其它生物组分分别产生的、或者与其它生物组分纯化分开的，在所述分离、产生或纯化的同时在该组分中产生化学上或功能上的变化(例如，核酸可能是通过断裂连接该核酸与染色体中其余DNA的化学键而从染色体分离的)。

核酸分子：如本文所使用的，术语“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义链和反义链，和上述物质的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或者任一类型核苷酸的修饰形式。如本文所使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。核酸分子的核苷酸序列按常规是从分子的5'端向3'端阅读。核苷酸序列的“互补物”是指由与该核苷酸序列的核苷碱基形成碱基对(即，A-T/U，和G-C)的核苷碱基所成的5'到3'的序列。核酸序列的“反向互补物”是由与该核苷酸序列的核苷碱基形成碱基对的核苷碱基所成的从3'到5'的序列。

“核酸分子”包括单链和双链形式的DNA；单链形式的RNA；和双链形式的RNA(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指在核酸(或是作为个别的单链，或是呈双链体形式)的有义和反义链上存在的核苷碱基的顺序。术语“核糖核酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、hpRNA(发夹RNA)、tRNA(转运RNA5，装载着或者卸载了相应的酰化氨基酸)和cRNA(互补RNA)。术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、基因组DNA和DNA-RNA杂交体。术语“核酸区段”和“核苷酸序列区段”或者更一般地“区段”，本领域的技术人员可理解为是一种功能术语，包括基因组序列、核糖体RNA序列、转运RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列，和编码或可以适于编码肽、多肽、或蛋白质的较小的工程化核苷酸序列。

核酸分子可以包括天然存在的和/或经修饰的核苷酸，其通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起。核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，这是本领域的技术人员容易理解的。这样的修饰包括，例如，标志、甲基化、一个或多个天然存在的核苷酸用类似物取代、核苷酸间修饰(internucleotidemodification)(例如，不带电的连接键：如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电荷的连接键：如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分(pendentmoieties)：如肽；嵌入剂：如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；和经过修饰的连接键：如α-异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体(triplexed)、发夹体(hairpinned)、圆形和挂锁构象。

寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割更长的核酸区段、或者通过聚合个别的核苷酸前体而形成。自动化合成仪允许合成长度高达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以结合互补的碱基序列，故它们可以用作探针用于检测DNA或RNA。由DNA(寡脱氧核苷酸)构成的寡核苷酸可用于PCR，这是一种用于扩增小DNA序列的技术。在PCR中，寡核苷酸通常被称作“引物”，其允许DNA聚合酶延长寡核苷酸并复制互补链。

基因组：如本文所使用的，术语“基因组”是指在细胞核中发现的染色体DNA，也指在细胞的亚细胞器组分中发现的细胞器DNA。

序列同一性：如本文所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”在两个核酸序列的语境中是指，当两个序列被比对使得在特定的比较窗口内实现最大相应度时，两个序列中相同的残基。

如本文所使用的，术语“百分比序列同一性”可以指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列(例如，核酸序列)而确定的数值，其中为了实现两个序列的最佳比对，比较窗口内的序列部分与参考序列(其不含有添加或缺失)相比可以包含添加或缺失。百分比的计算如下：确定在两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目；用匹配位置的数目除以比较窗口内的位置总数，并乘以100，产生百分比序列同一性。与参考序列相比在每个位置均相同的序列被称作与参考序列100％相同，反之亦然。

用于比对序列以供比较的方法是本领域众所周知的。在下列文献中描述了各种程序和比对算法，例如：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-3；Corpetetal.(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90；Huangetal.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearsonetal.(1994)MethodsMol.Biol.24:307-31；Tatianaetal.(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考虑参见例如Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。

美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST；Altschul等(1990))可在几个来源处访问，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和互联网上，以供与多种序列分析程序联用。关于如何使用该程序来确定序列同一性的描述可以在互联网上通过BLAST的“帮助”部分获得。核酸序列的比较可以采用BLAST(Blastn)程序的“Blast2sequences”功能，使用默认参数来进行。当通过这个方法进行评估时，与参考序列具有越大相似性的核酸序列显示越高的百分比同一性。

特异性杂交/同源性互补：如本文所使用的，术语“能特异性杂交”和“特异性互补”是指具有足够程度的互补性，使得核酸分子与靶核酸分子之间发生稳定而特异的结合。两个核酸分子之间的杂交涉及两个核酸分子的核酸序列之间形成反平行对齐。然后，两个分子能够与相对链的相应碱基形成氢键，从而形成二聚体分子，如果它足够稳定，则可以用本领域众所周知的方法进行检测。特异性杂交的核酸分子不必与其靶序列100％互补。然而，发生特异性杂交必需的序列互补性的量依赖于所用杂交条件而变。

导致特定严格程度的杂交条件取决于所选杂交方法的性质和杂交分子序列的组成和长度。一般地，杂交缓冲液的杂交温度和离子强度(特别是Na⁺和/或Mg⁺⁺浓度)会决定杂交的严格度，尽管清洗时间也会影响严格度。关于实现特定严格度所需的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且在下列文献中有讨论，例如：Sambrook等.(编辑)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，第1-3卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989,第9和11章；和Hames和Higgins(编辑)NucleicAcidHybridization,IRLPress,Oxford,1985。关于核酸杂交的更详细的介绍和指导可以参见，例如Tijssen,“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,”收录于LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分,第2章,Elsevier,NY,1993；和Ausubel等编辑,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章,GreenePublishingandWiley-Interscience,NY,1995。

如本文所使用的，“严格条件”包括这样的条件，在该条件下，只有当杂交分子与靶核酸分子内的同源序列之间的错配小于20％时杂交才会发生。“严格条件”进一步包括特定水平的严格度。因此，如本文所使用的，“中等严格”条件是指这样的条件，其中序列错配超过20％的分子将不会杂交；“高严格”条件是指这样的条件，其中序列错配超过10％的分子将不会杂交；“极高严格”条件是指这样的条件，其中序列错配超过5％的分子将不会杂交.

下面是代表性的非限制性杂交条件。

高严格条件(检测具有至少90％序列同一性的序列)：在5xSSC缓冲液中65℃杂交16个小时；在2xSSC中室温清洗2次，每次15分钟；和在0.5xSSC缓冲液中65℃清洗2次，每次20分钟。

中等严格条件(检测具有至少80％序列同一性的序列)：在5x-6xSSC缓冲液中65-70℃杂交16-20个小时；在2xSSC中室温清洗2次，每次5-20分钟；和在1xSSC缓冲液中55-70℃清洗2次，每次30分钟。

非严格的对照条件(具有至少50％序列同一性的序列将会杂交)：在6xSSC缓冲液中室温-55℃杂交16-20个小时；在2x-3xSSC中室温-55℃清洗至少2次，每次20-30分钟。

如本文所使用的，术语“基本上同源的”或“基本上同源”对于连续的核苷酸序列而言是指在严格条件下与参考核酸序列杂交的连续核苷酸序列。例如，与参考核酸序列基本上同源的核酸序列是如下的核酸序列，其在严格条件下(例如前文提到的中等严格条件)与参考核酸序列杂交。基本上同源的序列可以具有至少80％序列同一性。例如，基本相同的序列可以具有大约80％-100％的序列同一性，例如大约81％；大约82％；大约83％；大约84％；大约85％；大约86％；大约87％；大约88％；大约89％；大约90％；大约91％；大约92％；大约93％；大约94％大约95％；大约96％；大约97％；大约98％；大约98.5％；大约99％；大约99.5％；和大约100％。基本上同源的性质与特异性杂交密切相关。例如，当存在足够程度的互补性从而避免核酸与非靶序列在期望特异性杂交的条件下，例如在严格杂交条件下，非特异性结合时，核酸分子是能特异性杂交的。

如本文所使用的，当有义链沿着5’-3’方向阅读出每一个核苷酸均与沿着5’-3’方向阅读的反义链的每一个核苷酸互补时，两个核酸序列分子称为显示“完全的互补(性)”。与参考核苷酸序列互补的核苷酸序列将会显示与参考核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述在本领域都是明确定义的，并且容易为本领域的普通技术人员所理解。

连锁、紧密连锁和极紧密连锁：如本文所使用的，基因和标志之间的连锁是指这样的现象，其中染色体上的基因或标志显示出一起被传递给下一代的个体的可测量的概率。两个基因或标志彼此越接近，这个概率越接近(1)。因此，术语“连锁”可以指一个或多个以大于0.5的概率与某个基因一起传递的基因或标志(0.5是位于不同染色体上的标志/基因的自由组合(independentassortment)所预期的数值)。当基因的存在有助于个体中的某个表型时，与该基因连锁的标志可以称作与该表型连锁。因此，术语“连锁”可以指标志与基因或者标志与表型之间的关系。因为两个基因或标志在染色体上的接近度与该基因或标志被一起传递给下一代的个体中的概率直接相关，所以术语“连锁”在本文中也指一个或多个在同一染色体上彼此紧邻的基因或标志。

表型的连锁遗传标志可用于标志辅助育种程序，用以鉴定包含该表型的植物品种，或者用于将该表型育种到其它品种中。

基因座：如本文所使用的，术语“基因座”是指基因组上相应于某种可测量的特性(例如性状)的位置。SNP基因座用可与基因座内含有的DNA杂交的探针限定。

标志：如本文所使用的，标志是指能够用于鉴定具有特定等位基因的植物的基因或核苷酸序列。标志可被描述为给定基因组基因座处的变异。遗传标志可以是短DNA序列，例如单碱基对变化(单核苷酸多态性或SNP)周围的序列，或者可以是长的，例如微卫星/简单序列重复(“SSR”)。“标志等位基因”是指存在于特定个体中的标志的版本。如本文所使用的，术语“标志”可以指DNA的克隆区段，还可以/或者可以指与DNA的克隆区段互补的DNA分子。

在一些实施方案中，植物中标志的存在可以通过使用核酸探针检测。探针可以是DNA分子或者RNA分子。RNA探针可以通过本领域已知的方法合成，例如使用DNA分子模板。探针可以包含标志核苷酸序列的全部或一部分，以及和来自植物基因组的附加邻接核苷酸序列。这在本文中被称作“邻接探针”。附加的邻接核苷酸序列被称作原始标志的“上游”或“下游”，这取决于该来自植物染色体的邻接核苷酸序列是位于原始标志的5’还是3’侧(如常规理解的)。正如本领域普通技术人员所认识的，获得用于包含在标志内的附加邻接核苷酸序列可以被几乎无限次重复(仅由染色体的长度限制)，借此沿着染色体鉴定附加的标志。所有上述标志均可用在本发明的一些实施方案中。

寡核苷酸探针序列可以合成制备或者通过克隆制备。合适的克隆载体是本领域技术人员众所周知的。寡核苷酸探针可以被标记或者不被标记。有许多用于标记核酸分子的技术，包括例如但不仅限于：通过切口(nick)平移；随机引发；用末端脱氧转移酶(deoxytransferase)拖尾；等进行放射性标志，其中所用核苷酸被例如用放射性³²P标志。可以使用的其他标记物包括，例如但不仅限于：荧光团(例如，FAM和VIC)；酶；酶底物；酶的辅因子；酶抑制剂；等。或者，可以用与受体结合的配体来代替单独提供或者与其他活性剂联合提供可检测信号的标记物的使用，其中该受体被标记(例如，用上文提到的标记物标记)，从而独自提供或者与其他活性剂联合提供可检测信号。参见例如Leary等.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4045-9。

探针可以含有不与原始标志邻接的核苷酸序列；这种探针在本文中被称作“非邻接探针”。非邻接探针的序列与基因组上的原始标志序列充分接近，使得该非邻接探针与原始标志遗传连锁于相同的基因或性状。

探针可以是被检测标志的精确拷贝。探针也可以是这样的核酸分子，其包含与主题生物的染色体DNA的某个克隆区段基本上相同的核苷酸序列，或者由这样的核苷酸序列构成。如本文所使用的，术语“基本上相同”可以指超过85％相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以和参考序列具有85.5％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％同一性。探针还可以是与要检测的标志(“DNA靶”)的精确拷贝“能特异性杂交”或“特异性互补”的核酸分子。

标志辅助育种：如本文所使用的，术语“标志辅助育种”可以指直接对一个或多个性状进行育种的方法。在目前的实践中，植物育种者尝试鉴定容易检测的性状，例如花的颜色、种皮外貌，或与农艺学期望性状连锁的同工酶变异体。然后，植物育种者通过跟踪该容易检测的性状的分离而在分离的育种群体中跟踪该农艺学性状。然而，可供用于植物育种的这样的连锁关系非常少。在标志辅助育种中，利用特定分子标志的存在与否来做出育种程序中的选择决定(标志辅助选择(MAS))。

标志辅助育种为改良植物品种提供了一种时间和成本高效的过程。应用标志辅助育种的一些实例涉及使用同工酶标志。参见例如Tanksley和Orton编辑(1983)IsozymesinPlantBreedingandGenetics,Amsterdam:Elsevier。一个实例是与番茄中抗线虫害虫的基因关联的同工酶标志。该抗性由命名为Mi的基因控制，位于番茄染色体6上，并且与一种酸性磷酸酶同工酶Aps1极紧密连锁。使用Aps1同工酶标志间接选择Mi基因提供的优势在于群体中的分离可以用标准电泳技术清楚地确定；该同工酶标志可以在幼苗组织中评分，从而不需要维持植物到成熟；并且同工酶标志等位基因的共显性容许区分纯合子和杂合子。参见收录于Tanksley和Orton中的Rick(1983)，前文。

单核苷酸多态性：如本文所使用的，术语“单核苷酸多态性”(SNP)可以指当基因组(或者其他共享的序列)中的单个核苷酸在物种的成员之间或者个体的配对染色体之间存在差异时发生的DNA序列变异。在群体中，SNP可以被分配以较小(minor)等位基因频率，其是在特定群体中所观察到的某个基因座处的最低等位基因频率。对于单核苷酸多态性而言，它就是两个等位基因频率中较小的那个。预期不同的群体展示的等位基因频率至少略有不同。特定的群体可以展示显著不同的等位基因频率。在一些实例中，标志辅助育种中使用的标志是种子的果皮的母本DNA中包含的SNP标志。

SNP可以位于基因的编码区中、基因的非编码区中、或者位于基因之间的基因间区域内。由于遗传密码具有简并性，编码序列内的SNP不一定会改变所产生的蛋白质的氨基酸序列。若某SNP中两种形式产生相同的多肽序列，则该SNP称作是“同义的”(有时称作沉默突变)。如果产生不同的多肽序列，则它们称作是“非同义的”。非同义的变化可以是错义的或者无义的，其中错义改变导致不同的氨基酸，而无义改变导致过早的终止密码子。不位于蛋白编码区内的SNP可能仍然具有用于基因剪接、转录因子结合或非编码RNA序列的共同序列(consequences)。SNP通常是两个等位基因，因此容易在植物和动物中测定。Sachidanandam(2001)Nature409:928-33。

种子样品：如本文所使用的，术语“种子样品”可以指一个或多个从种子获得的材料和/或物质。例如，种子样品可以包括来自感兴趣植物的一个或多个半种子和/或种子片段、区段或部分。种子样品还可以包括种子材料的集合。在本文实施方案的特定实例中，种子样品可以包括种子子叶的全部或一部分，但是可能不包含种子胚。

性状或表型：术语“性状”和“表型”在本文中可互换使用。出于本公开的目的，特别感兴趣的性状包括农艺学重要的性状(例如，油性状)，如可能在例如作物植物中表达的性状。

除非具体指出或暗示，如本文所使用的，术语“一”、“一个”和“该”指“至少一个”。

除非另外解释，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员所公知的相同含义。分子生物学中通用术语的定义可以参见，例如LewinB.,GenesV,OxfordUniversityPress,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编辑),TheEncyclopediaofMolecularBiology,BlackwellScienceLtd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；和MeyersR.A.(编辑),MolecularBiologyandBiotechnology:AComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8)。除非另外指出，否则所有的百分比均根据重量，所有的溶剂混合物比例均按照体积。所有温度均为摄氏度。

IV.从残余脱脂材料自动分离高纯度核酸

本文的实施方案包括用于从脱脂种子材料分离高品质核酸样品(例如，基因组DNA)的系统和/或方法。在一些实施方案中，脱脂的种子材料可以是通过溶剂提取(例如用于FAME分析的油提取)种子样品产生的残余种子材料，例如但不仅限于，小种子部分或半种子材料。尽管本领域的技术人员会意识到，本文的实施方案包括从其它植物的种子材料分离核酸，但是某些实施例包括从芸苔属(例如芥花)、向日葵和/或大豆分离。特定的实施方案包括这样的系统和/或方法，其可分离如此高纯度(例如，无污染、具有更少的非核酸材料)的核酸并提供如此完整的基因组覆盖，以使得该核酸可用于基于扩增的基因分型处理(例如，基于PCR的分析)。

在一些实施方案中，用分离核酸的方法可以包括细胞破坏或细胞裂解(例如，通过研磨或超声破碎种子材料)；除去膜脂(例如，利用去污剂)；和沉淀DNA(例如，用冷EtOH或IPA)。核酸提取方法还可以包括从样品除去蛋白质；从样品除去盐；和/或从样品除去RNA。在DNA分离应用中，某些实施方案中的产量可能在群体之间波动。在某些实施方案中，A₂₆₀/A₂₈₀可以为大约1.7-大约2.0(即，“纯”DNA样品)。小于1.7的A₂₆₀/A₂₈₀值可能表明样品有蛋白污染，而超过2.0的数值可能表明存在残余RNA、酚、盐和/或醇。

如多个在下文中详述的实施例所证明的，利用根据一些实施方案的系统和方法从各种脱脂种子材料分离的DNA显示的平均产量为大约0.5-大约20.0ng/μL，纯度为大约1.7-2.0(A₂₆₀/A₂₈₀)。而且，通过本文的系统和方法分离的核酸可以提供充分的基因组覆盖，允许对任何来源的种子进行精确的基因型确定。因此，本文的实施方案适合于从多种多样的植物来源的种子样品提取高品质的DNA。

因此，根据一些实施方案分离的高品质DNA可以以大约1.7-大约2.0A₂₆₀/A₂₈₀的纯度获得。例如，所得DNA的纯度可以为大约1.70；大约1.72；大约1.74；大约1.76；大约1.78；大约1.80；大约1.82；大约1.84；大约1.86；大约1.88；和大约2.0A₂₆₀/A₂₈₀，或者包含任何前述的数值和范围。而且，根据一些实施方案分离的高品质DNA能够用作底物，用于将来源种子材料中发现的任一基因组DNA序列扩增为寡核苷酸。

在具体的实施例中，使用(Qiagen,Valencia,CA)的基于珠子的化学，通过DNA提取从脱脂种子材料中分离核酸分子。在具体的实施例中，使用基于珠子的化学进行的DNA提取以全自动化的方式实施(例如，利用机器人转移和处理样品)，从而显著减少该程序所涉及的时间和花费。例如但不作为限制，DNA可以使用全自动化的经过修改的DNA提取处理在机器人(例如，1600和1800机器人(Agilent,Technologies,Inc.,SantaClara,CA)上执行。

在特定的实施方案中，脱脂种子材料在分离核酸之前可以被储存(例如，在环境温度或者在4度)。这个储存期可以是24小时、48小时、72小时、96小时、1周、10天、或者甚至更长。令人惊讶地，即使在这些种子材料长时间储存后，仍然可以从该材料分离足够量的高品质核酸，使得人们可以利用基于扩增的遗传分析来确定种子的遗传特征。在一些实施例中，脱脂种子材料可以保存在环境温度中数天、数周和/或数月。例如但不仅限于，脱脂种子材料可以被保存至少1天；至少2天；至少3天；至少4天；至少5天；至少6天；至少1周；至少8天；至少9天；至少10天；至少11天；至少12天；至少13天；至少大约2周；或更长。

V.确定植物特征和基因谱

在本文的实施方案中，有可能通过分析种子样品，例如但不仅限于利用包括脂肪酸提取的方法分析种子样品，来有利地确定植物的特征，并且还可以从同一种子样品确定出植物在一个或多个遗传基因座处的基因型。

在一些实施方案中，通过对种子样品进行脂肪酸分析来确定植物的特征(例如油性状)。可以利用溶剂提取以及其它脂提取技术来确定来自油料种子的油的组成。例如，可使用FAME分析确定不同脂肪酸(例如，油酸、硬脂酸、棕榈酸)的量及其类别(例如，饱和、不饱和、和单不饱和脂肪酸)。尤其在油料植物的育种中，这些信息可用于高效率地判定新的和/或未经表征的品种的性能。

从种子样品除去脂肪酸产生“脱脂”的种子样品，其先前仅被看作是废物。因为先前人们认为从这种脱脂的种子样品中不可能提取出适用于遗传分析的高品质的DNA，所以常规的植物育种方法包括一个昂贵的额外步骤，即种植种子的剩余部分以产生叶材料，用于DNA提取和随后标志确认。本文一些实施方案的一个特征是不需要这个步骤，使得，例如，只有被确定为具有期望特征的种子才被继续用于种植和进一步的分析。

因此，在本文的一些实施方案中，可以对已从脱脂种子样品分离的高品质核酸进行分析，以确定该种子样品所来源的种子的至少一部分基因型。在具体的实施方案中，核酸可以具有足够的品质和大小，以允许通过基于扩增的技术进行基因组范围的遗传分析。例如，可以确定种子在一个或多个基因座(例如与感兴趣表型连锁的标志，和候选的连锁标志)处的接合性。通过分析种子的脱脂样品确定种子的接合性这一手段可用于实施标志辅助选择。与使用通过常规方法从植物或幼苗的叶材料分离的DNA所进行的测定相比，这样的测定可能几乎一样精确。

在具体的实施例中，可以用本领域已知的任何遗传分析系统或方法来分析从脱脂种子样品提取的高品质DNA，这样的系统或方法例如但不仅限于，基于PCR的分析技术(例如，KASParSNP基因分型平台(KBioscienceLtd.,Hoddesdon,UK)和分析)。用于设计基于PCR的基因分型用的分子标志的靶DNA序列可以从基因组数据库中鉴定，或者通过独立的测序加以鉴定。用于DNA扩增的寡核苷酸引物可以相应地合成。

基因分型测定利用寡核苷酸探针从样品中检测被扩增的遗传标志。该方法利用特异针对遗传标志(例如，与感兴趣的基因或表型连锁的标志)的引物，和被设置成检测不同的标志等位基因的荧光标记探针。用某种荧光染料如FAM标记与一个等位基因相关的探针，而用不同的荧光染料如(AppliedBiosystems)标记与另一个等位基因相关的探针。以光染料信号的存在与否的形式分析杂交数据。该检测系统可以高通量和便利的格式使用。

KASPar是一种用于确定SNP基因型的可商购的均质性(homogeneous)荧光系统(KBiosciencesLtd.,Hoddesdon,UK)。KASPar测定法包括SNP特异性的“测定预混物”，其含有三种未标记的引物，和“反应预混物”，其含有所有其它必需的组分；例如，通用荧光报告系统。除了这些预混物之外，用户提供能够进行FRET的酶标仪、微量滴定板和含有大约5ng/L高品质DNA的DNA样品，及其他。

典型的KASPar分析包括如下步骤：等位基因特异性引物设计(例如，使用PrimerPicker，一款可以通过互联网在KBiosciences网站获取的免费服务)；制备包含等位基因特异性引物的反应预混物；在微量滴定板中将反应混合物与DNA样品混合；热循环；在荧光酶标仪中读取平板；和对荧光数据进行描点作图和打分。将每个样品的数据在2-D线图上一起描点作图，其中x-和y-轴对应于FAM和VIC荧光数值。具有相同SNP基因型的样品在描点图上聚类在一起(即A/A；A/a；和a/a)。关于KASPar相同更技术的信息，包括常见问题的解决指导，可以从KBiosciences有限公司获得(例如，KASParSNP基因分型系统试剂手册)。

当在特定实施方案中使用时，从脱脂种子材料分离的DNA的遗传分析可以以全自动化的方式实施。例如，可以将对应于不同种子的脱脂种子材料装载到具有离散的孔的平板上，从而可以对平板进行处理而无需实践者进一步操作，以提供用于进行接合性测定的数据和/或提供这种测定本身。

VI.分离的DNA在植物育种中的用途

在本文的一些实施方案中，利用从脱脂种子材料分离高品质核酸样品(例如，基因组DNA)的系统和/或方法获得的基因分型信息可用于为植物育种决定，例如在对植物选择性育种一个或多个感兴趣性状时可能做的决定提供信息和/或指导。

例如，可以从通过亲本基因型杂交产生的植物收集的种子进行采样，其中对样品进行包括脂肪酸提取的表型分析(例如，油性状测定)，然后用作分离核酸样品的原材料。任何在种子中可测量、或者以其他方式可确定的表型分析均可以对种子和/或种子样品实施。例如，可以实施不包括脂肪酸提取的分析。在具体的实施方案中，在核酸分离之前对种子样品脱脂的方式可以不同。

在一些实施方案中，被基因分型的脱脂种子样品所来源的植物的感兴趣的性状是油性状。例如，感兴趣的性状可以是如下所述的策略的执行过程中在植物中产生的油性状，该策略用于将油性状渗入到新种质中，和/或用于将不同性状基因渗入到已包含感兴趣性状的种质中，其中期望在植物中保留该感兴趣的性状。在一些实施例中，感兴趣的油性状可以是通过植物育种程序被除去或改变的性状。

在通过根据本文一些实施方案的系统和/或方法从脱脂种子材料分离的高品质核酸样品中可以确定多种多样的遗传信息。例如，可以针对一个或多个提供信息的分子标志(例如，与感兴趣基因和/或性状连锁的标志)对种子样品进行基因分型。作为进一步的实例，可以针对一个或多个与感兴趣基因和/或性状不具有已知关联的多态性标志对种子样品进行基因分型，以便例如从候选标志池鉴定提供信息的标志。根据具体的育种应用，不同的遗传信息可用于选择种子，例如要种植成为植物或小植株的种子。

在一些实施方案中，对于植物育种程序中的杂交产生的某个世代的植物所产生的种子，可以通过对从这些种子产生的种子样品进行表型分析和基因型分析来加以筛选。例如，可以从种子获取样品，其中该样品包括种子的子叶，但不包括种子胚，并可对种子样品进行表型分析(例如，针对油性状、种子重量、蛋白质组成等)。可以在对种子进行表型分析的过程中或者另外对种子样品进行脱脂，随后可以根据本文的系统和/或方法从脱脂的种子样品材料分离核酸。这种对种子样品的表型和遗传筛选在保留了包含胚和任意量的残余子叶的活种子材料的同时，还允许对种子进行选择而不必从种子种植出植物或小植株。

具体举出的实例涉及针对油性状对植物进行选择性育种，油性状包括，例如但不仅限于：ω-9油性状(DowAgroSciences,LLC)，包括高油酸含量、低亚麻酸含量、和低饱和脂肪酸含量。ω-9油性状在芥花中的基因渗入和保持取决于特定fad2、fad3a和fad3c等位基因的存在，它们的存在可以通过在种子中遗传筛选一个或多个连锁标志加以确定。而且，在这些和其它性状的育种中，可能期望同时筛选额外的感兴趣基因和/或性状，例如但不仅限于：育性恢复基因(例如Ogura细胞质雄性不育系统的Rfo育性恢复子)。在这样的实例中，利用两种分析选择种质：通过种子材料的脂肪酸分析评估脂肪酸组成的油谱；和fad2,fad3a,和fad3c基因(可以还有Rfo，以评估育性恢复子的存在)的接合性分析。根据本文的一些系统和/或实施方案，这两种分析可以在来自种子的同一种子样品上进行。从单个种子产生油谱(在芥花的情况下，从单个种子的外子叶)，该过程产生残余的脱脂种子材料，然后对后者进行遗传分析。如果期望比较油谱(和/或种子中确定的其它性状)和遗传分析的结果，那么可以种植残余胚和内子叶以进行世代推进和/或进一步的接合性测试。

提供了如下的实施例用于举例说明某些特定的特征和/或实施方案。这些实施例不应看作将本公开限制于所举例的特定特征或实施方案。

实施例

实施例1：从脱脂芥花半种子材料分离DNA用于基因分型

某些芥花和冬油菜(WOSR)种质的ω-9油谱依赖于在fad2,fad3a,和fad3c基因中突变的存在。因此，对于Ogura细胞质雄性不育杂交系统的雄性株系，需要存在Rfo(育性恢复子)基因以恢复雄性育性。为了鉴定新的ω-9雄性育种质，应当存在所有四个基因的合适变异体组合。为了在产生和鉴定WOSR种质时显著节约时间和成本，开发了用于对种子材料进行遗传和表型分析的新方法，其中实施分析不必播种和萌发种子。

材料和方法

使用两组芥花半种子材料。“A组”对Rfo基因分离，而“B组”对Rfo,Fad2a,Fad3a,和Fad3c基因分离。表1。

芥花的半种子处理需要将种子浸泡在水中1-2天，以分离种皮和胚和子叶。除去种皮，对外子叶进行解析分析和遗传分析，将种子的内子叶/胚部分种植在温室中。随后在四叶期收集叶参考材料，冻干并发送进行遗传测试。使用相同的基于珠子的提取和分离程序从种子和叶参考材料回收基因组DNA。通过相同的基于珠子的化学还提取了用于Fad2a,Fad3a,Fad3c,和Rfo基因的纯合、半合和空PCR测试对照。

表1.用于测试的芥花F₂种子群体。A组对Rfo分离。B组对Rfo,Fad2,Fad3a,和Fad3c分离。

F₂群体的基因ID	分组
		231741	A
231743	A
		200281	A
231761	A

231757	B
		200278	B
231755	B
		231753	B

对芥花半种子样品进行油提取，随后进行脂肪酸甲酯(FAME)分析，以鉴定每个种子的油谱。图1。为了粉碎半种子样品以进行溶剂提取，用1/8”钢珠对样品进行研磨。用旋转蒸发器(7810010,Labconco,KansasCity,MO)65℃15分钟除去来自提取处理的残余庚烷，并制备残余的种子材料用于DNA提取。

将经过研磨的溶剂提取芥花半种子在Matrix架子(rack)(RB管/分析钢珠)上在环境温度下过夜温育，以蒸发残余的庚烷。次日，向每个样品孔添加300μL的缓冲液RLT(79216,Qiagen)，给架子封盖。将样品以1500rpm研磨5分钟以从种子材料释放DNA，最后以6,000rpm旋转5分钟，以沉淀悬浮组织碎片。然后，将架子装载到1800机器人下方的温育器(incubator)中。方案的其余部分在1800上进行。

使用全自动化提取程序回收DNA，该程序使用Velocity11软件启动：

通过剧烈震荡或涡旋使SuspensionG磁珠重悬。将10μL重悬的SuspensionG珠转移到1mLHalfWell平板的每个样品孔中。将装有经浸渍的组织的Matrix微管架以3000rpm离心45秒。从每个微管取200μL样品上清并转移到装有SuspensionG珠子和结合缓冲液的1mLAB-GeneHalfWell平板中。将样品用吸头混合(tip-mixed)并在室温下温育90秒以引发DNA结合(15℃-25℃)。

然后，将样品置于滴定震荡器(titershaker)的模块(block)上，完全混合20秒，确保任何肉眼可见的团块破碎分离。然后，将样品在室温下再温育90秒。在磁性MAGNARACK^TM上将磁颗粒分离15秒。将200μL样品上清转移回Matrix微管架内。检查每个孔，以确认它们仅含有珠子而所有液体均已被除去。

向每个样品孔添加200μL缓冲液RPW(Qiagen)，然后将样品置于滴定震荡器上充分混合20秒。使磁颗粒在磁架上分离15秒。将200μL样品上清转移回2DMatrix微管架。检查每个孔，以确认它们仅含有珠子而所有液体均已被除去。

向模块的每个样品孔添加200μLEtOH(96-100％)，然后将其置于滴定震荡器上并震荡20秒，以确保磁颗粒悬浮。使磁颗粒在磁架上分离15秒。将200μL样品上清转移到2DMatrix微管架。检查每个孔以确认所有液体均已被除去。

向模块的每个样品孔添加200μLEtOH(96-100％)，然后将其置于滴定震荡器上并震荡20秒，以确保磁颗粒均匀悬浮。使磁颗粒在磁架上分离15秒。将200μL样品上清转移到2DMatrix微管架。检查每个孔以确认所有液体均已被除去。

将磁颗粒在室温下温育5分钟以确保所有EtOH均已挥发。向模块的每个样品孔添加100μL缓冲液AE(Qiagen)，然后将其置于震荡器上1分钟，以确保磁颗粒被均匀悬浮。使磁颗粒在磁架上分离30秒。将100μL样品上清转移到有标签的500μLV形底收集平板中。用设定在175℃2.1秒的对收集平板进行热封。

为每个样品回收90μLDNA，并保存在4℃。

在基于珠子的DNA提取之后，样品在5酶标仪(BIOTEK,Winooski,VT)上用试剂(P7581,Invitrogen,Carlsbad,CA)(一种插入性dsDNA染料)进行定量。装载一个稀释系列(0ng/μL,2.5ng/μL,5.0ng/ul,和10ng/μL)的LambdaDNA以产生标准曲线。DNA纯度(A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀)在8000(ThermoFisher)上用2μL未稀释的DNA评估。还用下述方式确定DNA品质(例如，分子量)：在1.0％琼脂糖(G5518-01,LifeTechnologies,GrandIsland,NY)可视化5μL未稀释的DNA，与10kB高分子量DNA标准(ladder)对比。

使用PCR对DNA筛选Rfo和/或FAD(Fad2,Fad3a,和Fad3c)基因的存在。每10μL反应使用1μL未稀释的DNA。对于一般的基因组SNP测试，使用KASPar化学。比较每个种子样品的FAD接合性结果与FAME分析数据，以选择高油酸谱。

对于KASParPCR验证，对半种子DNA测试三个稀释度(1:2,1:5,和1:10)，并与从参考叶DNA(1:25稀释)获得的结果进行比较。评估了16个标志，所有DNA样品均存在于同一PCR平板上。将2μL稀释的DNA加到一块1536孔板，然后在65℃干燥2小时。一旦DNA被干燥，用(KBioSciences,UK)向每个孔分配1.3μL准备好的PCR鸡尾酒混合物(1xKASPar混合物+引物)。密封平板，在(KbioSciences,UK)上使用触地(touchdown)方案进行热循环，最终退火温度为55℃。使用酶标仪(BMGLabTech,Offensburg,Germany)读取平板，用软件包(KbioSciences)对数据进行打分。

评估芥花半种子DNA产量、纯度和品质

对每组芥花半种子样品进行油提取和FAME分析，并生成油谱。图1。使用基于珠子的自动化程序从两组的残余溶剂提取组织成功回收了DNA。定量显示给定组内的浓度相当一致(标准差，群(Pop)(A):0.24；群(B):0.09)。表2-3。平均而言，从A组回收了1.05ng/μLDNA，从B组回收了0.4ng/μLDNA。

DNA品质的评估通过在1.0％琼脂糖w/EtBr上可视化5μL来自B组的基因组DNA进行。使用来自B组的一组代表性DNA样品(平板#673-768)进行分析。添加10高分子量基因组DNA标准作为参照。存在一条略带拖尾的高分子量条带(10kb)。图2。

表2.A组(Rfo)的DNA产量(ng/μL)和纯度度量

表3.B组(Rfo:Fad2a:Fad3a:Fad3b)的DNA产量(ng/μL)和纯度度量

评估芥花脱脂半种子DNA在PCR应用中的效力

使用性状特异性引物(A组:Rfo,和B组:Rfo,fad2a,fad3a,和fad3c)通过PCR测定性能对每组DNA进行评估。对从残余的溶剂提取组织分离的3μL未稀释DNA实施实时PCR，以鉴定Rfo基因的分离样品。图3-4。从萌发的部分种子提取的叶DNA也被筛选，以验证种子接合性确定的准确性。图3-4。Fad分析以终点Taqman测定的形式实施。图5。通过计算百分比数据返回(percentdatareturn)、错误读出率(miss-callrate)、无读出率(no-callrate)和失败率(failrate)来量度样品性能。总体上，无读出和失败是针对总数据返回计数的。DNA在分析之前没有标准化。

在所有测定中均获得了高品质的接合性数据，对于FAD基因，数据返回大于99％，半种子和叶参考样品之间的一致性大于99％。表4。对于Rfo基因，叶和种子样品之间的一致性也为97％。表4。发现了预期的样品分离模式，观察到了纯合聚类、半合聚类和空聚类之间的充分分离。总共为每个测定生成了330个数据点。满足全部的接合性验证标准。

表4.从脱脂种子材料分离的芥花DNA的PCR确认统计

还用一组16个SNP标志对从脱脂种子材料分离的芥花种子DNA的性能进行了评估。将一块平板的来自B组的DNA用水稀释2X,5X,和10X后进行分析。将参考叶DNA稀释25X。PCR之后，将每组原始数据上传到中，并描点作图以观察等位基因的分离模式。图6。品质不够的样品在数据图上或者作为异常点(outlier)、或者作为失败点出现。

油特征与基因型的比较

对于所有样品，将18:1,18:2和18:3含量的油谱与Fad2,Fad3a,和Fad3c基因的接合性读出数据进行比对。图7。18:1含量与纯合Fad2之间的对应性强烈，所有纯合子个体的油含量均超过70％。对于亚麻酸(18:3)含量，当Fad3a和Fad3c处于纯合突变状态时，会降低水平(≤3.5％)。我们观察到，一些对这两个基因均为纯合的个体的18:3含量高于预期的3.5％。具有这种谱的个体均来自一个群体，表明是来自非ω-9亲本的基因驱使18:3含量高于预期的。

油谱和接合性结果的组合将用于选择和推进最有希望的ω-9材料。在应用中，从单个半种子源同时鉴定油谱和基因谱将允许芥花和WOSR育种程序基于单个样品仅选择具有期望特征的植物(从含有胚的种子部分种植而得)用于移植，从而减少田间工作量并增加育种效率。

使用1800机器人的高通量提取化学已经被自动化，并且该自动化系统能够每天处理高达70个96孔组织平板(6,300个样品)。这种方法是鲁棒的。目前油提取/FAME分析的成本为$0.62，DNA提取的成本为$0.59，因此，能够以小于$1.23的成本从单个种子源获得油谱和基因谱对田间和实验室都是巨大的节约。在本研究之前，基因谱的获得只能通过将群体种植到至少4叶期，并将叶组织打孔块(punch)发往他处进行DNA提取来实现。尽管从残余溶剂提取材料只能回收很少的DNA，但是它具有高分子量和高纯度，因此能够产生可靠的SNP和接合性数据。

实施例2：从脱脂大豆种子材料分离DNA用于基因分型

这里，我们采用与实施例1中所述相似的自动化程序从残余的溶剂提取大豆种子材料分离高品质基因组DNA，随后对种子DNA进行RR1,RR2,和AAD12PCR分析，以鉴定这些感兴趣基因的接合性。使用通过种植含有胚的种子部分产生的叶参考样品来验证接合性确定的准确性。

材料和方法

使用两组大豆种子。“A组”种子材料由分离的RR1和RR2种子的多个单独群体组成，在进行实验之前将这些群体混合以创建一个“合成”群体，而“B组”材料由对AAD12性状分离的单一种质群体构成。表5。

在实施本实验之前，所有种子已在环境温度下储存了1年。由于有足够的RR1/RR2种子可用于采样，从该群体产生了两盘种子材料(称作“A组群体1”和“群体2”)。B组种子材料仅采样了1次。

表5.用于测试的大豆F₂种子群体

分组	群体	源ID	材料分类
				A	合成预混物(1和2)	09BIW057118	RR2分离

		09B1X056130	RR1分离
				B	1	GX08KX036929.008	AAD12分离

将整个种子在diH₂O中浸泡10分钟，随后除去一小部分，从而使胚乳更加柔韧。使用脚甲钳(toenailnipper)(TopCare)(图8a)除去一部分子叶(即，从胚的对侧，但不包括脐)，大约等于总种子大小的1/3(图8b)。然后，将每个种子样品置于96孔测定板的指定孔内，并将含有胚的种子部分置于另一个96孔测定板的相应孔内。

对所有种子部分进行油提取和脂肪酸油谱分析，而将含有胚的种子部分置于360土壤中，在移动生长室中以双昼周期(白天-16小时，27℃：黑夜-8小时，21℃；60％湿度)种植2周。在生长的2叶期，从每个植物回收单个6mm组织冲孔快，并进行DNA提取以获得用于接合性读出的参考DNA。

针对每个种子，对种子溶剂提取物进行脂肪酸甲酯(FAME)分析以鉴定脂肪酸谱。图9。为了粉碎种子样品用于溶剂提取，将种子用3/16”钢珠研磨。使用旋转蒸发器(Labconco)65℃15分钟蒸发来自FAME处理的残余庚烷，并制备残余的种子材料用于DNA提取。

在24小时内，向Matrix架的每个样品孔添加350μL缓冲液RLT(Qiagen)，并封盖。将样品以1500rpm研磨2分钟以启动DNA从种子材料的释放，随后以6,000rpm最终旋转5分钟，以沉淀悬浮的组织碎片。然后，将架子去盖并装载到NX上，向一个新的预加有珠子(1/8”珠)的Matrix架中转移200μL上清，从而使各样品针对1800机器人上的离心机平衡。然后将架子装载到机器人下面的温育器中，并用与实施例1所述相同的全自动化提取程序回收DNA，该程序使用Velocity11软件启动。为每个样品回收90μLDNA，并保存在4℃。

在基于珠子的DNA提取之后，通过定量、定量和凝胶电泳对DNA进行表征。对于定量，向10mL1XTE缓冲液中添加50μL染料，并混合(对每个待定量的DNA平板)。向一块白色板(236108,NalgeNuncInternational,Rocheseter,NY)的每个孔添加90μL稀释的试剂和10μL样品DNA，并完全混合。在5酶标仪上测量吸光度，并为针对稀释度调节浓度。

为了评估DNA纯度，直接向8000读取器(ThermoScientific)的基座添加来自每个孔的未稀释大豆种子DNA，并记录A₂₆₀/A₂₈₀纯度比值。大约1.8-2.0的测量值一般认为是纯的，而这个范围之外的数值则表明可能存在蛋白质、酚、盐和其它污染物。还通过在1.0％琼脂糖(LifeTechnologies)上可视化5μL未稀释的DNA来评估DNA品质。凝胶在XR成像仪(170-8195,BioRadLaboratories,Hercules,CA)上进行可视化。

在收集了半种子样品的DNA品质度量之后，PCR筛选DNA中RR1、RR2和AAD12基因的存在和接合性。在LIMS系统中创建一项接合性研究，以便能够输入并观察测定数据，用于鉴定样品分离模式。

用于RR1/RR2(表6)和AAD12GS(表7)测定的PCR主预混物组分和热循环条件如下所列。所有PCR平板在5微板读取器上进行分析，并将接合性数据上传到中用于分析。将来自每个样品平板的数据根据“无读出”、“错误读出”或“失败”的数目进行分类。“无读出”的定义为数据点不与纯合、空、或半合子对照聚类。“错误读出”是指样品与参考(叶)的读出不匹配。没有扩增(无信号产生)的“失败”样品仍然保持在数据图的原始点处。

表6(a-b).用于种子DNA的RR1和PCR反应和热循环条件

b.终点PCR条件

表7(a-b).用于种子DNA的PCRPCR反应和热循环条件

b.实时PCR

·大豆脱脂种子DNA产量、纯度和品质的评估

使用基于珠子的自动程序，从残余的溶剂提取的A组(群体1和2)和B组大豆种子发送样品成功回收了DNA。定量数据显示，平板间的平均DNA浓度范围是7.52-16.25ng/μL，记录到最大回收为平板#Y120067的单个孔中的43ng/μL。表8。还通过在琼脂糖w/EtBr上可视化来自每个平板的一个代表行的5μL基因组DNA评估了DNA品质。有一个略微拖尾的高分子量条带(10kb)，表明每个DNA样品有一部分断裂。图10。DNA纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)在所有被评估种子平板之间保持一致，并且良好地位于1.7-2.0的可接受范围内，表明不大可能带入污染化合物。

表8.A组和B组的DNA产量(ng/μL)和纯度

A组B组

评估大豆脱脂种子DNA在PCR应用中的效率

使用性状特异性引物(A组:RR1和RR2,和B组:AAD12)，利用PCR测定性能来评估每组种子DNA。RR1和RR2PCR以终点PCR格式实施(图11和12)，而AAD12基因特异性分析以实时PCR测定的形式实施(图13)。样品性能通过计算百分比数据返回、错误读出率(miss-callrate)、无读出率(no-callrate)和失败率(failrate)来度量。总体上，将无读出和失败针对总体数据返回进行计数。在A组种子DNA样品中，为RR1和RR2测定总共生成了180个数据点，在B组种子样品中，为AAD12测定总共生成了90个数据点。观察到了预期的样品分离模式，并且观察到纯合聚类、半合聚类和空聚类的充分分离。

为所有种子DNA群体获得了高品质的接合性数据，在RR1,RR2,和AAD12GS测定中，数据返回率分别为98.4％,99.5％和100％。表9。进一步，在RR1和RR2测定中，在可比较的种子和叶参考样品之间观察到了100％的一致性，在AAD12GS测定中，叶和种子之间观察到了92.3％的一致性。表9。

表9(a-c).从脱脂种子材料分离的大豆DNA的PCR验证统计学结果

*播种了90个切割种子的含胚部分。萌发的数目用星号指示。

**只对有可用的叶参考读出的种子部分进行了比较

前述用于从残余溶剂提取组织提取和扩增DNA的系统和方法是鲁棒的。在油提取(FAME)成本为$0.62，基因组DNA提取成本为$0.61的条件下，能够以每个样品低于$1.23的成本从单一种子源获得油谱和基因谱。在应用中，育种者能够仅选择那些含有期望油谱和基因谱的种子用于播种，而直接丢弃不想要的种质，从而减少田间工作量和提高性能。

实施例3：从脱脂向日葵种子材料分离DNA用于基因分型

这里，我们采用与实施例1中所述相似的自动化程序从残余的溶剂提取的向日葵种子材料分离高品质基因组DNA。使用分离的DNA对一组半种子溶剂提取样品(“A组”)进行SNP标志基因分型，所述SNP标志是9个先前已被鉴定与霜霉病抗性连锁的SNP标志。从第二组溶剂(该组对霜霉病抗性和低饱和油性状是分离的)提取样品(“B组”)分离DNA，并用于PCR分析(对14个SNP标志)，以证明溶剂提取的平板在DNA分离之前能够在环境温度下保存长达11天，并证明该程序能够以低体积实施，从而降低成本和增加产出。在大规模应用时，利用这些特征可产生显著的成本改善。

材料和方法

使用两组向日葵半种子材料。图14。将“A组”材料(对霜霉病抗性分离)被分割成含子叶的种子部分(1/4种子)和含胚的种子部分(3/4种子)。对种子部分进行溶剂提取和DNA分离处理。还从另一未脱脂的1/4种子材料的对照组分离了DNA。在SNP分析之前将所有DNA稀释2X。

使用B组种子材料(1/4种子)评估在DNA分离之前被长期(5天或11天)保存的残余溶剂提取种子材料中核酸的稳定性。用实施例1所述的自动化DNA分离程序的一个修饰版本(也称作低体积)处理B组溶剂提取材料，以降低程序成本。在SNP分析之前将B组DNA样品稀释20X，以适应使用更大的标志筛选组(panel)。

与芥花和大豆半种子材料不同，向日葵种子材料在分割之前不浸泡，并且不除去种壳。用外科手术刀(scalpel)人工除去可提取的种子部分。因为A组和B组的亲本对照已经使用相似的程序得到了分离并且被列入了标志文库的目录中，所以这个实施例中没有种植叶组织参照材料。

对A组的1/4种子和3/4种子部分进行溶剂提取，以鉴定每个样品的油谱。图15。B组材料用3/8”钢珠研磨并脱脂。还测定了一个补充的溶剂提取的1/4种子群体的油谱。图16。使用旋转蒸发仪(Labconco)65℃15分钟蒸发溶剂提取处理残余的庚烷，并制备残余的种子材料用于DNA提取。脱脂之后，将溶剂提取的B组材料保存在通风橱中，在环境温度(～25℃)下保存5天(“B1组”)或11天(“B2组”)。

对于溶剂提取的A组种子材料，在提取大约24小时内向Matrix架子的每个样品孔中添加350μL缓冲液RLT(Qiagen)。利用3/8”钢珠以1500rpm2分钟研磨样品以启动DNA从种子材料的释放，然后以6,000rpm最终旋转5分钟，以沉淀悬浮的组织碎片。然后，将架子装载到1800机器人下方的温育器中，使用与实施例1所述相同的全自动提取程序回收DNA，该程序使用Velocity11软件启动。为每个样品回收90μLDNA，并保存在4℃。

对于在DNA提取之前没有脱脂的1/4种子样品(“A1组”)，组织制备方法略有不同。最初用1/8”钢珠以1500rpm干研磨5分钟，以软化(macerate)种子组织。然后，向Matrix架子的每个样品孔添加300μL缓冲液RLT，并对样品封盖。然后在1500rpm对样品再研磨5分钟以均质样品和释放DNA，随后在6,000rpm5分钟进行最后的离心以沉淀悬浮的组织碎片。与使用脱脂样品相同，然后将架子去封盖并装载到机器人平台下方的温育器中，使用自动化处理进行提取。从每个A1组样品回收90μLDNA，并保存在4℃。

使用“低体积”版本的自动化DNA分离程序提取B组样品。“低体积”方法利用更少的磁珠进行DNA结合，更少的清洗缓冲液，和更少的洗脱缓冲液(浓缩DNA)。

为了制备用于DNA提取的样品，向Matrix架子的每个样品孔添加300μL缓冲液RLT。将样品以1500rpm研磨2分钟以启动DNA从种子材料的释放，随后在6,000rpm5分钟进行最后的离心以沉淀悬浮的组织碎片。因为样品孔仍然含有3/8”磁珠，架子不会与离心机中的平衡状态相容。因此，使用NX向含有1/8”珠子的新matrix架子转移200μL样品上清。将样品架子去封盖并置于温育器中。自动化的“低体积”方案该程序使用Velocity11软件启动，从每个样品回收75μLDNA，并保存在4℃。

用于从脱脂种子材料分离DNA的“低体积”程序：将Matrix架子中经研磨的溶剂提取的向日葵半种子在环境温度下温育过夜，以挥去残余庚烷。次日，向每个管添加300μL缓冲液RLT。将架子封盖并在1500rpm研磨20秒。然后，将架子在6,000rpm离心5分钟。然后，将Matrix架子转移到1800上的温育器中。方案的其余部分在1800上进行。

通过剧烈震荡或涡旋重悬浮SuspensionG珠子。将10μL重悬的SuspensionG珠子转移到1mLHalfWell平板的每个样品孔中。将含有经软化的样品组织的Matrix微管架子在3000rpm离心45秒。从每个微管转移100μL上清液到1mLAB-GeneHalfWell平板上一个相应的含有10μlSuspensionG的孔中。将样品用吸头混合，并在室温下温育90秒，以引发DNA结合(15-25℃)。

然后，将样品置于滴定震荡器的模块上，完全混合20秒，确保任何可见的团块被破碎分离。将样品在室温下再温育90秒。将磁颗粒在磁性MAGNARACK^TM上分离15秒。将150μL样品上清转移回2DMatrix微管架。检查各孔，确认它们仅含有珠子并且所有液体均被除去。

向每个样品孔添加100μL缓冲液RPW(Qiagen)，然后将样品置于滴定震荡器上完全混合20秒。将磁颗粒在磁性架上分离15秒。将大约150μL样品上清转移回2DMatrix微管架。检查孔，确认它们仅含有珠子并且所有液体均被除去。

向模块的每个样品孔添加100μLEtOH(96-100％)，然后将模块置于滴定震荡器上，震荡20秒以确保磁颗粒悬浮。磁颗粒在磁性架上分离15秒。将大约150μL样品上清转移回2DMatrix微管架。检查孔，确认所有液体均被除去。

向模块的每个样品孔添加200μLEtOH(96-100％)，然后将模块置于滴定震荡器上，并震荡20秒以确保磁颗粒均匀悬浮。磁颗粒在磁性架上分离15秒。将200μL上清转移到2DMatrix微管架。检查孔，确认所有液体均被除去。

将磁颗粒在室温下温育5分钟，以确保所有EtOH被蒸发。向模块的每个孔添加75μL缓冲液AE(Qiagen)，然后将模块置于震荡器上1分钟，以确保磁颗粒均匀悬浮。磁颗粒在磁性架上分离30秒。向一个带标签的500μLV-底收集平板中转移75μL上清液。将该收集平板用设定于175℃2.1秒的进行热封。

从每个样品回收75μLDNA并保存在4℃。

在基于珠子的DNA提取之后，通过定量、定量和琼脂糖凝胶电泳对DNA进行表征。对于定量，向10mL1XTE缓冲液中添加50μL染料，并混合(对每个待定量的DNA平板)。向白色板的每个孔添加90μL稀释的试剂和10μL样品DNA，并完全混合。在5酶标仪上测量285/520和535/10波长下的吸光度。向相邻孔添加系列稀释的10.0,5.0,2.5,和0ng/μLλDNA标准(N3011L,NewEnglandBioLabs,Ipswitch,MA)，以生成标准曲线，并针对稀释度调节浓度。

为了评估DNA纯度，直接向8000读取器(ThermoScientific)的每个基座添加2μL来自A组的未稀释1/4种子DNA，来自A组的未稀释3/4种子DNA，和来自B组的未稀释1/4种子DNA，并记录A₂₆₀/A₂₈₀纯度比值。大约1.8-2.0的测量值一般认为是纯的，而这个范围之外的数值则表明可能存在蛋白质、酚、盐和其它污染物。还通过在含有EtBr的1.0％(LifeTechnologies)上可视化5μL未稀释的DNA评估了每个样品的DNA品质。在凝胶的一端加载400-10,000bpHIGHRANGE^TM分子量标准用于比较。在XR成像仪上对凝胶进行可视化。

利用基于KASParPCR的方案对从脱脂的1/4和3/4种子样品和从没有脱脂的1/4种子样品分离的DNA进行筛选，考察SNP标志系列的接合性。使用A组材料对9个与霜霉病性状相关的标志进行评估。获得了两个亲本的对照DNA并稀释20X。

向384孔PCR平板的每个孔加入2μL2X稀释的种子DNA，并在65℃干燥2小时。在干燥期结束时，用MERIDIAN^TM移液器(liquidhander)(KBS-0002-001,KBioscience,Hertfordshire,UK)向PCR平板的每个孔添加四4μL1XKASParPCR预混物(含有引物)(表10)，并添加亲本对照。用FLEXISEAL^TM热封仪(Kbioscience)密封平板，并在HYDROCYCLER^TM-16(KBioscience)上实施触地(touchdown)PCR(表10)，最终退火温度为55℃。PCR之后，将平板3000rpm离心1分钟，并用(470-0268,BMGLabtech,Offenburg,Germany)酶标仪读取。

SNP数据分析用完成。

表10(a-c).用于384孔和1536孔板的KASParPCR和循环条件

a.测定预混物制备

b.KASParPCR反应设置

*在添加KASParPCR主预混物前被干燥

c.PCR热循环参数

向日葵脱脂种子DNA产量、纯度和品质的评估

使用基于珠子的分离程序，从残余的溶剂提取的1/4和3/4种子组织、以及从完整的1/4种子组织均成功回收了DNA。定量数据显示，平板间平均DNA浓度范围是4.87(完整的1/4种子样品)-19.50ng/μL(脱脂的1/4种子样品)。表8。从脱脂的3/4种子样品回收了平均18.21ng/μLDNA。

在A1组和A2组1/4种子平板之间观察到的产量差异似乎是由于种子破碎尺寸的不同，而不太可能是由于FAME提取处理所致。因为FAME提取(当存在时)在DNA提取之前实施，所以种子材料在DNA分析之前被粉碎，不太可能在DNA提取步骤中确认种子的破碎尺寸。由于这个不确定性，用另一块1/4种子样品平板(称作“补充群体”)来收集额外的油组成(图16)和DNA数据(图20)。在这个补充群体中获得的平均产量为6.42ng/μLDNA，这与从A1组完整1/4种子样品记录的DNA度量相当。

所有A组群体的凝胶电泳表明，来自A2组的1/4种子DNA样品的条带强度与来自A1组的脱脂3/4种子样品最相似，这进一步表明，在回收时很可能A2组1/4种子样品的尺寸与3/4种子样品更接近。图17。凝胶还显示每个DNA样品的一部分被断裂，因为存在微弱的拖尾。

表11.用标准MagAttract方法提取的A组种子样品的DNA产量(ng/μL)和纯度量度

注：浓度用ng/μL表示；DNA用100μL洗脱。

还使用“低体积”程序从残余溶剂提取种子材料成功回收了DNA。定量数据显示，这些样品的平均DNA浓度范围是24.54ng/μL-30.49ng/μL(脱脂样品在环境温度下保存11天)，和8.21ng/μL-19.87ng/μL(脱脂样品在环境温度下保存5天)。表12。从保存了11天的溶剂提取材料平均回收了2.06μgDNA，而从保存了5天的两个溶剂提取平板回收了1.49μg和0.62μgDNA。

所有测试样品的DNA纯度(A₂₆₀/A₂₈₀)相当，平均为1.72-1.75。

表12.从经过储存的脱脂种子样品(B组)分离的DNA的DNA产量(ng/μL)和纯度量度

B组向日葵MagAttract“低体积”种子DNA(提取后5和11天)

注：浓度用ng/μL表示；DNA用75μL洗脱。

还确定了补充的溶剂提取1/4种子群体的DNA产量和纯度。表13和图18。

表13.使用MagAttract程序从脱脂1/4向日葵种子“补充”群体分离的DNA的DNA产量(ng/μL)和纯度(A260/280)量度

向日葵脱脂种子DNA在PCR应用中的效力的评估

使用一组9个SNP标志(即SNPIDs:67988；68382；68442；69337；69424；65952；92237；95348；和89986)，通过PCR测定性能评估每组种子DNA样品的接合性确定。图19-20。每个平板的脱脂(A2组)和非脱脂(A1组)1/4种子DNA样品被测试2次以确保数据的重现性。此外，用相同的9个标志对脱脂的3/4种子DNA样品(含胚)进行评估，以确定雄性和雌性遗传的同时存在是否会扭曲标志数据。在分析之前，用水将所有种子DNA稀释2X，更浓的亲本叶DNA对照则稀释20X。在PCR之后，将每组原始PCR数据上传到并描点作图以可视化等位基因分离模式。品质不够的样品在数据点图上会显示为异常点或失败。

在所有的测试情形下均获得了可靠的SNP标志数据。此外，比较1/4种子部分与相应的3/4种子部分的标志数据显示，它们的读出具有高度的一致性。

对从在分离之前保存了5天或11天的残余溶剂提取种子材料回收的DNA的PCR测定性能也进行了评估。在这些测定中，DNA用水稀释20X，随后干燥2μLDNA，并在一个1.3μLKASPar测定(1536孔格式)中进行分析。使用一组14个SNP标志(SNPIDs:67988；68382；68442；68862；69337；69424；65952；65992；66345；92237；95348；94512；89986；和93920)对这些样品进行基因分型。PCR之后，将每组的原始PCR数据上传到并描点作图以可视化等位基因分离模式。

数据包括了与预期亲本紧密聚类的样品，证明这些样品中在PCR基因分型系统中的鲁棒性。图21。对于在整个标志组中均有分离的样品(主要是B2组(平板#2012-092_1&2))，观察到在AA、AB和BB基因型之间有充分的分离。图21。在任何一组样品中很少发现失败或错误读出。

对“低体积”版本的DNA分离程序进行了验证，结果确定了长时间保存溶剂提取种子材料不会显著影响DNA回收和性能。

Claims

1.一种用于确定植物就至少一个感兴趣的基因座而言的基因型的系统，该系统包括：

已经历溶剂提取的种子样品；

从所述种子样品中结合核酸以产生高品质核酸样品的磁性颗粒；

用于扩增该高品质核酸样品以产生扩增核酸的手段；

选择性地与感兴趣基因座的等位基因杂交的寡核苷酸探针；和

用于根据该寡核苷酸探针与该扩增核酸之间的杂交或缺乏杂交来确定种子样品的基因型的计算机实现的手段。

2.权利要求1的系统，其中所述感兴趣的基因座是基因。

3.权利要求1的系统，其中该系统是完全自动化的。

4.权利要求1的系统，其中该系统包括附接于所述寡核苷酸探针上的荧光指示染料。

5.权利要求1的系统，其中该种子样品已经历通过溶剂提取进行的脂肪酸提取。

6.权利要求1的系统，其中该种子样品来自油料植物。

7.权利要求6的系统，其中该油料植物是芸苔属、大豆或向日葵。

8.利用权利要求1的系统产生的高品质核酸样品。

9.权利要求8的高品质核酸样品，其中该核酸样品的A₂₆₀/A₂₈₀吸光度比值是大约1.7到大约2.0之间，并且其中该核酸样品能够通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。

10.一种用于确定植物就至少一个感兴趣的基因座而言的基因型的方法，该方法包括：

提供来自该植物的经历了溶剂提取的种子样品；

从该脱脂的种子样品分离高品质核酸；

扩增该高品质核酸以确定接合性；和

鉴定该扩增核酸的等位基因组成。

11.权利要求10的方法，其中该感兴趣的基因座是基因。

12.根据权利要求10的方法，其中鉴定所述扩增核酸的等位基因组成包括使等位基因特异性探针与所述扩增核酸杂交。

13.根据权利要求10的方法，其中所述溶剂提取包括通过溶剂提取脱脂，其中所提取的油通过酯交换反应被转变成脂肪酸甲酯(FAME)。

14.权利要求11的方法，其中该脂肪酸甲酯用气相色谱定量。

15.根据权利要求10的方法，其中从所述脱脂的种子样品分离高品质核酸是利用基于珠子的DNA提取平台进行的。

16.根据权利要求15的方法，其中该基于珠子的DNA提取平台包括结合核酸的磁性颗粒。

17.根据权利要求10的方法，其中该方法以自动化的方式进行。

18.根据权利要求10的方法，其中扩增所述高品质核酸包括利用聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸分子。

19.根据权利要求10的方法，其中该种子样品包括一部分种子子叶，但不包括种子胚。

20.根据权利要求10的方法，其中该方法包括定量分离的核酸样品。

21.根据权利要求10的方法，其中该方法包括为种子样品提供油性状判定。

22.根据权利要求10的方法，其中该植物种子中除所述种子样品之外的部分被选择用于播种。

23.根据权利要求22的方法，其中该植物种子的所述部分由于该植物种子包含感兴趣基因的基因型而被选择。

24.根据权利要求23的方法，其中该植物种子的所述部分进一步由于该植物种子包含感兴趣脂肪酸谱而被选择。

25.根据权利要求22的方法，其中该方法包括播种该被选择的植物种子的所述部分。

26.根据权利要求25的方法，其中播种该种子部分包括将该种子部分置于土壤中。

27.根据权利要求25的方法，其中播种该种子部分包括将该种子部分置于生长支持性培养基中。

28.根据权利要求22的方法，其中该方法包括：在没有让来自不包含感兴趣基因的基因型的植物种子的除所述种子样品之外的植物种子部分萌发的情况下，从不包含感兴趣的基因的基因型的植物种子中弃去除所述种子样品之外的植物种子部分。