CN101956011A

CN101956011A - 一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN101956011A
Application number: CN 201010290041
Authority: CN
Inventors: 吴希阳; 芦春斌; 陈贞
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2010-09-20
Filing date: 2010-09-20
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2030-09-20
Also published as: CN101956011B

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法及其应用。本发明提供了sad1基因、GUS基因、Cry1Ab/Ac基因、NPTII基因、NOS基因和CaMV35S基因的引物，总共6对，将其应用于同一个PCR反应体系中，能从棉花籽中一次测出6种基因，步骤少，效率高，结果准确可靠。本发明为转基因棉花的检测提供了较为可靠和简便的检测方法，所建立的体系可重复性高，经多次试验稳定性好。其检测结果与其他检测技术相比，具有更大的可靠性和适应性，简化了检测步骤，提高了检测效率，从而为转基因棉花的检测提供更有为效的检测手段。

Description

一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法及其应用。

背景技术

棉花不仅可作为纤维原料应用在纺织品上，也是动物饲料和各种加工食品组分原材料的重要来源。目前有许多国家包括印度、美国、中国、阿根廷、南非等均种植有转基因棉花。转基因棉花种植发展迅速，截止到2009年美国、印度和中国的转基因棉花种植面积分别为320万公顷、840万公顷、大于370万公顷，约占本国棉花种植面积的88％、89％、大于60％。随着转基因棉花越来越广泛的种植，出于对转基因作物安全性的考虑，日本、欧盟等许多国家相继建立了转基因食品标识制度。我国于2002年3月20日起施行《农业转基因生物标识管理办法》，要求对5类转基因生物所涉及的17种转基因产品进行标识，其中也包括了转基因棉花种子。因此建立一套方便、快捷的转基因产品检测技术是贯彻标识制度的重要前提。近年来国内外关于转基因植物检测的报道多涉及转基因大豆、玉米及其加工产品，检测方法中以多重PCR技术较为常见。而对于转基因棉花的检测研究则报道较少，目前有关转基因棉花检测技术包括SSR(simple sequences repeat，简单重复序列)PCR技术和ELISA方法等。但是，现有的检测技术操作复杂，检测耗时长，且无法同时检测转基因棉花中多个外源基因。

发明内容

本发明的首要目的是克服现有技术的缺点与不足之处，提供一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法。

本发明的另一目的在于提供所述检测方法的应用。

本发明是采用以下方案实现的：一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法，包含以下步骤：

(1)设计多重PCR的6对引物，分别为：

sad1-F：5’-CCACGAGACAGCCTATACCAAAAT-3’；

sad1-R：5’-CCCTAACCAAAGCCACGCA-3’；

GUS-F：5’-CTGCGACGCTCACACCGATACC-3’；

GUS-R：5’-TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3’；

Cry1Ab/Ac-F：5’-GAAGGATTGAGCAATCTCTACCAA-3’；

Cry1Ab/Ac-R：5’-TTCCAATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’；

NPTII-F：5’-CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3’；

NPTII-R：5’-CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG-3’；

NOS-F：5’-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3’；

NOS-R：5’-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3’；

CaMV35S-F：5’-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3’；

CaMV35S-R：5’-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3’；

(2)检测：以棉花基因组DNA为模板，在PCR反应中加入步骤(1)设计的所有引物，进行PCR、电泳，从而得知所检测的棉花是否为转基因棉花。

所述棉花基因组DNA优选通过以下步骤提取得到：将棉花籽进行脱绒，用水浸泡脱绒后的棉花籽5～9h，接着研碎，再提取棉花籽基因组DNA；

所述棉花基因组DNA更优选通过以下步骤提取得到：将一粒棉花籽进行脱绒，用水浸泡脱绒后的棉花籽5～9h，接着研碎，于40～70℃放置30～50min，再提取棉花籽基因组DNA；

所述的脱绒优选通过浓硫酸进行脱绒；

所述的浓硫酸指的是浓度至少为体积百分比98％的硫酸；

所述的提取优选通过基因组DNA提取试剂盒进行提取；更优选为按照基因组DNA提取试剂盒的说明书进行提取，其中的改进之处在于：(1)裂解水浴时间延长；(2)离心时间延长；

所述PCR的反应体系优选为其中所用的引物终浓度分别是：引物sad1-F和引物sad1-R分别为0.1μmol/L、引物GUS-F和引物GUS-R分别为0.4μmol/L、引物Cry1Ab/Ac-F和引物Cry1Ab/Ac-R分别为0.1μmol/L、引物NPTII-F和引物NPTII-R分别为0.1μmol/L、引物NOS-F和引物NOS-R分别为0.4μmol/L、引物CaMV35S-F和引物CaMV35S-R分别为0.4μmol/L；

所述PCR的反应体系更优选为：使用PCR反应试剂盒，每50μL反应体系中含有Mix 1溶液(含Buffer、dNTP、MgCl₂)25μL、Mix 2(含Taq^TM DNA聚合酶)0.25μL，引物终浓度分别为0.1、0.4、0.1、0.1、0.4、0.4μmol/L(依照上述引物顺序)，模板DNA为150ng，用双蒸水将体积调整为50μL。

所述的PCR反应试剂盒优选为Takara宝生物公司的Multiplex PCR AssayKit(DRR060A)；

所述PCR的反应条件为：94℃ 1min；94℃ 30s，60.4℃ 90s，72℃ 90s，35个循环；72℃，10min；

所述电泳的条件优选为质量体积比2.5％的琼脂糖凝胶，80V电泳；

上述的检测方法还可应用于大米、菜籽粕或大豆中的转基因成分的鉴定。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明为转基因棉花的检测提供了较为可靠和简便的检测方法，所建立的体系可重复性高，经多次试验稳定性好。其检测结果与其他检测技术相比，具有更大的可靠性和适应性，简化了检测步骤，提高了检测效率，从而为转基因棉花的检测提供更有为效的检测手段。本发明中的内标准基因sad 1相当于阳性对照，这样可以保证抽提得到的棉花基因组DNA是可以进行PCR的，PCR的反应条件和反应体系是成功的。

(2)本发明能成功的从一颗棉花籽中提取到DNA、并将其用于PCR检测，本发明能从棉花籽中一次测出6种基因，步骤少，效率高，结果准确可靠。因此本发明可应用于较少数量的样品抽样检测的场合。

附图说明

图1是实施例1的PCR产物电泳图，其中：

泳道M为DL2000的核酸分子量标准；泳道1为转基因棉花籽；泳道2为未含转基因成分的棉花籽。

图2是实施例2的PCR产物电泳图，其中：

泳道M为DL2000的核酸分子量标准；泳道1为质粒PTF102；泳道2为转基因大米；泳道3为转基因菜籽柏；泳道4为转基因大豆。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

取棉花籽1粒(已知为转基因棉花籽SGK321品系转Bt棉花标准样品，由石家庄市农业科学研究院提供)，用体积百分比为98％的浓硫酸脱绒处理(参考文献：张存信《棉花种子硫酸脱绒技术》，北京农业)，将脱绒后的棉花籽用水浸泡6h，然后取出放入塑料袋研碎，接着放入65℃烘箱稍微烘干(30min)，使用基因组DNA提取试剂盒(Promega的wizard genomic DNA purification kit)，按照说明书进行提取，其中的改进之处在于：(1)裂解水浴时间延长，从说明书的20min延长至40min；(2)离心时间延长，从说明书的5min延长至8min。提取后棉花籽基因组经紫外分光光度计测定浓度为276ng/μL，纯度为OD260/280为1.76，将提取后棉花籽DNA稀释成浓度为50ng/μL。

再取棉花籽一粒(为未含有转基因成分的棉花籽，孟山都农业公司)，重复以上步骤，最后将提取后棉花籽DNA稀释成浓度为50ng/μL。

取2支200μL PCR管，加入PCR反应试剂盒(Multiplex PCR Assay Kit，DRR060A，Takara)中Mix 1(含Buffer、dNTP、MgCl₂)25μL，Mix 2(含Taq^TMDNA聚合酶)0.25μL，体系中多重PCR引物的终浓度依次分别为0.1、0.4、0.1、0.1、0.4、0.4μmol/L(依照sad1：GUS：Cry1Ab/Ac：NPTII：NOS：CaMV35S顺序)，2支管中分别加入2种样品的模板DNA各3μL(50ng/μL)，ddH₂O将体积调整为50μL。将PCR反应管放入PCR仪中，以94℃，1min；94℃，30s，60.4℃，90s，72℃，90s，35个循环；72℃，10min条件扩增，分别取反应液8μL进行DNA琼脂糖凝胶电泳(胶浓度为2.5％)，在凝胶成像仪中成像(如图1所示)。泳道1有5条清晰条带，从大到小依次为sad1基因、Cry1Ab/Ac基因、NPTII基因、NOS基因和CaMV35S基因，证明此棉籽中含有Cry1Ab/Ac、NPTII、NOS、CaMV35S共4种外源基因。泳道2所示只有1条清晰条带，是内源sad1基因，证明此棉花籽中不含GUS基因、Cry1Ab/Ac基因、NPTII基因、NOS基因和CaMV35S基因。

实施例2

用基因组DNA试剂盒分别提取大米、菜籽粕和大豆的基因组DNA。提取后三种样品基因组DNA稀释成浓度为50ng/μL。

取质粒PTF102(购自Promega公司)(50ng/μL)作为对照。取4支200μLPCR管，加入PCR反应试剂盒(Multiplex PCR Assay Kit，DRR060A，Takara)中Mix 1(含Buffer、dNTP、MgCl₂)25μL，Mix 2(含Taq^TM DNA聚合酶)0.25μL，体系中引物终浓度分别为0.1、0.4、0.1、0.1、0.4、0.4μmol/L(依照sad1：GUS：Cry1Ab/Ac：NPTII：NOS：CaMV35S顺序)。4支管中分别加入4种样品的模板DNA各3μL(50ng/μL)，ddH₂O将体积调整为50μL。将PCR反应管放入PCR仪中，以94℃，1min；94℃，30s，60.4℃，90s，72℃，90s，35个循环；72℃，10min条件扩增，分别取反应液8μL进行DNA琼脂糖凝胶电泳(胶浓度为2.5％)，在凝胶成像仪中成像(如图2所示)。泳道1有三条清晰条带，证明此质粒PTF102中含有GUS、NOS、CaMV35S共3种外源基因；泳道2有4条清晰条带，证明此大米中含有Cry1Ab/Ac、NPTII、NOS、CaMV35S共4种外源基因；泳道3有3条清晰条带，证明此菜籽粕中含有NPTII、NOS、CaMV35S共3种外源基因；泳道4有2条清晰条带，证明此大豆样品中含有NOS、CaMV35S共2种外源基因。

综合以上结果，本研究所建立的六重PCR体系能有效的检测出棉花籽、PTF102质粒、大米、菜籽柏、大豆中的转基因成分，由此证明以上建立的六重PCR体系用来检测棉花中转基因成分是可行的，检测方法效率高、简便、准确。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)设计多重PCR的6对引物，分别为：

sad1-F：5’-CCACGAGACAGCCTATACCAAAAT-3’；

sad1-R：5’-CCCTAACCAAAGCCACGCA-3’；

GUS-F：5’-CTGCGACGCTCACACCGATACC-3’；

GUS-R：5’-TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3’；

Cry1Ab/Ac-F：5’-GAAGGATTGAGCAATCTCTACCAA-3’；

Cry1Ab/Ac-R：5’-TTCCAATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’；

NPTII-F：5’-CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3’；

NPTII-R：5’-CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG-3’；

NOS-F：5’-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3’；

NOS-R：5’-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3’；

CaMV35S-F：5’-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3’；

CaMV35S-R：5’-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3’；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的棉花基因组DNA通过以下步骤提取得到：将棉花籽进行脱绒，用水浸泡脱绒后的棉花籽5～9h，接着研碎，再提取棉花籽基因组DNA。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述棉花基因组DNA通过以下步骤提取得到：将一粒棉花籽进行脱绒，用水浸泡脱绒后的棉花籽5～9h，接着研碎，于40～70℃放置30～50min，再提取棉花籽基因组DNA。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的脱绒通过浓硫酸进行脱绒；所述的浓硫酸指的是浓度至少为体积百分比98％的硫酸。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述的提取通过基因组DNA提取试剂盒进行提取。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述提取为按照所述基因组DNA提取试剂盒的说明书进行提取，其中的改进之处在于：(1)裂解水浴时间延长；(2)离心时间延长。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述PCR的反应体系为其中所用的引物终浓度分别是：引物sad1-F和引物sad1-R分别为0.1μmol/L、引物GUS-F和引物GUS-R分别为0.4μmol/L、引物Cry1Ab/Ac-F和引物Cry1Ab/Ac-R分别为0.1μmol/L、引物NPTII-F和引物NPTII-R分别为0.1μmol/L、引物NOS-F和引物NOS-R分别为0.4μmol/L、引物CaMV35S-F和引物CaMV35S-R分别为0.4μmol/L。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述PCR的反应条件为：94℃ 1min；94℃ 30s，60.4℃ 90s，72℃ 90s，35个循环；72℃，10min。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述电泳的条件为质量体积比2.5％的琼脂糖凝胶，80V电泳。

10.权利要求1～9任～项所述的检测方法应用于大米、菜籽粕或大豆中的转基因成分的鉴定。