CN104404161A - 转基因玉米的多重pcr筛查检测引物及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因玉米的多重PCR筛查检测引物及检测方法,所述引物具有较强的特异性,能够用于多重PCR筛查检测分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因玉米筛查检测方法,实现了转基因玉米的多靶标检测。利用毛细管电泳对PCR扩增产物进行分析,其片段大小区分率可达数个碱基,分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因玉米多靶标检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法。本实验建立的多重PCR反应体系不仅可以检测进口转基因玉米外源基因成分,而且还能扩增到其他转基因作物筛查检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种可同时检测两种和六种外源基因的多重PCR筛查检测方法。
背景技术
目前关于进口转基因玉米及其产品的筛查检测技术,主要集中在单一基因PCR方法,尚无关于检测进口转基因玉米及其产品的多重PCR筛查检测策略研究及相关筛查检测技术。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种准确、快速、简便的多重PCR快速筛查多个目的基因元件的检测方法。
本发明通过下述技术方案实现:
转基因玉米的多重PCR筛查检测引物,包括以下引物序列:
其中,二重PCR引物序列如下:
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。
六重PCR引物序列如下:
P-ract1-F:5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3';
P-ract1-R:5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3';
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
bar-F:5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3';
bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3';
pat-F:5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3';
pat-R:5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3';
PMI-F:5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3';
PMI-R:5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'。
上述二重PCR检测方法如下:
(a1)合成以下引物:
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3';
(a2)制备待测玉米的DNA稀释液;
(a3)配制PCR反应体系;
(a4)进行PCR反应;
(a5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
进一步地,步骤(a3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL;具体含以下组分:PCR Master Mix(2X)、DNA稀释液、步骤(a1)中的各引物、ddH2O;其中PCR Master Mix(2X)的加入量为12.5μL,DNA稀释液加入量为2.0μL,各引物加入后的终浓度均为0.2μM,采用ddH2O补足25μL。
再进一步地,所述PCR反应条件为:94℃变性5min,然后进入35个循环;94℃30s,58℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。
上述六重PCR检测方法如下:
(b1)合成以下引物:
P-ract1-F:5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3';
P-ract1-R:5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3';
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
bar-F:5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3';
bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3';
pat-F:5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3';
pat-R:5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3';
PMI-F:5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3';
PMI-R:5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3';
(b2)制备待测玉米的DNA稀释液;
(b3)配制PCR反应体系;
(b4)进行PCR反应;
(b5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
进一步地,步骤(b3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL;具体含以下组分:PCR Master Mix(2X)、DNA稀释液、步骤(b1)中的各引物、ddH2O;其中PCR Master Mix(2X)的加入量为12.5μL,DNA稀释液加入量为2.0μL,P-ract1引物加入后的终浓度为0.2μM,其他引物加入后的终浓度为0.1μM,采用ddH2O补足25μL。
再进一步地,所述PCR反应条件为:94℃变性5min,然后进入35个循环;94℃30s,56℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。
本发明具有以下优点及有益效果:
本发明在每个转基因玉米材料及产品至少检测出一次的筛查检测时,采用本发明设定的T-NOS和P-CaMV 35S两个基因,并通过对引物浓度和退火温度优化建立了检测转基因玉米的二重PCR技术体系。
本发明在每个转基因玉米材料及产品至少检测出两次的筛查检测时,采用本发明设定的P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI等6个基因,并通过对引物浓度和退火温度优化建立了检测转基因玉米的六重PCR技术体系。
本发明仅一次PCR反应可快速、准确检测出当前进口转基因玉米至少一次,且成本低、准确率高,假阳性率低,六重PCR技术体系也能有效控制假阴性的出现。
附图说明
图1为本发明中P-ract1(A),T-NOS(B),P-CaMV 35S(C),bar/pat(D),PMI(E)单基因PCR扩增结果。
图2为本发明中CaMV35s,T-NOS二重PCR引物梯度扩增结果(A),温度梯度扩增结果(B),已知样品验证扩增结果(C)。
图3为本发明中P-ract1,T-NOS,P-CaMV 35S,bar,pat,PMI六重PCR引物梯度扩增结果(A),温度梯度扩增结果(B),浓度梯度扩增结果(C),已知样品验证扩增结果(D)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
转基因玉米的多重PCR筛查检测方法,具体如下:
二重PCR筛查检测方法如下:
(a1)合成以下引物:
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3';
(a2)制备待测玉米的DNA稀释液;
(a3)配制PCR反应体系;
(a4)进行PCR反应;
(a5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
其中,步骤(a3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL;具体含以下组分:PCR Master Mix(2X)、DNA稀释液、步骤(a1)中的各引物、ddH2O;其中PCR Master Mix(2X)的加入量为12.5μL,DNA稀释液加入量为2.0μL,各引物加入后的终浓度均为0.2μM,采用ddH2O补足25μL。所述PCR反应条件为:94℃变性5min,然后进入35个循环;94℃30s,58℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。
六重PCR筛查检测方法如下:
(b1)合成以下引物:
P-ract1-F:5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3';
P-ract1-R:5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3';
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
bar-F:5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3';
bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3';
pat-F:5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3';
pat-R:5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3';
PMI-F:5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3';
PMI-R:5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3';
(b2)制备待测玉米的DNA稀释液;
(b3)配制PCR反应体系;
(b4)进行PCR反应;
(b5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
其中,步骤(b3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL;具体含以下组分:PCR Master Mix(2X)、DNA稀释液、步骤(b1)中的各引物、ddH2O;其中PCR Master Mix(2X)的加入量为12.5μL,DNA稀释液加入量为2.0μL,P-ract1引物加入后的终浓度为0.2μM,其他引物加入后的终浓度为0.1μM,采用ddH2O补足25μL。所述PCR反应条件为:94℃变性5min,然后进入35个循环;94℃30s,56℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。
为了验证本发明的筛查检测效果以及相应的参数选取的真实性,对各步骤进行具体的验证试验,其具体情况如下:
(1)扩增检测引物的合成:
表1 引物序列信息表
(2)待测转基因玉米DNA的小量提取:
转基因玉米DNA的提取依据农业部1485号公告-4-2010标准中A.6试剂盒方法,试剂盒是经验证适合转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化的天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305),转基因玉米粉末样品称取200mg,样品DNA洗脱加入70μL洗脱液TE,其他提取步骤参照试剂盒说明书操作。
将提取的样品DNA采用Thermo Nano Drop 1000紫外分光光度计进行浓度和纯度测定,并将样品DNA浓度稀释至50ng/μL待测。
(3)单基因验证
PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1X,引物终浓度上下游各0.2μM,待测DNA模板2.0μL,补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序:94℃变性5min;然后进入35个循环,94℃30s,60℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。结果见图1,其中泳道M:size marker,泳道1~15:转基因玉米T25、TC1507、59122、3272、Bt176、Bt11、MIR604、Bt11×GA21、MON810、MON863、NK603、MON88017、MON89034、MON87460、GA21,泳道16:ddH2O对照。
结论:由图1结果可知,P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI等6个基因特异性条带都能得到有效扩增。
(4)二重PCR
①引物浓度梯度试验:
PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1X,P-CaMV 35S、T-NOS引物终浓度(μM)梯度为0.8:0.2、0.6:0.2、0.4:0.2、0.2:0.2、0.2:0.4、0.2:0.6,待测DNA模板2.0μL,补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序:94℃变性5min;然后进入35个循环,94℃30s,58℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。结果见图2(A),其中泳道M:size maker ,泳道1-6分别对应引物终浓度(μM)梯度0.8:0.2、0.6:0.2、0.4:0.2、0.2:0.2、0.2:0.4、0.2:0.6,泳道7为ddH2O对照。
结论:由图2(A)结果可知,P-CaMV 35S、T-NOS引物终浓度(μM)为0.2:0.2条件下两者扩增效率一致。
②退火温度梯度试验:
PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1X,T-NOS,P-CaMV 35S引物上下游各0.1μM,待测DNA模板2.0μL,补充ddH2O至体积为25μL。
在定性PCR仪上运行如下反应程序:94℃变性5min;然后进入35个循环,94℃30s,退火30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。退火温度梯度为50℃、54℃、56℃、58℃、60℃、64℃。结果见附图2(B),其中泳道M:size maker,泳道1-6分别对应退火温度梯度50℃、54℃、56℃、58℃、60℃、64℃,泳道7为ddH2O对照。
结论:由图2(B)结果可知,退火温度在58℃条件下P-CaMV 35S、T-NOS的扩增效率一致且无非特异性条带出现。
③已知样品验证试验:
PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1X,T-NOS,P-CaMV 35S引物上下游各0.1μM,待测DNA模板2.0μL,补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序:94℃变性5min;然后进入35个循环,94℃30s,58℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。结果见图2(C),其中泳道M:size maker,泳道1-15:转基因玉米T25、TC1507、59122、3272、Bt176、Bt11、MIR604、Bt11×GA21、MON810、MON863、NK603、MON88017、MON89034、MON87460、GA21,16:ddH2O对照。
结论:由图2(C)结果可知,各已知样品都能检测到相关特异性条带。
(5)六重PCR
①引物浓度梯度试验:
PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1X,P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI引物终浓度(μM)梯度见表2,待测DNA模板2.0μL,补充ddH2O至体积为25μL。
表2 反应体系引物终浓度
引物序列 | P-ract1 | T-NOS | P-CaMV 35S | bar | pat | PMI |
终浓度1 | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM |
终浓度2 | 0.2μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM |
终浓度3 | 0.2μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.05μM | 0.05μM | 0.1μM |
终浓度4 | 0.2μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.05μM | 0.05μM | 0.05μM |
终浓度5 | 0.2μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.05μM |
在普通PCR仪上运行如下反应程序:94℃变性5 min;然后进入35个循环,94℃30s,58℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5 min。结果见图3(A),其中泳道M:size maker,泳道1-6分别对应引物终浓度(μM)梯度1、2、3、4、5,泳道6为ddH2O对照。
结论:由图3(A)结果可知,P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI引物终浓度(μM)为梯度1时各基因特异条带亮度更一致。
②退火温度梯度试验:
PCR反应体系组成:PCR Master Mix终浓度为1X,引物浓度参照梯度试验结果,待测DNA模板2.0μL,补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序:94℃变性5min;然后进入35个循环,94℃30s,退火温度 30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。退火温度梯度为48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃。结果见附图3(B),其中泳道M:size maker,泳道1-6分别对应退火温度梯度48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃,泳道7为ddH2O对照。
结论:由图3(B)结果可知,退火温度在56℃条件下P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI基因的扩增效率更一致,非特异性条带弱且不影响结果判断。
③灵敏度试验:
PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1X,引物浓度梯度参照试验结果,待测DNA模板终浓度(ng/μL)梯度50、15、3、1、0.3,补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序: 94℃变性5min;然后进入35个循环,94℃30s,56℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。结果见图3(C),其中泳道M:size maker,泳道1-5分别对应浓度梯度50、15、3、1、0.3,泳道6为ddH2O对照。
结论:由图3(C)结果可知,模板浓度最低在1ng/μL条件下P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI基因的扩增效率一致且能清晰判断结果。
④已知样品验证试验:
PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1X,引物浓度参照梯度试验结果,待测DNA模板2.0μL,补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序:94℃变性5min;然后进入35个循环,94℃30s,56℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。结果见附图3(D),其中泳道M:size maker,泳道1-15:转基因玉米T25、TC1507、59122、3272、Bt176、Bt11、MIR604、Bt11×GA21、MON810、MON863、NK603、MON88017、MON89034、MON87460、GA21,16:ddH2O对照。
结论:由图3(D)结果可知,各已知样品都能检测到相关特异性条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院分析测试中心
<120> 转基因玉米的多重PCR筛查检测引物及检测方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P-CaMV 35S-F
<400> 1
gctcctacaa atgccatcat tgc 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P-CaMV 35S-R
<400> 2
gatagtggga ttgtgcgtca tccc 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T-NOS-F
<400> 3
tgaatcctgt tgccggtctt 20
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T-NOS-R
<400> 4
aaatgtataa ttgcgggact ctaatc 26
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> p-ract1-F
<400> 5
agtccaaaat aaaacaaagg taagat 26
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> p-ract1-R
<400> 6
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<210> 7
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<213> Artificial
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<223> bar-F
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<211> 21
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<211> 21
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<223> pat-F
<400> 9
gaaggctagg aacgcttacg a 21
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> pat-R
<400> 10
ccaaaaacca acatcatgcc a 21
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<212> DNA
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<223> PMI-F
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ttctgaaatc ggttttgcca a 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PMI-R
<400> 12
tcagcaatag cggggagaa 19
Claims (8)
1.转基因玉米的多重PCR筛查检测引物,其特征在于,包括以下引物序列:
二重PCR引物序列:
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。
2. 转基因玉米的多重PCR筛查检测引物,其特征在于,包括以下引物序列:
六重PCR引物序列:
P-ract1-F:5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3';
P-ract1-R:5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3';
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
bar-F:5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3';
bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3';
pat-F:5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3';
pat-R:5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3';
PMI-F:5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3';
PMI-R:5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'。
3. 转基因玉米的多重PCR筛查检测方法,其特征在于,包括以下步骤:二重PCR检测方法:
(a1)合成以下引物:
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3';
(a2)制备待测玉米的DNA稀释液;
(a3)配制PCR反应体系;
(a4)进行PCR反应;
(a5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
4. 根据权利要求3所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法,其特征在于,步骤(a3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL;具体含以下组分:PCR Master Mix(2X)、DNA稀释液、步骤(a1)中的各引物、ddH2O;其中PCR Master Mix(2X)的加入量为12.5μL,DNA稀释液加入量为2.0μL,各引物加入后的终浓度均为0.2μM,采用ddH2O补足25μL。
5. 根据权利要求4所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法,其特征在于,所述PCR反应条件为:94℃变性5min,然后进入35个循环;94℃30s,58℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。
6. 转基因玉米的多重PCR筛查检测方法,其特征在于,六重PCR检测方法:
(b1)合成以下引物:
P-ract1-F:5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3';
P-ract1-R:5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3';
T-NOS-F:5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3';
T-NOS-R:5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3';
P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
bar-F:5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3';
bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3';
pat-F:5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3';
pat-R:5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3';
PMI-F:5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3';
PMI-R:5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3';
(b2)制备待测玉米的DNA稀释液;
(b3)配制PCR反应体系;
(b4)进行PCR反应;
(b5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
7. 根据权利要求6所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法,其特征在于,步骤(b3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL;具体含以下组分:PCR Master Mix(2X)、DNA稀释液、步骤(b1)中的各引物、ddH2O;其中PCR Master Mix(2X)的加入量为12.5μL,DNA稀释液加入量为2.0μL,P-ract1引物加入后的终浓度为0.2μM,其他引物加入后的终浓度为0.1μM,采用ddH2O补足25μL。
8. 根据权利要求7所述的转基因玉米的多重PCR筛查检测方法,其特征在于,所述PCR反应条件为:94℃变性5min,然后进入35个循环;94℃30s,56℃30s,72℃30s;循环结束后72℃延伸5min。
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