CN104404161A - 转基因玉米的多重pcr筛查检测引物及检测方法 - Google Patents
转基因玉米的多重pcr筛查检测引物及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种转基因玉米的多重PCR筛查检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于多重PCR筛查检测分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因玉米筛查检测方法，实现了转基因玉米的多靶标检测。利用毛细管电泳对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因玉米多靶标检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法。本实验建立的多重PCR反应体系不仅可以检测进口转基因玉米外源基因成分，而且还能扩增到其他转基因作物筛查检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种可同时检测两种和六种外源基因的多重PCR筛查检测方法。
背景技术
目前关于进口转基因玉米及其产品的筛查检测技术，主要集中在单一基因PCR方法，尚无关于检测进口转基因玉米及其产品的多重PCR筛查检测策略研究及相关筛查检测技术。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种准确、快速、简便的多重PCR快速筛查多个目的基因元件的检测方法。
本发明通过下述技术方案实现：
转基因玉米的多重PCR筛查检测引物，包括以下引物序列：
其中，二重PCR引物序列如下：
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。
六重PCR引物序列如下：
P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；
P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
bar-F：5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'；
bar-R：5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'；
pat-F：5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3'；
pat-R：5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3'；
PMI-F：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3'；
PMI-R：5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'。
上述二重PCR检测方法如下：
（a1）合成以下引物：
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；
（a2）制备待测玉米的DNA稀释液；
（a3）配制PCR反应体系；
（a4）进行PCR反应；
（a5）取PCR反应产物进行毛细管电泳。
进一步地，步骤（a3）中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL；具体含以下组分：PCR Master Mix（2X）、DNA稀释液、步骤（a1）中的各引物、ddH2O；其中PCR Master Mix（2X）的加入量为12.5μL，DNA稀释液加入量为2.0μL，各引物加入后的终浓度均为0.2μM，采用ddH2O补足25μL。
再进一步地，所述PCR反应条件为：94℃变性5min，然后进入35个循环；94℃30s，58℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。
上述六重PCR检测方法如下：
（b1）合成以下引物：
P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；
P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
bar-F：5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'；
bar-R：5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'；
pat-F：5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3'；
pat-R：5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3'；
PMI-F：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3'；
PMI-R：5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'；
（b2）制备待测玉米的DNA稀释液；
（b3）配制PCR反应体系；
（b4）进行PCR反应；
（b5）取PCR反应产物进行毛细管电泳。
进一步地，步骤（b3）中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL；具体含以下组分：PCR Master Mix（2X）、DNA稀释液、步骤（b1）中的各引物、ddH2O；其中PCR Master Mix（2X）的加入量为12.5μL，DNA稀释液加入量为2.0μL，P-ract1引物加入后的终浓度为0.2μM，其他引物加入后的终浓度为0.1μM，采用ddH2O补足25μL。
再进一步地，所述PCR反应条件为：94℃变性5min，然后进入35个循环；94℃30s，56℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。
本发明具有以下优点及有益效果：
本发明在每个转基因玉米材料及产品至少检测出一次的筛查检测时，采用本发明设定的T-NOS和P-CaMV 35S两个基因，并通过对引物浓度和退火温度优化建立了检测转基因玉米的二重PCR技术体系。
本发明在每个转基因玉米材料及产品至少检测出两次的筛查检测时，采用本发明设定的P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI等6个基因，并通过对引物浓度和退火温度优化建立了检测转基因玉米的六重PCR技术体系。
本发明仅一次PCR反应可快速、准确检测出当前进口转基因玉米至少一次，且成本低、准确率高，假阳性率低，六重PCR技术体系也能有效控制假阴性的出现。
附图说明
图1为本发明中P-ract1（A），T-NOS（B），P-CaMV 35S（C），bar/pat（D），PMI（E）单基因PCR扩增结果。
图2为本发明中CaMV35s，T-NOS二重PCR引物梯度扩增结果（A），温度梯度扩增结果（B），已知样品验证扩增结果（C）。
图3为本发明中P-ract1，T-NOS，P-CaMV 35S，bar，pat，PMI六重PCR引物梯度扩增结果（A），温度梯度扩增结果（B），浓度梯度扩增结果（C），已知样品验证扩增结果（D）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，具体如下：
二重PCR筛查检测方法如下：
（a1）合成以下引物：
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；
（a2）制备待测玉米的DNA稀释液；
（a3）配制PCR反应体系；
（a4）进行PCR反应；
（a5）取PCR反应产物进行毛细管电泳。
其中，步骤（a3）中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL；具体含以下组分：PCR Master Mix（2X）、DNA稀释液、步骤（a1）中的各引物、ddH2O；其中PCR Master Mix（2X）的加入量为12.5μL，DNA稀释液加入量为2.0μL，各引物加入后的终浓度均为0.2μM，采用ddH2O补足25μL。所述PCR反应条件为：94℃变性5min，然后进入35个循环；94℃30s，58℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。
六重PCR筛查检测方法如下：
（b1）合成以下引物：
P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；
P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
bar-F：5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'；
bar-R：5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'；
pat-F：5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3'；
pat-R：5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3'；
PMI-F：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3'；
PMI-R：5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'；
（b2）制备待测玉米的DNA稀释液；
（b3）配制PCR反应体系；
（b4）进行PCR反应；
（b5）取PCR反应产物进行毛细管电泳。
其中，步骤（b3）中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL；具体含以下组分：PCR Master Mix（2X）、DNA稀释液、步骤（b1）中的各引物、ddH2O；其中PCR Master Mix（2X）的加入量为12.5μL，DNA稀释液加入量为2.0μL，P-ract1引物加入后的终浓度为0.2μM，其他引物加入后的终浓度为0.1μM，采用ddH2O补足25μL。所述PCR反应条件为：94℃变性5min，然后进入35个循环；94℃30s，56℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。
为了验证本发明的筛查检测效果以及相应的参数选取的真实性，对各步骤进行具体的验证试验，其具体情况如下：
（1）扩增检测引物的合成：
表1 引物序列信息表
（2）待测转基因玉米DNA的小量提取：
转基因玉米DNA的提取依据农业部1485号公告-4-2010标准中A.6试剂盒方法，试剂盒是经验证适合转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化的天根生化科技（北京）有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒（DP305），转基因玉米粉末样品称取200mg，样品DNA洗脱加入70μL洗脱液TE，其他提取步骤参照试剂盒说明书操作。
将提取的样品DNA采用Thermo Nano Drop 1000紫外分光光度计进行浓度和纯度测定，并将样品DNA浓度稀释至50ng/μL待测。
（3）单基因验证
PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为1X，引物终浓度上下游各0.2μM，待测DNA模板2.0μL，补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序：94℃变性5min；然后进入35个循环，94℃30s，60℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。结果见图1，其中泳道M：size marker，泳道1～15：转基因玉米T25、TC1507、59122、3272、Bt176、Bt11、MIR604、Bt11×GA21、MON810、MON863、NK603、MON88017、MON89034、MON87460、GA21，泳道16：ddH2O对照。
结论：由图1结果可知，P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI等6个基因特异性条带都能得到有效扩增。
（4）二重PCR
①引物浓度梯度试验：
PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为1X，P-CaMV 35S、T-NOS引物终浓度（μM）梯度为0.8:0.2、0.6:0.2、0.4:0.2、0.2:0.2、0.2:0.4、0.2:0.6，待测DNA模板2.0μL，补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序：94℃变性5min；然后进入35个循环，94℃30s，58℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。结果见图2（A），其中泳道M：size maker ，泳道1-6分别对应引物终浓度（μM）梯度0.8:0.2、0.6:0.2、0.4:0.2、0.2:0.2、0.2:0.4、0.2:0.6，泳道7为ddH2O对照。
结论：由图2（A）结果可知，P-CaMV 35S、T-NOS引物终浓度（μM）为0.2:0.2条件下两者扩增效率一致。
②退火温度梯度试验：
PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为1X，T-NOS，P-CaMV 35S引物上下游各0.1μM，待测DNA模板2.0μL，补充ddH2O至体积为25μL。
在定性PCR仪上运行如下反应程序：94℃变性5min；然后进入35个循环，94℃30s，退火30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。退火温度梯度为50℃、54℃、56℃、58℃、60℃、64℃。结果见附图2（B），其中泳道M：size maker，泳道1-6分别对应退火温度梯度50℃、54℃、56℃、58℃、60℃、64℃，泳道7为ddH2O对照。
结论：由图2（B）结果可知，退火温度在58℃条件下P-CaMV 35S、T-NOS的扩增效率一致且无非特异性条带出现。
③已知样品验证试验：
PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为1X，T-NOS，P-CaMV 35S引物上下游各0.1μM，待测DNA模板2.0μL，补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序：94℃变性5min；然后进入35个循环，94℃30s，58℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。结果见图2（C），其中泳道M：size maker，泳道1-15：转基因玉米T25、TC1507、59122、3272、Bt176、Bt11、MIR604、Bt11×GA21、MON810、MON863、NK603、MON88017、MON89034、MON87460、GA21，16：ddH2O对照。
结论：由图2（C）结果可知，各已知样品都能检测到相关特异性条带。
（5）六重PCR
①引物浓度梯度试验：
PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为1X，P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI引物终浓度（μM）梯度见表2，待测DNA模板2.0μL，补充ddH2O至体积为25μL。
表2 反应体系引物终浓度
| 引物序列 | P-ract1 | T-NOS | P-CaMV 35S | bar | pat | PMI |
| 终浓度1 | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM |
| 终浓度2 | 0.2μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM |
| 终浓度3 | 0.2μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.05μM | 0.05μM | 0.1μM |
| 终浓度4 | 0.2μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.05μM | 0.05μM | 0.05μM |
| 终浓度5 | 0.2μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.1μM | 0.05μM |
在普通PCR仪上运行如下反应程序：94℃变性5 min；然后进入35个循环，94℃30s，58℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5 min。结果见图3（A），其中泳道M：size maker，泳道1-6分别对应引物终浓度（μM）梯度1、2、3、4、5，泳道6为ddH2O对照。
结论：由图3（A）结果可知，P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI引物终浓度（μM）为梯度1时各基因特异条带亮度更一致。
②退火温度梯度试验：
PCR反应体系组成：PCR Master Mix终浓度为1X，引物浓度参照梯度试验结果，待测DNA模板2.0μL，补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序：94℃变性5min；然后进入35个循环，94℃30s，退火温度 30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。退火温度梯度为48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃。结果见附图3（B），其中泳道M：size maker，泳道1-6分别对应退火温度梯度48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃，泳道7为ddH2O对照。
结论：由图3（B）结果可知，退火温度在56℃条件下P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI基因的扩增效率更一致，非特异性条带弱且不影响结果判断。
③灵敏度试验：
PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为1X，引物浓度梯度参照试验结果，待测DNA模板终浓度（ng/μL）梯度50、15、3、1、0.3，补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序： 94℃变性5min；然后进入35个循环，94℃30s，56℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。结果见图3（C），其中泳道M：size maker，泳道1-5分别对应浓度梯度50、15、3、1、0.3，泳道6为ddH2O对照。
结论：由图3（C）结果可知，模板浓度最低在1ng/μL条件下P-ract1、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI基因的扩增效率一致且能清晰判断结果。
④已知样品验证试验：
PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为1X，引物浓度参照梯度试验结果，待测DNA模板2.0μL，补充ddH2O至体积为25μL。
在普通PCR仪上运行如下反应程序：94℃变性5min；然后进入35个循环，94℃30s，56℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。结果见附图3（D），其中泳道M：size maker，泳道1-15：转基因玉米T25、TC1507、59122、3272、Bt176、Bt11、MIR604、Bt11×GA21、MON810、MON863、NK603、MON88017、MON89034、MON87460、GA21，16：ddH2O对照。
结论：由图3（D）结果可知，各已知样品都能检测到相关特异性条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院分析测试中心
<120> 转基因玉米的多重PCR筛查检测引物及检测方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (8)
1.转基因玉米的多重PCR筛查检测引物，其特征在于，包括以下引物序列：
二重PCR引物序列：
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。
2. 转基因玉米的多重PCR筛查检测引物，其特征在于，包括以下引物序列：
六重PCR引物序列：
P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；
P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
bar-F：5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'；
bar-R：5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'；
pat-F：5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3'；
pat-R：5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3'；
PMI-F：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3'；
PMI-R：5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'。
3. 转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，包括以下步骤：二重PCR检测方法：
（a1）合成以下引物：
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；
（a2）制备待测玉米的DNA稀释液；
（a3）配制PCR反应体系；
（a4）进行PCR反应；
（a5）取PCR反应产物进行毛细管电泳。
4. 根据权利要求3所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，步骤（a3）中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL；具体含以下组分：PCR Master Mix（2X）、DNA稀释液、步骤（a1）中的各引物、ddH2O；其中PCR Master Mix（2X）的加入量为12.5μL，DNA稀释液加入量为2.0μL，各引物加入后的终浓度均为0.2μM，采用ddH2O补足25μL。
5. 根据权利要求4所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：94℃变性5min，然后进入35个循环；94℃30s，58℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。
6. 转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，六重PCR检测方法：
（b1）合成以下引物：
P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；
P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3'；
T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；
T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；
P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；
P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；
bar-F：5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'；
bar-R：5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'；
pat-F：5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3'；
pat-R：5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3'；
PMI-F：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3'；
PMI-R：5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'；
（b2）制备待测玉米的DNA稀释液；
（b3）配制PCR反应体系；
（b4）进行PCR反应；
（b5）取PCR反应产物进行毛细管电泳。
7. 根据权利要求6所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，步骤（b3）中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL；具体含以下组分：PCR Master Mix（2X）、DNA稀释液、步骤（b1）中的各引物、ddH2O；其中PCR Master Mix（2X）的加入量为12.5μL，DNA稀释液加入量为2.0μL，P-ract1引物加入后的终浓度为0.2μM，其他引物加入后的终浓度为0.1μM，采用ddH2O补足25μL。
8. 根据权利要求7所述的转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：94℃变性5min，然后进入35个循环；94℃30s，56℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。
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| CN108251501A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-07-06 | 中国农业大学 | 一种转基因作物双重基因的可视化定量筛查新方法 |
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