CN104195257A - 转基因玉米ie034的转化体特异性定量pcr检测引物和探针及方法 - Google Patents

转基因玉米ie034的转化体特异性定量pcr检测引物和探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及转基因玉米IE034的定量PCR检测引物和探针及方法。本方法首先公开了用于精准检测转基因玉米IE034的特异性引物和探针。在此基础上，本发明建立了一种特异性强、灵敏度高、准确性好的转基因玉米IE034的定量PCR检测方法。实验证明，本发明提供的转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测引物和探针及方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点，适用于转基因玉米IE034及其衍生品种的特异性定量检测。

Description

转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测引物和探针及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测引物和探针及方法。
背景技术
转基因玉米IE034是将密码子经过优化的杀虫基因cry1Ie通过农杆菌介导法转入玉米基因组中，获得的一个抗虫转基因玉米新品系。目前，IE034玉米已进入生产性试验阶段，具有重大产业化应用前景。建立IE034玉米的转化体特异性精准检测方法，是对该转基因玉米进行安全评价和安全监管的重要手段。
PCR技术是当前国内外转基因产品检测中应用最为广泛的方法。迄今为止，缺乏一种针对转基因抗虫玉米IE034及其衍生品种的特异性强、灵敏度高、准确性好的定量PCR检测方法。
发明内容
本发明的目的在于公开转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测引物及配套使用的荧光探针。
本发明的另一个目的在于公开一种转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
根据转基因玉米IE034的转化体特异性序列，设计合成IE034玉米的特异性定量PCR检测引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~3；确定定量PCR的反应体系；对定量PCR检测方法进行线性、特异性、检测限、定量限、准确性等测试。
转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测引物，其核苷酸序列为：
上游引物序列，IE034-QF1：5’-AGCTTCGCACTCAGCAGTAAG-3’（SEQ ID NO：1）；
下游引物序列，IE034-QR1：5’-AACGTCCGCAATGTGTTATT-3’（SEQ ID NO：2）；
荧光探针序列，IE034-QP：5’-FAM- CAAGAAGCAGGTCCCAGTATATTTTGTGGTG -TAMRA-3’ （SEQ ID NO：3）。
转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）合成上游引物（SEQ ID NO：1）、下游引物（SEQ ID NO：2）和荧光探针（SEQ ID NO：3）；
（2）制备待测样品的基因组DNA溶液；
（3）配制定量PCR反应体系；
（4）运行定量PCR反应程序。
进一步地，步骤（1）所述合成的上游引物、下游引物及荧光探针的浓度均为10μmol/L，步骤（2）所述制备的DNA溶液的浓度为50ng/μL。
进一步地，步骤（3）所述的配制定量PCR反应体系的总体积为25μL，包括以下组分：2×TaqMan Real-time PCR Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、荧光探针0.5μL、DNA溶液2μL、水8μL。
进一步地，步骤（4）所述的定量PCR反应程序为：95℃变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，共进行45次循环。
通过实验证明，本发明提供的转基因玉米IE034的定量PCR检测引物和探针及方法具有特异性强、灵敏度高、准确性好等优点，适用于转基因玉米IE034及其衍生品种的特异性定量检测。
附图说明
图1为IE034玉米定量PCR检测方法的反应体系的筛选结果，a~e依次为引物/探针终浓度为0.8μmol/L/0.4μmol/L、0.6μmol/L/0.4μmol/L、0.4μmol/L/0.2μmol/L、0.2μmol/L/0.1μmol/L、0.1μmol/L/0.04μmol/L等5个组合的扩增曲线及标准曲线；
图2为IE034玉米定量PCR检测方法的扩增曲线及标准曲线，1~6依次为IE034玉米基因组DNA拷贝数为9000copies/μL、2250copies/μL、560copies/μL、140copies/μL、70copies/μL、35copies/μL的标准样品；
图3为IE034玉米定量PCR检测方法的特异性测试结果，1为IE034玉米。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1  转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的反应体系优化
用灭菌超纯水将IE034玉米的基因组DNA按照4倍梯度稀释，获得6个IE034玉米DNA测试样品（1:1，1:4，1:16；1:64；1:256；1:1024）；以非转基因玉米综31为阴性对照，以灭菌超纯水为空白对照，定量PCR反应体系中的引物/探针终浓度设置0.8μmol/L/0.4μmol/L、0.6μmol/L/0.4μmol/L、0.4μmol/L/0.2μmol/L、0.2μmol/L/0.1μmol/L、0.1μmol/L/0.04μmol/L等5个组合，采用通用的定量PCR反应程序，进行PCR扩增，每个样品平行4次；以6个IE034玉米DNA测试样品制作标准曲线。
结果表明（图1），使用5种不同终浓度的引物/探针组合进行定量PCR扩增时，除0.1μmol/L/0.04μmol/L组合外，其他4种组合均符合下述国际公认标准：扩增效率（E）介于90%～110%，决定系数（R2值）≥98%，斜率介于-3.1～-3.6，表明本发明所述的检测方法对不同引物/探针终浓度有很好的容许度，最终确定引物/探针终浓度组合优选为0.6μmol/L/0.4μmol/L。
实施例2  转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的标准曲线
用灭菌超纯水将IE034玉米的基因组DNA进行梯度稀释，制备6个IE034玉米DNA标准样品（9000copies/μL、2250copies/μL、560copies/μL、140copies/μL、70copies/μL、35copies/μL、18copies/μL），用于制作实施例1所述的转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的标准曲线，每个样品平行4次。
结果表明（图2），标准曲线的扩增效率（E）为95.8%，决定系数（R2值）为0.997，斜率为-3.426，均符合国际公认标准（扩增效率介于90%～110%，决定系数≥98%，斜率介于-3.1～-3.6），表明依据本发明所述的定量PCR检测方法建立的标准曲线具有很好的线性。
实施例3  转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的检测限和定量限
用灭菌超纯水将IE034玉米的基因组DNA进行梯度稀释，制备7个IE034玉米DNA测试样品（70copies/μL、35copies/μL、18copies/μL、9copies/μL、4copies/μL、2copies/μL、1copies/μL），对实施例1所述的转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的检测线（LOD）和定量限（LOQ）进行评价，每个样品平行10次。
结果表明（表1），当样品中IE034玉米的含量≥4copies/μL时，在10次平行试验中均能获得典型扩增曲线，且Ct值均＜37，表明本发明所述的定量PCR方法的检出限可达4个拷贝；当样品中IE034玉米的含量≥35copies/μL时，在10次平行试验中均能获得典型扩增曲线，Ct值的极差＜0.5，且10次平行的Ct值相对标准差＜25%，表明本发明所述的定量PCR方法的定量限可达35个拷贝。
表1  
实施例4  转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的特异性测试
对实施例1所述的转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的特异性进行测试，测试样品包括：转基因玉米IE034，由转基因玉米MON89034、MON810、Bt11、Bt176、MON863、MON88017、MIR604、TC1507、59122和NK603制成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%），由转基因大豆MON89788、GTS40-3-2、A2704-12、A5547-127、305423和356043制成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%），由转基因水稻KF-6、TT51-1和KMD-1制成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%），由转基因棉花MON531、MON15985、MON1445和LLCOTTON25制成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%），由转基因油菜RF1、MS1、Topas19/2和T45制成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%），非转基因玉米综31，每个样品平行4次。
结果表明（图3），仅含有转基因玉米IE034的样品中获得典型扩增曲线，而其他转基因作物和非转基因玉米中均未出现典型扩增曲线，表明本发明所述的定量PCR检测方法对转基因玉米IE034具有很好的特异性。
实施例5  转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的准确性
用灭菌超纯水将IE034玉米的基因组DNA进行梯度稀释，获得6个IE034玉米DNA测试样品（9000copies/μL、2250copies/μL、560copies/μL、140copies/μL、70copies/μL、35copies/μL），以这6个IE034玉米DNA测试样品制作标准曲线（图2）；将转基因玉米IE034的基因组DNA与对应的非转基因玉米综31的基因组DNA按质量比混合，配制IE034玉米质量分数为5%、1%和0.5%的测试样品；用实施例1所述的IE034玉米定量PCR方法对这三份玉米样品进行定量测试，每个样品4次平行，整个实验重复2次。
结果表明（表2），3份测试样品的测定值分别为4.35%、0.96%和0.53%，与预期值的相对偏差分别为13%、4%和6%，均符合国际公认标准（相对偏差＜25%），表明本发明所述的定量PCR检测方法可准确地对转基因玉米IE034进行定量检测。
表2  
应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测引物和探针，其特征在于：
上游引物序列，IE034-QF1：5’-AGCTTCGCACTCAGCAGTAAG-3’（SEQ ID NO：1）；
下游引物序列，IE034-QR1：5’-AACGTCCGCAATGTGTTATT-3’（SEQ ID NO：2）；
荧光探针序列，IE034-QP：5’-FAM- CAAGAAGCAGGTCCCAGTATATTTTGTGGTG -TAMRA-3’ （SEQ ID NO：3）。
2.转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）合成权利要求1所述的上游引物、下游引物和荧光探针；
（2）制备待测样品的基因组DNA溶液；
（3）配制定量PCR反应体系；
（4）运行定量PCR反应程序。
3.根据权利要求2所述的转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测方法，其特征在于，步骤（1）所述合成的上游引物、下游引物及荧光探针的浓度均为10μmol/L，步骤（2）所述制备的DNA溶液的浓度为50ng/μL。
4.根据权利要求2和3所述的转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测方法，其特征在于，步骤（3）所述的配制定量PCR反应体系的总体积为25μL，包括以下组分：2×TaqMan Real-time PCR Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、荧光探针0.5μL、DNA溶液2μL、水8μL。
5.根据权利要求2～4所述的转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）所述的定量PCR反应程序为：95℃变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，共进行45次循环。
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