CN112094932B - 转基因抗虫玉米gab-3转化体的定性pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

转基因抗虫玉米gab-3转化体的定性pcr检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转基因抗虫玉米GAB‑3转化体的定性PCR检测引物对，试剂盒，以及它们在转基因抗虫玉米GAB‑3转化体的定性PCR检测中的应用。本发明还公开了转基因抗虫玉米GAB‑3转化体的定性PCR检测方法。

Description

转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中转基因植物的分子生物学检测方法，特别是涉及转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测方法及其引物和试剂盒。
背景技术
近年来，随着基因工程技术的飞速发展，转基因作物种植面积和转基因作物品种都大量增加，同时转基因植物及其产品安全性也引起全球范围内的关注和担忧。为了有效监管转基因植物及其产品，保障消费者的合法权益，目前，包括中国在内的全世界50多个国家颁布并实施了转基因生物安全标识制度和配套的管理规定。中国的基因工程育种技术发展迅速，近年来育成了一系列的转基因品种作物，因此制定相关的转基因生物安全评价方法显得尤其重要。
在转基因作物及其产品安全检测方法中，PCR技术以其灵敏度高、稳定性好、准确性强、操作简便成为国际上转基因植物及其产品检测的主要方法，中国近年来颁布的转基因生物及其产品安全评价方法也是以PCR检测方法为主。根据检测目的基因的不同，PCR检测方法分为筛查、基因特异性、构建特异性和转化体特异性检测；其中，转化体特异性检测方法的特异性最高，筛查检测和转化体特异性检测方法是实际检测中应用最广泛的方法。筛查检测方法主要用于初步检测样品中是否含有转基因成分，转化体特异性检测方法可以准确确定转基因植物的身份。
转基因抗虫玉米GAB-3是由杭州瑞丰生物科技有限公司和浙江大学联合研发的转基因抗虫玉米。该转化体于2008年利用农杆菌介导法转化栽培玉米品系Hi-II中获得的，转基因抗虫玉米GAB-3产生Cry1Ab和Cry2Ab两种杀虫蛋白，对玉米螟、棉铃虫及黏虫高抗，可以满足玉米种植者对鳞翅目害虫的有效地防治。2012年5月在农业农村部备案开展了中间试验(农基安办字2012-T088)，2015年获得批准在浙江省开展环境释放试验(农基安审字(2014)第005号)，2019年获得批准在浙江省开展生产性试验(农基安审字(2019)第033号)。经过连续多年多点的安全性评价研究，转基因抗虫玉米GAB-3的分子特征、环境安全性和食用安全性已十分明确。
在分子特征方面，转基因抗虫玉米GAB-3的目的基因和标记基因以单位点单拷贝的方式插入在第7号染色体上，实际插入序列全长为11064bp，T-DNA中其余各元件均保持完整，并且与转化质粒中T-DNA序列完全一致。目的基因cry1Ab、cry2Ab和标记基因g10evo-epsps在不同世代之间整合、表达稳定。
到目前为止，中国尚未发布专门针对转基因抗虫玉米GAB-3转化体及其衍生品种检测的方法，迫切需要尽快制定相关检测方法，为中国转基因生物安全管理部门实施各项安全管理制度提供科学方法和技术支撑。
发明内容
为此，本发明的一个目的是提供一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测引物对，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个目的是提供一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测试剂盒，其中包括上述定性PCR检测引物对。
本发明的另一个目的是提供上述定性PCR检测引物对在转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述定性PCR检测试剂盒在转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入包含上述PCR检测引物对的PCR反应液进行PCR扩增反应；
(3)PCR扩增反应结束后，根据凝胶扩增条带是否有预期扩增条带来判断，如果扩增条带与预期条带位置一致，则说明样品含有转基因抗虫玉米GAB-3转化体成分；如果扩增条带与预期条带位置不一致，则说明样品不含转基因抗虫玉米GAB-3转化体成分。
进一步地，上述定性PCR检测方法中，所述的步骤(2)的扩增反应的反应体系以25μL反应体积为例表示如下：
Figure BDA0002633112510000021
Figure BDA0002633112510000031
进一步地，在上述方法中，所述的步骤(2)的扩增反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃延伸5min；10℃保存。
本发明的优点和有益效果：转基因抗虫玉米GAB-3是由杭州瑞丰生物科技有限公司和浙江大学联合研发的转基因抗虫玉米，拥有自主知识产权。此方法的开发为该产品提供了可靠的检测方法，为保护该产品提供了技术支撑。
附图说明
图1是GAB3转化体特异性引物筛选。注：M，100bp marker；泳道1,2：GAB3-F1/R1转化体特异性引物扩增(质量分数1％GAB3玉米)，泳道3,4：GAB3-F1/R1转化体特异性引物扩增(质量分数0.1％GAB3玉米)，泳道5,6：GAB3-F2/R2转化体特异性引物扩增(质量分数1％GAB3玉米)，泳道7,8：GAB3-F2/R2转化体特异性引物扩增(质量分数0.1％GAB3玉米)。
图2是引物GAB3-F1/R1浓度和退火温度优化。注：M，100bp DNA marker；0.1μmol为引物终浓度0.1μmol/L；0.2μmol为引物终浓度0.2μmol/L；0.4μmol为引物终浓度0.4μmol/L；0.6μmol为引物终浓度0.6μmol/L；0.8μmol为引物终浓度0.8μmol/L；退火温度54℃、56℃、58℃、60℃。
图3是候选引物的扩增特异性测试。注：M，100bp DNA marker；1～3，1％转基因玉米GAB3；4～6，转基因大豆混合样；7～9，转基因棉花混合样；10～12，其他转基因玉米混合样；13～15，转基因油菜混合样；16～18，转基因水稻混合样；19～21，非转基因玉米混合样；22～24，阴性对照
图4是引物3023-L1灵敏度测试。注：M，100bp DNA marker；1～2，10％；3～4，1％；5～6，0.5％；7～8，0.1％；9～10，0.05％；11～12，0％。
图5是引物GAB3-F1/R1对成分质量分数为0.1％的GAB3成分的检出限测试。注：M，100bp Marker；1-60，60次重复。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细描述本发明，不能将其解释为限制本发明的范围。
实施例1.引物序列、位置和扩增片段序列及大小
玉米内标准基因，参考国家标准《转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法》(农业部1861号公告—3—2012)中规定的zSSIIb基因作为抗虫耐除草剂玉米GAB3的内标准基因，引物信息如下：
zSSIIb-1F：5′-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3′
zSSIIb-2R：5′-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3′
预期扩增片段大小151bp。
根据研发单位提供的序列信息，进行转化体引物设计。定性检测的引物设计位置(下划线)如下，引物序列信息见表1。
1 5’CCCTTATCTG GGAACTACTC ACACAATATT ATGGAGAAAC TCGAGCTCCT
51ATTAGGCGGT GGCCTCAGCG TACTCTGATA GTTTAAACTG AAGGCGGGAA
101ACGACAATCT GATCCAAGCT CAAGCTGCTC TAGCATTCGC CAT 3’
表1 GAB3玉米转化体定性PCR方法引物序列
Figure BDA0002633112510000041
以质量分数为1％和0.1％的玉米GAB3模板进行PCR扩增筛选引物(图1)。通过筛选可知，引物GAB3-F2/R2有非特异性扩增条带，干扰结果判定。用0.1％含量的玉米GAB3作为检测样品，GAB3-F1/R1可得到特异性扩增条带，因此选择GAB3-F1/R1作为候选引物。
实施例2.反应体系和反应程序
1％的转基因玉米GAB3作为检测样品，模板浓度为50ng，调整优化PCR反应体系中引物的终浓度，设置0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L等浓度梯度，退火温度设置为54℃、56℃、58℃、60℃进行PCR反应的扩增。根据比较结果，以及为了方便检测实际需求，同时考虑玉米内标准基因的退火温度，最终确定最佳引物终浓度为0.2μmol/L，退火温度为58℃(见图2)。
PCR检测反应体系
表2 PCR检测反应体系
Figure BDA0002633112510000042
Figure BDA0002633112510000051
PCR检测反应程序
94℃变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃延伸5min；10℃保存。
实施例3.特异性和灵敏度实证数据。每个实验组至少做两个平行。
3.1特异性试验
采用主要非转基因作物、转基因作物主要转化体混合物进行筛选，检测结果表明，仅从含有GAB3转化体的转基因玉米GAB3的样品中扩增到130bp的预期DNA条带，而在其他样品中均未扩增到预期大小的条带(见图3)，表明建立的检测方法具有高度特异性。
特异性测试样品
设置以下样品，每种转化体在样品中的质量分数为1％，包括：
1)其他转基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、双抗12-5、IE09S034、C0030.3.5、C0010.3.7、4114、MON87427、5307)；
2)转基因大豆混合物(GTS40-3-2、MON89788、CV127、A5547-127、A2704-12、305423、356043、MON88302、73496、MON87769、MON87705、FG72、DAS68416-4、SHZD32-1)；
3)转基因棉花混合物(MON531、MON1445、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102)；
4)转基因油菜混合物(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、OXY235、Topas19/2、MON88302、73496)；
5)转基因水稻混合物(TT51-1、科丰6号、克螟稻、M12、科丰8号、科丰2号、G6H1、T1C-19)。
3.2灵敏度试验
将转基因玉米GAB3和非转基因玉米提取的基因组DNA按不同比例混合，制备成转基因玉米GAB3质量分数分别为10％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0％。进行PCR扩增。结果表明，在质量分数为0.1％以上的样品中均能特异性地扩增到130bp的预期DNA片段(见图4)，符合定性PCR方法对检测灵敏度的要求。
实施例4.检出限试验
为了进一步测试检测方法的检测极限，0.1％的样品进行了60次平行。测试结果表明60次平行均能获得预期扩增，因此本参数检测方法符合定性PCR方法对检测灵敏度的要求(见图5)。
实施例5.实验的重复性和再现性。
经反复试验，本发明的实验结果具有重复性和再现性。
以上以具体实施方式描述了本发明，本领域技术人员在不背离本发明精神的情况下，可以做出等同的修改或变型，其同样在权利要求的范围之内。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测方法及试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcccttatct gggaactact caca 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcagcttga gcttggatca 20

Claims (4)

1.一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测引物对在转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测中的应用，其特征在于，所述引物对由序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物组成，该引物对的PCR扩增片段大小为130bp。
2.一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测试剂盒在转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测中的应用；定性PCR检测试剂盒包括定性PCR检测引物对，其特征在于，所述引物对由序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物组成，该引物对的PCR扩增片段大小为130bp。
3.一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入含有如权利要求1所述的引物对的PCR反应液进行PCR扩增反应；
(3)PCR扩增反应结束后，根据凝胶电泳的扩增条带进行判断：如果扩增出130 bp的条带，则说明样品含有转基因抗虫玉米GAB-3转化体成分；如果没有扩增出130 bp的条带，则说明样品不含转基因抗虫玉米GAB-3转化体成分。
4.权利要求3所述的定性PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)的扩增反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃延伸5min；10℃保存。
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