CN107937589A - 用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒 - Google Patents

用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒 Download PDF

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刘卫晓
兰青阔
温洪涛
武利庆
刘刚
柳方方
王迪
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Abstract

本发明公开了属于生物技术领域的一种用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒。所述检测引物对为：cry1A‑F，其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示；cry1A‑R，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。所述检测方法及检测试剂盒可作为鉴定含有cry1A基因的转基因产品。本发明的cry1A基因定性PCR检测方法具有广泛适用性，对于对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰的序列能够准确的进行检测，该方法对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段，为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。

Description

用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒。
背景技术
Cry1A基因是一类抗虫基因的总称，也是当前商业化应用的抗虫转基因作物中最常见的外源目的基因，包括cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、mcry1Ac、cry1Ab/Ac等，cry1A基因在转基因检测工作中可作为一种具有广泛代表性的靶标。但是，由于转基因作物研发者往往会对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰，导致不同转化体中的同一类型的cry1A基因在核苷酸序列上也有较大变异，因此，建立具有广泛适用性的cry1A基因定性PCR检测方法，对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段，为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种cry1A基因定性PCR检测引物。
本发明的目的之二是建立一种cry1A基因定性PCR检测方法。
本发明的目的之三是一种cry1A基因定性PCR检测试剂盒。
一种cry1A基因定性PCR检测引物，所述定性检测引物为：cry1A-F，其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示；cry1A-R，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
一种抗虫基因cry1A定性PCR检测方法，按照如下步骤进行：
(1)DNA模板制备：提取待检测样品的DNA；
(2)试样PCR反应：以提取样品的DNA为模板，利用cry1A基因定性PCR检测引物配置反应体系，并进行PCR扩增。
(3)对照PCR反应：在试样PCR反应的同时，应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。以水作为空白对照；以非转基因玉米材料中提取的DNA作为阴性对照；以转基因玉米MON810作为阳性对照。
(4)PCR产物电泳检测及凝胶成像分析。
所述cry1A基因定性PCR反应体系为：2×GoGreen Master Mix缓冲液12.5μL，10μmol/L cry1A-F引物1μL，10μmol/L cry1A-R引物1μL，25ng/μL DNA模板2μL，用去离子水补至25μL。
所述定性PCR反应的条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，进行35次循环；72℃延伸7min。
一种cry1A基因定性PCR检测试剂盒，包括：2×GoGreen Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水；所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的序列。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
(1)序列比对：通过查询网络数据库、国内外专利、科技论文等方式，收集不同转基因作物中的cry1A基因序列，利用DNAMAN软件进行序列比对分析，并设计引物对11种转基因材料中的cry1A基因进行扩增，并测序验证。
(2)引物设计：利用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对分析，根据比对结果，将cry1A基因分为4类，针对4类序列中相对保守部分，利用Primer premier 5.0软件进行引物设计。采用简并引物策略筛选出1对cry1A基因定性PCR检测引物，cry1A-F，其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示；cry1A-R，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。扩增产物大小为282bp。
(3)PCR反应体系和反应程序优化：用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果，确定最适合的PCR反应体系和反应程序。
(4)方法特异性测试：选取不同物种和相同物种不同品种的材料混合成测试样品，对方法进行特异性测试。若仅从含有cry1A抗虫基因材料中获得预期扩增产物，而从其他样品中未获得预期扩增产物，表明方法特异性符合要求。
(5)方法检出限测试：使用购买的欧盟标准物质，对含有cry1A抗虫基因的4类材料(Bt11、MON810、Bt176、DAS-81419-2)不同质量分数的样品进行测试，确定方法灵敏度。
(6)本发明进一步提供一种cry1A抗虫基因定性PCR检测试剂盒，包括：2×GoGreen Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水；所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
本发明的有益效果：本发明的cry1A基因定性PCR检测方法具有广泛适用性，对于对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰的序列能够准确的进行检测，该方法对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段，为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。
附图说明
图1是4类Cry1A基因测序结果比对及引物结合位点图。
图2是引物筛选电泳结果：M、100bp；1、Bt11；2、Bt176；3、DAS-81419-2；4、MON810；5、阴性玉米；6、空白对照。
图3是PCR反应体系和反应程序优化电泳结果：3A、3B、3C、3D分别表示引物终浓度的4个梯度：0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L；1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12分别表示退火温度的5个梯度：58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃。
图4是方法特异性测试电泳结果：(4A)含cry1A基因材料测试结果：M、100bp DNALadder；1、Bt11；2、MON89034；3、Bt176；4、DAS-81419-2；5、C0030.3.5；6、SK12-5；7、Bt506；8、MON88017；9、MON810；10、MON531；11、MON15985；12、T304-40；13、Kefeng 6；14、KMD；15、TT51-1；16、Kefeng 8；17、阴性玉米；18、空白对照。(4B)不含cry1A基因材料测试结果：M、100bp DNA Ladder；1、空白对照；2、阴性玉米；3、阳性对照(MON810)；4、MON863；5、MON88017；6、MIR604；7、TC1507；8、MIR162；9、59122；10、4114；11、MON87460；12、NK603；13、GA21；14、3272；15、T25。(4C)1、非转基因油菜混合样；2、非转基因水稻混合样；3、非转基因大豆混合样；4、非转基因玉米混合样品；5、非转基因棉花混合样品；6、阳性对照(MON810)；7、空白对照。
图5是利用转基因玉米Bt11对方法检出限进行测试电泳结果：(5A)欧盟标准物质：转基因玉米Bt11(质量分数分别为4.89％、1.96％、0.98％、0.49％、0.098％、<0.012％)；1、4.89％；2、1.96％；3、0.98％；4、0.49％；5、0.098％；6、<0.012％；7、空白对照；(5B)转基因玉米Bt11质量分数为0.098％的样品60次重复实验结果，1-60、098％Bt11；61、阳性对照(0.98％Bt11)；62、阴性玉米；63、空白对照。
图6是利用转基因玉米MON810对方法检出限进行测试电泳结果：(6A)欧盟标准物质：转基因玉米MON810(质量分数分别为9.9％、1.98％、0.49％、<0.09％)；1、9.9％；2、1.98％；3、0.49％；4、<0.09％；5、阴性玉米；6、空白对照；(6B)转基因玉米MON810质量分数为<0.09％的样品60次重复实验结果，1-60、<0.09％MON810；61、阳性对照(1.98％MON810)；62、阴性玉米；63、空白对照。
图7是利用转基因玉米Bt176对方法检出限进行测试电泳结果：(7A)欧盟标准物质：转基因玉米Bt176(质量分数分别为5.0％、2.0％、1.0％、0.5％、0.1％、<0.014％)，1、5％；2、2％；3、1％；4、0.5％；5、0.1％；6、<0.014％；7、空白对照；(7B)转基因玉米Bt176质量分数为0.1％的样品60次重复实验结果，1-60、0.1％Bt176；61、阳性对照(1.0％Bt176)；62、阴性玉米；63、空白对照。
图8是利用转基因大豆DAS-81419-2对方法检出限进行测试电泳结果：(8A)欧盟标准物质：转基因大豆DAS-81419-2(质量分数分别为>98.9％、10％、0.99％、<0.7％、0.099％)；1、>98.9％；2、10％；3、0.99％；4、<0.7％；5、0.099％；6、阴性大豆；7、空白对照；(8B)转基因玉米DAS-81419-2质量分数为0.099％的样品60次重复实验结果，1-60、0.099％；61、阳性对照(0.99％DAS-81419-2)；62、阴性大豆；63、空白对照。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实验采用如下所述的实验材料
1、植物材料
含cry1A抗虫基因的材料：Bt11、MON89034、Bt176、DAS-81419-2、C0030.3.5、SK12-5、Bt506、MON88017、MON810、MON531、MON15985、T304-40、Kefeng 6、KMD、TT51-1、Kefeng 8。
不含cry1A抗虫基因的材料：MON863、MON88017、MIR604、TC1507、MIR162、59122、4114、MON87460、NK603、GA21、3272、T25。
非转基因材料：(1)非转基因油菜混合样：5种非转基因油菜等量混合制成1个样品；(2)非转基因水稻混合样：5种非转基因水稻等量混合制成1个样品；(3)非转基因大豆混合样：5种非转基因大豆等量混合制成1个样品；(4)非转基因玉米混合样：5种非转基因玉米等量混合制成1个样品；(5)非转基因棉花混合样：5种非转基因棉花等量混合制成1个样品；
欧盟标准物质：转基因玉米Bt11(质量分数分别为4.89％、1.96％、0.98％、0.49％、0.098％、<0.012％)、转基因玉米MON810(质量分数分别为9.9％、1.98％、0.49％、<0.09％)、转基因玉米Bt176(质量分数分别为5.0％、2.0％、1.0％、0.5％、0.1％、<0.014％)、转基因大豆DAS-81419-2(质量分数分别为>98.9％、10％、0.99％、<0.7％、0.099％)。
2、酶与试剂
Promega的GoGreen Master Mix缓冲液，天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，引物由上海生工合成。
3、实验仪器
分光光度计：Thermo ND-1000；
离心机：Thermo Bioguge Primo R；
PCR仪：ABI Veriti；
凝胶成像仪：BioRad T2A；
其他仪器包括水浴锅、精密天平、通风柜、生物安全柜、电泳仪等。
实施例1植物基因组DNA的提取与检测
采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技(北京)有限公司)进行植物材料DNA提取和纯化，提取方法如下：
1)分别取200mg粉末样品；
2)加入800μL 65℃预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。
4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。
5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积700μL，可分次加入离心)。
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60μL 0.1×TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260/OD280比值应为1.7-1.9。
实施例2 cry1A基因测序验证
序列比对：通过查询网络数据库、国内外专利、科技论文等方式，收集11种不同转基因作物中的cry1A基因序列，利用DNAMAN软件进行序列比对分析，并设计引物，对cry1A基因部分序列进行扩增。引物及转基因材料信息见表1。
表1引物及转基因材料信息表
对表1中11种转基因材料中的cry1A基因进行扩增，定性PCR反应体系如下：GoGreen Master Mix缓冲液25μL，10μmol/L上游引物2μL，10μmol/L下游引物2μL，DNA模板2μL，用去离子水补至50μL；定性PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸7min。反应结束后，对PCR产物进行电泳检测。并回收PCR产物进行测序，以确定不同转化体中cry1A基因的序列。
实施例3 cry1A基因检测方法的建立
(1)序列比对及引物设计：利用DNAMAN软件对测序获得的序列进行比对分析，根据比对结果(图1)，将cry1A基因分为4类，分别为①Bt11、Kefeng6、TT51-1、MON531、MON15985、MON88017；②MON810、MON89034；③Bt176、SK12-5；④DAS-81419-2。
针对4类序列中相对保守部分，利用Primer premier 5.0软件进行引物设计。采用简并引物策略筛选出1对cry1A基因定性PCR检测引物，简并引物信息见表2，引物筛选实验结果见图2。
表2简并引物信息
(2)PCR反应体系和反应程序优化：引物终浓度设置为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L等4个梯度处理；退火温度设置为58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃等5个梯度处理。用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果(见图3)，确定最适合的PCR反应体系和反应程序。
(3)方法特异性测试：根据优化好的PCR反应体系和反应程序，选取特异性实验验证样品33种对方法进行特异性测试。结果显示仅从含有cry1A基因的材料中获得预期扩增产物，而从其他样品中未获得预期扩增产物，表明方法特异性符合要求，实验结果见图4。
(4)方法检出限测试：对含有cry1A抗虫基因的4类材料(Bt11、MON810、Bt176、DAS-81419-2)，使用购买的欧盟标准物质，对不同质量分数的样品进行测试，确定方法灵敏度。对可检出的最低质量分数的测试样品，提取60份基因组DNA，进行检测限测试。若60份测试样品中不少于59份的测试结果为阳性，则将该样品的质量分数确定为方法的相对检测限。否则，应重新确定方法灵敏度和进行检出限测试，直至确定方法的相对检测限。实验结果见图5-8。
(6)本发明进一步提供一种cry1A抗虫基因定性PCR检测试剂盒，包括：2×GoGreen Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水；所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
实施例4定性PCR反应体系优化
对表1中11种转基因材料中的cry1A基因进行扩增，定性PCR反应体系如下：GoGreen Master Mix缓冲液25μL，1％二巯基噻二唑水溶液2μL或1％2-噁唑烷酮水溶液2μL，10μmol/L上游引物2μL，10μmol/L下游引物2μL，DNA模板2μL，用去离子水补至50μL；定性PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸7min。反应结束后，对PCR产物进行电泳检测。并回收PCR产物进行测序，以确定不同转化体中cry1A基因的序列。加入1％二巯基噻二唑水溶液或1％2-噁唑烷酮水溶液后，PCR体系更加稳定，不加入1％二巯基噻二唑水溶液或1％2-噁唑烷酮水溶液的PCR假阳性率为0.5％，加入后假阳性率分别为0.05％，0.006％。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctsagcgag ttcgtgcc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgctgttca tgtcrttgaa 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accggytaca cycccatcga catc 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggatgcgat gatgttgttg aactc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgttgttctg tggtgggatt tcgtc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggacaaca atcccaacat caacg 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgattatc actccggcgg tt 22

Claims (5)

1.一种cry1A基因定性PCR检测引物，其特征在于，所述定性检测引物为：cry1A-F，其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示；cry1A-R，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
2.一种抗虫基因cry1A定性PCR检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)DNA模板制备：提取待检测样品的DNA；
(2)试样PCR反应：以提取样品的DNA为模板，利用cry1A基因定性PCR检测引物配置反应体系，并进行PCR扩增。
(3)对照PCR反应：在试样PCR反应的同时，应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。以水作为空白对照；以非转基因玉米材料中提取的DNA作为阴性对照；以转基因玉米MON810作为阳性对照。
(4)PCR产物电泳检测及凝胶成像分析。
3.根据权利要求2所述的cry1A基因定性PCR检测方法，其特征在于，所述cry1A基因定性PCR反应体系为：Green Master Mix缓冲液12.5μL，10μmol/L cry1A-F引物1μL，10μmol/L cry1A-R引物1μL，25ng/μL DNA模板2μL，用去离子水补至25μL。
4.根据权利要求2所述的cry1A基因定性PCR检测方法，其特征在于，所述定性PCR反应的条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，进行35次循环；72℃延伸7min。
5.一种cry1A基因定性PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：Green MasterMix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水；所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
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