CN112126706B - 一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法 - Google Patents

一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法 Download PDF

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Abstract

一种抗虫转基因水稻mfb‑MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法，属于生物技术领域。所述检测引物对为：MH3301‑3‑aF，其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示；所述反向引物为MH3301‑3‑aR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。所述检测方法及检测试剂盒可作为鉴定转基因水稻mfb‑MH3301及其衍生衍生品种的有效手段。

Description

一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引 物、检测方法
技术领域
本发明提供了一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法、检测试剂盒，属于生物技术领域。涉及鉴定转基因水稻mfb-MH3301及其衍生品种的定性PCR检测方法。
背景技术
随着转基因作物在全球的种植面积不断扩大，转基因产品的安全性问题引起了世界各国普遍的关注。近年来，关于转基因产品的安全性事件报道不断，尽管有些报道缺乏事实依据，但却更加引起了公众的重视和担忧，而我国尚未建立转基因产品标识制度。
目前，转基因检测主要有两个大类：一种是在核酸水平上进行检测，另一种是在蛋白质水平上进行检测。在核酸水平上进行检测通常以DNA为模板采用PCR的基础方法进行检测。在应用PCR技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性方法是通过检测外源DNA与染色体连接区的序列来实现的。由于连接区序列的特异性，因而该方法准确性高，最适用于转基因产品检测。
定性PCR技术，是目前转基因检测中应用最广泛的技术，具有快速、简便、灵敏等诸多优点。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物；所述定性检测引物为：MH3301-3-aF，其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示；所述反向引物为：MH3301-3-aR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本发明的目的之二是建立一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测方法；
本发明的目的之三是一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测试剂盒；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
(1)引物设计：根据抗虫转基因水稻mfb-MH3301的3’端旁侧序列，在外源插入序列与水稻染色体连接区设计相应的定性PCR引物。正向引物位于外源插入序列上，反向引物位于水稻染色体上，正向引物及反向引物各设计2条引物。
(2)引物筛选：采用常规检测中的PCR体系及扩增程序进行PCR扩增，对设计的4条引物两两组合，采用试验方法进行评价，筛选出最适合的引物。
(3)PCR反应体系和反应程序优化：用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果，确定最适合的PCR反应体系和反应程序。
(4)方法特异性测试：选取不同物种和相同物种不同品种的材料混合成测试样品，对方法进行特异性测试。若仅从含有转基因水稻mfb-MH3301材料中获得预期扩增产物，而从其他样品中未获得预期扩增产物，表明方法特异性符合要求。
(5)方法检出限测试：将转基因水稻mfb-MH3301及其受体材料按质量比混合，配制成一系列梯度稀释样品进行测试，质量分数分别为5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0％的梯度稀释样品，确定方法灵敏度。
(6)本发明进一步提供一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测试剂盒，包括：
Figure BDA0002743560670000021
Green Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水；所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
附图说明
图1是引物筛选电泳结果：1、Marker；2、空白对照；3-4、阴性对照；5-6、mfb-MH3301。
图2是PCR反应体系和反应程序优化电泳结果：A、B、C、D分别表示引物终浓度的4个梯度：0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L；1-2、3-4、5-6、7-8、9-10分别表示退火温度的5个梯度：56℃、58℃、60℃、62℃、64℃。
图3是方法特异性测试电泳结果：1、空白对照；2、阴性对照；3、1％mfb-MH3301；4-6、非转基因玉米；7-9、转基因玉米；10-12、非转基因大豆；13-15、转基因大豆；16-18、非转基因水稻；19-21、其他转基因水稻；22-24、非转基因油菜；25-27、转基因油菜；28-30、非转基因棉花；31-33、转基因棉花；34-36、小麦混合样。
图4是方法检出限测试电泳结果：1-3、5％；4-6、1％；7-9、0.5％；10-12、0.1％；13-15、0.05％；16-18、0.01％；19-21、0％。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实验采用如下所述的实验材料
1、植物材料
转基因水稻mfb-MH3301纯合体(100％)，非转基因水稻明恢86，特异性实验验证样品13种。
特异性实验验证样品设计如下：
(1)阳性对照样品：转基因水稻mfb-MH3301，含量为1％；
(2)阴性对照样品：明恢86；
(3)非转基因玉米：3种非转基因玉米等量混合制成1个样品；
(4)转基因玉米：Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、SH12-5、IE09S034，18个转化体混合制成1个样品，含量各1％；
(5)非转基因大豆：3种非转基因大豆等量混合制成1个样品；
(6)转基因大豆：GTS40-3-2、MON89788、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、FG72，12个转化体混合制成1个样品，含量各1％；
(7)非转基因水稻：TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1，7个转化体混合制成一个样品，含量各1％；
(8)其他转基因水稻：3种非转基因水稻等量混合制成1个样品；
(9)非转基因油菜：3种非转基因油菜等量混合制成1个样品；
(10)转基因油菜：MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302，9个转化体混合制成1个样品，含量各1％；
(11)非转基因棉花：3种非转基因棉花等量混合制成1个样品；
(12)转基因棉花：MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614，6个转化体混合制成1个样品，含量各1％；
(13)小麦混合样：3种非转基因小麦等量混合制成1个样品。
2、酶与试剂
Promega的
Figure BDA0002743560670000041
Green Master Mix缓冲液，天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，引物由上海生工合成。
3、实验仪器
分光光度计：Thermo ND-1000；
离心机：Thermo Bioguge Primo R；
PCR仪：ABI Veriti；
凝胶成像仪：BioRad T2A；
其他仪器包括水浴锅、精密天平、通风柜、生物安全柜、电泳仪等。
实施例1植物基因组DNA的提取与检测
采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技有限公司)进行植物材料DNA提取和纯化，提取方法如下：
1)取200mg水稻粉末样品；
2)加入800μL 65℃预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。
4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。
5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积700μL，可分次加入离心)。
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60μL 0.1×TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260/OD280比值应为1.7-1.9。
实施例2检测方法的建立
(1)引物设计：根据抗虫转基因水稻mfb-MH3301的3’端旁侧序列，在外源插入序列与水稻染色体连接区设计相应的定性PCR引物。正向引物位于外源插入序列上，反向引物位于水稻染色体上，正向引物及反向引物各设计2条引物。
正向引物MH3301-3-aF:5'-agcatcggtaacatgagcaaag-3'(SEQ ID No.1)
正向引物MH3301-3-bF:5'-ttgccgttcttccgaatagc-3'(SEQ ID No.3)
反向引物MH3301-3-aR:5'-aatccgaaaagaagtctgccat-3'(SEQ ID No.2)
反向引物MH3301-3-bR:5'-catgagtttcccaaagtgcctag-3'(SEQ ID No.4)
(2)引物筛选：采用常规检测中的PCR体系及扩增程序进行PCR扩增，对设计的4条引物两两组合(见表1)，采用试验方法进行评价，筛选出最适合的引物，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
表1筛选引物信息
Figure BDA0002743560670000061
(3)PCR反应体系和反应程序优化：引物终浓度设置为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L等4个梯度处理；退火温度设置为56℃、58℃、60℃、62℃、64℃等5个梯度处理。用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果(见图2)，确定最适合的PCR反应体系和反应程序。
(4)方法特异性测试：根据优化好的PCR反应体系和反应程序，选取特异性实验验证样品13种对方法进行特异性测试。若仅从含有转基因水稻mfb-MH3301材料中获得预期扩增产物，而从其他样品中未获得预期扩增产物，表明方法特异性符合要求，实验结果见图3。
(5)方法检出限测试：将转基因水稻mfb-MH3301及其受体材料按质量比混合，配制成一系列梯度稀释样品进行测试，质量分数分别为5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0％的梯度稀释样品，确定方法灵敏度，实验结果见图4。
(6)本发明进一步提供一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测试剂盒，包括：
Figure BDA0002743560670000062
Green Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水；所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法
<141> 2020-10-07
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agcatcggta acatgagcaa ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aatccgaaaa gaagtctgcc at 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ttgccgttct tccgaatagc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
catgagtttc ccaaagtgcc tag 23

Claims (3)

1.一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物，其特征在于，所述检测引物为：正向引物MH3301-3-aF，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向引物MH3301-3-aR，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述特异性定性PCR反应体系为：
Figure 898399DEST_PATH_IMAGE001
Green Master Mix缓冲液12.5μL，10μmol/L MH3301-3-aF 1μL，10μmol/L MH3301-3-aR 1μL，DNA模板2μL，用去离子水补至25μL；
所述定性PCR反应的条件为：94℃变性5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃延伸7min。
2.一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)DNA模板制备：提取待检测水稻样品的DNA；
(2)试样PCR反应：以提取的水稻样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的PCR检测引物配置反应体系，并进行PCR扩增；
(3)对照PCR反应：在试样PCR反应的同时，应设置空白对照、阴性对照和阳性对照，以水作为空白对照；以非转基因水稻材料中提取的DNA作为阴性对照；以转基因水稻mfb-MH3301作为阳性对照；
(4)PCR产物电泳检测及凝胶成像分析。
3. 一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：
Figure 209295DEST_PATH_IMAGE001
Green Master Mix缓冲液、权利要求1所述的检测引物、阳性及阴性对照样品、去离子水。
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