CN112126706B - 一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种抗虫转基因水稻mfb‑MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法,属于生物技术领域。所述检测引物对为:MH3301‑3‑aF,其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示;所述反向引物为MH3301‑3‑aR,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。所述检测方法及检测试剂盒可作为鉴定转基因水稻mfb‑MH3301及其衍生衍生品种的有效手段。
Description
技术领域
本发明提供了一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法、检测试剂盒,属于生物技术领域。涉及鉴定转基因水稻mfb-MH3301及其衍生品种的定性PCR检测方法。
背景技术
随着转基因作物在全球的种植面积不断扩大,转基因产品的安全性问题引起了世界各国普遍的关注。近年来,关于转基因产品的安全性事件报道不断,尽管有些报道缺乏事实依据,但却更加引起了公众的重视和担忧,而我国尚未建立转基因产品标识制度。
目前,转基因检测主要有两个大类:一种是在核酸水平上进行检测,另一种是在蛋白质水平上进行检测。在核酸水平上进行检测通常以DNA为模板采用PCR的基础方法进行检测。在应用PCR技术进行转基因作物定性检测时,根据其特异性,将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性方法是通过检测外源DNA与染色体连接区的序列来实现的。由于连接区序列的特异性,因而该方法准确性高,最适用于转基因产品检测。
定性PCR技术,是目前转基因检测中应用最广泛的技术,具有快速、简便、灵敏等诸多优点。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物;所述定性检测引物为:MH3301-3-aF,其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示;所述反向引物为:MH3301-3-aR,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本发明的目的之二是建立一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测方法;
本发明的目的之三是一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测试剂盒;
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
(1)引物设计:根据抗虫转基因水稻mfb-MH3301的3’端旁侧序列,在外源插入序列与水稻染色体连接区设计相应的定性PCR引物。正向引物位于外源插入序列上,反向引物位于水稻染色体上,正向引物及反向引物各设计2条引物。
(2)引物筛选:采用常规检测中的PCR体系及扩增程序进行PCR扩增,对设计的4条引物两两组合,采用试验方法进行评价,筛选出最适合的引物。
(3)PCR反应体系和反应程序优化:用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果,确定最适合的PCR反应体系和反应程序。
(4)方法特异性测试:选取不同物种和相同物种不同品种的材料混合成测试样品,对方法进行特异性测试。若仅从含有转基因水稻mfb-MH3301材料中获得预期扩增产物,而从其他样品中未获得预期扩增产物,表明方法特异性符合要求。
(5)方法检出限测试:将转基因水稻mfb-MH3301及其受体材料按质量比混合,配制成一系列梯度稀释样品进行测试,质量分数分别为5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0%的梯度稀释样品,确定方法灵敏度。
附图说明
图1是引物筛选电泳结果:1、Marker;2、空白对照;3-4、阴性对照;5-6、mfb-MH3301。
图2是PCR反应体系和反应程序优化电泳结果:A、B、C、D分别表示引物终浓度的4个梯度:0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L;1-2、3-4、5-6、7-8、9-10分别表示退火温度的5个梯度:56℃、58℃、60℃、62℃、64℃。
图3是方法特异性测试电泳结果:1、空白对照;2、阴性对照;3、1%mfb-MH3301;4-6、非转基因玉米;7-9、转基因玉米;10-12、非转基因大豆;13-15、转基因大豆;16-18、非转基因水稻;19-21、其他转基因水稻;22-24、非转基因油菜;25-27、转基因油菜;28-30、非转基因棉花;31-33、转基因棉花;34-36、小麦混合样。
图4是方法检出限测试电泳结果:1-3、5%;4-6、1%;7-9、0.5%;10-12、0.1%;13-15、0.05%;16-18、0.01%;19-21、0%。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实验采用如下所述的实验材料
1、植物材料
转基因水稻mfb-MH3301纯合体(100%),非转基因水稻明恢86,特异性实验验证样品13种。
特异性实验验证样品设计如下:
(1)阳性对照样品:转基因水稻mfb-MH3301,含量为1%;
(2)阴性对照样品:明恢86;
(3)非转基因玉米:3种非转基因玉米等量混合制成1个样品;
(4)转基因玉米:Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、SH12-5、IE09S034,18个转化体混合制成1个样品,含量各1%;
(5)非转基因大豆:3种非转基因大豆等量混合制成1个样品;
(6)转基因大豆:GTS40-3-2、MON89788、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、FG72,12个转化体混合制成1个样品,含量各1%;
(7)非转基因水稻:TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1,7个转化体混合制成一个样品,含量各1%;
(8)其他转基因水稻:3种非转基因水稻等量混合制成1个样品;
(9)非转基因油菜:3种非转基因油菜等量混合制成1个样品;
(10)转基因油菜:MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302,9个转化体混合制成1个样品,含量各1%;
(11)非转基因棉花:3种非转基因棉花等量混合制成1个样品;
(12)转基因棉花:MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614,6个转化体混合制成1个样品,含量各1%;
(13)小麦混合样:3种非转基因小麦等量混合制成1个样品。
2、酶与试剂
3、实验仪器
分光光度计:Thermo ND-1000;
离心机:Thermo Bioguge Primo R;
PCR仪:ABI Veriti;
凝胶成像仪:BioRad T2A;
其他仪器包括水浴锅、精密天平、通风柜、生物安全柜、电泳仪等。
实施例1植物基因组DNA的提取与检测
采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技有限公司)进行植物材料DNA提取和纯化,提取方法如下:
1)取200mg水稻粉末样品;
2)加入800μL 65℃预热的GP1缓冲液,迅速颠倒混匀,将离心管放在65℃水浴1h,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3)加入等体积酚:氯仿(1:1),充分混匀,12000rpm离心10min。
4)转移上清至一新离心管,加入等体积氯仿,充分混匀,12000rpm离心10min。
5)取上清,加入等体积GP2,充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12000rpm离心30s,弃掉废液(吸附柱容积700μL,可分次加入离心)。
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位加入60μL 0.1×TE缓冲液,室温放置5min,12000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中。
采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时,DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260/OD280比值应为1.7-1.9。
实施例2检测方法的建立
(1)引物设计:根据抗虫转基因水稻mfb-MH3301的3’端旁侧序列,在外源插入序列与水稻染色体连接区设计相应的定性PCR引物。正向引物位于外源插入序列上,反向引物位于水稻染色体上,正向引物及反向引物各设计2条引物。
正向引物MH3301-3-aF:5'-agcatcggtaacatgagcaaag-3'(SEQ ID No.1)
正向引物MH3301-3-bF:5'-ttgccgttcttccgaatagc-3'(SEQ ID No.3)
反向引物MH3301-3-aR:5'-aatccgaaaagaagtctgccat-3'(SEQ ID No.2)
反向引物MH3301-3-bR:5'-catgagtttcccaaagtgcctag-3'(SEQ ID No.4)
(2)引物筛选:采用常规检测中的PCR体系及扩增程序进行PCR扩增,对设计的4条引物两两组合(见表1),采用试验方法进行评价,筛选出最适合的引物,琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
表1筛选引物信息
(3)PCR反应体系和反应程序优化:引物终浓度设置为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L等4个梯度处理;退火温度设置为56℃、58℃、60℃、62℃、64℃等5个梯度处理。用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果(见图2),确定最适合的PCR反应体系和反应程序。
(4)方法特异性测试:根据优化好的PCR反应体系和反应程序,选取特异性实验验证样品13种对方法进行特异性测试。若仅从含有转基因水稻mfb-MH3301材料中获得预期扩增产物,而从其他样品中未获得预期扩增产物,表明方法特异性符合要求,实验结果见图3。
(5)方法检出限测试:将转基因水稻mfb-MH3301及其受体材料按质量比混合,配制成一系列梯度稀释样品进行测试,质量分数分别为5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0%的梯度稀释样品,确定方法灵敏度,实验结果见图4。
(6)本发明进一步提供一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测试剂盒,包括:Green Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水;所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法
<141> 2020-10-07
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agcatcggta acatgagcaa ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aatccgaaaa gaagtctgcc at 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ttgccgttct tccgaatagc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
catgagtttc ccaaagtgcc tag 23
Claims (3)
1.一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物,其特征在于,所述检测引物为:正向引物MH3301-3-aF,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;反向引物MH3301-3-aR,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;
所述特异性定性PCR反应体系为:Green Master Mix缓冲液12.5μL,10μmol/L MH3301-3-aF 1μL,10μmol/L MH3301-3-aR 1μL,DNA模板2μL,用去离子水补至25μL;
所述定性PCR反应的条件为:94℃变性5min;94℃,30s,60℃,30s,72℃,30s,35个循环;72℃延伸7min。
2.一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测方法,其特征在于,按照如下步骤进行:
(1)DNA模板制备:提取待检测水稻样品的DNA;
(2)试样PCR反应:以提取的水稻样品的DNA为模板,利用权利要求1所述的PCR检测引物配置反应体系,并进行PCR扩增;
(3)对照PCR反应:在试样PCR反应的同时,应设置空白对照、阴性对照和阳性对照,以水作为空白对照;以非转基因水稻材料中提取的DNA作为阴性对照;以转基因水稻mfb-MH3301作为阳性对照;
(4)PCR产物电泳检测及凝胶成像分析。
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