CN107868844A - 一种cry1A基因定性PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒 - Google Patents
一种cry1A基因定性PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种cry1A基因定性PCR检测引物、检测方法、检测试剂盒,属于生物技术领域。所述检测引物对为:cry1A‑aF,其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示;cry1A‑aR,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。所述检测方法及检测试剂盒可作为鉴定含有cry1A基因的转基因产品。本发明的cry1A基因定性PCR检测方法具有广泛适用性,对于对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰的序列能够准确的进行检测,该方法对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段,为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种cry1A基因定性PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒。
背景技术
Cry1A基因是一类抗虫基因的总称,也是当前商业化应用的抗虫转基因作物中最常见的外源目的基因,包括cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、mcry1Ac、cry1Ab/Ac等,cry1A基因在转基因检测工作中可作为一种具有广泛代表性的靶标。但是,由于转基因作物研发者往往会对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰,导致不同转化体中的同一类型的cry1A基因在核苷酸序列上也有较大变异,因此,建立具有广泛适用性的cry1A基因定性PCR检测方法,对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段,为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种cry1A基因定性PCR检测引物;
本发明的目的之二是建立一种cry1A基因定性PCR检测方法;
本发明的目的之三是一种cry1A基因定性PCR检测试剂盒;
一种cry1A基因定性PCR检测引物,所述定性检测引物为:cry1A-aF,其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示;cry1A-aR,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
一种抗虫基因cry1A定性PCR检测方法,按照如下步骤进行:
(1)DNA模板制备:提取待检测样品的DNA;
(2)试样PCR反应:以提取样品的DNA为模板,利用cry1A基因定性PCR检测引物配置反应体系,并进行PCR扩增。
(3)对照PCR反应:在试样PCR反应的同时,应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。以水作为空白对照;以非转基因玉米材料中提取的DNA作为阴性对照;以转基因玉米MON810作为阳性对照。
(4)PCR产物电泳检测及凝胶成像分析。
所述cry1A基因定性PCR反应体系为:2×Green Master Mix缓冲液12.5μL,10μmol/L cry1A-aF引物1μL,10μmol/L cry1A-aR引物1μL,25ng/μL DNA模板2μL,用去离子水补至25μL。
所述定性PCR反应的条件为:94℃变性5min;94℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸30s,进行35次循环;72℃延伸7min。
一种cry1A基因定性PCR检测试剂盒,包括:2×Green Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水;所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的序列。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
(1)序列比对:通过查询网络数据库、国内外专利、科技论文等方式,收集不同转基因作物中的cry1A基因序列,利用DNAMAN软件进行序列比对分析,并设计引物对11种转基因材料中的cry1A基因进行扩增,并测序验证。
(2)引物设计:利用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对分析,根据比对结果,将cry1A基因分为4类,针对4类序列中相对保守部分,利用Primer premier 5.0软件进行引物设计。采用简并引物策略筛选出1对cry1A基因定性PCR检测引物,cry1A-aF,其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示;cry1A-aR,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。扩增产物大小为253bp。
(3)PCR反应体系和反应程序优化:用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果,确定最适合的PCR反应体系和反应程序。
(4)方法特异性测试:选取不同物种和相同物种不同品种的材料混合成测试样品,对方法进行特异性测试。若仅从含有cry1A抗虫基因材料中获得预期扩增产物,而从其他样品中未获得预期扩增产物,表明方法特异性符合要求。
(5)方法检出限测试:使用购买的欧盟标准物质,对含有cry1A抗虫基因的4类材料(Bt11、MON810、Bt176、DAS-81419-2)不同质量分数的样品进行测试,确定方法灵敏度。
(6)本发明进一步提供一种cry1A抗虫基因定性PCR检测试剂盒,包括:2×Green Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水;所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
本发明的有益效果:本发明的cry1A基因定性PCR检测方法具有广泛适用性,对于对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰的序列能够准确的进行检测,该方法对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段,为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。
附图说明
图1是4类Cry1A基因测序结果比对及引物结合位点图。
图2是引物筛选电泳结果:M、100bp;1、Bt11;2、Bt176;3、DAS-81419-2;4、MON810;5、阴性玉米;6、空白对照。
图3是PCR反应体系和反应程序优化电泳结果:3A、3B、3C、3D分别表示引物终浓度的4个梯度:0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L;1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12分别表示退火温度的5个梯度:58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃。
图4是方法特异性测试电泳结果:(4A)含cry1A基因材料测试结果:M、100bp DNALadder;1、Bt11;2、MON89034;3、Bt176;4、DAS-81419-2;5、C0030.3.5;6、SK12-5;7、Bt506;8、MON88017;9、MON810;10、MON531;11、MON15985;12、T304-40;13、Kefeng 6;14、KMD;15、TT51-1;16、Kefeng 8;17、阴性玉米;18、空白对照。(4B)不含cry1A基因材料测试结果:M、100bp DNA Ladder;1、空白对照;2、阴性玉米;3、阳性对照(MON810);4、MON863;5、MON88017;6、MIR604;7、TC1507;8、MIR162;9、59122;10、4114;11、MON87460;12、NK603;13、GA21;14、3272;15、T25。(4C)1、非转基因油菜混合样;2、非转基因水稻混合样;3、非转基因大豆混合样;4、非转基因玉米混合样品;5、非转基因棉花混合样品;6、阳性对照(MON810);7、阴性玉米;8、空白对照。
图5是利用转基因玉米Bt11对方法检出限进行测试电泳结果:(5A)欧盟标准物质:转基因玉米Bt11(质量分数分别为4.89%、1.96%、0.98%、0.49%、0.098%、<0.012%);1、4.89%;2、1.96%;3、0.98%;4、0.49%;5、0.098%;6、<0.012%;7、空白对照;(5B)转基因玉米Bt11质量分数为0.098%的样品60次重复实验结果,1-60、098%Bt11;61、阳性对照(0.98%Bt11);62、阴性玉米;63、空白对照。
图6是利用转基因玉米MON810对方法检出限进行测试电泳结果:(6A)欧盟标准物质:转基因玉米MON810(质量分数分别为9.9%、1.98%、0.49%、<0.09%);1、9.9%;2、1.98%;3、0.49%;4、<0.09%;5、阴性玉米;6、空白对照;(6B)转基因玉米MON810质量分数为<0.09%的样品60次重复实验结果,1-60、<0.09%MON810;61、阳性对照(1.98%MON810);62、阴性玉米;63、空白对照。
图7是利用转基因玉米Bt176对方法检出限进行测试电泳结果:(7A)欧盟标准物质:转基因玉米Bt176(质量分数分别为5.0%、2.0%、1.0%、0.5%、0.1%、<0.014%),1、5%;2、2%;3、1%;4、0.5%;5、0.1%;6、<0.014%;7、空白对照;(7B)转基因玉米Bt176质量分数为0.1%的样品60次重复实验结果,1-60、0.1%Bt176;61、阳性对照(1.0%Bt176);62、阴性玉米;63、空白对照。
图8是利用转基因大豆DAS-81419-2对方法检出限进行测试电泳结果:(8A)欧盟标准物质:转基因大豆DAS-81419-2(质量分数分别为>98.9%、10%、0.99%、<0.7%、0.099%);1、>98.9%;2、10%;3、0.99%;4、<0.7%;5、0.099%;6、阴性大豆;7、空白对照;(8B)转基因玉米DAS-81419-2质量分数为0.099%的样品60次重复实验结果,1-60、0.099%;61、阳性对照(0.99%DAS-81419-2);62、阴性大豆;63、空白对照。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实验采用如下所述的实验材料
1、植物材料
含cry1A抗虫基因的材料:Bt11、MON89034、Bt176、DAS-81419-2、C0030.3.5、SK12-5、Bt506、MON88017、MON810、MON531、MON15985、T304-40、Kefeng 6、KMD、TT51-1、Kefeng 8。
不含cry1A抗虫基因的材料:MON863、MON88017、MIR604、TC1507、MIR162、59122、4114、MON87460、NK603、GA21、3272、T25。
非转基因材料:(1)非转基因油菜混合样:5种非转基因油菜等量混合制成1个样品;(2)非转基因水稻混合样:5种非转基因水稻等量混合制成1个样品;(3)非转基因大豆混合样:5种非转基因大豆等量混合制成1个样品;(4)非转基因玉米混合样:5种非转基因玉米等量混合制成1个样品;(5)非转基因棉花混合样:5种非转基因棉花等量混合制成1个样品;
欧盟标准物质:转基因玉米Bt11(质量分数分别为4.89%、1.96%、0.98%、0.49%、0.098%、<0.012%)、转基因玉米MON810(质量分数分别为9.9%、1.98%、0.49%、<0.09%)、转基因玉米Bt176(质量分数分别为5.0%、2.0%、1.0%、0.5%、0.1%、<0.014%)、转基因大豆DAS-81419-2(质量分数分别为>98.9%、10%、0.99%、<0.7%、0.099%)。
2、酶与试剂
Promega的Green Master Mix缓冲液,天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒,引物由上海生工合成。
3、实验仪器
分光光度计:Thermo ND-1000;
离心机:Thermo Bioguge Primo R;
PCR仪:ABI Veriti;
凝胶成像仪:BioRad T2A;
其他仪器包括水浴锅、精密天平、通风柜、生物安全柜、电泳仪等。
实施例1植物基因组DNA的提取与检测
采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技(北京)有限公司)进行植物材料DNA提取和纯化,提取方法如下:
1)分别取200mg粉末样品;
2)加入800μL 65℃预热的GP1缓冲液,迅速颠倒混匀,将离心管放在65℃水浴1h,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3)加入等体积酚:氯仿(1:1),充分混匀,12000rpm离心10min。
4)转移上清至一新离心管,加入等体积氯仿,充分混匀,12000rpm离心10min。
5)取上清,加入等体积GP2,充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12000rpm离心30s,弃掉废液(吸附柱容积700μL,可分次加入离心)。
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位加入60μL 0.1×TE缓冲液,室温放置5min,12000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中。
采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时,DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260/OD280比值应为1.7-1.9。
实施例2 cry1A基因测序验证
序列比对:通过查询网络数据库、国内外专利、科技论文等方式,收集11种不同转基因作物中的cry1A基因序列,利用DNAMAN软件进行序列比对分析,并设计引物,对cry1A基因部分序列进行扩增。引物及转基因材料信息见表1。
表1 引物及转基因材料信息表
对表1中11种转基因材料中的cry1A基因进行扩增,定性PCR反应体系如下:Green Master Mix缓冲液25μL,10μmol/L上游引物2μL,10μmol/L下游引物2μL,DNA模板2μL,用去离子水补至50μL;定性PCR反应的条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min,共进行35个循环;72℃延伸7min。反应结束后,对PCR产物进行电泳检测。并回收PCR产物进行测序,以确定不同转化体中cry1A基因的序列。
实施例3 cry1A基因检测方法的建立
(1)序列比对及引物设计:利用DNAMAN软件对测序获得的序列进行比对分析,根据比对结果(图1),将cry1A基因分为4类,分别为①Bt11、Kefeng6、TT51-1、MON531、MON15985、MON88017;②MON810、MON89034;③Bt176、SK12-5;④DAS-81419-2。
针对4类序列中相对保守部分,利用Primer premier 5.0软件进行引物设计。采用简并引物策略筛选出1对cry1A基因定性PCR检测引物,简并引物信息见表2,引物筛选实验结果见图2。
表2 简并引物信息
(2)PCR反应体系和反应程序优化:引物终浓度设置为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L等4个梯度处理;退火温度设置为58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃等5个梯度处理。用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果(见图3),确定最适合的PCR反应体系和反应程序。
(3)方法特异性测试:根据优化好的PCR反应体系和反应程序,选取特异性实验验证样品33种对方法进行特异性测试。结果显示仅从含有cry1A基因的材料中获得预期扩增产物,而从其他样品中未获得预期扩增产物,表明方法特异性符合要求,实验结果见图4。
(4)方法检出限测试:对含有cry1A抗虫基因的4类材料(Bt11、MON810、Bt176、DAS-81419-2),使用购买的欧盟标准物质,对不同质量分数的样品进行测试,确定方法灵敏度。对可检出的最低质量分数的测试样品,提取60份基因组DNA,进行检测限测试。若60份测试样品中不少于59份的测试结果为阳性,则将该样品的质量分数确定为方法的相对检测限。否则,应重新确定方法灵敏度和进行检出限测试,直至确定方法的相对检测限。实验结果见图5-8。
(6)本发明进一步提供一种cry1A抗虫基因定性PCR检测试剂盒,包括:2×Green Master Mix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水;所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
实施例4 定性PCR反应体系优化
对表1中11种转基因材料中的cry1A基因进行扩增,定性PCR反应体系如下:Green Master Mix缓冲液25μL,1%2-(4-羟基苯基)吡啶水溶液2μL或1%1-二甲氨基-2-甲基-3-戊酮水溶液,10μmol/L上游引物2μL,10μmol/L下游引物2μL,DNA模板2μL,用去离子水补至50μL;定性PCR反应的条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min,共进行35个循环;72℃延伸7min。反应结束后,对PCR产物进行电泳检测。并回收PCR产物进行测序,以确定不同转化体中cry1A基因的序列。加入1%2-(4-羟基苯基)吡啶水溶液或1%1-二甲氨基-2-甲基-3-戊酮水溶液后,PCR体系更加稳定,不加入2-(4-羟基苯基)吡啶水溶液或1%1-二甲氨基-2-甲基-3-戊酮水溶液的PCR假阳性率为0.5%,加入后假阳性率分别为0.01%,0.005%。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种cry1A基因定性PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 1
carttcaacg acatgaacag cgc 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 2
gctccaggcc vgtgttgtac ca 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 3
accggytaca cycccatcga catc 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 4
cggatgcgat gatgttgttg aactc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 5
tgttgttctg tggtgggatt tcgtc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 6
atggacaaca atcccaacat caacg 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 7
gtcgattatc actccggcgg tt 22
Claims (5)
1.一种cry1A基因定性PCR检测引物,其特征在于,所述定性检测引物为:cry1A-aF,其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示;cry1A-aR,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
2.一种抗虫基因cry1A定性PCR检测方法,其特征在于,按照如下步骤进行:
(1)DNA模板制备:提取待检测样品的DNA;
(2)试样PCR反应:以提取样品的DNA为模板,利用cry1A基因定性PCR检测引物配置反应体系,并进行PCR扩增。
(3)对照PCR反应:在试样PCR反应的同时,应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。以水作为空白对照;以非转基因玉米材料中提取的DNA作为阴性对照;以转基因玉米MON810作为阳性对照。
(4)PCR产物电泳检测及凝胶成像分析。
3.根据权利要求2所述的cry1A基因定性PCR检测方法,其特征在于,所述cry1A基因定性PCR反应体系为:Green Master Mix缓冲液12.5μL,10μmol/L cry1A-aF引物1μL,10μmol/L cry1A-aR引物1μL,25ng/μL DNA模板2μL,用去离子水补至25μL。
4.根据权利要求2所述的cry1A基因定性PCR检测方法,其特征在于,所述定性PCR反应的条件为:94℃变性5min;94℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸30s,进行35次循环;72℃延伸7min。
5.一种cry1A基因定性PCR检测试剂盒,其特征在于,包括:Green MasterMix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水;所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
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2017
- 2017-12-08 CN CN201711296185.5A patent/CN107868844A/zh active Pending
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