MX2007012561A - Evento elite a5547-127, y metodos y equipos para identificar dicho evento en muestras biologicas. - Google Patents

Abstract

Se proveen herramientas que permiten la identificacion rapida e inequivoca del evento elite A5547-127 en muestras biologicas.

Description

EVENTO ÉLITE A5547-127, Y MÉTODOS Y EQUIPOS PARA IDENTDFDCAR DICHO EVENTO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención pertenece a métodos y equipos para identificar, en muestras biológicas, la presencia de materia vegetal que comprende específicamente el evento de transformación A5547-127, así como plantas de soya transgénicas, materia vegetal y familias que contienen a dicho evento. Las plantas de soya de la invención, combinan el fenotipo tolerante a herbicidas con un desempeño agronómico, estabilidad genética y adaptabilidad a diferentes bases genéticas equivalentes a la línea de soya no transformada en ausencia de presión por malas hierbas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La expresión fenotípica de un transgen en una planta, es determinada por la estructura del gen mismo y por su ubicación en el genoma de la planta. Al mismo tiempo, la presencia del transgen (en un ADN extraño) en diferentes sitios en el genoma, influirá sobre el fenotipo general de la planta en diferentes formas. La introducción agronómicamente o ¡ndustrialmente exitosa de un rasgo comercialmente interesante en una planta mediante manipulación genética, puede ser un procedimiento largo que depende de diferentes factores. La transformación real y regeneración de plantas genéticamente transformadas, son sólo el primero en una serie de pasos de selección, que incluyen caracterización genética extensiva, mejoramiento genético y evaluación en pruebas de campo, que llevan finalmente a la 5 selección de un evento élite.

La identificación inequívoca de un evento élite está llegando a ser cada vez más importante en vista de discusiones sobre alimento/pienso (forraje) novedoso, segregación de GMO (organismos genéticamente modificados) y productos sin GMO, y la identificación de material patentado.

I ¡10 Idealmente, dicho método de identificación es rápido y simple, sin la necesidad de una estructura de laboratorio extensiva. Además, el método debe proveer resultados que permitan la determinación inequívoca del evento élite sin interpretación del experto, pero que se sostenga bajo escrutinio del experto, si es necesario. 15 Se seleccionó a A5547-127 como un evento élite en el desarrollo i de soya (Glicine max L.) resistente al herbicida Liberty®, mediante la transformación de la soya con un plásmido que comprende el gen pat sintético que codifica para tolerancia a fosfinotricina, y que puede venderse comercialmente como soya Liberty Link®. Las herramientas de uso en 20 métodos simples e inequívocos para la identificación del evento élite A5547- ? 127 en muestras biológicas, se describen en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para identificar el evento élite A5547-127 en muestras biológicas, cuyos métodos se basan en i 5 iniciadores o sondas que reconocen específicamente la secuencia flanqueante 5' y/o 3' de A5547-127. Más específicamente, la invención se refiere a un método que comprende amplificar una secuencia de un ácido nucleico presente en muestras biológicas, usando una reacción en cadena de polimerasa con por lo ¡10 menos dos iniciadores, uno de los cuales reconoce la región flanqueante 5' o 3' de A5547-127, el otro que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño, de preferencia para obtener un fragmento de ADN entre 100 y 500 pb. Los iniciadores pueden reconocer una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de A5547-127 (SEQ ID No. 1 , de la posición 1 a la posición 311 ), o dentro 15 de la región flanqueante 3' de A5547-127 (complemento de SEQ ID No. 2 de la posición 510 a la posición 1880), y una secuencia dentro del ADN extraño (complemento de SEQ ID No. 1 de la posición 312 a 810, o SEQ ID No. 2 de la posición 1 a la posición 510), respectivamente. El iniciador que reconoce la región flanqueante 5' puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ 20 ID No. 15, y el iniciador que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño, puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 13 descrita en la presente. La presente invención se refiere más específicamente a un método para identificar el evento élite A5547-127 en muestras biológicas, cuyo método comprende amplificar una secuencia de un ácido nucleico presente en una muestra biológica, usando una reacción en cadena de polimerasa con dos iniciadores que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 15 y SEQ ID No. 13, respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 151 pb. La presente invención se refiere además a las secuencias flanqueantes específicas de A5547-127 descritas en la presente, que pueden usarse para desarrollar métodos de identificación específicos para A5547-127 en muestras biológicas. Más particularmente, la invención se refiere a las regiones flanqueantes 5' y/o 3' de A5547-127 que pueden usarse para el desarrollo de iniciadores y sondas específicos como se describe además en la presente. La invención se refiere además a métodos de identificación para la presencia de A5547-127 en muestras biológicas con base en el uso de dichos iniciadores o sondas específicos. Los iniciadores pueden consistir de una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 , o el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880), en combinación con iniciadores que consisten de una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados del complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 312 al nucleótido 810, o la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1 al nucleótido 510. Los iniciadores pueden comprender también estas secuencias de nucleótidos localizadas en su extremo 3', y comprenden además secuencias no relacionadas o secuencias derivadas de las secuencias de nucleótidos mencionadas, pero comprendiendo no apareamientos. La invención se refiere además a equipos para identificar el evento élite A5547-127 en muestras biológicas, dichos equipos comprendiendo por lo menos un iniciador o sonda que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' de A5547-127. El equipo de la invención puede comprender, además de un iniciador que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' de A5547-127, un segundo iniciador que reconoce específicamente una secuencia dentro del ADN extraño de A5547-127, para su uso en un protocolo de identificación por PCR. De preferencia, el equipo de la invención comprende dos iniciadores específicos, uno de los cuales reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de A5547-127, y el otro que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño. Especialmente, el iniciador que reconoce la región flanqueante 5' puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 14, y el iniciador que reconoce el transgen puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 13, o cualquier otro iniciador como se describe en la presente. La invención se refiere además a un equipo para identificar el evento élite A5547-127 en muestras biológicas, dicho equipo comprendiendo los iniciadores de PCR que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 15, para su uso en el protocolo de identificación por PCR de A5547-127 descpto en la presente. La ¡nvención se refiere también a un equipo para identificar el evento élite A5547-127 en muestras biológicas, cuyo equipo comprende una sonda específica que tiene una secuencia que corresponde (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con una región específica de A5547-127. De preferencia, la secuencia de la sonda corresponde a una región específica que comprende parte de la región flanqueante 5' o 3' de A5547-127. Más preferiblemente, la sonda específica tiene (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre los nucleótidos 360 y 460 de SEQ ID No. 1 , o la secuencia entre los nucleótidos 460 y 560 de SEQ ID No. 2. Los métodos y equipos abarcados por la presente ¡nvención pueden usarse para diferentes propósitos tales como, pero no limitados a, los siguientes: identificar la presencia o ausencia de A5547-127 en plantas, matepa vegetal o en productos tales como, pero no limitados a, productos alimenticios o forrajeros (frescos o procesados) que comprendan o se deriven de matepa vegetal; además o en forma alternativa, los métodos y equipos de la presente invención pueden usarse para identificar materia vegetal transgénica para propósitos de segregación entre material transgénico y no transgénico; además o en forma alternativa, los métodos y equipos de la presente invención, pueden usarse para determinar la calidad (es decir, porcentaje de material puro) de la materia vegetal que comprenda A5547-127. La invención se refiere además a las regiones flanqueantes 5' y/o 3' de A5547-127, así como a los iniciadores y sondas específicos 5 desarrollados a partir de las secuencias flanqueantes 5' y/o 3' de A5547-127. La ¡nvención se refiere también a plantas de soya, partes de las mismas, células, semillas y plantas descendientes que comprenden el evento élite A5547-127. Dichas plantas, partes de las mismas, células, semillas y plantas descendientes, pueden identificarse usando los métodos descritos en 10 la presente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La incorporación de una molécula de ADN recombinante en el ¡15 genoma de la planta, resulta típicamente de la transformación de una célula o ¡ tejido (o de otra manipulación genética). El sitio de incorporación particular se debe a integración "aleatoria", o está en un sitio predeterminado (si se usa un i , procedimiento de integración elegida como objetivo). El ADN introducido en el genoma de la planta como resultado de ¡20 la transformación de una célula o tejido vegetal con un ADN recombinante o "ADN transformante", y que se origina de dicho ADN transformante, es referido en lo sucesivo como "ADN extraño" que comprende uno o más "transgenes". El "ADN de la planta" en el contexto de la presente invención, se referirá a ADN que se origina de la planta que es transformada. El ADN de la ' planta se encontrará usualmente en el mismo locus genético en la planta de tipo silvestre correspondiente. El ADN extraño puede caracterizarse por la ubicación y la configuración en el sitio de incorporación de la molécula de 1 5 ADN recombinante en el genoma de la planta. El sitio en el genoma de la l planta en donde un ADN recombinante ha sido insertado, es referido también como el "sitio de inserción" o "sitio objetivo". La inserción del ADN recombinante en el genoma de la planta puede asociarse con una deleción del ADN de la planta, referida como "deleción del sitio objetivo". Una "región 10 flanqueante" o "secuencia flanqueante", como se usa en la presente, se refiere i a una secuencia de por lo menos 20 pb, de preferencia por lo menos 50 pb, y 1 hasta 5000 pb del genoma de la planta, que se localiza inmediatamente hacia el extremo 5' de y contigua con, o inmediatamente hacia el extremo 3' de y contigua con, el ADN extraño. Los procedimientos de transformación que 1'5 llevan a la integración aleatoria del ADN extraño, resultarán en transformantes con diferentes regiones flanqueantes, que son características y únicas para cada transformante. Cuando el ADN recombinante es introducido en una planta a través de cruzamiento tradicional, su sitio de inserción en el genoma de la planta, o sus regiones flanqueantes, no cambiarán generalmente. Una 20 "región de inserción", como se usa en la presente, se refiere a la región que corresponde a la región de por lo menos 40 pb, de preferencia por lo menos 100 pb, y hasta 10000 pb, abarcada por la secuencia que comprende la región flanqueante hacia el extremo 5' y/o la región flanqueante hacia el extremo 3' de un ADN extraño en el genoma de la planta. Tomando en cuenta diferencias | menores debidas a mutaciones dentro de una especie, una región de inserción retendrá, tras el cruzamiento en una planta de la misma especie, por lo menos 85%, de preferencia 90%, más prefepblemente 95%, y muy 5 preferiblemente 100% de identidad de secuencia con la secuencia que i comprende las regiones flanqueantes hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' del ADN extraño en la planta que se obtiene originalmente de la transformación. Un evento se define como un locus genético (artificial) que, como ¡10 resultado de ingeniería genética, lleva un transgen que comprende por lo menos una copia de un gen de interés. Los estados alélicos típicos de un evento, son la presencia o ausencia del ADN extraño. Un evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del transgen. Al nivel genético, un evento forma parte de la constitución genética de una planta. Al nivel 15 molecular, un evento puede caracterizarse por el mapa de restricción (por ejemplo, según se determina mediante Southern blotting), por las secuencias flanqueantes hacia el extremo 5' y/o hacia el extremo 3' del transgen, la ubicación de marcadores moleculares y/o la configuración molecular del transgen. Usualmente la transformación de una planta con un ADN 20 transformante que comprende por lo menos un gen de interés, lleva a una multitud de eventos, cada uno de los cuales es único. Un evento élite, como se usa en la presente, es un evento que se selecciona de un grupo de eventos, obtenidos mediante transformación con el mismo ADN transformante, o por retrocruza con plantas obtenidas mediante í dicha transformación, con base en la expresión y estabilidad de los , transgenes, y su compatibilidad con características agronómicas óptimas de la planta que los comprende. De esta manera, los criterios para la selección del ! 5 evento élite son uno o más, de preferencia dos o más, en forma ventajosa la I totalidad, de los siguientes: a) que la presencia del ADN extraño no comprometa otras características deseadas de la planta, tales como aquellas relacionadas con el desempeño agronómico o el valor comercial; 10 b) que el evento se caracterice por una configuración molecular i bien definida que sea heredada establemente, y para la cual puedan desarrollarse herramientas adecuadas para el control de la identidad; c) que los genes de interés muestren una expresión fenotípica espacial y temporal correcta, adecuada y estable, tanto en condición 15 heterocigótica (o hemicigótica) como homocigótica del evento, a un nivel comercialmente aceptable en una gama de condiciones ambientales en las cuales es probable que las plantas que poseen el evento sean expuestas en uso agronómico normal.

Se prefiere que el ADN extraño esté asociado con una posición 20 en el genoma de la planta que permita la introgresión fácil en bases genéticas comerciales deseadas.

El estado de un evento como un evento élite se confirma mediante introgresión del evento élite en diferentes bases genéticas relevantes, y observando el cumplimiento con uno, dos o todos los criterios, por ejemplo, a), b) y c) anteriores. Un "evento élite" se refiere de esta manera a un locus genético que comprende un ADN extraño, que responde a los criterios descritos 5 anteriormente. Una planta, materia vegetal o progenie tal como semillas, i puede comprender uno o más eventos élite en su genoma. Las herramientas desarrolladas para identificar un evento élite o la planta, materia vegetal que comprende un evento élite, o productos que comprenden la materia vegetal que comprende el evento élite, se basan en 10 las características genómicas específicas del evento élite, tales como un mapa de restricción específico de la región genómica que comprende el ADN i extraño, marcadores moleculares o la secuencia de las regiones flanqueantes del ADN extraño. Una vez que ambas regiones flanqueantes o una de ellas del 15 ADN extraño hayan sido secuenciadas, pueden desarrollarse iniciadores y sondas que reconocen específicamente estas secuencias en el ácido nucleico (ADN o ARN) de la muestra, por medio de una técnica de biología molecular. Por ejemplo, puede desarrollarse un método de PCR para identificar el evento élite en muestras biológicas (tales como muestras de plantas, materia vegetal 20 o productos que comprendan materia vegetal). Dicha PCR se basa en por lo menos dos "iniciadores" específicos, uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento élite, y el otro que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño. Los iniciadores tienen de preferencia una secuencia entre 15 y 35 nucleótidos que bajo condiciones de PCR i ¡ optimizadas, "reconocen específicamente" una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento élite y el ADN extraño del evento élite respectivamente, de modo que un fragmento específico ("fragmento de j 5 integración" o amplicón discriminante) es amplificado a partir de una muestra I de ácido nucleico que comprende el evento élite. Esto significa que sólo el fragmento de integración elegido como objetivo, y no otra secuencia en el genoma de la planta o ADN extraño, es amplificado bajo condiciones de PCR optimizadas. ¡10 Iniciadores de PCR adecuados para la invención, pueden ser los siguientes: - Oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, comprendiendo una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos, de preferencia 20 15 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante 5' (SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 ) en su extremo 3' (iniciadores que reconocen secuencias flanqueantes 5'); o i - oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, comprendiendo una secuencia de 20 nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos, de preferencia 20 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante 3' (complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880) en su extremo 3' (iniciadores que reconocen secuencias flanqueantes 3'); o - oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nucleótidos a aproximadamente 510 nucleótidos, comprendiendo una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos, de preferencia 20 nucleótidos seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (complemento de SEQ ID No. 1 del nucleótido 312 al nucleótido 810) en su extremo 3' (iniciadores que reconocen ADN extraño); o - oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, comprendiendo una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos, de preferencia 20 nucleótidos seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (SEQ ID No. 2 del nucleótido 1 al nucleótido 509). Los iniciadores pueden ser, de hecho, más largos que los 17 nucleótidos consecutivos mencionados y pueden ser, por ejemplo, de 20, 21 , 30, 35, 50, 75, 100, 150 o 200 nucleótidos de longitud o incluso más largos. Los iniciadores pueden consistir enteramente de secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos mencionadas de secuencias flanqueantes y secuencias de ADN extraño. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los iniciadores en su extremo 5' (es decir, fuera de los 17 nucleótidos consecutivos localizados 3') es menos crítica. De esta manera, la secuencia 5' de los iniciadores puede consistir de una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias flanqueantes o ADN extraño, según sea adecuado, pero puede contener varios, por ejemplo, 1 , 2, 5 o 10 no apareamientos. La secuencia 5' de los iniciadores puede consistir incluso enteramente de una secuencia de nucleótidos no relacionada con las secuencias flanqueantes o ADN extraño como es el caso, por ejemplo, de una secuencia de nucleótidos que represente sitios de reconocimiento de enzima de restricción. Dichas secuencias no relacionadas o secuencias de ADN 5 flanqueantes con no apareamientos, deben ser de preferencia no más largas de 100, más prefepblemente no más largas de 50 o incluso 25, nucleótidos. Además, los iniciadores adecuados pueden comprender o consistir de una secuencia de nucleótidos en su extremo 3' que abarque la región de unión entre las secuencias derivadas del ADN de la planta y las 10 secuencias del ADN extraño (localizadas en los nucleótidos 311-312 en SEQ ¡ ID No. 1 y los nucleótidos 509-510 en SEQ ID No. 2), siempre que los 17 nucleótidos consecutivos localizados 3' mencionados, no se deriven exclusivamente del ADN extraño o secuencias derivadas de la planta en SEQ ID No. 1 ó 2. ,15 De esta manera, iniciadores de PCR adecuados para la invención, pueden ser también los siguientes: - Oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nucleótidos a 1 aproximadamente 300 nucleótidos, comprendiendo una secuencia de i nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos, de preferencia 20 ¡20 nucleótidos consecutivos seleccionados de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 325 en su extremo 3'; o - oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, comprendiendo una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos, de preferencia 20 nucleótidos consecutivos seleccionados del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 495 al nucleótido 1880 en su extremo 3'; o - oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, comprendiendo una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos, de preferencia 20 nucleótidos seleccionados del complemento de SEQ ID No. 1 del nucleótido 295 al nucleótido 810 en su extremo 3'; o - oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, comprendiendo una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos, de preferencia 20 nucleótidos seleccionados de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1 al nucleótido 525. Será también inmediatamente claro para los expertos en la técnica, que los pares de iniciadores de PCR adecuadamente seleccionados no deben comprender tampoco secuencias que sean complementarias entre sí. Para el propósito de la invención, el "complemento de una secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID No: X", es la secuencia de nucleótidos que puede derivarse de la secuencia de nucleótidos representada, reemplazando los nucleótidos a través de su nucleótido complementario de acuerdo a las reglas de Chargaff (A<=>T; G<= C), y leyendo la secuencia en la dirección 5' a 3', es decir, en dirección opuesta de la secuencia de nucleótidos representada.

Ejemplos de iniciadores adecuados, son las secuencias de oligonucleótidos de SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 (iniciadores que reconocen la secuencia flanqueante 5'), SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 (iniciadores que reconocen el ADN extraño para su uso con los iniciadores que reconocen la secuencia flanqueante 5'), SEQ ID No. 1 1 , SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14 (iniciadores que reconocen el ADN extraño para su uso con los iniciadores que reconocen la secuencia flanqueante 3'), SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16 o SEQ ID No. 17 (iniciadores que reconocen la secuencia flanqueante 3'). Otros ejemplos de oligonucleótidos iniciadores adecuados comprenden en su extremo 3' las siguientes secuencias, o consisten de dichas secuencias: a. iniciadores que reconocen la secuencia flanqueante 5': - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 45 al nucleótido 64 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 22 al nucleótido 41 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 47 al nucleótido 64 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 183 al nucleótido 202 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 184 al nucleótido 203 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 301 al nucleótido 320 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 303 al nucleótido 322 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 306 al nucleótido 325 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 36 al nucleótido 55 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 182 0 al nucleótido 202 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 183 al nucleótido 203 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 184 al nucleótido 202 '5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 185 al nucleótido 203 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 185 al nucleótido 204 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 292 ¡0 al nucleótido 311 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 295 al nucleótido 314 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 307 al nucleótido 325 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 8 al nucleótído 27 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 10 al nucleótido 29 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 11 al nucleótido 30 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 13 al nucleótído 32 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 20 al nucleótído 41 - la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 35 al nucleótido 54 - la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 37 al nucleótido 55 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 66 al nucleótido 85 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 67 al nucleótido 86 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 68 al nucleótido 87 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 181 al nucleótido 202 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 182 al nucleótido 203 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 184 al nucleótido 204 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 185 al nucleótido 202 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 186 al nucleótido 204 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 186 al nucleótido 203 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 248 al nucleótido 267 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 249 al nucleótído 268 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 290 al nucleótido 309 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 291 al nucleótido 311 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 293 al nucleótido 311 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 294 al nucleótido 314 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 301 i al nucleótido 322 1 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 303 : al nucleótido 320 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 305 al nucleótido 322 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 308 ,10 al nucleótido 325 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 11 1 al nucleótido 29 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 36 al nucleótido 54 15 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 41 al nucleótido 61 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 43 al nucleótido 64 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 66 20 al nucleótido 86 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 67 al nucleótido 85 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 67 al nucleótido 87 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 68 al nucleótido 86 - la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 69 al nucleótido 87 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 180 al nucleótido 197 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 183 al nucleótido 204 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 187 al nucleótido 204 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 200 al nucleótido 219 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 246 al nucleótido 263 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 247 al nucleótido 267 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 248 al nucleótido 268 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 249 al nucleótido 267 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 250 al nucleótido 268 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 290 al nucleótido 311 i 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 291 al nucleótido 308 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 291 al nucleótído 309 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 293 |10 al nucleótido 214 I - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 8 al I nucleótido 29 1 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 11 al nucleótido 32 15 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 37 al nucleótido 54 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 40 al nucleótido 61 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 64 20 al nucleótido 85 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 65 al nucleótido 86 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 66 al nucleótido 87 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 68 al nucleótido 85 , 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 69 al nucleótido 86 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 197 al nucleótido 218 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 201 0 al nucleótido 219 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 201 i al nucleótido 218 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 234 al nucleótido 253 15 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 244 al nucleótido 263 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 246 al nucleótido 267 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 247 20 al nucleótido 268 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 250 al nucleótido 267 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 292 al nucleótido 309 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 198 al nucleótido 219 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 202 al nucleótido 219 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 233 al nucleótido 253 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 235 ¡10 al nucleótido 254 i - la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 235 i al nucleótido 253 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 243 al nucleótido 263 15 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 232 al nucleótido 253 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 234 al nucleótido 254 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 242 20 al nucleótido 263 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 233 al nucleótido 254 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 234 al nucleótido 255 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 294 al nucleótido 215 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 247 al nucleótido 266 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 248 al nucleótido 266 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 249 al nucleótido 266 b. iniciadores que reconocen la secuencia del ADN extraño para su uso con iniciadores que reconocen la secuencia flanqueante 5': - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 781 al nucleótido 800 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 301 al nucleótido 320 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 303 al nucleótido 322 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 442 al nucleótido 461 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 444 al nucleótido 463 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. del nucleótido 778 al nucleótido 797 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. del nucleótido 781 al nucleótido 799 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. del nucleótido 788 al nucleótido 807 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. del nucleótido 318 al nucleótido 337 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. del nucleótido 322 al nucleótido 341 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 325 al nucleótido 344 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 329 al nucleótido 348 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 353 al nucleótido 372 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 376 al nucleótido 395 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 378 al nucleótido 397 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 384 al nucleótido 403 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. | 1 del nucleótido 440 al nucleótido 459 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No.

I 1 del nucleótido 442 al nucleótido 460 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 444 al nucleótido 462 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 442 al nucleótido 462 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 10 1 del nucleótido 444 al nucleótido 464 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 1 del nucleótido 449 al nucleótido 468 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 470 al nucleótido 489 15 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 484 al nucleótido 503 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 492 al nucleótido 511 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 i 0 1 del nucleótido 781 al nucleótído 798 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 778 al nucleótido 798 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 781 al nucleótido 802 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 788 al nucleótido 806 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 301 al nucleótido 318 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 303 al nucleótido 320 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 301 al nucleótido 322 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 318 al nucleótido 336 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 318 al nucleótido 338 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 320 al nucleótído 339 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 322 al nucleótido 340 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 322 al nucleótído 342 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 325 al nucleótido 343 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 1 del nucleótido 329 al nucleótido 347 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. i 1 del nucleótido 346 al nucleótido 365 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 348 al nucleótido 367 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 353 al nucleótido 371 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 10 1 del nucleótido 378 al nucleótido 396 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. ' 1 del nucleótido 376 al nucleótido 396 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 382 al nucleótido 400 15 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 382 al nucleótido 401 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 384 al nucleótido 404 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 20 1 del nucleótido 442 al nucleótido 459 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 440 al nucleótido 460 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 444 al nucleótido 461 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 442 al nucleótído 463 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 444 al nucleótido 465 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 469 al nucleótido 488 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 470 al nucleótido 488 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 484 al nucleótido 504 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 490 al nucleótido 509 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 491 al nucleótido 510 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 492 al nucleótido 512 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 561 al nucleótido 580 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 563 al nucleótido 582 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 565 al nucleótido 584 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 568 al nucleótido 587 i 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 572 al nucleótido 591 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 590 al nucleótido 609 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 0 1 del nucleótido 640 al nucleótido 659 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. ' 1 del nucleótido 695 al nucleótido 713 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 782 al nucleótido 799 15 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 778 al nucleótido 799 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 788 al nucleótido 805 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 0 1 del nucleótido 788 al nucleótido 808 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 318 al nucleótido 335 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 315 al nucleótido 336 . - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 320 al nucleótído 338 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. l 1 del nucleótido 318 al nucleótido 339 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 322 al nucleótido 339 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. jI O 1 del nucleótido 320 al nucleótido 340 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No.

I 1 del nucleótido 325 al nucleótido 342 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 322 al nucleótido 343 15 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 329 al nucleótido 346 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 325 al nucleótido 346 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 i0 1 del nucleótido 329 al nucleótido 349 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 346 al nucleótido 364 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 348 al nucleótido 366 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No.

I 1 del nucleótido 346 al nucleótído 366 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 348 al nucleótido 368 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 353 al nucleótido 370 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. ll? 1 del nucleótido 378 al nucleótido 395 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 376 al nucleótido 397 I - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 376 al nucleótido 399 Í5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 384 al nucleótido 401 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 384 al nucleótido 405 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 20 1 del nucleótido 440 al nucleótido 461 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 466 al nucleótido 487 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. I 1 del nucleótido 484 al nucleótido 505 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No.

I 1 del nucleótido 490 al nucleótido 508 i 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 492 al nucleótido 509 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 491 al nucleótido 509 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 0 1 del nucleótido 490 al nucleótido 510 I - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. | 1 del nucleótido 491 al nucleótido 511 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 492 al nucleótido 513 15 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 561 al nucleótido 579 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 561 al nucleótido 581 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 20 1 del nucleótido 563 al nucleótido 581 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 568 al nucleótido 586 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. del nucleótido 572 al nucleótido 590 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 572 al nucleótido 592 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 590 al nucleótido 610 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 596 al nucleótido 613 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 596 al nucleótido 614 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 640 al nucleótido 657 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 640 al nucleótido 658 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 640 al nucleótido 660 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 695 al nucleótido 712 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 696 al nucleótido 713 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 320 al nucleótido 337 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 320 al nucleótido 341 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 329 al nucleótido 350 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. i 1 del nucleótido 346 al nucleótido 363 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 348 al nucleótido 365 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. ¡10 1 del nucleótido 346 al nucleótido 367 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 348 al nucleótido 369 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 354 al nucleótido 371 15 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 382 al nucleótido 403 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 482 al nucleótido 503 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 20 1 del nucleótido 491 al nucleótido 518 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 490 al nucleótido 511 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 491 al nucleótido 512 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. i 1 del nucleótido 563 al nucleótido 580 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No.

I 1 del nucleótido 563 al nucleótido 582 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 565 al nucleótido 582 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 10 1 del nucleótido 563 al nucleótido 584 : - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 568 al nucleótido 585 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 562 al nucleótido 589 15 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 572 al nucleótido 593 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 584 al nucleótido 605 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 20 1 del nucleótido 590 al nucleótido 607 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 590 al nucleótido 611 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. del nucleótido 596 al nucleótido 615 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 599 al nucleótido 618 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 540 al nucleótido 661 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 779 al nucleótido 798 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 788 al nucleótido 809 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 568 al nucleótido 589 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 596 al nucleótido 616 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 599 al nucleótido 619 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 745 al nucleótido 762 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 779 al nucleótido 797 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 779 al nucleótido 799 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 786 al nucleótido 805 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 596 al nucleótido 617 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 599 al nucleótido 620 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 779 al nucleótido 796 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 779 al nucleótido 800 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 786 al nucleótido 804 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 314 al nucleótido 335 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 786 al nucleótído 803 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 786 al nucleótido 806 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 296 al nucleótido 315 c. iniciadores que reconocen la secuencia del ADN extraño para su uso con iniciadores que reconocen la secuencia flanqueante 3': - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1413 al nucleótido 1432 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 721 al nucleótido 740 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 767 al nucleótido 786 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1185 al nucleótido 1204 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1332 al nucleótido 1351 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1413 al nucleótido 1431 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1415 al nucleótido 1433 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 503 al nucleótido 522 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 507 al nucleótido 526 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 721 al nucleótido 739 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 722 al nucleótido 741 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 721 al nucleótído 741 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 770 al nucleótido 789 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 775 al nucleótido 794 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 1135 al nucleótido 1154 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1185 al nucleótido 1202 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1185 al nucleótido 1205 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1191 al nucleótido 1210 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1332 al nucleótido 1350 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1332 al nucleótido 1352 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1413 al nucleótido 1430 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 506 al nucleótido 525 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 507 al nucleótido 525 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 507 al nucleótido 527 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 721 al nucleótido 738 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 722 al nucleótido 740 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 10 2 del nucleótido 721 al nucleótido 742 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 775 al nucleótido 793 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 775 al nucleótido 795 15 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1135 al nucleótido 1153 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 1135 al nucleótido 1155 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. ¡20 2 del nucleótido 1185 al nucleótido 1206 ¡ - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1191 al nucleótido 1209 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. i 2 del nucleótido 1316 al nucleótido 1335 ¡ - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1325 al nucleótido 1344 I 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. i 2 del nucleótido 1332 al nucleótido 1353 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1413 al nucleótido 1434 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. ^0 2 del nucleótido 507 al nucleótido 528 1 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. i 2 del nucleótido 722 al nucleótido 739 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 725 al nucleótído 742 15 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 730 al nucleótido 749 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 770 al nucleótido y787 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 20 2 del nucleótido 770 al nucleótido 791 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 771 al nucleótido 792 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 775 al nucleótido 792 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 775 al nucleótido 796 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1153 al nucleótido y1134 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1135 al nucleótido 1156 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. ¡10 2 del nucleótido 1187 al nucleótido 1206 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1 191 al nucleótido 1208 I - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1191 al nucleótido 1212 ^ 5 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1325 al nucleótido 1343 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1325 al nucleótido 1345 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 20 2 del nucleótido 1367 al nucleótido 1384 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1511 al nucleótido 1528 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 506 al nucleótido 527 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 730 al nucleótido 750 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1187 al nucleótido 1204 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1187 al nucleótido 1205 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1249 al nucleótido 1266 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1325 al nucleótido 1342 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1325 al nucleótido 1346 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 730 al nucleótido 751 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1 187 al nucleótido 1208 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1334 al nucleótido 1353 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1334 al nucleótido 1352 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1334 al nucleótido 1354 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1334 al nucleótido 1351 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 1334 al nucleótido 1355 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 754 al nucleótido 771 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 842 al nucleótido 863 - el complemento de la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 732 al nucleótido 751 - el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 732 al nucleótido 750 d. iniciadores que reconocen la secuencia flanqueante 3': - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 284 al nucleótido 303 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 285 al nucleótido 305 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 289 al nucleótido 308 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 160 al nucleótido 179 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 162 al nucleótido 181 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 283 al nucleótido 303 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 284 al nucleótido 304 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 286 al nucleótido 304 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 287 al nucleótido 306 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 288 al nucleótido 308 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 290 al nucleótido 308 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 394 al nucleótido 413 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 398 al nucleótido 417 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 399 al nucleótido 418 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 400 al nucleótido 418 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 119 al nucleótido 138 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 161 al nucleótido 179 ' 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 161 al nucleótido 181 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 184 al nucleótido 203 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 192 10 al nucleótido 211 I - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 193 1 al nucleótido 212 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 195 al nucleótido 214 15 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 241 al nucleótido 260 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 283 al nucleótido 304 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 286 20 al nucleótido 303 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 286 al nucleótido 306 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 287 al nucleótido 304 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 287 i ! al nucleótido 308 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 288 al nucleótido 306 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 366 al nucleótido 385 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 393 10 al nucleótído 412 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 395 al nucleótido 413 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 398 al nucleótido 418 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 399 al nucleótido 417 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 400 al nucleótido 417 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 401 20 al nucleótido 418 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 430 al nucleótido 449 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 81 al nucleótido 100 I - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 90 i al nucleótido 109 i I 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 159 I al nucleótido 179 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 160 al nucleótido 181 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 185 ¡10 al nucleótido 203 i - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 191 I al nucleótido 211 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 192 al nucleótido 212 15 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 193 al nucleótido 211 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 194 al nucleótido 212 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 194 20 al nucleótido 214 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 196 al nucleótido 215 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 196 al nucleótido 214 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 219 al nucleótido 238 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 240 al nucleótído 260 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 242 al nucleótido 261 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 242 al nucleótido 260 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 275 al nucleótido 294 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 285 al nucleótido 306 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 289 al nucleótido 306 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 315 al nucleótido 334 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 319 al nucleótido 338 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 366 al nucleótido 383 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 372 al nucleótido 391 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 392 al nucleótido 412 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 392 al nucleótido 413 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 394 al nucleótido 412 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 397 al nucleótido 417 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 397 al nucleótido 418 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 424 al nucleótido 443 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 429 al nucleótido 449 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 431 al nucleótido 450 - la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 431 al nucleótido 449 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 439 al nucleótido 458 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 447 al nucleótido 466 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 481 I ¡ al nucleótido 500 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 507 al nucleótído 526 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 79 al nucleótido 96 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 80 ¡10 al nucleótido 100 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 82 al nucleótido 100 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 89 al nucleótido 109 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 91 al nucleótido 109 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 121 al nucleótido 138 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 184 20 al nucleótido 202 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 186 al nucleótido 203 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 190 al nucleótido 211 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 191 al nucleótido 212 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 193 al nucleótido 214 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 194 al nucleótido 211 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 195 ¡ 10 al nucleótido 215 ¡ ; - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 195 ! al nucleótido 212 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 218 al nucleótido 238 15 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 220 al nucleótido 238 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 221 al nucleótido 238 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 239 20 al nucleótido 260 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 241 al nucleótido 261 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 277 al nucleótido 294 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 282 al nucleótido 303 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 314 al nucleótido 334 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 316 al nucleótido 334 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 318 al nucleótido 338 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 320 al nucleótido 338 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 371 al nucleótido 391 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 391 al nucleótido 412 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 395 al nucleótido 412 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 396 al nucleótido 417 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 423 al nucleótido 443 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 430 al nucleótido 450 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 432 al nucleótido 449 - la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 438 al nucleótido 458 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 446 al nucleótido 466 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 448 al nucleótido 466 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 449 al nucleótido 466 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 481 al nucleótido 498 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 481 al nucleótido 499 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 482 al nucleótido 500 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 508 al nucleótido 526 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 79 al nucleótido 100 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 83 al nucleótido 100 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 88 al nucleótido 109 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 92 al nucleótido 109 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 185 al nucleótido 202 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 194 10 al nucleótido 215 I - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 217 I al nucleótido 238 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 240 al nucleótido 261 15 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 241 al nucleótido 262 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 313 al nucleótido 334 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 317 20 al nucleótido 338 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 321 al nucleótido 338 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 370 al nucleótido 391 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 422 al nucleótído 443 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 428 al nucleótido 449 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 429 al nucleótido 450 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 437 al nucleótido 458 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 441 al nucleótido 458 - la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 445 al nucleótido 466 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 482 al nucleótido 499 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 504 al nucleótido 523 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 266 al nucleótído 287 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 446 al nucleótido 465 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 156 al nucleótido 175 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 448 al nucleótido 465 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 155 al nucleótido 175 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 157 al nucleótido 175 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 154 al nucleótido 175 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 312 al nucleótido 329 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 191 al nucleótido 210 - la secuencia de nucleótídos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 190 al nucleótido 210 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 192 al nucleótido 210 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 157 al nucleótido 176 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 189 al nucleótido 210 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 193 al nucleótido 210 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 156 al nucleótido 176 5 - la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 155 al nucleótido 176.

Como se usa en la presente, "la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. Z de la posición X a la posición Y" indica la secuencia de nucleótidos, incluyendo ambos puntos de extremo de los nucleótidos. 10 De preferencia, el fragmento de integración tiene una longitud entre 50 y 500 nucleótidos, más preferiblemente entre 100 y 350 nucleótidos.

¡ Los iniciadores específicos pueden tener una secuencia que sea entre 80 y i 100% idéntica a una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento élite y el ADN extraño del evento élite, respectivamente, siempre que 15 los no apareamientos permitan aún la identificación específica del evento élite con estos iniciadores bajo condiciones de PCR optimizadas. Sin embargo, la gama de no apareamientos permisible puede determinarse fácilmente experimentalmente, y es conocida por los expertos en la técnica.

El siguiente cuadro ejemplifica el tamaño de los amplicones de 20 ADN (o fragmentos de integración) esperados, con pares de iniciadores de PCR seleccionados.

La detección de los fragmentos de integración puede ocurrir en varias formas, por ejemplo, por medio de la estimación del tamaño después de análisis en gel. Los fragmentos de integración pueden ser también secuenciados directamente. Otros métodos específicos de secuencia para la detección de los fragmentos de ADN amplificados, se conocen también en la técnica.

Puesto que la secuencia de los iniciadores y su ubicación relativa en el genoma son únicas para el evento élite, la amplificación del fragmento de integración ocurrirá sólo en muestras biológicas que comprendan el evento élite (el ácido nucleico del mismo). De preferencia, cuando se realice una PCR j 5 para identificar la presencia de A5547-127 en muestras desconocidas, se incluye un control de una serie de iniciadores con el cual un fragmento dentro de un "gen de mantenimiento" de la especie vegetal del evento pueda amplificarse. Los genes de mantenimiento son genes que se expresan en la mayoría de los tipos de células, y los cuales están relacionados con 10 actividades metabólicas básicas comunes a todas las células. De preferencia, el fragmento amplificado del gen de mantenimiento es un fragmento que es más largo que el fragmento de integración amplificado. Dependiendo de las muestras que se analizarán, pueden incluirse otros controles. Protocolos de PCR estándar se describen en la técnica, tal como ¡15 en "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2a. edición, 1999). Las condiciones óptimas para la PCR, incluyendo la secuencia de los iniciadores específicos, se especifican en un "protocolo de identificación por PCR" para cada evento élite. Sin embargo, se entiende que puede ser necesario ajustar muchos parámetros en el protocolo de identificación por 20 PCR a condiciones de laboratorio específicas, y pueden ser modificados ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un método diferente para la preparación de ADN puede requerir el ajuste, por ejemplo, de la cantidad de iniciadores, polimerasa y condiciones de unión usadas. Asimismo, la selección de otros iniciadores puede dictar otras condiciones óptimas para el protocolo de identificación por PCR. Sin embargo, estos ajustes serán evidentes para los expertos en la técnica, y se detallan además en manuales de aplicación de PCR comunes, tales como los citados antepormente. En forma alternativa, pueden usarse iniciadores específicos para amplificar un fragmento de integración que puede usarse como una "sonda específica" para identificar a A5547-127 en muestras biológicas. El contacto del ácido nucleico de una muestra biológica, con la sonda, bajo condiciones que permitan la hibridación de la sonda con su fragmento correspondiente en el ácido nucleico, resulta en la formación de un híbrido de ácido nucleico/sonda. La formación de este híbrido puede detectarse (por ejemplo, marcando el ácido nucleico o sonda), por lo cual la formación de este híbrido indica la presencia de A5547-127. Dichos métodos de identificación basados en hibridación con una sonda específica (ya sea sobre un vehículo de fase sólida o en solución), se han descpto en la técnica. La sonda específica es de preferencia una sonda que, bajo condiciones optimizadas, hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento élite, y también de preferencia comprende parte del ADN extraño contiguo con la misma (referida en lo sucesivo como "región específica"). De preferencia, la sonda específica comprende una secuencia entre 50 y 500 pb, de preferencia de 100 a 350 pb, que es por lo menos 80%, de preferencia entre 80 y 85%, más preferiblemente entre 85 y 90%, especialmente de preferencia entre 90 y 95%, más preferiblemente entre 95% y 100% idéntica (o complementaria), a la secuencia de nucleótidos de una región específica. De preferencia, la sonda específica comprenderá una secuencia de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleótidos contiguos idénticos (o complementarios) a una región específica del evento élite. Un "equipo", como se usa en la presente, se refiere a una serie de reactivos para el propósito de llevar a cabo el método de la invención, más particularmente, la identificación del evento élite A5547-127 en muestras biológicas. Más particularmente, una modalidad preferida del equipo de la invención comprende por lo menos uno o dos iniciadores específicos, como se describió anteriormente. Opcionalmente, el equipo puede comprender además cualquier otro reactivo descrito en la presente en el protocolo de identificación por PCR. En forma alternativa, de conformidad con otra modalidad de esta invención, el equipo puede comprender una sonda específica, como se describió anteriormente, que hibrida específicamente con el ácido nucleico de muestras biológicas para identificar la presencia de A5547-127 en las mismas. Opcionalmente, el equipo puede comprender además cualquier otro reactivo (tal como, pero no limitado a, regulador de pH de hibridación, marca) para la identificación de A5547-127 en muestras biológicas, usando la sonda específica. El equipo de la invención puede usarse, y sus componentes pueden ajustarse específicamente, para propósitos de control de calidad (por ejemplo, pureza de lotes de semilla), detección del evento élite en materia vegetal o material que comprenda o se derive de materia vegetal tal como, pero no limitada a, productos alimenticios o forrajeros. Como se usa en la presente, el término "identidad de secuencia" con respecto a secuencias de nucleótidos (ADN o ARN), se refiere al número de posiciones con nucleótidos idénticos, dividido entre el número de nucleótidos en la más corta de las dos secuencias. La alineación de las dos secuencias de nucleótidos se lleva a cabo mediante el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 726), usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalización de espacio de 4. El análisis asistido por computadora y la interpretación de los datos de secuencia, incluyendo la alineación de secuencias como se describió anteriormente, pueden llevarse a cabo convenientemente, por ejemplo, usando los programas de la serie de Intelligenetics™ (Intellígenetics Inc., CA), o el paquete de software de análisis de secuencia de Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin, Biotechnology Center). Las secuencias se indican como "esencialmente similares", cuando dichas secuencias tienen una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 75%, en particular por lo menos aproximadamente 80%, más particularmente por lo menos aproximadamente 85%, muy particularmente aproximadamente 90%, especialmente aproximadamente 95%, más especialmente aproximadamente 100%. Es claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con secuencias de ADN, se considera que la timidina (T) en la secuencia de ADN es igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. El término "iniciador", como se usa en la presente, abarca cualquier ácido nucleico que sea capaz de iniciar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un procedimiento dependiente del molde, tal como PCR. Típicamente, los iniciadores son oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos, pero pueden usarse secuencias más largas. Los iniciadores pueden proveerse en forma de doble cadena, aunque se prefiere la forma de cadena sencilla. Las sondas pueden usarse como iniciadores, pero están diseñadas para unirse al ADN o ARN objetivo, y no necesitan usarse en un procedimiento de amplificación. El término "reconocimiento", como se usa en la presente, cuando se hace referencia a iniciadores específicos, se refiere al hecho de que los iniciadores específicos hibridan específicamente con una secuencia de ácido nucleico en el evento élite bajo las condiciones expuestas en el método (tales como las condiciones del protocolo de identificación por PCR), por medio del cual se determina el carácter específico mediante la presencia de controles positivos y negativos. El término "hibridación", como se usa en la presente cuando se hace referencia a sondas específicas, se refiere al hecho de que la sonda se une a una región específica en la secuencia de ácido nucleico del evento élite bajo condiciones de severidad estándar. El término condiciones de severidad estándar, como se usa en la presente, se refiere a las condiciones para hibridación descritas en la presente, o a las condiciones de hibridación convencionales descritas por Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por ejemplo, pueden comprender los siguientes pasos: 1 ) inmovilización de fragmentos de ADN genómico de la planta sobre un filtro, 2) prehibridación del filtro por 1 a 2 horas a 42°C en formamida a 50%, 5X SSPE, 2X reactivo de Denhardt y SDS a 0.1 %, o por 1 a 2 horas a 68°C en 6X SSC, 2X reactivo de Denhardt y SDS a 0.1 %, 3) adición de la sonda de hibridación que ha sido marcada, 4) incubación por 16 a 24 horas, 5) lavado del filtro por 20 minutos a temperatura ambiente en 1X SSC, SDS a 0.1 %, 6) lavado del filtro tres veces por 20 minutos, cada vez a 68°C en 0.2 X SSC, SDS a 0.1 %, y 7) exposición del filtro por 24 a 48 horas a película de rayos X a -70°C con una pantalla de intensificación. Como se usa en la presente, una muestra biológica es una muestra de una planta, materia vegetal o productos que comprendan materia vegetal. Se pretende que el término "planta" abarque tejidos de la planta de soya (Glicyne max) en cualquier etapa de madurez, así como cualquier célula, tejido u órgano tomado de, o derivado de, dicha planta incluyendo, sin limitación, cualquiera de semillas, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametos, cultivos de células, cultivos de tejidos o protoplastos. El término "materia vegetal", como se usa en la presente, se refiere a material que se obtiene o se deriva de una planta. Los productos que comprenden materia vegetal se refieren a alimento, forraje u otros productos que se producen usando materia vegetal, o que pueden ser contaminados por materia vegetal. Se entiende que, en el contexto de la presente invención, dichas muestras biológicas se ponen a prueba para la presencia de ácidos nucleicos específicos para A5547-127, implicando la presencia de ácidos i 5 nucleicos en las muestras. De esta manera, los métodos referidos en la presente para identificar al evento élite A5547-127 en muestras biológicas, se refieren a la identificación, en muestras biológicas, de ácidos nucleicos que comprenden el evento élite. i Como se usa en la presente, se interpretará que el término "que ¡10 comprende" especifica la presencia de las características, enteros, pasos, i reactivos o componentes establecidos referidos, pero no excluye la presencia I o adición de uno o más de características, enteros, pasos o componentes, o grupos de los mismos. De esta manera, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprenda una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede 15 comprender más nucleótidos o aminoácidos que los realmente citados, es decir, incluidos en una proteína o ácido nucleico más largo. Un gen quimérico que comprenda una secuencia de ADN que esté funcionalmente o estructuralmente definida, puede comprender secuencias de ADN adicionales, etc. 20 La presente invención se refiere también al desarrollo de un evento élite A5547-127 en la soya para las plantas que comprenden este evento, la progenie obtenida de estas plantas, y para las células vegetales o materia vegetal derivadas de este evento. Las plantas que comprenden el evento élite A5547-127, se obtuvieron enteramente como se describe en el ejemplo 1. Plantas de soya o materia vegetal que comprendan A5547-127, pueden identificarse de acuerdo al protocolo de identificación por PCR descrito para A5547-127 en el ejemplo 2. En resumen, ADN genómico de soya presente en la muestra biológica se amplifica por PCR usando un iniciador que reconozca específicamente una secuencia dentro de la secuencia flanqueante 5' o 3' de A5547-127, tal como el iniciador con la secuencia de SEQ ID No. 15, y un iniciador que reconozca una secuencia en el ADN extraño, tal como el iniciador con la secuencia de SEQ ID No. 13. Iniciadores de ADN que amplifican parte de una secuencia endógena de soya, se usan como control positivo para la amplificación por PCR. Si tras la amplificación por PCR, el material da un fragmento del tamaño esperado, el material contiene materia vegetal de una planta de soya que alberga al evento élite A5547-127. Las plantas que albergan a A5547-127 se caracterizan por su tolerancia al glufosinato, que en el contexto de la presente invención, incluyen aquellas plantas que son tolerantes al herbicida Liberty™. La tolerancia a Liberty™ puede ponerse a prueba en diferentes formas. El método del disco foliar como se describe en la presente, es más útil cuando se requiere discriminación entre plantas resistentes y sensibles, sin que se destruyan las plantas sensibles. En forma alternativa, puede ponerse a prueba la tolerancia mediante la aplicación de Liberty™ por pulverización. Los tratamientos de pulverización deben realizarse entre las etapas foliares V3 y V4 para mejores resultados. Las plantas tolerantes se caracterizan por el hecho de que la pulverización de las plantas con por lo menos 200 g de ingrediente activo/hectárea, de preferencia 400 g de ingrediente activo/hectárea, y posiblemente hasta 1600 g de ingrediente activo/hectárea (4X el régimen de campo normal), no destruye a las plantas. Debe practicarse una aplicación al voleo a un régimen de 739.52 g a 963.56 g de Liberty™. Es mejor aplicar a un volumen de 75.7 litros de agua por 4,046 m2 usando una boquilla tipo ventilador plano, mientras se tiene cuidado de no dirigir las aplicaciones por pulverización directamente en el verticilo de las plantas para evitar que el agente tensioactivo queme las hojas. El efecto herbicida debe aparecer dentro de 48 horas, y es claramente visible dentro de 5 a 7 días. Las plantas que albergan a A5547-127 pueden caracterizarse además por la presencia, en sus células, de fosfinotricína acetil transferasa, según se determina mediante una prueba de PAT (De Block et al., 1987). Las plantas que albergan a A5547-127 se caracterizan también porque tienen características agronómicas que son comparables a las variedades de soya disponibles comercialmente en los Estados Unidos, en ausencia de presión por malas hierbas y el uso de Liberty™ para el control de malas hierbas. Se ha observado que la presencia de un ADN extraño en la región de inserción del genoma de la planta de soya descrita en la presente, confiere características fenotípicas y moleculares particularmente interesantes a las plantas que comprenden este evento. Más específicamente, la presencia del ADN extraño en esta región particular en el genoma de estas plantas, resulta en plantas que exhiben una expresión fenotípica estable del gen de interés sin que comprometa significativamente algún aspecto del desempeño agronómico deseado de las plantas. Los siguientes ejemplos describen la identificación del desarrollo de herramientas para la identificación del evento élite A5547-127 en muestras biológicas. A menos que se indique de otra manera, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo a protocolos estándar como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY, y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel ef al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiales y métodos estándar para trabajo molecular en plantas, se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) pro R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. En la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias: SEQ ID No. 1 : secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 5' de A5547-127 SEQ ID No. 2: secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 3' de A5547-127 SEQ ID No. 3: iniciador HCA150 SEQ ID No. 4: iniciador DPA013 SEQ ID No. 5: iniciador DPA228 SEQ ID No. 6: iniciador KVM173 SEQ ID No. 7: iniciador YTP228 5 SEQ ID No. 8: iniciador YTP220 SEQ ID No. 9: iniciador DPA024 SEQ ID No. 10: iniciador YTP245 SEQ ID No. 11 : iniciador YTP170 SEQ ID No. 12: iniciador YTP227 llO SEQ ID No. 13: iniciador MDB688 i SEQ ID No. 14: iniciador KVM175 SEQ ID No. 15: iniciador MDB687 SEQ ID No. 16: iniciador SMO022 SEQ ID No. 17: iniciador SMO024 15 SEQ ID No. 18: iniciador 1 para la amplificación del fragmento de control SEQ ID No. 19: iniciador 2 para la amplificación del fragmento de control.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 20 Los siguientes ejemplos, no destinados para limitar la invención a las modalidades específicas descritas, pueden entenderse en conjunto con las figuras acompañantes, incorporadas en la presente como referencia, en las cuales: La figura 1 es una representación esquemática de la relación entre las secuencias de nucleótidos citadas y los iniciadores. Barra negra: ADN extraño; barra clara: ADN de origen de la planta; las figuras bajo las barras representan las posiciones de los nucleótidos; (c) se refiere al complemento de la secuencia de nucleótidos indicada. La figura 2 representa el protocolo de identificación por PCR desarrollado para A5547-127. Secuencia de carga del gel: campo 1 : muestra de ADN de plantas de soya que comprenden el evento transgénico A5547-127; campo 2: muestra de ADN de una planta de soya transgénica que no comprende el evento élite A5547-127; campo 3: muestras de ADN control de plantas de soya de tipo silvestre; campo 4: sin control de molde; campo 5: marcador de peso molecular.

EJEMPLOS 1. Identificación de las regiones flanqueantes del evento élite A5547-127 Se desarrolló soya resistente a herbicidas, mediante la transformación de la soya con un vector que comprendía la secuencia codificante de un gen pat que codifica para la enzima fosfinotricina acetil transferasa, bajo el control del promotor 35S constitutivo del virus del mosaico de la coliflor. Se seleccionó el evento élite A5547-127 con base en un procedimiento de selección extensivo basado en buena expresión y estabilidad del gen de resistencia a herbicidas, y su compatibilidad con características agronómicas óptimas. La secuencia de las regiones que flanquean al ADN extraño en el evento A5547-127, se determinó usando el método de PCR entrelazado asimétrico térmico (TAIL-) descrito por Liu et al. (1995, Plant J. 8(3): 457-463). Este método usa tres iniciadores anidados en reacciones sucesivas junto con un iniciador degenerado arbitrario más corto, de modo que las eficiencias de amplificación relativas de productos específicos y no específicos, pueden controlarse térmicamente. Los iniciadores específicos se seleccionaron para unión al borde del ADN extraño, y con base en sus condiciones de unión. Una pequeña cantidad (5 µl) de productos de PCR no purificados, secundarios y terciarios, se analizó sobre un gel de agarosa a 1 %. El producto de PCR terciario se usó para amplificación preparativa, se purificó, y se secuenció en un secuenciador automatizado usando el equipo con ciclo de terminador DyeDeoxy. 1.1. Región flanqueante derecha (5') El fragmento identificado que comprende la región flanqueante 5' obtenida mediante el método de PCR-TAIL, fue completamente secuenciado (SEQ ID No. 1 ). La secuencia entre los nucleótidos 1 y 311 corresponde al ADN de la planta, mientras que la secuencia entre los nucleótidos 312 y 810 corresponde al ADN extraño. 1.2. Región flanqueante izquierda (3') El fragmento identificado que comprende la región flanqueante 3' obtenida mediante el método de PCR-TAIL, fue completamente secuenciado (SEQ ID No. 2). La secuencia entre los nucleótidos 1 y 509 corresponde al ADN extraño, mientras que la secuencia entre los nucleótidos 510 y 1880 corresponde al ADN de la planta. 2. Desarrollo de un protocolo de identificación por reacción en cadena de polimerasa 2.1. Iniciadores Se desarrollaron iniciadores específicos que reconocen secuencias dentro del evento élite. Más particularmente, se desarrolló un iniciador que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de A5547-127. Se seleccionó entonces un segundo iniciador dentro de la secuencia del ADN extraño, de modo que los iniciadores abarcaran una secuencia de aproximadamente 150 nucleótidos. Se encontró que los siguientes iniciadores dan resultados particularmente claros y reproducibles en una reacción de PCR en el ADN de A5547-127: MDB687: 5'-TgT.ggT.TAT.ggCggT.gCC.ATC-3' (SEQ ID No. 15) (objetivo: ADN de la planta) MDB688: 5'-TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT.gTC-3' (SEQ ID No. 13) (objetivo: ADN de la inserción) Iniciadores que eligen como objetivo una secuencia endógena, se incluyen de preferencia en el coctel de PCR. Estos iniciadores sirven como un control interno en muestras desconocidas y en el control positivo de ADN. Un resultado positivo con el par de iniciadores endógenos, demuestra que existe ADN de calidad adecuada en la preparación del ADN genómíco para un producto de PCR que se va a generar. Los iniciadores endógenos se seleccionaron para reconocer un gen de mantenimiento en Glicyne max: SOY01 : 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' (SEQ ID No. 20) (localizado en el gen 1 de actina de Glycine max (acceso J01298)) SOY02: 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3' (SEQ ID No. 21 ) (localizado en el gen 1 de actina de Glicyne max (acceso J01298)) 2.2. Fragmentos amplificados Los fragmentos amplificados esperados en la reacción de PCR, son: Para el par de iniciadores SOY01-SOY02: 413 pb (control endógeno) Para el par de iniciadores MDB688-MDB687: 151 pb (evento élite A5547-127) 2.3. ADN molde Se preparó ADN molde a partir de un disco foliar de acuerdo a Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991 ). Cuando se usa ADN preparado con otros métodos, debe hacerse una prueba que use diferentes cantidades de molde. Usualmente, 50 ng de ADN molde genómico dan los mejores resultados. 2.4. Controles positivos y negativos asignados Para evitar falsos positivos o negativos, se determinó que los siguientes controles positivos y negativos deben incluirse en una prueba de PCR: - Control de mezcla maestra (control negativo de ADN). Esta es una PCR en la cual no se añade ADN a la reacción. Cuando se observa el resultado esperado, falta de productos de PCR, esto indica que el coctel de PCR no fue contaminado con ADN objetivo. - Un control positivo de ADN (muestra de ADN genómico, que se sabe contiene a las secuencias transgénicas). La amplificación exitosa de este control positivo, demuestra que la PCR se llevó a cabo bajo condiciones que permiten la amplificación de las secuencias objetivo. - Un control de ADN de tipo silvestre. Esta es una PCR en la cual el ADN molde provisto es ADN genómico preparado a partir de una planta no transgéníca. Cuando se observa el resultado esperado, falta de amplificación de un producto de PCR del transgen, pero amplificación del producto de PCR endógeno, esto indica que no existe amplificación detectable de la base del transgen en una muestra de ADN genómico. 2.5. Condiciones de PCR Se obtuvieron resultados óptimos bajo las siguientes condiciones: - La mezcla de PCR para reacciones de 25 µl contiene: 2.5 µl de ADN de molde 2.5 µl de 10x regulador de pH de amplificación (provisto con ADN polimerasa de Thermus aquaticus) 0.5 µl de dNTP's a 10 mM 0.5 µl de MDB688 (10 pmoles/µl) 0.5 µl de MDB687 (10 pmoles/µl) 0.25 µl de SOY01 (10 pmoles/µl) 0.25 µl de SOY02 (10 pmoles/µl) 0.1 µl de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (5 unidades/µl) agua hasta 25 µl - el perfil de termociclización que se seguirá para resultados óptimos, es el siguiente: 4 minutos a 95°C Seguido de: 1 minuto a 95°C 1 minuto a 57°C 2 minutos a 72°C por 5 ciclos Seguido de: 30 segundos a 92°C 30 segundos a 57°C 1 minuto a 72°C por 25 ciclos Seguido de: 5 minutos a 72°C 2.6. Análisis sobre gel de agarosa Para visualizar óptimamente los resultados de la PCR, se determinó que deben aplicarse entre 10 y 20 µl de las muestras de PCR sobre un gel de agarosa a 1.5% (regulador de pH de borato-Tris), con un marcador de peso molecular adecuado (por ejemplo, escala de 100 pb, PHARMACIA). 2.7. Validación de los resultados Se determinó que los datos de muestras de ADN de plantas transgénicas dentro de una prueba de PCR individual y un coctel de PCR individual no deben ser aceptables, a menos que 1 ) el control positivo de ADN muestre los productos de PCR esperados (fragmentos transgénicos y endógenos), 2) el control negativo de ADN sea negativo para la amplificación por PCR (sin fragmentos), y 3) y el control de ADN de tipo silvestre muestre el resultado esperado (amplificación del fragmento endógeno). Cuando se sigue el protocolo de identificación por PCR para A5547-127 como se describió anteriormente, los campos que muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgénicos y endógenos de los tamaños esperados, indican que la planta correspondiente de la cual se preparó el ADN molde genómico, ha heredado el evento élite A5547-127. Los campos que no muestren cantidades visibles de los productos de PCR transgénicos y que muestren cantidades visibles del producto de PCR endógeno, indican que la planta correspondiente de la cual el ADN molde genómico se preparó, no comprende el evento élite. Los campos que no muestren cantidades visibles de los productos de PCR endógenos y transgénicos, indican que la calidad y/o cantidad del ADN genómico no permitió que se generara un producto de PCR. Estas plantas no pueden evaluarse. La preparación de ADN genómico debe repetirse, y tiene que llevarse a cabo una nueva prueba de PCR, con los controles adecuados. 2.8. Uso del protocolo de PCR discriminante para identificar a A5547-127 Antes de que se intente seleccionar materiales desconocidos, tiene que llevarse a cabo una prueba con todos los controles adecuados. El protocolo desarrollado podría requerir optímización para componentes que pueden diferir entre los laboratorios (preparación del ADN molde, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, calidad de los iniciadores, dNTP's, temociclizador, etc.). La amplificación de la secuencia endógena desempeña una función clave en el protocolo. Tienen que lograrse condiciones de PCR y de termociclización que amplifiquen cantidades equimolares de la secuencia endógena y transgénica en un molde de ADN genómico transgénico conocido.

Siempre que el fragmento endógeno elegido como objetivo no sea amplificado, o siempre que las secuencias elegidas como objetivo no sean amplificadas con las mismas intensidades de tinción con bromuro de etidio, según se juzga mediante electroforesis en gel de agarosa, puede requerirse la optimización de las condiciones de PCR. Material foliar de Glycine max de muchas plantas, algunas de las cuales comprendían A5547-127, se puso a prueba de acuerdo al protocolo descrito anteriormente. Muestras del evento élite A5547-127 y de Glycine max de tipo silvestre, se consideraron como los controles positivo y negativo, respectivamente. La figura 2 ilustra el resultado obtenido con el protocolo de identificación por PCR del evento élite para A5547-127 en muchas muestras de plantas de soya (campos 1 a 14). Se encontró que las muestras en el campo 1 contienen el evento élite conforme se detecta la banda de 185 pb, mientras que las muestras en los campos 2, 3 y 4 no comprenden A5547-127. El campo 2 comprende otro evento élite de soya, el campo 3 representa un control de Glycine max no transgénico; el campo 4 representa la muestra de control negativo (agua), y el campo 5 representa el marcador de peso molecular (100 pb). 3. Uso de un fragmento de integración específico como una sonda para la detección de material que comprende A5547-127 Un fragmento de integración específico de A5547-127 se obtiene mediante amplificación por PCR, usando los iniciadores específicos MDB687 (SEQ ID No. 15) y MDB688 (SEQ ID No. 13), o mediante síntesis química, y es marcado entonces. Este fragmento de integración se usa como una sonda específica para la detección de A5547-127 en muestras biológicas. Se extrae ácido nucleico de las muestras de acuerdo a procedimientos estándar. Este ácido nucleico se pone en contacto entonces con la sonda específica bajo condiciones de hibridación que son optimizadas para permitir la formación de un híbrido. La formación del híbrido se detecta entonces para indicar la presencia de ácido nucleico de A5547-127 en la muestra. Opcionalmente, el ácido nucleico en las muestras se amplifica usando los iniciadores específicos antes de su puesta en contacto con la sonda específica. En forma alternativa, el ácido nucleico es marcado antes del contacto con la sonda específica en lugar del fragmento de integración. Opcionalmente, la sonda específica es unida a un vehículo sólido (tal como, pero no limitado a, un filtro, tira o perlas), antes del contacto con las muestras.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para identificar el evento élite A5547-127 en muestras biológicas, cuyo método comprende la detección de una región específica de A5547-127 con una sonda o iniciador específico que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' de A5547-127. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho método comprende amplificar un fragmento de ADN entre 100 y 500 pb a partir de un ácido nucleico presente en dichas muestras biológicas usando una reacción en cadena de polímerasa con por lo menos dos iniciadores, uno de dichos iniciadores reconociendo la región flanqueante 5' de A5547-127, dicha región flanqueante 5' teniendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o la región flanqueante 3' de A5547-127, dicha región flanqueante 3' teniendo la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880, el otro iniciador de dichos iniciadores reconociendo una secuencia dentro del ADN extraño que tiene la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 1 del nucleótido 312 al nucleótido 810, o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho iniciador que reconoce la región flanqueante 5' consiste de una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de ! SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 , o dicho iniciador que 5 reconoce la región flanqueante 3' de A5547-127 consiste de una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880, y dicho iniciador reconociendo una secuencia dentro del ADN extraño que consiste de 17 a 200 nucleótidos consecutivos I i 10 seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 1 del nucleótido 312 al nucleótido 810, o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótído 510 al nucleótido 1880. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho iniciador que reconoce la región 15 flanqueante 5' comprende en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 , o dicho iniciador que reconoce la región flanqueante 3' de A5547-127 comprende en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos 20 consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880, y dicho iniciador que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño comprende en su extremo 3' por lo menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 1 del nucleótido 312 al nucleótido 810, o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dichos iniciadores comprenden la secuencia de SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 15, respectivamente. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el método comprende amplificar un fragmento de aproximadamente 151 pb usando el protocolo de identificación de A5547-127. 7 '.- Un equipo para identificar el evento élite A5547-127 en muestras biológicas, dicho equipo comprendiendo un iniciador que reconoce la región flanqueante 5' de A5547-127, dicha región flanqueante 5' teniendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 , o un iniciador que reconoce la región flanqueante 3' de A5547-127, dicha región flanqueante 3' teniendo la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880, y un iniciador que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño, dicho ADN extraño teniendo la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 1 del nucleótido 312 al nucleótido 810, o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880. 8.- El equipo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho iniciador que reconoce la región flanqueante 5' consiste de una secuencia de nucleótídos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 a nucleótido 311 , o dicho iniciador que reconoce la región flanqueante 3' de A5547-127 consiste de una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótído 510 al nucleótido 1880, y dicho iniciador que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño consiste de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 1 del nucleótido 312 al nucleótido 810, o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880. 9 - El equipo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho iniciador que reconoce la región flanqueante 5' comprende en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótído 1 al nucleótido 311 , o dicho iniciador que reconoce la región flanqueante 3' de A5547-127 comprende en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótídos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótídos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótído 510 al nucleótido 1880, y dicho iniciador que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño comprende en su extremo 3' por lo menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 1 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880. 10.- El equipo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende un iniciador que consiste de la secuencia de SEQ ID No. 13 y un iniciador que consiste de la secuencia de SEQ ID No. 15. 11.- Un iniciador para su uso en un protocolo de identificación por PCR de A5547-127 que tiene una secuencia que, bajo condiciones de PCR optimizadas, reconoce específicamente una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' de A5547-127, dicha región flanqueante 5' teniendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 , y dicha región flanqueante 3' teniendo la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880. 12.- El iniciador de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho iniciador consiste de una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 , o una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880. 13.- El iniciador de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho iniciador comprende en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 del nucleótido 1 al nucleótido 311 , o una secuencia de nucleótidos de por lo menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de SEQ ID No. 2 del nucleótido 510 al nucleótido 1880. 14.- Un iniciador que comprende en su extremo 3' la secuencia de SEQ ID No. 13. 15.- Un iniciador que comprende en su extremo 3' la secuencia de SEQ ID No. 15. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende hibridar un ácido nucleico de muestras biológicas con una sonda específica para A5547-127. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la secuencia de dicha sonda específica tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia flanqueante 5' o la secuencia flanqueante 3' de A5547-127, y la secuencia del ADN extraño contiguo con la misma. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la secuencia de dicha sonda específica tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 1 del nucleótido 260 a 360, o SEQ ID No. 2 del nucleótido 460 a 560, o el complemento de dichas secuencias. 19.- Un equipo para identificar el evento élite A5547-127 en muestras biológicas, dicho equipo comprendiendo una sonda específica capaz ! de hibridar específicamente con una región específica de A5547-127. 20.- El equipo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la secuencia de dicha sonda específica tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que 5 comprende parte de la secuencia flanqueante 5' o la secuencia flanqueante 3' de A5547-127, y la secuencia del ADN extraño contiguo con la misma. 21.- El equipo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la secuencia de dicha sonda específica tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 1 del nucleótído 110 260 a 360, o SEQ ID No. 2 del nucleótido 460 a 560, o el complemento de dichas secuencias. 22.- Una sonda específica para la identificación del evento élite I A5547-127 en muestras biológicas. 23.- La sonda de conformidad con la reivindicación 22, 15 caracterizada además porque tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia flanqueante 5' o la secuencia flanqueante 3' de A5547-127, y la secuencia del ADN extraño contigua con la misma, o el complemento de la misma. 24.- La sonda de conformidad con la reivindicación 23, 20 caracterizada además porque tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 1 del nucleótido 260 a 360, o SEQ ID No. 2 del nucleótido 460 a 560, o el complemento de dichas secuencias. 25.- Una sonda específica para la identificación del evento élite A5547-127 en muestras biológicas, la secuencia siendo esencialmente similar a SEQ ID No. 1 del nucleótido 260 a 360, o SEQ ID No. 2 del nucleótido 460 a 560, o el complemento de dichas secuencias. 26.- Un método para confirmar la pureza de la semilla, cuyo método comprende la detección de una región específica de A5547-127 con una sonda o iniciador específico que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' de A5547-127, en muestras de semilla. 27.- Un método para seleccionar semillas para la presencia de A5547-127, cuyo método comprende la detección de una región específica de A5547-127 con una sonda o iniciador específico que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' de A5547-127, en muestras de lotes de semilla. 28.- Una planta de soya, o células, partes, semilla o progenie de la misma, que comprende el evento élite A5547-127 en su genoma.