KR20140135576A

KR20140135576A - 유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 이를 이용한 분석 방법 및 검정용 키트

Info

Publication number: KR20140135576A
Application number: KR20130056073A
Authority: KR
Inventors: 김형하; 김우정; 이수경; 서정근
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2014-11-26
Also published as: US20160138102A1; WO2014185741A1; US9562267B2

Abstract

본 발명은 유전자변형 식물체의 검정을 위한 표준 플라스미드 및 표준 플라스미드를 이용한 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법 및 표준 플라스미드를 포함한 유전자변형 식물체 정량 분석용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의한 표준 플라스미드는 EPSPS 유전자를 함유한 유전체의 검정에 활용이 가능하며, 특히 대두 RRS와 같은 품종에 대한 혼입여부 또는 혼입률을 분석할 수 있는 표준물질로서 매우 유용하다.

Description

유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 이를 이용한 분석 방법 및 검정용 키트{Standard Plasmid for Detection of Genetically Modified Organism, Qualitative detection method using the same and Detection Kit comprising the same}

본 발명은 유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 특히 EPSPS 유전자를 함유하고 있는 유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 표준 플라스미드를 이용한 유전자 변형체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법 및 상기 표준 플라스미드를 포함한 유전자 변형체 검정용 키트에 관한 것이다.

유전자변형 식품은 GMO(Genetically Modified Organism, 유전자 변형체)에서 유래한 식품 산물로 식품의 저장수명, 영양소 함량, 색상, 풍미, 식감을 향상시키고자 하는 최신 기술의 산물이다. GMO란 기존의 작물육종에 의한 품종 개발과는 달리, 동식물 또는 미생물의 유용 유전자를 인공적으로 분리, 결합시켜 생산성이 증가되도록 한 생물체를 총칭하는 것으로, 즉 전통적인 교배나 자연적인 재조합을 통해서가 아니라 현대 생명공학 기술을 이용하여 기준 생물체의 유전물질에 외부 유래 유전자를 삽입함으로써 새로운 유전형질을 획득하게 된 생물체를 말한다. 그리고 유전자재조합 식품은 이러한 유전자 변형체를 원료로 제조된 식품을 말한다. 일반적으로 유전자변형 농산물의 생산성을 증가시키기 위하여 제초제 저항성, 내충성, 내병성, 내한성 등에 관련된 유전자를 농산물에 도입하고 있다. 오늘날 시장에는 많은 GMO 식품이 유통되고 있으며, 그 중 높은 비중을 차지하는 것은‘대두(soybean)’이며, 그 외에도 옥수수, 파파야, 호박 등 종류가 다양하다. 한편, 현재 GMO의 인체 유해성 관련 논란이 있어 전 세계적으로 GMO에 대한 소비자와 농민들의 우려가 높아지고 있다. 이에 따라 유전자변형 작물의 상업화를 위해서는 환경 위해성, 인체 및 식품안정성 평가가 요구되고 있으며, 유전자변형 농산물을 수입하는 관련 국가에서는 GMO 의무 표시제를 포함한 규제제도를 수립하고 있다. 우리나라의 경우 유전자변형 식물이 3%이상 혼입된 경우 유전자변형 식물이라고 표기하도록 하는 표시제를 시행하고 있고, 다른 나라들도 혼입허용치의 차이는 있으나 비슷한 실정이다. 따라서 GMO의 혼입 여부를 측정하는 정성적인 분석법 이외에도, 혼입률을 정량적으로 측정하는 정확한 분석기술을 필요로 하는 실정이다.

GMO의 정량 분석법은 크게 단백질 분석법과 DNA 분석법 두 가지로 분류된다. 일반적으로 유전자변형 식물에 도입된 유전자로부터 발현되는 단백질을 대상으로 하는 ELISA법은 검출강도가 PCR법에 비해 떨어지며 열처리 등으로 단백질의 변성이 생길 수 있어 한계가 있다. 이에 유전자의 증폭과 함께 증폭산물의 양을 정량적으로 모니터링해주는 실시간 PCR(Real-Time PCR)법을 이용하여 유전자변형 식물에 도입된 유전자를 정량하는 기술이 현재 주로 이용되고 있다. 정성 PCR에 필요한 프라이머 세트 외에도 형광 프로브(probe)를 사용하고 CRM(인증표준물질)이나 표준 플라스미드를 표준물질로 사용하여 실시간 PCR법으로 표준물질에 대하여 내재유전자와 외래유전자의 비율로서 데이터를 얻을 수 있다.

유전자변형 식물의 혼입허용치에 대한 정확하고 정밀한 분석을 위해서는 무엇보다 분석에 사용한 표준물질이 매우 중요하다. 현재 우리나라는 GMO 콩을 재배 생산하여 유통하지는 않지만, 정부 발표에 따르면, 2008년 전체 콩 수입량의 77%인 93만2천톤의 GM 콩(식용)이 수입되었다. GMO 콩의 용도는 기름이나 단백질을 추출하여 식품원료로서 이용된다. 주로 콩 단백이 빵, 과자, 식육가공품, 이유식, 영양보충제 등에 이용되고, 콩 섬유질이 밀빵, 시리얼, 스낵 가공품에 이용되며, 콩기름은 샐러드유, 샐러드 드레싱, 쇼트닝 및 가공식품의 원료 등에 다양하게 쓰인다. 이렇게 우리 생활에 다양하게 사용되고 있는 콩에 대해 GMO 표시제가 엄격하게 시행되어져야 하는 요구는 당연한 것이며, 그에 따라 유전자변형 생물체의 혼입률을 정확하게 검출할 수 있는 표준물질의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한국공개특허공보 제10-2006-0048402호 (공개일 2005.05.18) 한국공개특허공보 제10-2012-0089971호 (공개일 2012.08.16)

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로,

본 발명의 목적은 유전자 변형체, 특히 EPSPS 유전자를 함유한 유전자 변형체의 검정용 표준 플라스미드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 표준 플라스미드를 이용하는 유전자 변형체의 정량 분석방법, 특히 EPSPS 유전자를 함유한 유전자 변형체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 표준 플라스미드를 포함하는 유전자 변형체 검정용 키트, 특히 EPSPS 유전자를 포함한 유전자 변형체 검정용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 표준 플라스미드로부터 발현되는 단백질을 포함하는 유전자 변형체 검정용 키트, 특히 EPSPS 유전자를 포함한 유전자 변형체 검정용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Lectin 유전자와 EPSPS 유전자를 포함하는 유전자 변형체의 검정용 표준 플라스미드를 제공한다.

본 발명의 일구체예는 상기 EPSPS 유전자가 5′ 영역의 인접서열(5′ flanking sequence) 및 3′ 영역의 인접서열(3′ flanking sequence)을 포함하는 것이 특징인 유전자변형 식물체의 검정용 표준 플라스미드를 제공한다.

상기 표준 플라스미드에 포함되는 EPSPS 유전자는 바람직하게 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있으며, Lectin 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 유전자 변형체의 검정용 표준 플라스미드는 식품의약품안전처와 IRMM에서 제공하는 GM 유전자인 EPSPS 유전자 서열과 내재 유전자인 Lectin 유전자의 서열을 포함한다.

바람직하게는, 상기 표준 플라스미드에 포함되는 EPSPS 유전자는 5′ 영역의 인접서열(5′ flanking sequence) 및 3′ 영역의 인접서열(3′ flanking sequence)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 표준 플라스미드는 상기 EPSPS 유전자의 5′ 영역 및 3′ 영역의 인접서열을 포함함으로써 분석 대상인 품종을 구분할 수 있다는 이점을 가진다. GM 유전자만으로는 다른 품종인지 구분할 수 없는데, 인접서열을 포함함으로써 정성 PCR로 GTS 40-3-2(이하, 명세서 및 청구항에서‘RRS(Roundup Ready Soya)' 라 명칭함)와 동일한 품종인지 여부를 판단할 수 있게 된다.

또한 본 발명의 표준 플라스미드를 이용하여 유전자변형 식물체의 이벤트(event)를 판별할 수 있다. 따라서 본 발명의 표준 플라스미드는 유전자 변형체의 품종 뿐만 아니라 유전자 변형체의 다수 이벤트를 검정할 수 있게 하기 때문에, GMO 검출용 표준물질로서 더욱 적합하다.

더욱 바람직하게, 상기 표준 플라스미드는 도 1에 도시된 바와 같은 유전자 지도를 가지는 pBlunt-9kbLE 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 pBlunt-9kbLE 플라스미드는 Lectin 삽입 유전자를 확보하기 위한 정방향 프라이머 leK1F(서열번호 9)와 역방향 프라이머 leK1R(서열번호 10)에 의해 증폭된 Lectin 유전자의 PCR 산물과 RRS 삽입 유전자를 확보하기 위한 정방향 프라이머 35Sbean3F(서열번호 11)와 역방향 프라이머 GW1R(서열번호 12)에 의해 증폭된 EPSPS 유전자의 PCR 산물을 각각 얻은 후, 이들을 각각 제한효소로 처리하여 pCR-Blunt 벡터에 삽입하여 획득하였다. 상기 pBlunt-9kbLE 플라스미드는 본 발명에 따른 유전자 변형체의 유전자 혼입률을 산출하는 정량적 검정방법을 위한 표준 플라스미드로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 표준 플라스미드의 검정 대상인 상기 유전자변형 식물체는 대두 RRS 품종일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 "대두 RRS"은 몬산토코리아(주)가 유전자재조합 기술을 이용하여 개발된 제초제 내성 콩으로, 제초제인 글리포세이트(Glyphosate)에 대해 영향을 받지 않는 CP4 균의 EPSPS 단백질을 발현시키는 유전자인 EPSPS 유전자가 도입된 대두를 의미한다. 글리포세이트는 식물이나 미생물의 특유한 방향족 아미노산 합성경로(shikimate pathway)의 한 효소인 5-enoyl-4-pyruvylshkimate-3-phosphate synthase (이하 'EPSPS 단백질'이라 함)에 특이적으로 결합하여 그 활성을 저해시키므로, 이 농약을 살포하게 되면 필수아미노산 합성이 이루어지지 않아 거의 모든 식물이 고사하게 된다. 그러나 EPSPS 유전자가 도입된 식물체는 글리포세이트에 영향을 받지 않는 insensitive target site를 가지므로 CP4 EPSPS 단백질을 발현시키는 유전자가 도입된 제초제 내성 콩은 글리포세이트를 살포해도 고사하지 않고 생육할 수 있게 된다. 이와 같이 대두 RRS 품종은 EPSPS 유전자를 함유하고 있어, 본 발명의 표준 플라스미드를 이용한 정량분석의 유전자 변형체로서 적합하다. 다만, 반드시 이에 한정될 필요는 없으며, EPSPS 유전자를 함유하고 있는 어떠한 유전자 변형체도 본 발명에 따른 검정 대상이 될 수 있음은 자명하다.

본 발명의 다른 목적을 위하여, 상기 표준 플라스미드를 이용하는 유전자 변형체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법을 제공한다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 정량 분석방법은

ⅰ) 상기 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;

ⅱ) 농도별로 희석한 상기 표준 플라스미드와 생물학적 시료로부터 수득한 DNA를 각각 주형으로 해서 검정용 PCR 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계;

ⅲ) 상기 희석한 표준 플라스미드를 이용하여 수행한 PCR 산물의 양을 측정하여 표준 정량 곡선을 산출하는 단계; 및

ⅳ) 상기 생물학적 시료로부터 수득한 DNA를 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 상기 표준 정량 곡선에 도입하여 외래 도입 유전자의 혼입률을 산출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 정량 분석방법에서 유전자 변형체는 대두 RRS 품종인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

실시간 PCR을 이용할 경우, 내재 유전자 및 도입 유전자의 DNA에 특이적으로 결합하는 양방향 프라이머와 검출용 프로브를 이용하여 PCR 증폭과정에서 발색되는 형광의 양을 측정함으로써 내재 및 도입 유전자의 양을 산출할 수 있다. 즉 상기 정량 분석방법은 해당 품종의 식물이 반드시 가지고 있는 내재 유전자에 대한 외래 도입 유전자의 상대적인 비율을 통하여 유전자변형 식물이 몇 % 함유되어 있는지를 분석해내는 방법이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 표준물질을 검출용 프로브와 도입 유전자 검출용 프라이머 및 내재 유전자 검출용 프라이머로 실시간 PCR하여 형광을 측정함으로써 유전자 카피수에 대한 PCR 사이클수를 나타내는 표준곡선을 산출하고 이를 분석시료로부터 얻은 실시간 PCR 산물과 비교함으로써 유전자변형 식물의 시료내 혼입률을 분석할 수 있다.

바람직하게, 상기 정량 분석방법에서 ⅱ) 단계의 상기 PCR 프라이머 세트는, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트 및 서열번호 6 및 7의 프라이머 세트일 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 5 및 8 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 프로브는 실시간 PCR 수행시 정량분석을 위해 형광물질이 염기서열에 도입되어 있는 검출용 프로브를 의미한다. 검출용 프로브의 종류는 내재 유전자 및 도입 유전자의 종류에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

상기 정량 분석방법의 ⅲ) 단계에서 표준 정량 곡선은 표준 플라스미드 DNA를 소정의 비율로 희석하여 서로 다른 유전자 카피수를 갖는 복수개의 표준시료에 대해 실시간 PCR을 수행하고 이로부터 얻은 유전자 카피수에 대한 PCR 사이클수를 적용하여 산출될 수 있다. 구체적으로, 혼입률을 알고 있는 표준물질의 DNA를 적절히 희석하여 카피수를 일정한 간격으로 만들거나, 유전자변형 식물과 유전자비변형 식물의 DNA를 소정비율로 혼합하여 일정한 혼입률을 갖도록 제조한 수개의 시료에 대해 실시간 PCR을 수행하면, PCR 사이클수에 따른 형광의 정도를 측정할 수 있다. 이때 표준액의 형광시그널이 지수함수적으로 증폭하고 있는 부위를 선택하여 Threshold line(Th. line)을 설정하고, 설정된 Th. line과 표준액의 증폭 곡선이 교차하는 점의 사이클수를 Ct(threshold cycle)라고 하는데, 이 값은 시료의 초기농도(유전자 카피수)와 가장 재현성 있는 상관관계를 나타내는 시점으로서, 실시간 PCR을 이용한 정량적인 분석에 있어서 가장 중요한 수치이다. 실시간 PCR에서 표준곡선은 Ct 값에서의 표준물질의 유전자 카피수를 로그(log)값으로 환산한 값을 X축, 상기 유전자 카피수에 대한 PCR 사이클수를 Y축으로 하여 작성한다. 이후 분석시료의 형광량을 이 표준곡선에 적용하면 분석시료의 유전자 카피수를 알 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여, 본 발명은 상기 표준 플라스미드를 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트를 제공한다.

상기 검정용 키트의 대상인 유전자변형 식물체는 RRS 품종의 유전자변형 대두인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

바람직하게 상기 검정용 키트는 서열번호 3 및 4, 그리고 6 및 7 로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 5 및 8 인 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 표준 플라스미드를 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트를 제공함으로써, EPSPS 유전자를 함유하는 유전자변형 식물체 검정을 위해 실시간 PCR에 의한 정량분석을 가능하게 한다.

상기 키트는 전사, 증폭, 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시 사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 전사효소, 데옥시뉴클레오티드, DNA 증폭 반응에 적합한 열 안정성 폴리머라제 및 핵산의 표지화 및 검출용 시약을 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여, 본 발명은 상기 표준 플라스미드로부터 발현되는 단백질을 포함한 유전자 변형체 검정용 키트를 제공한다. 본 발명의 표준 플라스미드는 T7 프로모터를 포함하고 있으며, 표준 플라스미드에 도입된 외래 유전자인 EPSPS 유전자 및 내재 유전자인 Lectin 유전자가 T7 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 따라서 적당한 단백질의 발현환경에서 본 발명의 표준 플라스미드로부터 EPSPS 단백질 및 Lectin 단백질이 발현될 수 있다. 이러한 상기 발현된 단백질들을 표준 단백질로 하여, ELISA(Enyzme Linked Immunusorbent Assay) 방법 등을 이용하여 정량분석 또는 정성분석에 이용할 수 있다.

본 발명에 의한 표준 플라스미드는 EPSPS 유전자를 함유한 유전체의 검정에 활용이 가능하며, 이에 따라 유전자변형 식물체의 품종 또는 이벤트를 판별할 수 있다. 특히 대두 RRS와 같은 품종에 대한 혼입여부 또는 혼입률을 분석할 수 있는 표준물질로서 매우 유용하다. 따라서 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 유전자 변형체인 대두 RRS에 대한 정확하고 신뢰도가 개선된 정량분석 방법 및 검출용 키트를 제공할 수 있으며, 유전자 변형체의 혼입률을 정확하게 검출하는데 매우 적합하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일구체예에 따른 표준 플라스미드의 구성도이다.
도 2는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA의 농도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 만들기 위해 벡터에 삽입(insertion)된 유전자 및 방향(orientation)을 확인하기 위한 전기영동 사진이다. (M: 분자량 마커, 1,2 : 9kbLE pDNA, UC: 플라스미드 DNA, C: enzyme으로 cutting한 플라스미드 DNA로 insert확인, set1,2 : orientation 확인 )
도 4는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA의 형광측정값을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA를 사용하여 실시간 정량 PCR을 수행하여 균질함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA를 사용하여 실시간 정량 PCR을 수행하여 안정함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7의 (a)는 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 미지의 시료의 내재 유전자에 대한 정량 분석을 한 결과를 나타낸 것이며, (b)는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 및 미지시료의 내재 유전자에 대한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
도 8의 (a)는 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 미지의 시료의 도입 유전자에 대한 정량 분석을 한 결과를 나타낸 것이며, (b)는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 및 미지시료의 도입 유전자에 대한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

< 실시예 >

1. 표준 플라스미드 제작

표준 플라스미드는 대두의 내재 유전자(Lectin) 및 GM 유전자(EPSPS)에 대한 PCR 산물을 연결하여 이를 pCR-Blunt 벡터(미국 Invitrogen사)에 삽입한 표준 플라스미드를 제작하였다(pBlunt-9kbLE, 도 1 참조), 구체적으로 먼저 full gene(flanking region존재)의 삽입 유전자를 확보하기 위해, 정방향 프라이머 35Sbean3F(서열번호 11)와 역방향 프라이머 GW1R(서열번호 12)에 의해 증폭된 EPSPS 유전자의 PCR 산물을 얻은 후, 이를 pCR-Blunt 벡터에 삽입하였다. 이후, Lectin 삽입 유전자를 확보하기 위해, 정방향 프라이머 leK1F(서열번호 9)와 역방향 프라이머 leK1R(서열번호 10)에 의해 증폭된 Lectin 유전자의 PCR 산물을 얻은 후, 이를 제한효소 XbaⅠ과 NotⅠ으로 처리한 다음, 상기 EPSPS 유전자가 삽입된 pCR-Blunt 벡터에 Zero PCR cloning 키트(미국 Invitrogen사)를 사용하여 삽입하여 표준 플라스미드 pBlunt-9kbLE를 제작하였다. pCR-Blunt 벡터에 삽입된 Lectin 유전자의 크기는 1278bp이고 EPSPS 유전자의 크기는 3826bp로, 벡터에 최종 삽입된 산물(insertion)의 크기는 5104bp이다. 상기 pBlunt-9kbLE 에 삽입된 산물(insertion) 및 그 방향은 도 3에서 나타난 바와 같이 확인되었다. 재조합된 플라스미드 pBlunt-9kbLE는 E. coli 균주 TOP10 세포에 도입하여 형질전환시킨 후, LB 배지에서 cell culture하여 다량확보하였다.

서열번호	프라이머/프로브 종류	프라이머/프로브 염기서열
3	le1n02-5'	5'-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3'
4	le1n02-3'	5'-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3'
5	lel-taq	5'-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-TAMRA-3'
6	RRS 01-5'	5'-CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG-3'
7	RRS 01-3'	5'-GACTTGTCGCCGGGAATG-3'
8	RRS-taq	5'-TAMRA-CGCAACCGCCCGCAAATCC-TAMRA-3'
9	leK1F	5'-CTACCCTTGTTAGTCAAACCACAC-3'
10	leK1R	5'-CAATGACAATCACTAGCGATCGAG-3'
11	35Sbean3F	5'-GAACCTTGTGCAAATTATTCAAAC C-3'
12	GW1R	5'-GTCCCCATAGATTACATAACCGAC-3'

2. 플라스미드 DNA 추출

실시예 1에서 다량확보한 cell에서 plasmid maxi 키트 (Qiagen사)를 사용해 제조사가 제안하는 방법을 그대로 또는 약간 변형시켜 사용하여 플라스미드 DNA(pDNA)를 추출하였다. 구체적으로, 배양한 cell을 4℃에서 15분간 6000g 로 원심분리하여 수확한 후, 수확된 cell pellet에 10ml 버퍼 P1을 넣고 재부유시켰다. 이후 10ml Buffer P2를 첨가한 후 4-6번 아래 위를 뒤집어서(inverting) 섞어준 후, 5분 동안 상온(15-25℃)에 방치한 후 10ml Buffer P3을 첨가한 후 4-6번 아래 위를 뒤집어서(inverting) 섞어준 후 20분간 ice에 놓아 두었다. 다음 4℃에서 30분간 20000g 이상에서 상층액을 원심분리시켰다(상층액이 깨끗하지 않다면, 추가로 원심분리를 한다). Qiagen-tip에 10ml Buffer QBT를 중력으로 통과시켜 Equilibrate시킨 다음, Qiagen-tip에 step 5로부터의 상층액을 통과시킨 후, 30ml Buffer QC로 Qiagen-tip을 두번 정도 워싱해 주었다. 50ml tube에 15ml Buffer QF를 넣어 DNA를 분리시켰다. 10.5ml 이소프로판올을 첨가하여 분리된 DNA를 4℃에서 30분간 ≥15000g 침전시킨 후, 상층액은 버렸다. 침전물을 5ml 상온의 70% 에탄올로 DNA pellet을 워싱하고 10분간 ≥15000g 에서 원심분리 후, 상층액을 조심스럽게 버렸다. 5-10분간 pellet을 자연 건조시킨 후 적절한 부피의 버퍼(e.g. TE buffer, pH 8.0, 10mM Tris, pH8.5)로 녹여서 최종적으로 추출된 플라스미드 DNA(pDNA)를 준비하였다.

3. 플라스미드 DNA 의 농도 및 오염도 확인

추출된 플라스미드 DNA의 질적인 평가와 정량을 위해 흡광도 측정과 피코그린(picogreen)을 이용한 형광측정법을 수행하였다. DNA 용액은 자외선 흡광도를 측정한 결과, 260 nm 근방에서 peak을 보이는 전형적인 DNA의 UV 흡광도 스펙트럼을 나타냈다 (도 2 및 표 2 참조).

또한 추출된 플라스미드 DNA는 단백질 등 불순물이 적은 양질의 시료로 판단되었다. DNA 용액 내의 단백질 오염도는 다음과 같이 알아볼 수 있다. 260 nm의 흡광도를 280 nm에서의 흡광도로 나누어 1.7부터 2.0 사이의 값을 얻으면 단백질 오염이 적은 양질의 DNA로 판단하게 되는데 본 실험에 사용한 모든 DNA 시료는 이 사이의 값을 가져서 실험에 적합한 시료로 판단되었다. 이외에 260 nm의 흡광도를 230 nm에서의 흡광도로 나누어 DNA 용액 내의 당(예: 식물조직을 이루고 있는 다당류 등)의 오염도를 알아볼 수 있다. 0.8 이상의 값을 얻으면 양질의 DNA로 판단하게 되는데, 본 실험에 사용한 모든 DNA 시료는 0.8 이상의 값을 나타내어 당의 오염이 적은 다음 단계의 실험을 진행해도 되는 양질의 시료로 판단되었다(표 2 참조).

tube	9kbLE pDNA
원액 농도(ng/ul)	451.85
1/5 dilution 농도(ng/ul)	90.37
230	0.800
260	1.807
280	0.936
단백질혼입(260/280)	1.93
탄수화물 혼입(260/230)	2.26

상기 플라스미드 DNA의 농도를 확인하기 위해, ds-DNA(double strand DNA)에 특이적으로 결합하는 형광 염료인 Pico Green^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 사용한 ds-DNA의 농도를 측정하는 방법을 이용하여 용액 내의 DNA 양을 결정하였다. 구체적으로, kit 내에 구비된, 이미 농도가 결정된 lambda DNA calibrator를 사용하여 형광값에 대한 검량선(calibration curve)을 얻고, 시료의 형광값을 검량선에 대입함으로써 DNA의 농도를 결정하였다. 그 결과 추출한 플라스미드 DNA는 질적으로 순도가 적합하고, 양적으로 충분한 농도가 되어 다음 단계에 사용하였다.

4. 표준 플라스미드 stock 제조

형광정량을 통해 플라스미드 DNA의 농도를 구한 후, 알고 있는 플라스미드 DNA size(base pair, bp)를 아래의 계산식에 대입하여 카피수(Number of copies)를 계산한 다음, 최종 표준 플라스미드 stock의 플라스미드 DNA의 농도가 4.00 X 10⁸cp/㎕가 될 수 있도록, 10mM Tris로 희석하였다.

Number of copies(cp/ul) = amount × 6.022 ×10²³ / 플라스미드 DNA size(bp) × 1 × 10⁹ ×650

클린 벤치내에서 여과하여 불순물을 제거한 후 약 900개의 cryo tube(Nunc사)에 각각 50 ul씩 분주하였다.

예상한 카피수와 일치하는지 알아보기 위해 실시간 PCR법을 사용하여 예비 테스트를 하였다. 본 실험예에서는 ABI 7900HT (미국 Applied Biosystems사)를 사용하여 모든 실험을 수행하였으며 실험의 기본적인 디자인 및 프라이머, 프로브 등의 실험 구성요소는 식품의약안전처의 규격에 나온 내용을 취하여 사용하였다. 먼저 이미 카피수를 아는 상용화된 플라스미드 DNA(일본, Nippon Gene)를 표준곡선을 그리기 위한 표준물질로 사용하고, 실시예 1 및 실시예 2에 따라 추출한 플라스미드 DNA를 분석시료로 사용하여, 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 즉 이미 카피수를 아는 상용화된 플라스미드 DNA를 표준물질로 삼아 농도별로 내재 유전자를 증폭한 결과, 250000, 20000, 1500, 125, 20 카피 사이로 DNA 기준물질을 첨가하여 농도간 간격이 일정하면서 반복성이 있는 결과를 얻었다. 이는 GM 유전자의 결과에서도 동일한 경향을 확인할 수 있었다.

5. 표준 플라스미드의 균질성 확인

총 900여개의 tube에 분주한 시료 중 일정한 간격으로 10개의 tube를 선정해서 tube간 균질성을 확인하는 절차를 거쳤다.

병간 균질성을 점검하고자 분석한 10개 tube에 있는 플라스미드 DNA의 transgene: endogene(GM 유전자:내재 유전자)의 비를 측정하였다(transgene과 endogene은 각 1:1로 재조합). 측정한 결과 이들의 측정값은 0.994~1.012 사이였으며 평균치는 1.003 ± 0.009였다(도 5 참조). 10개의 tube는 서로의 표준편차 범위 내에 존재하고 IRMM에서 제조된 재조합 ERM-AD413의 경우, 인증값 및 범위가 1.037 ± 0.007로 병간 균질성이 있다고 보고했는데 본 발명에서의 재조합 표준물질은 이보다 두 유전자 간의 비율이 1에 더 가까웠으므로 이에 균질성이 있는 것으로 판단되었다.

6. 표준 플라스미드의 안정성 확인

안정성 확인 실험과 관련하여, 시료의 운반시 안정한지를 확인하기 위한 것으로 네개의 온도(-20 ℃, 4 ℃, 상온, 60 ℃)에서 일정한 시간 간격(2주, 4주)으로 각 3개 tube의 시료를 분석하여 두 유전자의 비율에 변화가 있는지 살펴보았다.

단기 안정성을 점검하고자 분석한 시료의 도입 유전자(transgene) : 내재 유전자(endogene)의 비율의 측정값은 1.023±0.001(0 time), 1.019±0.003(2 weeks, -20 ℃), 1.020±0.007(4 weeks, -20 ℃), 1.024±0.001(2 weeks, 4 ℃), 1.016±0.004(4 weeks, 4 ℃), 1.013±0.026(2 weeks, 상온), 1.022±0.003(4 weeks, 상온), 0.996±0.028(2 weeks, 60 ℃), 0.992±0.024(4 weeks, 60 ℃)로, 4주간 -20 ℃, 4 ℃, 상온에서 GM 유전자와 내재 유전자 비율이 균질성 실험 결과와 유사하게 나타나, 상기의 온도에서 시료가 안정함을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

7. 표준 플라스미드를 이용한 정량성 확인

pBlunt-9kbLE 플라스미드를 6단계의 카피수로 희석한 DNA를 주형으로 하여, 실시간 PCR을 수행, 그 결과를 이용하여 표준 정량 곡선을 산출하고, 미지 시료에 대하여 정량분석을 수행하였다. 또한 기존에 시판되는 Nippon Gene의 정량곡선을 산출하여 본 발명의 pBlunt-9kbLE 플라스미드와 calibrator로서 비교해 보았다.

그 결과 pBlunt-9kbLE 플라스미드의 상관계수(R＾) 값이 0.9996(Lectin) 및 0.9982(EPSPS)으로 나타나, 그 수치가 0.99 이상이며, Nippon Gene의 상관계수(R＾) 값 0.9977(Lectin) 및 0.9980(EPSPS)보다 높은 결과를 나타내므로, 본 발명에 따른 플라스미드가 정량분석을 위한 표준 플라스미드로 이용 가능함을 확인할 수 있었다. 또한 도 7 및 도 8에서 나타낸 바와 같이 미지시료의 도입 유전자(GM)%를 알기 위한 정량분석을 위해 표준 플라스미드로 이용 가능함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아니다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Research Institute of Standards and Science <120> Standard Plasmid for Detection of Genetically Modified Organism, <130> P12091001202 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPSPS <400> 1 atgcttcacg gtgcaagcag ccggcccgca accgcccgca aatcctctgg cctttccgga 60 accgtccgca ttcccggcga caagtcgatc tcccaccggt ccttcatgtt cggcggtctc 120 gcgagcggtg aaacgcgcat caccggcctt ctggaaggcg aggacgtcat caatacgggc 180 aaggccatgc aggccatggg cgccaggatc cgtaaggaag gcgacacctg gatcatcgat 240 ggcgtcggca atggcggcct cctggcgcct gaggcgccgc tcgatttcgg caatgccgcc 300 acgggctgcc gcctgaccat gggcctcgtc ggggtctacg atttcgacag caccttcatc 360 ggcgacgcct cgctcacaaa gcgcccgatg ggccgcgtgt tgaacccgct gcgcgaaatg 420 ggcgtgcagg tgaaatcgga agacggtgac cgtcttcccg ttaccttgcg cgggccgaag 480 acgccgacgc cgatcaccta ccgcgtgccg atggcctccg cacaggtgaa gtccgccgtg 540 ctgctcgccg gcctcaacac gcccggcatc acgacggtca tcgagccgat catgacgcgc 600 gatcatacgg aaaagatgct gcagggcttt ggcgccaacc ttaccgtcga gacggatgcg 660 gacggcgtgc gcaccatccg cctggaaggc cgcggcaagc tcaccggcca agtcatcgac 720 gtgccgggcg acccgtcctc gacggccttc ccgctggttg cggccctgct tgttccgggc 780 tccgacgtca ccatcctcaa cgtgctgatg aaccccaccc gcaccggcct catcctgacg 840 ctgcaggaaa tgggcgccga catcgaagtc atcaacccgc gccttgccgg cggcgaagac 900 gtggcggacc tgcgcgttcg ctcctccacg ctgaagggcg tcacggtgcc ggaagaccgc 960 gcgccttcga tgatcgacga atatccgatt ctcgctgtcg ccgccgcctt cgcggaaggg 1020 gcgaccgtga tgaacggtct ggaagaactc cgcgtcaagg aaagcgaccg cctctcggcc 1080 gtcgccaatg gcctcaagct caatggcgtg gattgcgatg agggcgagac gtcgctcgtc 1140 gtgcgtggcc gccctgacgg caaggggctc ggcaacgcct cgggcgccgc cgtcgccacc 1200 catctcgatc accgcatcgc catgagcttc ctcgtcatgg gcctcgtgtc ggaaaaccct 1260 gtcacggtgg acgatgccac gatgatcgcc acgagcttcc cggagttcat ggacctgatg 1320 gccgggctgg gcgcgaagat cgaactctcc gatacgaagg ctgcctga 1368 <210> 2 <211> 1278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lectin <400> 2 ctacccttgt tagtcaaacc acacataaga gaggatggat ttaaaccagt cagcaccgta 60 agtatatagt gaagaaggct gataacacac tctattattg ttagtacgta cgtatttcct 120 tttttgttta gtttttgaat ttaattaatt aaaatatata tgctaacaac attaaatttt 180 aaatttacgt ctaattatat attgtgatgt ataataaatt gtcaaccttt aaaaattata 240 aaagaaatat taattttgat aaacaacttt tgaaaagtac ccaataatgc tagtataaat 300 aggggcatga ctccccatgc atcacagtgc aatttagctg aagcaaagca atggctactt 360 caaagttgaa aacccagaat gtggttgtat ctctctccct aaccttaacc ttggtactgg 420 tgctactgac cagcaaggca aactcagcgg aaactgtttc tttcagctgg aacaagttcg 480 tgccgaagca accaaacatg atcctccaag gagacgctat tgtgacctcc tcgggaaagt 540 tacaactcaa taaggttgac gaaaacggca ccccaaaacc ctcgtctctt ggtcgcgccc 600 tctactccac ccccatccac atttgggaca aagaaaccgg tagcgttgcc agcttcgccg 660 cttccttcaa cttcaccttc tatgcccctg acacaaaaag gcttgcagat gggcttgcct 720 tctttctcgc accaattgac actaagccac aaacacatgc aggttatctt ggtcttttca 780 acgaaaacga gtctggtgat caagtcgtcg ctgttgagtt tgacactttc cggaactctt 840 gggatccacc aaatccacac atcggaatta acgtcaattc tatcagatcc atcaaaacga 900 cgtcttggga tttggccaac aataaagtag ccaaggttct cattacctat gatgcctcca 960 ccagcctctt ggttgcttct ttggtctacc cttcacagag aaccagcaat atcctctccg 1020 atgtggtcga tttgaagact tctcttcccg agtgggtgag gatagggttc tctgctgcca 1080 cgggactcga catacctggg gaatcgcatg acgtgctttc ttggtctttt gcttccaatt 1140 tgccacacgc tagcagtaac attgatcctt tggatcttac aagctttgtg ttgcatgagg 1200 ccatctaaat gtgacagatc gaaggaagaa agtgtaataa gacgactctc actactcgat 1260 cgctagtgat tgtcattg 1278 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leln02 forward primer <400> 3 gccctctact ccaccccca 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leln02 reverse primer <400> 4 gcccatctgc aagccttttt 20 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lel taq <400> 5 agcttcgccg cttccttcaa cttcac 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRS 01 forward primer <400> 6 cctttaggat ttcagcatca gtgg 24 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRS 01 reverse primer <400> 7 gacttgtcgc cgggaat 17 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRS taq <400> 8 cgcaaccgcc cgcaaatcc 19 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lek1 forward primer <400> 9 ctacccttgt tagtcaaacc acac 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lek1 reverse primer <400> 10 caatgacaat cactagcgat cgag 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35sbean3F <400> 11 gaaccttgtg caaattattc aaacc 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GW1R <400> 12 gtccccatag attacataac cgac 24

Claims

Lectin 유전자와 EPSPS 유전자를 포함하는 유전자 변형체의 검정용 표준 플라스미드.
제 1항에 있어서, 상기 EPSPS 유전자는 5′ 영역의 인접서열 및 3′ 영역의 인접서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표준 플라스미드.
제 2항에 있어서, 상기 EPSPS 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하며, 상기 Lectin 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표준 플라스미드.
제 1항 내지 3항에 있어서, 상기 유전자 변형체는 대두 RRS 품종인 것을 특징으로 하는 표준 플라스미드.
제 1항 내지 3항에 있어서, 상기 표준 플라스미드는 도 1에 개시된 제한 효소 맵인 것을 특징으로 하는 표준 플라스미드.
ⅰ) 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;
ⅱ) 농도별로 희석한 상기 표준 플라스미드와 생물학적 시료로부터 수득한 DNA를 각각 주형으로 해서 검정용 PCR 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계;
ⅲ) 상기 희석한 표준 플라스미드를 이용하여 수행한 PCR 산물의 양을 측정하여 표준 정량 곡선을 산출하는 단계; 및
ⅳ) 상기 생물학적 시료로부터 수득한 DNA를 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 상기 표준 정량 곡선에 도입하여 외래 도입 유전자의 혼입률을 산출하는 단계를 포함하는, 제 1항에 따른 표준 플라스미드를 이용하는 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법.
제 6항에 있어서, 상기 유전자변형 식물체는 대두 RRS 품종인 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
제 6항에 있어서, ⅱ)단계의 상기 PCR 프라이머 세트는, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트 및 서열번호 6 및 7의 프라이머 세트이며, 상기 프로브 세트는 서열번호 5 및 8인 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
제 1항에 따른 표준 플라스미드를 포함하는 유전자 변형체 검정용 키트.
제 9항에 있어서, 상기 유전자 변형체는 대두 RRS 품종의 유전자변형 대두임을 특징으로 하는 검정용 키트.
제 9항에 있어서, 상기 검정용 키트는 서열번호 3 및 4, 그리고 6 및 7 로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 5 및 8 인 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 검정용 키트.
제 1항에 따른 표준 플라스미드로부터 발현되는 단백질을 포함하는 유전자 변형체 검정용 키트.