WO2010022579A1 - 检测转基因玉米bt11的方法 - Google Patents

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WO2010022579A1
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reaction
dna polymerase
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兰青阔
王永
程奕
赵新
朱珠
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天津市农业科学院中心实验室
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Definitions

  • the invention belongs to the technical field of molecular biology, and relates to a detection method of a transgenic product, in particular to a method for rapidly detecting transgenic corn BT11, by visually observing the turbidity of the reaction tube or observing the color change after adding 1000 X SYBR Green or observing agarose Gel electrophoresis was used to determine the amplification.
  • Transgenic maize BT11 is a strain with both insect resistance and herbicide tolerance.
  • the insect-resistant gene transferred into it is the Cry lAb insect-resistant gene of BT series toxic protein gene.
  • the glufosinate-resistant herbicide gene is grass. Butyronyl acetyltransferase gene.
  • the EU first proposed the label management of genetically modified foods. In 1999, non-GM products exported to the EU were not allowed to contain 1% of GM products; in 2002, the EU reduced the minimum mark to 0.9%. Japan, Australia, and New Zealand have different regulations for the minimum content of genetically modified ingredients, with domain values ranging from 5% to 5%.
  • the PCR detection method is the main method for detecting transgenic crops, including qualitative PCR method, compound PCR method, nested PCR method, competitive quantitative PCR method, and fluorescent quantitative PCR method. Qualitative PCR and real-time quantitative PCR detection methods are widely used at home and abroad.
  • the general detection procedure for PCR amplification technology is: extraction of plant genome DNA ⁇ PCR amplification - enzyme digestion test ⁇ detection of target gene - detection report.
  • the testing equipment is mainly a PCR instrument, an electrophoresis instrument, a refrigerated centrifuge, an ultraviolet observation (or imaging) instrument, and the like.
  • the technical conditions required for the detection of genetically modified products are relatively high, the equipment and equipment are relatively expensive, and the testing cost and cost are quite high.
  • the present invention aims to disclose a method for rapidly detecting transgenic corn BT11, and designing a set of primers according to the sequence of the exogenous gene and the endogenous gene junction to amplify the turbidity by visual observation, or observe the color after adding SYBR Green. The change, or observation of agarose gel electrophoresis results to determine the amplification.
  • a set of specific primers for detection of transgenic maize BT11 wherein the outer primer forward sequence: 5,-AGGGATTCTTGGATTTTTGG-3, , the outer primer reverse sequence: 5,-AGAAATGGTTTCCACCAGAA-3, ; the inner primer forward sequence: 5'- ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGT-3', internal primer reverse sequence: 5,- GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA-3.
  • Each primer was prepared as a mother liquor at a concentration of ⁇ /L, 1 ⁇ L of each primer, 8 ⁇ of each primer, 2 ⁇ of deionized water, and mixed thoroughly, which was a primer mixed solution.
  • the invention adopts the above set of primers for the rapid detection of the transgenic corn BT11, comprising the following steps:
  • the amplification reaction system The total volume of the amplification reaction is 25 ⁇ , and its various components are: 10 X ThermoPol Buffer 2.5 ⁇ L, 4 mol/L betaine 6.25 ⁇ L, 0.2 mol/L MgS04 0.25 ⁇ L, mixed primer ⁇ ⁇ , ⁇ /L dNTPs 3.5 ⁇ L, strand displacement active DNA polymerase 1-2 ⁇ , template DNA 1-5 ⁇ , supplemented to 25 ⁇ L with sterile deionized water, Fully mix the hook, centrifuge at 4000-8000rpm for 5-10 seconds and then get on the machine;
  • the detection method according to the present invention wherein the strand displacement active DNA polymerase 8000 U/L Bst DNA polymerase large fragment 1-2 ⁇ .
  • the fluorescent dye SYBR Green according to the present invention is added in an amount of 1 - 2 ⁇ L and has a concentration of 1000 times.
  • the template DN ⁇ refers to the genomic ⁇ extracted from the sample to be tested.
  • test method of the present invention will be described in detail below.
  • the method uses a novel nucleic acid amplification method, which uses four specific primers and a DNA polymerase with strand displacement activity to amplify nucleic acids at 63 ° C to 65 ° C for short-time amplification.
  • Efficiency can reach 10 9 - 10'° copies. It is characterized by high specificity, fastness, simplicity, and easy detection.
  • the primers were synthesized by Shanghai Bioengineering Co., Ltd .:
  • BT11 forward external primer 20 ACCCATTCTTGGATTTTTCC
  • BT11 reverse outer primer 20 ACAAATCCTTTCCACCAGAA
  • Reactive reagents require strand displacement DNA polymerase, dNTPs, transgenic maize BT11 specific primers, betaine, MgSO 4 and reaction buffer.
  • the reaction is carried out under constant temperature conditions, and the reaction time varies depending on the efficiency of the primer and the mass of the template DNA, and is generally 1 h or less.
  • the template DNA was added for 45-60 min at 63-65 °C and terminated at 80 °C for 2 min.
  • the advantage of this technology is that the reaction process does not require thermal cycling, so expensive instruments such as PCR machines are not required, and a constant temperature water bath or metal heating block can maintain the reaction temperature.
  • Reagents BioLabs BstDNA polymerase large fragment (manufactured by NEW ENGLAND) and 10 times ThermoPol Buffer solution; BT11 specific primer; betaine solution; MgS0 4 solution; dNTPs;
  • Amplification reaction system The total volume of the amplification reaction is 25 ⁇ , and its various components are: 10 ThermoPol Buffer 2.5 ⁇ L, 4 mol/L betaine 6.25 ⁇ L, 0.2 mol/L gS0 4 0.25 ⁇ L , Primer mix ⁇ ⁇ , 10 ⁇ mol/L dNTPs 3.5 ⁇ L, 8000 U/L Bst DNA polymerase large fragment 1- 2 ⁇ , template DNA 1-5 pL, supplemented with sterile deionized water to 25 ⁇ L, Mix well, centrifuge at 4000-8000rpm for 5-10 seconds, then get on the machine;
  • reaction product 3-25 is judged by different detection methods for expansion or not.
  • the detection can also be carried out by evaluating the amount of the white precipitate of the amplification by-product magnesium pyrophosphate.
  • a by-product magnesium pyrophosphate precipitate is produced, and the turbidity in the reaction tube can be detected by visual observation or a turbidimeter to judge whether or not the amplification is performed.
  • the amplification method of the invention for detecting GM11 of transgenic corn has the following advantages:
  • DRAWINGS Figure 1 is an electrophoresis analysis of the amplified product, from left to right, Marker, blank control, negative control, negative sample, positive control and positive sample;
  • Figure 2 is a graph showing the results of adding SYBR Green to the amplified product, with the left side being the positive control and the right being the negative control;
  • Figure 3 is a graph showing the results of adding SYBR Green to the amplified product, and the negative control, the positive control, and the sample to be tested are sequentially from the left;
  • Figure 4 is a result of adding SYBR Green to the amplified product, from left to right as a negative control, a positive control, a sample to be tested 1 and a sample to be tested 2;
  • Figure 5 is an electrophoresis analysis of the amplified product, from left to right: negative control, positive control, sample to be tested 1, sample to be tested 2, sample to be tested 3, DL2000 DNA Marker;
  • Figure 6 is an agarose gel electrophoresis analysis of Example 4, using the method of the present invention, observed under ultraviolet light, wherein M, DL2000 DNA, Marker; 1, 5%; 2, 1%; 3, 0.5% 4, 0.1%; 5, 0.05%; 6, 0.01%; 7, 0.005%; 8, 0.001%; 9, 0.0005%; 10, negative control;
  • Figure 7 is an agarose gel electrophoresis analysis of the amplified product of Example 4, a conventional PCR method, and observed under an ultraviolet lamp.
  • M DL2000 DNA, Marker; 1, 5%; 2, 1%; 3, 0.5%; 4, 0.1%; 5, 0.05%; 6, 0.01%; 7, 0.005%; 8, 0.001%; 0.0005%; 10, negative control.
  • test method of the present invention will be described in detail below. It should be noted that the primer sequences of the present invention are shown in Table 1.
  • Reagents Bst DNA polymerized fragment produced by BioLabs (NEW ENGLAND) and 10 times ThermoPol Buffer solution; specific primer mixture; 4mol/L betaine solution; 0.2mol/L MgS04 solution.
  • Amplification reaction system The total volume of the amplification reaction is 25 ⁇ , and its various components are: 10 X ThermoPol Buffer 2.5 ⁇ L, 4 mol/L betaine 6.25 ⁇ L, 0.2 mol/L MgS040.25 ⁇ L, mixed primer 1 ⁇ 10 ⁇ /L dNTPs 3.5 ⁇ L, 8000 U/L Bst DNA polymerase large fragment 1 ⁇ , template DNA 1 M L, sterilized with deionized water to 25 ⁇ , mix well, 4000 rpm Centrifuge for 5 seconds and then get on the machine;
  • Amplification reaction procedure It was carried out at 63 ° C for 60 min, and kept at 80 ° C for 2 min, 4 ° C, and stored.
  • Reagents Large fragments of Bst DNA polymerase produced by BioLabs (NEW ENGLAND) and 10 times ThermoPol Buffer solution; BTl 1 specific primer mixture; 4 mol/L betaine solution; 0.2 mol/L MgS04 solution.
  • Amplification reaction system The total volume of the amplification reaction is 25 ⁇ , and its various components are: 10 X ThermoPol Buffer 2.5 ⁇ L, 4 mol/L betaine 6.25 ⁇ L, 0.2 mol/L MgS04, mixed primer 0.25 ⁇ , 10 ⁇ mol/L dNTPs 3.5 ⁇ L, 8000 U/L Bst DNA polymerase large fragment 2 ⁇ , template DNA 2 ⁇ L, supplemented with sterile deionized water to 25 ⁇ L, mixed well, centrifuged at 8000 rpm for 10 seconds on board.
  • Amplification reaction procedure Perform at 45 ° C for 45 min, and incubate at 80 ° C for 2 min, 4 V, and store.
  • the sample to be tested 1 is a positive sample, does not contain the GM11 component of the transgenic corn, and the sample 2 does not contain the BT11 component of the transgenic corn.
  • Reagents Large fragments of Bst DNA polymerase produced by BioLabs (NEW ENGLAND) and 10 times ThermoPol Buffer solution; specific primer mixture; 4 mol / L betaine solution;
  • Amplification reaction system The total volume of the amplification reaction is 25 ⁇ , and its various components are: 10 X ThermoPol Buffer 2.5 ⁇ L, 1 ⁇ 2 ol/L betaine 6.25 ⁇ L, 0.2 mol/L gS04, mixed primer 0.25 ⁇ , 10 ⁇ mol / L dNTPs 3.5 ⁇ L, 8000 U/L Bst DNA polymerase large fragment 2 ⁇ , template DNA 5 L, supplemented with sterile deionized water to 25 ⁇ L, mixed evenly, centrifuged at 8000 rpm for 10 seconds on board.
  • Reagents of the method of the invention Bst DNA polymerization produced by BioLabs (NEW ENGLAND) Large fragment and 10 times ThermoPol Buffer solution; specific primer mixture; 4mol/L betaine solution; 0.2mol/LMgS04 solution; DNA template including 5%, 1%, 0.5°/ of GM11 containing transgenic corn. , 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%, 0.001%, 0.0005%, 0% of the sample.
  • the amplification reaction system of the present invention The total volume of the amplification reaction is 25 ⁇ , and its various components are: 10 X ThermoPol Buffer 2.5 ⁇ L, 4 mol/L betaine 6.25 ⁇ L, 0.2 mol/L MgS04 0.25 ⁇ L, mixed primer 1 ⁇ ⁇ /L dNTPs 3.5 ⁇ L, 8000U/LBst DNA polymerase large fragment 2 ⁇ , template DNA 5 ⁇ L, supplemented with sterile deionized water to 25 ⁇ , mix well and mix thoroughly , centrifuged at 8000 rpm for 10 seconds and then on the machine;
  • the reaction primer uses a foreign primer to amplify the target gene in the reaction of the present invention.
  • the PCR reaction was 25 ⁇ L, 10 ⁇ L PCR buffer (Promega) 2.5 ⁇ L, 10 mM dNTPs (Promega) 0.5 ⁇ L, upstream and downstream primers (10 mM) 0.5 ⁇ L each, Taq enzyme (5 U/L, Promega) 0.5 ⁇ , DNA template ⁇ ⁇ , sterile deionized water 19.5 ⁇ L.
  • the sensitivity of the method of the present invention is significantly higher than that of the PCR method, and a sample having a lower content of BT 11 in the transgenic corn can be detected.

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Description

检测转基因玉米 BT11的方法 技术领域
本发明属于分子生物学技术领域， 涉及转基因产品的检测方法， 具 体说是一种快速检测转基因玉米 BT11的方法， 通过肉眼观察反应管浊度 或观察加入 1000 X SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断 扩增情况。
背景技术
随着生物技术的飞速发展， 基因工程技术为人类食品和动物飼料的 供应提供了新的途径。 目前， 全球已商业化和正在研究的转基因植物项 目中， 大多数与食品和饲料有关，其中已有成熟技术的共有数十个品种、 数百个品系， 主要有大豆、 玉米、 油菜籽、 马铃薯、 番茄、 小麦等。 玉 米是世界上重要的粮食作物之一， 在其生长过程中受到的危害主要来自 病虫害， 其次为杂草。 据统计， 玉米如不喷施杀虫剂可能造成 59%的产 量损失。 因此， 基因工程技术最早应用在玉米上是开发具有抗虫和抗除 草剂特性的转基因玉米品系。 经济合作发展组织（organization for economic cooperation and develclpment, 0ECD) 2000年登记的转基因 玉米品系共计 18种， 主要改良性状为抗病虫害和耐除草剂等。 2000年美 国栽种的转基因玉米中 72%属抗虫害特性， 24%属耐除草剂， 4%则兼具 抗虫害及耐除草剂两种特性。
转基因玉米 BT11为兼具抗虫害及耐除草剂两种特性的品系， 其转入 的抗虫基因为 BT系列毒蛋白基因的 Cry lAb抗虫基因， 转入的耐草丁膦除 草剂基因是草丁膦乙酰转移酶基因。
随着大量转基因作物逐步走向市场， 转基因作物和转基因作物加工 的食物的安全性问题也开始受到人们的关注。 从本质上讲， 转基因作物 和常规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是通过有性杂交来实现， 而植物基因工程则是用农杆菌、 基因枪、 电激、 微注射等技术将外源重 组 DNA导入植物基因组中。尽管从理论上讲，转基因的遗传特性及表型应 该可以更加精确的预测， 在应用上更加安全， 但对转基因作物进行安全 性评估仍然很有必要。
欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。 1999年， 要求出口到欧 盟的非转基因产品不得含有 1%的转基因产品污染； 2002年， 欧盟将标识 的最低限量降低到 0.9%。 日本、 澳大利亚、 新西兰对转基因成分的最低 含量做了不同规定， 域值从卜 5%不等。
我国于 2001年 5月 9 日公布并实施《农业转基因生物安全管理条
I 例》， 于 2002年 1月 5 日公布了农业转基因生物安全评价、 标识和进口 安全管理三个配套管理办法， 确定了第一批实施标识管理的农业转基因 生物目录， 并于 2002年 3月 20日起正式实施。
目前， 转基因作物的检测途径主要有两种， 一是检测是否有外源基 因（DNA ) ，该途径主要基于 PCR技术和核酸探针的杂交检测技术能精确、 快速地检测 GMC 中是否有外来基因（包括目的基因、 标记基因和引物）； 二是检测是否有外源蛋白质（基因表达的产物） ， 主要采用化学分析、 凝 胶电泳和酶联免疫的方法，检测工作较为繁杂。其中的 PCR检测方法是主 要的检测转基因作物的方法， 包括定性 PCR方法、 复合 PCR方法、 巢式 PCR 方法、 竟争性定量 PCR方法、 荧光定量 PCR方法等。 国内外推广使用的是 定性 PCR和实时定量 PCR检测方法。
PCR 扩增技术的一般检测程序是： 提取植物基因组 DNA →PCR 扩增 -酶切试验→检测目的基因 -检测报告。 检测仪器设备主要是 PCR 仪、 电泳仪、 冷冻离心机、 紫外观察（或成像）仪等。 另外转基因产品检测所 需的技术条件较高， 仪器设备较为昂贵， 且检测成本和费用相当高。
发明内容
本发明目的在于公开一种快速检测转基因玉米 BT11的方法， 以及根 据外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增， 通过肉 眼观察浊度， 或观察加入 SYBR Green后颜色的变化， 或观察琼脂糖凝胶 电泳结果判断扩增情况。
本发明的技术方案如下：
一套用于检测转基因玉米 BT11 的特异性引物， 其中外引物正向序 列 ： 5，- AGGGATTCTTGGATTTTTGG- 3， , 外 引 物 反 向 序 列 ： 5，-AGAAATGGTTTCCACCAGAA- 3， ； 内 引 物 正 向 序 列 ： 5'-ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGT-3', 内引物反 向序列： 5，- GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA- 3，。
每条引物分别配制成浓度为 ΙΟΟμηιοΙ/L的母液，取外引物各 1 μ L, 内引物各 8 μί， 灭菌去离子水 2 μί， 充分混合， 即为引物混合溶液。
本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因玉米 BT11的方法， 包 括如下步骤：
( 1 )采用权利要求 1所述的 4条特异引物及一种具有链置换活性的 DNA聚合酶， 加入模板 DNA, 在 63- 65 °C进行 45- 60min, 并且在 8G°C持 续 2min, 4°C保存；
其中的扩增反应体系： 扩增反应的总体积为 25 μί， 其各种成分分 别为： 10 X ThermoPol Buffer 2.5 μ L, 4mol/L甜菜碱 6.25 μ L, 0.2mol/L MgS04 0.25 μ L, 混合引物 Ι μί, ΙΟμπιοΙ/L dNTPs 3.5 μ L, 链置换活 性的 DNA聚合酶 1-2 μί， 模板 DNA 1-5 μί, 用灭菌去离子水补齐到 25 μ L, 充分混勾， 4000- 8000rpm离心 5- 10秒后上机；
( 2 )扩增反应结束， 取反应产物 3- 25μί, 采用不同方法判断扩增与 否， 包括： 直接向扩增管中加入荧光染料 SYBR Green, 通过颜色变化观 察有无扩增反应； 或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察 有无扩增反应； 或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
本发明所述的检测方法， 其中所述的链置换活性的 DNA聚合酶 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段 1-2 μί。
本发明所述的荧光染料 SYBR Green加入量为 1- 2 μ L, 浓度为 1000 倍。
本发明所述的检测方法， 模板 DN Α指的是从待测样品提取的基因组 瞧。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法， 下面对本发明的试验方 法做以详细的说明。
1、 原理
本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用 4条特异引物及 一种具有链置换活性的 DNA聚合酶， 在 63°C-65°C对核酸进行扩增， 短时 间扩增效率可达到 109- 10'°个拷贝。 具有特异性高、 快速、 简便、 易检测 等特点。
2、 引物设计
4条引物。 引物由上海生物工程公司合成:
表 1 引物序列表如下：
引物名称 碱基数 序列（5' to3')
BT11正向外引物 20 ACCCATTCTTGGATTTTTCC
BT11反向外引物 20 ACAAATCCTTTCCACCAGAA
BT11正向内引物 47 ATGAAAATACCCATCAGCGACCATCCATTTCTTCGTCTAAAATCTCT
ΒΠ1反向内引物 44 GGCCATTTATCATCCACCAGACCAATCTAATCTATGGCAAGGAA
3、 反应条件
反应试剂需要链置换型 DNA聚合酶、 dNTPs、 转基因玉米 BT11特异性 引物、 甜菜碱、 MgS04和反应緩沖液。 反应在恒温条件下进行， 反应时间 依据引物的效率和模板 DNA质量变化， 一般为 lh或更少。 加入模板 DNA, 在 63- 65 °C进行 45- 60min, 并且在 80°C, 持续 2min而终止。 这项技术的优点就是反应过程不需要热循环，所以不需要 PCR仪等昂 贵的仪器， 恒温水浴锅或金属加热块就可以维持反应温度。
材料与方法：
( 1 ) 试剂： BioLabs BstDNA聚合酶大片段 (NEW ENGLAND生产）和 10倍 ThermoPol Buffer溶液； BT11特异性引物； 甜菜碱溶液； MgS04溶液； dNTPs;
( 2 )扩增反应体系： 扩增反应的总体积为 25 μί, 其各种成分分别 为： 10 ThermoPol Buffer 2.5 μ L, 4mol/L甜菜碱 6.25 μ L, 0.2mol/L gS040.25 μ L, 引物混合液 Ι μί, 10 μ mol/L dNTPs 3.5 μ L, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段 1- 2μί, 模板 DNA 1-5 pL, 用灭菌去离子水补齐到 25 μ L, 充分混匀， 4000- 8000rpm离心 5- 10秒后上机；
( 3)扩增反应过程： 在 63- 65 °C进行 45- 6Gmin, 并且在 80°C持续 2min, 4°C保存；
( 4 )扩增反应结束， 取反应产物 3-25 用不同的检测方法判断扩 增与否。
4、 扩增结果观察
有三种观察方法， 适合不同情况下进行：
( 1 )使用 2%琼脂糖凝胶， 加入 ΕΒ染色剂， 100V电泳 50min, 在紫外 灯下观察。 因为扩增反应会产生不同长度的茎环结构， 因此在电泳图谱 中显示为从点样孔处开始的弥散和阶梯状条带现象。 结果见图 1。
( 2 ) 由于反应形成大量双链 DNA产物， 所以可直接向扩增管中加入 荧光染料 SYBR Green, 通过肉眼观察， 无扩增反应的反应管呈橙色， 有 扩增反应的反应管变为绿色。 结果见图 2。
( 3 )检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来 进行。 在反应中， 在核酸大量合成时， 产生副产物焦磷酸镁沉淀， 可以 用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的混浊度， 即可判断扩增与否。
本发明用于转基因玉米 BT11检测的扩增方法， 具有以下优点：
(1)操作简便： 不需要复杂的仪器， 只需一恒定温度就能反应。
(2)高特异性： 该技术由 4条引物扩增靶序列的 6个区段， 因此具有高 度特异性。
(3) 快速高效： 整个扩增不到 lh即可完成， 产量可达到 10'- 10'°个拷 贝；
(4)鉴定简便： 可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的浊度或者通过 SYBR Green颜色变化判断扩增与否。
附图说明 图 1为扩增产物的电泳分析图谱，自左向右依次为 Marker、空白对照、 阴性对照、 阴性样品、 阳性对照和阳性样品；
图 2为扩增产物加入 SYBR Green结果图， 左为阳性对照， 右为阴性对 照；
图 3为扩增产物加入 SYBR Green结果图， 从左边依次为阴性对照、 阳 性对照、 待测样品；
图 4为扩增产物加入 SYBR Green结果图， 由左至右为阴性对照、 阳性 对照、 待测样品 1和待测样品 2；
图 5为扩增产物的电泳分析图谱， 由左至右： 阴性对照、 阳性对照、 待测样品 1、 待测样品 2、 待测样品 3、 DL2000 DNA Marker;
图 6为实施例 4， 采用本发明方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析， 紫外灯下观察结果， 其中 M, DL2000 DNA, Marker; 1, 5%; 2, 1%; 3, 0.5%; 4， 0.1%; 5, 0.05%; 6, 0.01%; 7， 0.005%; 8, 0.001%; 9, 0.0005%; 10, 阴性对照；
图 7为实施例 4, 常规定性 PCR方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析， 紫外灯下观察结果。 其中 M, DL2000 DNA, Marker; 1, 5%; 2, 1%; 3, 0.5%; 4, 0.1%; 5， 0.05%; 6, 0.01%; 7, 0.005%; 8, 0.001%; 9, 0.0005%; 10, 阴性对照。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法， 下面对本发明的试验方法做 以详细的说明， 在此需加以说明的是： 本发明所述的引物序列见表 1。
实施例 1:
( 1 ) 试剂： BioLabs ( NEW ENGLAND) 生产的 Bst DNA聚合醉大片段 和 10倍 ThermoPol Buffer溶液； 特异性引物混合液； 4mol/L甜菜碱溶液； 0.2mol/L MgS04溶液。
( 2 )扩增反应体系： 扩增反应的总体积为 25 μί, 其各种成分分别 为： 10 X ThermoPol Buffer 2.5 μ L, 4mol/L甜菜碱 6.25 μ L, 0.2mol/L MgS040.25 μ L, 混合引物 1 μ 10 μηιοΙ/L dNTPs 3.5 μ L, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段 1 μί， 模板 DNA 1 ML, 用灭菌去离子水 补齐到 25 μί， 充分混匀， 4000rpm离心 5秒后上机；
( 3)扩增反应程序： 在 63°C进行 60min, 并且在 80°C保温 2min, 4 °C, 保存。
( 4 )扩增反应结束， 取反应产物 15 μί， 直接向扩增管中加入荧光 染料 1 1000 X SYBR Green, 振荡混匀， 肉眼观察结果。 无扩增反应的 反应管呈橙黄色， 有扩增反应的反应管将变为绿色。 结果见图 3, 由图可 见， 待测样品为阳性样品， 含有转基因玉米 BT11成份。
实施例 2:
( 1 )试剂： BioLabs (NEW ENGLAND)生产的 Bst DNA聚合酶大片段 和 10倍 ThermoPol Buffer溶液； BTl 1特异性引物混合液； 4mol/L甜菜碱 溶液； 0.2mol/L MgS04溶液。
(2 )扩增反应体系： 扩增反应的总体积为 25 μί, 其各种成分分别 为： 10 X ThermoPol Buffer 2.5 μ L, 4mol/L甜菜碱 6.25 μ L, 0.2mol/L MgS04, 混合引物 0.25μί , 10 μ mol/L dNTPs 3.5 μ L, 8000U/L Bst DNA 聚合酶大片段 2μί, 模板 DNA 2yL， 用灭菌去离子水补齐到 25 μ L, 充分 混匀， 8000rpm离心 10秒后上机。
( 3)扩增反应程序： 在 65°C进行 45min， 并且在 80°C保温 2min, 4 V, 保存。
(4 )扩增反应结束， 取反应产物 15 L, 直接向扩增管中加入荧光 染料 2 μ L 1000 X SYBR Green, 振荡混匀， 肉眼观察结果。 无扩增反应的 反应管呈橙黄色， 有扩增反应的反应管将变为绿色。 结果见图 4， 由图可 以看出， 待测样品 1为阳性样品， 不含有转基因玉米 BT11成分， 样品 2不 含有转基因玉米 BT11成分。
实施例 3:
( 1 )试剂： BioLabs ( NEW ENGLAND) 生产的 Bst DNA聚合酶大片段 和 10倍 ThermoPol Buffer溶液； 特异性引物混合液； 4mol /L甜菜碱溶液；
0.2mol/L MgS04溶液。
(2 )扩增反应体系： 扩增反应的总体积为 25 μί， 其各种成分分别 为： 10 X ThermoPol Buffer 2.5 μ L, ½ol/L甜菜碱 6.25 μ L, 0.2mol/L gS04, 混合引物 0.25μί , 10 μ mol /L dNTPs 3.5 μ L, 8000U/L Bst DNA 聚合酶大片段 2μί, 模板 DNA 5 L, 用灭菌去离子水补齐到 25 μ L, 混合 均匀， 8000rpm离心 10秒后上机。
( 3)扩增反应程序： 在 63°C进行 60min, 并且在 80°C保温 2min， 4 °C, 保存；
(4 )扩增反应结束， 取反应产物 25 经 2%琼脂糖凝胶电泳分析， 紫外灯下观察结果。 无扩增反应的反应管无明显条带， 有扩增反应的反 应管出现阶梯状条带。结果见图 5，三个样品都含有转基因玉米 BT11成分。
实施例 4: 的对比：
( 1 ) 本发明方法试剂： BioLabs ( NEW ENGLAND) 生产的 Bst DNA聚 合醉大片段和 10倍 ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液； 4mol/L甜 菜碱溶液； 0.2mol/LMgS04溶液； DNA模板包括含有转基因玉米 BT11成份 5%、 1%、 0.5°/。、 0.1%、 0.05%、 0.01%, 0.005%, 0.001%、 0.0005%, 0% 的样品。
( 2 )本发明扩增反应体系： 扩增反应的总体积为 25 μί, 其各种成 分分别为： 10 X ThermoPol Buffer 2.5 μ L, 4mol/L 甜菜碱 6.25 μ L, 0.2mol/L MgS04 0.25 μ L, 混合引物 1 μ ΙΟμηιοΙ/L dNTPs 3.5 μ L, 8000U/LBst DNA聚合酶大片段 2 μί， 模板 DNA 5 μ L, 用灭菌去离子水 补 齐到 25 μί, 混合均匀后充分混匀， 8000rpm离心 10秒后上机；
( 3)本发明扩增反应程序：在 63°C进行 6Qmin,并且在 80°C保温 2min,
4°C, 保存；
( 4 )本发明扩增反应结束， 取反应产物 4μί, 经 2%琼脂糖凝胶电泳 分析， 紫外灯下观察结果。 无扩增反应的反应管无明显条带， 有扩增反 应的反应管出现阶梯状条带。 结果见图 6: , DL2000 DNA, Marker; 1, 5%; 2, 1%; 3, 0.5%; 4, 0.1%; 5， 0.05%; 6, 0.01%; 7, 0.005%; 8, 0.001%; 9, 0.0005%; 10, 阴性对照。
( 5 ) PCR方法： 反应引物采用本发明反应中一对外引物扩增目标基 因。 PCR反应为 25 μ L体系， 10 χ PCR buffer ( Promega ) 2.5 μ L, 10 mM dNTPs ( Promega ) 0.5 μ L, 上游和下游引物 （10 mM)各 0.5 μ L, Taq 酶（5 U/ L, Promega ) 0.5 μί, DNA模板 Ι μί, 灭菌去离子水 19.5 μ L。 反应程序为 95 °C预变性 5min; 95 °C变性 30 s, 52"C退火 30 s, 72 °C延伸 30 s, 35个循环； 72 °C延伸 7 min。 PCR产物取 10 于 2%琼脂糖 凝胶电泳， 100 V电压下 40min， 通过凝胶成像分析仪观察， 结果见图 7: M, DL2000 DNA, Marker; 1, 5%; 2, 1%; 3, 0.5%; 4, 0.1%; 5， 0.05%; 6, 0.01%; 7, 0.005%; 8, 0.001%; 9, 0.0005%; 10, 阴性对照。
由两种方法比较可以看出，本发明的方法灵敏度明显高于 PCR方法的 敏感度， 能检测出转基因玉米 BT 11含量更低的样品。
在详细说明的较佳实施例之后， 熟悉该项技术人士可清楚地了解， 在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改， 凡依据本 发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、 等同变化与修饰， 均属于本发明技术方案的范围。 且本发明亦不受说明书中所举实例实施 方式的限制。

Claims

1、 用于检测转基因五米 BT11的特异性引物， 其特征在于包括外引 物正向序列： 5，- AGGGATTCTTGGATTTTTGG- 3， , 外引物反向序列： 5，- AGAAATGGTTTCCACCAGAA- 3， ； 内 引 物 正 向 序 列 ： 5,- ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGT- 3，, 内引物反
5 向序列： 5，- GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA- 3，。
2、 一种采用权利要求 1所述特异性引物检测转基因玉米 BT11的方 法， 其特征在于包括如下步骤：
( 1 )将引物混合溶液及一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶反应体 系， 加入样品 DNA模板， 在 63-65 °C, 进行 45- 60min, 并且在 80 °C持续
10 2min, 4°C保存；
其中的扩增反应体系： 扩增反应的总体积为 25μί, 其各种成分分 别为： 10 X ThermoPol Buffer 2.5 μ L, 4mol/L甜菜碱 6.25 μ L， 0.2mol/L gSO, 0.25 μ L, 引物混合液 Ι μί, 10 μ mo 1 /L dNTPs 3.5 μ L， 链置换活 性的 DNA聚合酶 1-2 μί, 模板 DNA 1- 5 μ L， 用灭菌去离子水补齐到 25
15 μ L, 混合均匀， 4000- 8000rpm离心 5- 10秒后上机；
( 2)扩增反应结束， 取反应产物 3-25 μί, 采用不同方法判断扩增与 否， 包括： 直接向扩增管中加入荧光染料 SYBR Green, 通过颜色变化观 察有无扩增反应； 或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有 无扩增反应； 或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
20 3、 如权利要求 2所述的检测转基因玉米 BT11的方法， 其中所述的 引物混合溶液为： 将合成的引物粉末分别配成浓度为 ΙΟΟμηιοΙ/L 的母 液， 然后取外引物各 Ι μί, 内引物各 8μί, 加灭菌去离子水 2μί， 充 分混合， 制得引物混合溶液。
?5
4、 如权利要求 2所述的检测转基因玉米 BT11的方法， 其中所述的
" 荧光染料 SYBR Green浓度为 1000倍， 加入量为 1-2 μ L。
5、 如权利要求 2所述的检测转基因玉米 BT11的方法， 其中所述的 链置换活性的 DNA聚合酶为 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段 1-2 μ L。
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