CN108251501A - 一种转基因作物双重基因的可视化定量筛查新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明所建立的基于超快速PCR和胶体金免疫层析试纸的筛查方法和生物传感器，使转基因作物的整体筛查时间控制在10分钟左右，比传统方法更快捷、更灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在转基因作物快速筛查领域，具有非常好的应用前景。

Description

一种转基因作物双重基因的可视化定量筛查新方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种定量筛查转基因作物双重基因的可视化新方法。
背景技术
自1994年转基因番茄在美国首次商业化种植以来,转基因技术在农业生产领域得到了快速的应用与发展,转基因作物的种植面积逐年扩大,已经对现代农业产生了巨大的冲击和深刻的影响。据国际农业生物技术应用服务组织统计,2014年种植转基因作物的国家达到28个,并且全球转基因作物种植面积由1996年的170万公顷增加到2014年的1.81亿公顷,转基因作物的种植面积增加超过100倍。随着转基因作物种植的迅猛发展,关于转基因生物及其产品成分食用和环境安全性的争议也与日俱增,相应的争议事件也频频出现。巴西坚果过敏事件、帝王蝶事件、墨西哥玉米转基因污染事件、转基因玉米MON863对小鼠肝肾毒性事件、食用转基因玉米Mon810后小鼠免疫表型异常事件及孕妇胎儿血液CryAb1毒素(Bt蛋白)事件等。虽然以上种种争议事件后续都被证实缺乏实验设计、统计或结论的科学性,或者缺少官方正面申明,但是关于对转基因生物及其产品成分食用和环境安全性的怀疑从未停息,还有愈演愈烈的趋势。因此,世界各国都在不同程度上制订了相应的管理制度,主要包括安全性评价制度和转基因成分标识制度等。由于不同国家和地区在转基因产品的阈值范围、标识方式等管理制度上的差异,直接关系到转基因产品的进出口检疫、国际贸易互认等诸多问题,加之转基因生物及其产品成分食用和环境安全性越来越被社会公众所广泛关注,直接推动了转基因检测技术近年来的快速发展和广泛应用。目前国内外对转基因作物及其相关制品的检测主要是基于外源蛋白靶标和外源核酸成分的检测来展开的,建立了一系列常见的快速、灵敏的转基因定性和定量检测技术,如酶联免疫吸附技术(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、PCR技术、等温扩增技术(isothermalamplification)、基因芯片技术(genechip)及数字PCR技术(digital PCR,d PCR)等,但在双重基因的超快速、定量、可视化筛查方面还存在诸多问题。
发明内容
本发明建立的可视化定量筛查新方法，克服了现有筛查技术的不足，实现了对转基因作物进行准确、快速、简单高效的筛查和分析。
本发明的一个目的是提供一种基因筛查方法，所述方法包括超快速PCR反应,所述超快速PCR反应的反应体系包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列，和/或所述下游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述超快速PCR反应的反应过程包括：90-98℃，2-6s；50-60℃，2-8s；共20-40个循环。
具体的，所述免疫标记包括生物素、Cy5和/或地高辛。
具体的，所述标记可在所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列的5’端、3’端和/或任意一个核苷酸上进行标记；所述任一标记的标记方法均属于现有技术。
所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列具体包括根据待测目标的特征序列所设计的引物序列；所述特征序列包括现有技术或公知常识所定义的特征序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法；所述待测目标包括转基因产品；再具体的，所述待测目标包括转基因产品中的外源基因。
具体的，所述超快速PCR反应的反应体系中上游引物和下游引物的浓度为普通PCR浓度的10倍以上；再具体的，为20倍；所述超快速PCR反应的反应体系中还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的浓度为普通PCR浓度的10倍以上，再具体的，为60倍。
具体的，所述超快速PCR反应的反应过程包括：95℃，4s；58℃，6s；共30个循环。
具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID№：1和/或SEQ ID№：3所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
2)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID№：2和/或SEQ ID№：4所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID№：1和/或SEQ ID№：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：1和/或SEQID№：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
4)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID№：2和/或SEQ ID№：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：2和/或SEQID№：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物。
具体的，所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。
具体的，所述免疫标记包括生物素、Cy5和/或地高辛。
具体的，所述标记可在所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列的5’端、3’端和/或任意一个核苷酸上进行标记；所述任一标记的标记方法均属于现有技术。
所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列具体包括根据待测目标的特征序列所设计的引物序列；所述特征序列包括现有技术或公知常识所定义的特征序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法；所述待测目标包括转基因产品；再具体的，所述待测目标包括转基因产品中的外源基因。
再具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID№：1和/或SEQ ID№：3所示的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；
2)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID№：2和/或SEQ ID№：4所示的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID№：1和/或SEQ ID№：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：1和/或SEQID№：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；
4)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID№：2和/或SEQ ID№：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：2和/或SEQID№：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物；
具体的，所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。
本发明的另一个目的是提供一种基因筛查方法，所述方法包括使用胶体金免疫层析试纸进行筛查，所述胶体金免疫层析试纸包括：试纸的C线含有生物素二抗，试纸的T线含有Cy5的抗体和/或地高辛的抗体，试纸的结合垫含有用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子。
所述生物素二抗、Cy5的抗体和/或地高辛的抗体喷涂溶液的浓度为1.0mg/mL,喷涂量为1.0μL/cm；所述用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子的喷涂量为2.5μL/cm。
本发明的还一个目的是提供一种基因筛查方法，所述方法包括先通过本发明任一所述方法扩增待测目标，然后再通过胶体金免疫层析试纸检测待测目标。
具体的，所述胶体金免疫层析试纸包括：试纸的C线含有本发明所述的至少一个免疫标记的二抗，试纸的T线含有本发明所述的至少一个免疫标记的抗体，试纸的结合垫含有用本发明所述的至少一个免疫标记的抗体制备的胶体金纳米粒子。
再具体的，所述胶体金免疫层析试纸包括：试纸的C线含有生物素二抗，试纸的T线含有Cy5的抗体和/或地高辛的抗体，试纸的结合垫含有用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子。
可选的，所述生物素二抗、Cy5的抗体和/或地高辛的抗体喷涂溶液的浓度为1.0mg/mL,喷涂量为1.0μL/cm；所述用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子的喷涂量为2.5μL/cm。
具体的，所述方法还包括下述1)-2)中至少一种：
1)通过胶体金免疫层析试纸的颜色变化判断待测物中是否含有待测目标；
具体的，当胶体金免疫层析试纸的颜色发生变化时，判断待测物中含有待测目标；再具体的，当胶体金免疫层析试纸的T线为红色时，判断待测物中含有待测目标；
2)通过增加反应体系中的上游引物和下游引物的种类来实现双重或多重检测。
所述种类包括：可实现同一待测目标的扩增的为同一种类上游引物和下游引物，反之，可实现不同待测目标的扩增的为不同种类的上游引物和下游引物。
本发明的再一个目的是提供一种试剂盒和/或生物传感器，所述试剂盒和/或生物传感器包括下述1)和2)：
1)上游引物和下游引物：所述上游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列，和/或所述下游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；
2)胶体金免疫层析试纸：试纸的C线含有1)所述中的至少一个免疫标记的二抗，试纸的T线含有1)所述中的至少一个免疫标记的抗体，试纸的结合垫含有用1)所述中的至少一个免疫标记的抗体制备的胶体金纳米粒子。
具体的，所述免疫标记包括生物素、Cy5和/或地高辛；
具体的，所述标记可在所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列的5’端、3’端和/或任意一个核苷酸上进行标记；所述任一标记的标记方法均属于现有技术。
所述可特异性扩增待测目标的核苷酸序列具体包括根据待测目标的特征序列所设计的引物序列；所述特征序列包括现有技术或公知常识所定义的特征序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法；所述待测目标包括转基因产品；再具体的，所述待测目标包括转基因产品中的外源基因。
具体的，所述上游引物和下游引物还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID№：1和/或SEQ ID№：3所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
2)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID№：2和/或SEQ ID№：4所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID№：1和/或SEQ ID№：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：1和/或SEQID№：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
4)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID№：2和/或SEQ ID№：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：2和/或SEQID№：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物。
所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。
再具体的，所述上游引物和下游引物还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID№：1和/或SEQ ID№：3所示的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；
2)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID№：2和/或SEQ ID№：4所示的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID№：1和/或SEQ ID№：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：1和/或SEQID№：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；
4)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID№：2和/或SEQ ID№：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：2和/或SEQID№：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物；
所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。
具体的，所述胶体金免疫层析试纸包括：试纸的C线含有生物素二抗，试纸的T线含有Cy5的抗体和/或地高辛的抗体，试纸的结合垫含有用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子。
所述生物素二抗、Cy5的抗体和/或地高辛的抗体喷涂溶液的浓度为1.0mg/mL,喷涂量为1.0μL/cm；所述用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子的喷涂量为2.5μL/cm。
本发明的最后一个目的是提供本发明所述方法中的至少一种、或本发明所述试剂盒和/或生物传感器中的至少一种的应用。
所述应用包括下述1)-4)中的至少一种应用：
1)筛查转基因产品；
2)在制备筛查转基因产品的产品和/或相关产品中的应用；
3)转基因的双重或多重筛查；
4)在制备用于转基因产品的双重或多重筛查的产品和/或相关产品中的应用。
具体的，所述转基因产品包括转基因作物；再具体的，所述转基因作物包括基因组中含花椰菜花叶病毒的35s启动子和/或胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的作物；所述基因组具体包括种子的基因组。
可选的，所述任一应用不包括中国专利法第二十五条所述的疾病的诊断和治疗方法。
本发明建立的一种基于超快速PCR的双重比色传感新方法：
(1)该方法建立了超快速PCR反应体系，将耗时3小时左右的传统PCR过程缩减到5分钟，显著减少了PCR反应的用时；
(2)将超快速PCR反应体系搭载胶体金免疫层析试纸显色模块，解决了传统PCR难于可视化定量检测的难题；
(3)将双重超快速PCR反应体系搭载双重胶体金免疫层析试纸显色模块，不仅实现了转基因双重基因的筛查，而且使整个筛查时间控制在10分钟左右，实现了双重基因的超快速、定量、可视化筛查。
本发明的一个具体实施例提供了一种基于双重超快速PCR的双重比色传感新方法，用于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子、胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的可视化超灵敏检测。该新方法根据花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子、胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的基因序列，设计超快速聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的双重扩增引物，同时通过该引物可实现双重胶体金免疫层析试纸的显色。
本发明具有下述有益技术效果：
1)本发明所建立的筛查方法和生物传感器，使整个筛查时间控制在10分钟左右，比传统方法更快捷、更灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在转基因作物快速筛查领域，具有非常好的应用前景。
2)本发明所建立的筛查方法和生物传感器可同时实现对花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子、胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的双重特异性检测，检测的特异性好、灵敏度高，检测结果可靠、肉眼即可辨别，检测过程快捷方便，在日常监控或市场筛查等方面具有重要意义。具体的，使用CBH-351-玉米种子基因组进行灵敏度实验，本发明所建立的筛查方法和生物传感器对花椰菜花叶病毒(CaMV)的胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的检测限为0.05％(质量百分浓度)，35s启动子的检测限为0.05％(质量百分浓度)；此外，使用59122-玉米种子，GA21-玉米种子，MON809-玉米种子，32138-玉米种子，3272-玉米种子，CBH-351-玉米种子，MON87411-玉米种子，33121-玉米种子进行特异性实验，结果表明本发明所建立的筛查方法和生物传感器对可同时实现花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子、胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的双重特异性检测。
3)本发明所建立的筛查方法和生物传感器，解决了传统PCR难于可视化定量检测的难题，实现了双重基因的超快速、定量、可视化筛查。
附图说明
图1为超快速PCR装置的结构图。
图2为双重超快速PCR反应的扩增效果验证结果图；其中，泳道1为DNA分子量标准；泳道2为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子的阴性对照(不添加花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子模板)；泳道3为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子的阳性样品(添加花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子模板)；泳道4为胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的阴性对照(不添加胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子模板)；泳道5为胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的阳性样品(添加胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子模板)；泳道6为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子、胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的阳性样品(添加花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子模板、添加胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子模板)。
图3为灵敏度实验结果图，其中A、B、C、D、E、F依次为模板中转基因成分的含量分别为100％、50％、5％、0.5％、0.05％、0％的检测结果，T1线为胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的检测结果，T2线为35s启动子的检测结果，C线为控制线。
图4为特异性实验结果图，其中A、B、C、D、E、F、G、H依次为转基因作物59122-玉米种子、GA21-玉米种子、MON809-玉米种子、32138-玉米种子、3272-玉米种子、CBH-351-玉米种子、MON87411-玉米种子、33121-玉米种子的检测结果，T1线为胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的检测结果，T2线为35s启动子的检测结果，C线为控制线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种用于筛查花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子、胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的超快速PCR的双重比色传感新方法的建立
(一)实验材料
本实施例所设计的引物的核苷酸序列见表1和序列表。
表1
表1中，上游引物35s-F为通过在序列表中SEQ ID№：1所示的核苷酸序列的5’端进行生物素(Biotin)标记后得到的；下游引物35s-R为通过在序列表中SEQ ID№：2所示的核苷酸序列的3’端进行Cy5标记后得到的；上游引物Nos-F为通过在序列表中SEQ ID№：3所示的核苷酸序列的5’端进行生物素(Biotin)标记后得到的；上游引物Nos-R为通过在序列表中SEQ ID№：4所示的核苷酸序列的3’端进行地高辛(Digoxin)标记后得到的。
表1中所列的序列均为人工合成并标记。
rTaq DNA聚合酶,10×PCR Buffer(20mM Mg2+Plus)与dNTP Mixture(2.5mM)均购自宝生物公司(TAKaRa)。四氯金酸三水合物、柠檬酸三钠、磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M)、牛血清白蛋白(BSA)、吐温20，Cy5-抗体、地高辛-抗体、生物素抗体均购自Sigma公司。塑料背板、结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫与吸水垫均购自Millipore公司。实验用水均来自Milli-Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。
(二)超快速PCR装置的搭建
超快速PCR装置的主要结构如图1所示，其具体的结构、连接方式和工作原理、工作过程包括：
超快速PCR装置采用Light Cycler型号的毛细管(20uL，04 929 292 001，Roche)作为PCR样品室，通过快速离心的方式，样品会分别聚集到各个毛细管一端，离心完成后带有样品的毛细管被固定在塑料支架上。塑料支架连接到步进电机(42JSF630AS-1000，JustMotioin Control)上，由该步进电机带动固定在塑料支架上的毛细管样品室在95℃的高温水浴锅和58℃的中温水浴锅之间循环转换，实现超快速PCR反应过程中的反应温度变化及控制。所述步进电机由开关电源(S-100-24，Elecall)进行供电，采用直流伺服电机驱动器(YZ-ACSD60，Moving)以及Labview(version 2014)实现步进电机的上述循环转换的频率或时间的控制。温度测量利用封装在毛细管中的热电偶来实现。热电偶信号的放大及线性化处理过程则利用温度变送器(SBWR-2260，K，Yuancheng)进行传递并采用Arduino UNO v1.0芯片进行处理。Arduino UNO芯片将接收到的温度的模拟信号转换成数字信号，然后由Arduino IDE(version 1.8.1)模块执行运算。
(三)双重超快速PCR反应
1)配制双重超快速PCR反应体系，具体见表2：
表2
将不添加花椰菜花叶病毒的35s启动子的玉米基因组、添加花椰菜花叶病毒的35s启动子的玉米基因组、不添加花椰菜花叶病毒的胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的玉米基因组、添加花椰菜花叶病毒的胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的玉米基因组、同时添加花椰菜花叶病毒的35s启动子和胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的玉米基因组，分别作为表2中的模板。表2中的上游引物和下游引物具体为上述表1中所列的引物(35s-F、35s-R、Nos-F、Nos-R)。
2)双重超快速PCR反应过程：
按照表2，在冰上配制10微升反应体系，迅速置于步骤(二)搭建的超快速PCR反应装置中进行温度控制，温度控制及循环数见表3：
表3
3)双重超快速PCR反应的扩增效果验证：
完成上述双重超快速PCR反应过程后，使用2％溴化乙锭预染色的琼脂糖凝胶电泳验证双重超快速PCR反应体系的扩增效果，电泳条件：130V for 25min，拍照系统：Molecular Imager Gel Doc XR(Bio-Rad)。
双重超快速PCR反应的扩增效果验证结果见图2，图2结果表明：双重超快速PCR反应体系实现了花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子、胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的有效扩增。
(四)胶体金免疫层析试纸显色模块的制备
1)金纳米粒子的制备参照文献：He,Y.,Zhang,S.,Zhang,X.,Baloda,M.,Gurung,A.S.,Xu,H.,Zhang,X.,Liu,G.,2011.Biosensor and Bioelectronics,26(5),2018-2024.
2)金标抗体的制备：
将1μg生物素抗体加入1mL制备的金纳米粒子储液中，于室温下缓慢震荡1h；之后，在反应体系中缓慢加入质量百分含量10％BSA与质量百分含量10％NaCl，于室温下缓慢震荡2h之后，12000g离心20min，丢掉上清，将红棕色的金标抗体沉淀置于4℃备用。
3)分别将Cy5-抗体、地高辛-抗体和生物素二抗用PBS(pH 7.4)稀释至1.0mg mL﹣1。分别将稀释好的Cy5-抗体、地高辛-抗体溶液装入BIODOT划膜机喷头2，分别固定在距NC膜下边缘1.1cm、1.6cm的位置上(T线的位置)，稀释好的生物素二抗溶液装入BIODOT划膜机喷头1，固定在远离NC膜下边缘端并距T线(为距NC膜下边缘1.6cm的T线)4.5mm的位置上(C线的位置)，按1.0μL/cm分别喷涂在NC膜上。将已喷好的NC膜37℃烘干过夜后备用。用切条机切成3.8mm宽的试纸，将切好的试纸放入装有干燥剂的包装袋内。将上述步骤2)制备的金标抗体装入BIODOT划膜机喷头3，固定在距结合垫下边缘0.5cm的位置上，按2.5μL/cm喷涂在结合垫上，将已喷好的结合垫37℃烘干过夜后备用。将制备好的NC膜和结合垫按照现有方法制备成胶体金免疫层析试纸，具体可选：将制备好的NC膜固定到塑料低衬上，再将制备好的结合垫覆盖到NC膜下边缘一端，将吸水垫(纸)覆盖到NC膜上边缘一端，最后覆盖保护膜，制备成胶体金免疫层析试纸备用。
(五)可视化筛查
将上述步骤(三)反应完成后的10μL双重超快速PCR反应体系与60μL检测缓冲液(4×SSC,质量百分含量2％BSA,质量百分含量0.05％Tween-20,pH7.0)混合均匀，将上述步骤(四)制备的胶体金免疫层析试纸浸入其中，室温反应5min，观察结果即可。
实施例2、灵敏度实验
将转基因作物CBH-351-玉米种子使用球磨机研磨成粉，采用全式金公司植物基因组提取试剂盒提取基因组，参照上述实施例1步骤(三)所述双重超快速PCR反应进行扩增反应，其中将经过梯度稀释的基因组分别作为模板，模板的用量即经梯度稀释后其转基因成分的含量分别为：(A)100％,(B)50％(C)5％,(D)0.5％,(E)0.05％,(F)0％，所述百分数为质量百分数。
扩增反应完成后，分别将10μL双重超快速PCR反应体系与60μL检测缓冲液(4×SSC,质量百分含量2％BSA,质量百分含量0.05％Tween-20,pH 7.0)混合均匀，将上述制备的胶体金免疫层析试纸浸入其中，室温反应5min，观察结果。
实验结果见图3，由图3可知，胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的检测限为0.05％，35s启动子的检测限为0.05％。该结果表明本发明所建立的筛查方法和生物传感器灵敏度高。
实施例3、特异性实验
将转基因作物59122-玉米种子，GA21-玉米种子，MON809-玉米种子，32138-玉米种子，3272-玉米种子，CBH-351-玉米种子，MON87411-玉米种子，33121-玉米种子使用球磨机研磨成粉，采用全式金公司植物基因组提取试剂盒分别提取基因组，将提取的基因组分别作为模板(每个模板添加2uL)，参照上述实施例1步骤(三)所述双重超快速PCR反应分别进行扩增反应。
扩增反应完成后，分别将10μL双重超快速PCR反应体系与60μL检测缓冲液(4×SSC,质量百分含量2％BSA,质量百分含量0.05％Tween-20,pH 7.0)混合均匀，将上述制备的胶体金免疫层析试纸浸入其中，室温反应5min，观察结果。
实验结果如图4和表4所示。该结果表明本发明所建立的筛查方法和生物传感器对可同时实现花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子、胭脂碱合酶基因(Nos)的终止子的双重特异性检测。
表4
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种转基因作物双重基因的可视化定量筛查新方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctcctacaa atgccatcat tgc 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatagtggga ttgtgcgtca tccc 24
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcttgcgat gattatcata taatttctg 29
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgctatattt tgttttctat cgcgt 25

Claims (10)

1.一种基因筛查方法，其特征在于，所述方法包括超快速PCR反应,所述超快速PCR反应的反应体系包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列，和/或所述下游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述超快速PCR反应的反应过程包括：90-98℃，2-6s；50-60℃，2-8s；共20-40个循环。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超快速PCR反应的反应过程包括：95℃，4s；58℃，6s；共30个循环。
3.根据权利要求1和/或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：3所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
2)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID №：2和/或SEQ ID №：4所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1和/或SEQID №：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
4)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID №：2和/或SEQ ID №：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：2和/或SEQID №：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物。
4.根据权利要求1、2和/或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：3所示的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；
2)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID №：2和/或SEQ ID №：4所示的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1和/或SEQID №：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的5’端第一个核苷酸进行生物素标记后得到的引物；
4)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID №：2和/或SEQ ID №：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：2和/或SEQID №：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的3’端最后一个核苷酸进行Cy5和/或地高辛标记后得到的引物。
5.一种基因筛查方法，所述方法包括使用胶体金免疫层析试纸进行筛查，其特征在于，所述胶体金免疫层析试纸包括：试纸的C线含有生物素二抗，试纸的T线含有Cy5的抗体和/或地高辛的抗体，试纸的结合垫含有用生物素的抗体制备的胶体金纳米粒子。
6.一种基因筛查方法，其特征在于，所述方法包括先通过权利要求1、2、3和/或4所述方法扩增待测目标，然后再通过胶体金免疫层析试纸检测待测目标。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胶体金免疫层析试纸包括：试纸的C线含有权利要求1所述的至少一个免疫标记的二抗，试纸的T线含有权利要求1所述的至少一个免疫标记的抗体，试纸的结合垫含有用权利要求1所述的至少一个免疫标记的抗体制备的胶体金纳米粒子。
8.根据权利要求6和/或7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-2)中至少一种：
1)通过胶体金免疫层析试纸的颜色变化判断待测物中是否含有待测目标；
2)通过增加反应体系中的上游引物和下游引物的种类来实现双重或多重检测。
9.一种试剂盒和/或生物传感器，其特征在于，所述试剂盒和/或生物传感器包括下述1)和2)：
1)上游引物和下游引物：所述上游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列，和/或所述下游引物包括带有免疫标记的可特异性扩增待测目标的核苷酸序列；所述待测目标为转基因产品和/或转基因产品中的外源基因；
2)胶体金免疫层析试纸：试纸的C线含有1)所述中的至少一个免疫标记的二抗，试纸的T线含有1)所述中的至少一个免疫标记的抗体，试纸的结合垫含有用1)所述中的至少一个免疫标记的抗体制备的胶体金纳米粒子；
具体的，所述上游引物和下游引物包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：3所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
2)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID №：2和/或SEQ ID №：4所示的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
3)所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID №：1和/或SEQ ID №：3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1和/或SEQID №：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物；
4)所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID №：2和/或SEQ ID №：4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：2和/或SEQID №：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列进行免疫标记后得到的引物。
10.权利要求1、2和/或3所述方法、权利要求4和/或5所述方法、权利要求6和/或7所述方法、权利要求8和/或9所述试剂盒和/或生物传感器的应用。
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