CN103509821B - 一种植物磷素营养快速诊断和可视化动态监测方法及其重组表达载体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物磷素营养快速诊断和可视化动态监测方法及其重组表达载体的应用。用特异地响应缺磷信号的启动子调控植物花青素合成途径基因表达的重组表达载体转化到植物中获得转基因植物，在磷素供应充足时，转基因植物叶片保持原有绿色；在磷素养分缺乏时，启动子特异的驱动花青素合成基因的过量表达，使转基因植物叶片上花青素大量积累，植物叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因植物可在短期内恢复绿色，从而达到可视化动态监测植物磷素养分的目的。本发明方法可灵敏而专一的监测植物体内磷素养分的动态变化，同时结合遥感技术的应用可实现大面积快速监测植物磷素养分供应状况，从而指导田间合理施肥。

Description

一种植物磷素营养快速诊断和可视化动态监测方法及其重组表达载体的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法及其重组表达载体的应用。

背景技术

磷是植物生长发育过程中最为重要的大量矿质营养元素之一，广泛参与植物体内的能量转移、信号转导、生化合成等代谢过程[1,2]。然而由于磷在土壤中容易被固定和沉淀，且植物从土壤中吸收的主要是无机态正磷酸盐，因此相对于其他营养元素，磷在土壤中的移动性和有效性均很低，这也常常成为农田及自然生态系统中植物生长的主要限制因子之一[3‐5]。

施加磷肥是农业耕作系统中解决作物缺磷、提高产量和品质的重要手段。但是80%以上施加的磷肥被土壤矿物固定而不能被植物吸收利用。为了确保作物产量，农民通常在土壤中过度施加磷肥，这样极易造成土壤磷含量超标。过度施用的磷肥随着雨水的冲刷进入水体造成水体富营养化等生态环境污染问题[6]。另一方面，磷矿作为一种非可再生资源，按照目前的开采速度，世界上已探明的磷矿将趋于耗尽[7,8]。因此通过有效的生物技术手段，提高与完善磷肥的使用与管理，减少对不可再生磷资源的利用对于缓解磷资源的危机有重要意义。

在磷素养分供应不足时，植物会出现矮化，生长发育不良，叶色深绿等表型，但这些表型往往出现在缺磷严重并已影响植物生长的情况下，而此时已经滞后于最佳的施肥时间。传统的定性分析磷素养分供应状况的方法是通过测定植株叶片可提取磷含量和土壤有效磷含量来指导施肥[9]。近年来我国大力推行地“测土配方施肥”项目就是以此为基础进行的。然而这种传统的生理检测方法需要破坏性采样，且高度依赖于实验条件和设备，需要专业人员操作，并不适用于大规模简单便捷的田间监测。

随着生物技术的迅速发展，对植物缺磷信号转导途径的分子生物学研究将作物的缺磷诊断深入到了分子水平。将响应缺磷信号的基因启动子融合报告基因后转入受体植物，通过检测报告基因的表达指示植物磷素养分缺乏状况[10]。这一方法同时也应用于突变体筛选。常见的报告基因有三种：GUS（β‐glucuronidase）、LUC(Luciferase)和各种荧光蛋白(FluorescentProtein)，如黄色荧光蛋白（YFP）、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）[11]。虽然这些报告基因可灵敏的指示植物磷素养分状况，但是其测定仍然需要依赖于破坏性采样，复杂的实验操作和精密的实验仪器，同样无法实现大规模田间监测。此外由于这些报告基因大多来源于细菌基因组，其对植物体、人体及生态环境的影响具有一定的不确定性。

花青素属于黄酮类物质亚家族，通常存在于植物细胞液泡中[12]。作为植物体内的一种天然色素，花青素可促进植物授粉、种子传播、防止紫外线对植物光合组织的侵害等；在人体内，适量的花青素可抗衰老、预防心脑血管疾病，保护肝脏健康。由于花青素具有吸光性，因此其在植物体内的积累可使植物组织呈现出红、紫、蓝等肉眼易辩的色彩。目前对花青素的研究应用主要集中在培育花卉新品种及研制抗氧化保健食品等领域[13]，将其作为可视的报告基因在生物技术工程领域的应用研究仍是空白。

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发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法。

本发明的另一目的是以水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6的启动子和花椰菜花青素合成基因Pr为例，提供缺磷特异诱导调控花青素合成的植物表达载体。

本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：

一种植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，用特异地响应缺磷信号的启动子调控植物花青素合成途径相关基因表达的重组表达载体转化到植物中获得转基因植物，在磷素供应充足时，转基因植物叶片保持原有绿色；在磷素养分缺乏时，响应缺磷信号的启动子特异的驱动花青素合成基因的过量表达，使转基因植物叶片上花青素大量积累，植物叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因植物可在短期内恢复绿色，从而达到快速诊断植物磷素营养状况，以及灵敏地可视化动态监测植物磷素养分的目的。

本发明所述的植物磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，优选将水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子(为特异地响应缺磷信号的启动子)特异调控花青素合成基因Pr的植物表达载体转化到植物中获得转基因植物，在磷素供应充足时，水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT6启动子无法驱动花青素合成基因Pr表达，转基因植物叶片保持原有的绿色；在磷素缺乏时水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT6启动子特异地驱动花青素合成基因Pr在植物叶片中过量表达，使转基因植物叶片上花青素大量积累，植物叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因植物可在短期内恢复绿色，从而达到快速诊断植物磷素营养状况，以及灵敏地可视化动态监测植物磷素养分的目的。

其中，所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子特异调控花青素合成基因Pr的植物表达载体为重组表达载体pS1aG-3-OsPT6-Pr，是将OsPT6启动子和Pr基因分别插入到pS1aG-3表达载体的PacI,AscI和AscI,KpnI位点所得。

本发明方法中，植物叶片颜色的变化通过肉眼观测或者高光谱遥感技术测定。

当植物叶片颜色的变化采用高光谱遥感技术测定时，检测波段选自可见光、近红外或中红外波段，优选可见光波段，进一步优选554nm波长。

本发明方法中，当植物叶片颜色的变化采用高光谱遥感技术测定时，当554nm波长的反射率在0.16以下时，表明植物体内可提取磷含量低于40mg/kg，为缺磷状态，此时需施加磷肥；当554nm波长的反射率高于0.16时，植物体内可提取磷含量高于40mg/kg，为磷充足状态，此时不需要施加磷肥。

一种用于植物磷素营养快速可视化诊断的重组表达载体，含有水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子以及花青素合成基因Pr，且所述的花青素合成基因Pr位于水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子的下游，受水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子特异调控。

所述的重组表达载体优选以pS1aG‐3质粒为出发质粒，在PacI,AscI酶切位点插入所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子插入pS1aG‐3表达载体的，在AscI,KpnI酶切位点插入所述的花青素合成基因Pr。

所述的植物优选双子叶植物，进一步优选烟草。

本发明所述的重组表达载体的构建方法，以水稻日本晴基因组DNA为模板，以引物OsPT6‐G3‐F/OsPT6‐G3‐R克隆得到所述的OsPT6启动子，以花椰菜叶片基因组DNA为模板，以引物Pr‐G3‐F/Pr‐G3‐R克隆得到所述的Pr基因，将其分别插入到克隆载体pMD19‐T上，分别经PacI,AscI和AscI,KpnI双酶切后依次连接到pS1aG‐3表达载体进行两次重组反应而得到。

本发明所述的重组表达载体的构建方法，优选包含以下步骤：

分别提取水稻日本晴和花椰菜基因组DNA，设计引物扩增水稻OsPT6启动子和花椰菜Pr基因片段，

PT6启动子上游引物：

PT6‐G3‐F：5'‐TTAATTAATTCTTTGTTCTTCCTCCAGGCTTTC‐3'（SEQIDNO.1）

PT6启动子下游引物：

PT6‐G3‐R：5'‐GGCGCGCCGCCAGCTTAATTGCTTGCTTTGTGA‐3'（SEQIDNO.2）

Pr基因上游引物：

Pr‐G3‐F：5'‐GGCGCGCCATGGAGGGTATGTCCAAAGGGTT‐3'（SEQIDNO.3）

Pr基因下游引物：

Pr‐G3‐F：5'‐GGTACCTCAAGTTCCAGTTTCTCCATCCAA‐3'（SEQIDNO.4）

以水稻日本晴和花椰菜基因组DNA为模板进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19‐T载体，得到OsPT6‐T和Pr‐T中间载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆对其质粒进行商业化测序，OsPT6启动子序列如SEQIDNO.5所示，花椰菜Pr基因片段序列如SEQIDNO.6所示。

测序验证无误后，用PacI/AscI对OsPT6-T和pS1aG-3载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到pS1aG-3-OsPT6重组表达载体；再用AscI/KpnI对Pr-T和pS1aG-3-OsPT6表达载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到所述的重组表达载体，命名为pS1aG-3-OsPT6-Pr。

本发明所述的重组表达载体在植物磷素养分状况的可视化动态监测中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明在单子叶和双子叶植物中大量筛选响应植物缺磷信号的启动子和花青素合成基因，从中筛选到单子叶的水稻磷酸盐转运蛋白基因启动子OsPT1;6为缺磷响应启动子，其对缺磷的响应具有特异性和专一性，且在不同物种中具有功能的保守性；筛选到双子叶植物花椰菜的花青素合成途径调控基因关键基因Pr为可视化报告基因，其对多个物种的花青素合成调控途径基因具有保守的调控功能。

2、本发明筛选到的OsPT1;6启动子和Pr基因均来自于植物体（分别来自于水稻和花椰菜），不是外源基因，因此具有生物安全性。同时花青素作为天然的植物有益色素，其编码合成的花青素对植物体、人体及生态环境都不具有危害性；

3、进一步优选双子叶植物烟草为转化体，其宽大的叶片便于肉眼观测，强大的生命力适用于不同环境区域种植。

4、在此基础上构建了重组表达载体pS1aG-3-OsPT6-Pr，该重组表达载体转化入烟草基因组，在磷素缺乏时水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT6启动子特异地驱动花青素合成基因Pr在烟草叶片中过量表达，使烟草叶片上花青素大量积累，肉眼能够明显观测到烟草叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因烟草可在短期内恢复绿色，从而达到灵敏地可视化动态监测植物磷素养分的目的。

5、本发明所构建的水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子特异调控花青素合成基因Pr的植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，获得缺磷特异表达Pr基因的新种质。

6、对野生型和转基因烟草进行其他养分缺乏及非生物胁迫处理，与野生型相比，转基因烟草未发现肉眼可见的差异，表明该转基因烟草对植物磷素养分状况的指示具有特异性和专一性。

7、应用高光谱遥感技术，波长为554nm的光谱反射率与所述的转基因烟草叶片花青素含量和磷含量均呈现出很好的指数相关性（R²=0.94），可实现应用高光谱遥感技术大面积快速准确的动态检测植物磷素养分供应状况，从而指导农民合理施肥，提高磷肥利用效率，减少生产投入和环境污染的目的。

8、应用高光谱遥感技术，在土壤环境中验证所述的转基因烟草对植物体内磷含量的指示获得良好效果。当554nm波长的反射率在0.16以下时，植物体内可提取磷含量低于40mg/kg，为缺磷状态，此时需施加磷肥；当554nm波长的反射率高于0.16时，植物体内可提取磷含量高于40mg/kg，为磷充足状态，此时不需要施加磷肥。

附图说明

图1OsPT6基因启动子和Pr基因的琼脂糖凝胶电泳分析。其中1：OsPT6启动子；2：Pr基因；3：OsPT6‐T质粒PacI和AscI双酶切；4：pS1aG‐3‐OsPT6质粒PacI和AscI双酶切；5：Pr‐T质粒AscI和KpnI双酶切；6：pS1aG‐3‐OsPT6‐Pr质粒AscI和KpnI双酶切。

图2植物表达载体pS1aG‐3‐OsPT6‐Pr构建方法示意图。

图3野生型和转基因烟草的缺磷指示效果，其中WT：野生型；PT6_pro‐Pr：转基因烟草;(a)：野生型和转基因烟草的缺磷表型；(b)：野生型和转基因烟草不同叶位的缺磷表型；(c)：野生型和转基因烟草缺磷条件下Pr基因的表达量；(d)：野生型和转基因烟草不同叶位的花青素含量；(e)：野生型和转基因烟草不同叶位的磷含量。

图4转基因烟草对不同缺磷和恢复供磷时间的响应，其中d：缺磷天数；Rd：恢复供磷天数;红色箭头：第四位叶片；(a)：不同缺磷和恢复供磷时间转基因烟草的表型；(b)：不同缺磷和恢复供磷时间野生型和转基因烟草第四片叶子的花青素含量。

图5转基因烟草对不同磷浓度的响应，其中红色箭头：第四位叶片；(a)：不同磷浓度处理下转基因烟草的表型；(b)：不同磷浓度处理下野生型和转基因烟草第四片叶子的花青素含量；(c)：不同磷浓度处理下野生型和转基因烟草第四片叶子的磷含量。

图6野生型和转基因烟草中磷含量与花青素含量的相关性，其中灰色公式为野生型烟草的指数相关性方程；黑色公式为转基因烟草的指数相关性方程。

图7缺磷条件下野生型和转基因烟草中内源花青素合成调控基因的表达，（a）：烟草中内源花青素合成调控相关基因，（b）：缺磷条件下野生型和转基因烟草中内源花青素合成调控基因的相对表达量。

图8缺乏氮、钾、铁及低温、盐、干旱胁迫条件下野生型和转基因烟草的表型。

图9缺磷（0mMPi）和正常供磷（0.8mMPi）条件下野生型和转基因烟草在350‐2500nm波长范围内的光谱反射率

图10不同磷浓度梯度条件下野生型和转基因烟草在可见光（350‐700nm）范围内的光谱反射率。图a～e为磷浓度分别为0nm、0.2nm、0.4nm、0.6nm、0.8nm下野生型和转基因烟草在可见光（350‐700nm）范围内的光谱反射率，横坐标表示波长（nm），纵坐标表示反射率。

图11野生型和转基因烟草中磷含量与光谱反射率的相关性，其中灰色公式为野生型烟草的指数相关性方程；黑色公式为转基因烟草的指数相关性方程。

图12在土壤环境中验证高光谱遥感预测转基因烟草磷含量的实用性，其中(a)：施磷肥（+P）和不施磷肥（‐P）土壤中野生型和转基因烟草的表型；(b)：施磷肥（+P）和不施磷肥（‐P）土壤中转基因烟草的叶片磷含量和光谱反射率的关系。

具体实施方式

实施例1.OsPT6启动子和Pr基因的克隆：

1）基因组DNA的提取分别取自然条件下正常生长的水稻和花椰菜叶片，迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右样品，用液氮充分研磨转移至2ml离心管中，加入500μlDNA提取缓冲液后，充分涡旋混匀。65℃恒温水浴15-20min，每5min涡旋样品一次。添加500μl氯仿-异戊醇(比例24:1)，摇床上慢速混匀10-15min。4℃,7500rpm离心15min。转移上清至新的1.5ml离心管中，用500μl的酚/氯仿(1:1)抽提1次，再用等体积的氯仿抽提一次。小心转移上清至新的1.5ml离心管，添加1ml无水乙醇，上下颠倒几次，放置-20℃下10min。7500rpm离心5min，沉淀DNA，弃去多余液体。用75%的乙醇洗涤DNA，弃去乙醇，空气中充分干燥。添加30-50μlTER(TE+RNase，RNase终浓度50μg/ml)缓冲液溶解DNA。

2）PCR引物设计与扩增用软件Primer5.0设计引物序列，在OsPT6启动子引物两端分别加上酶切位点PacI(TTAATTAA)和AscI(GGCGCGCC)，在Pr基因引物两端分别加上酶切位点AscI(GGCGCGCC)和KpnI(GGTACC)。

PT6启动子上游引物：

PT6-G3-F：5'-TTAATTAATTCTTTGTTCTTCCTCCAGGCTTTC-3'（SEQIDNO.1）

PT6启动子下游引物：

PT6-G3-R：5'-GGCGCGCCGCCAGCTTAATTGCTTGCTTTGTGA-3'（SEQIDNO.2）

Pr基因上游引物：

Pr-G3-F：5'-GGCGCGCCATGGAGGGTATGTCCAAAGGGTT-3'（SEQIDNO.3）

Pr基因下游引物：

Pr-G3-F：5'-GGTACCTCAAGTTCCAGTTTCTCCATCCAA-3'（SEQIDNO.4）

PCR反应体系均为25μl：PCRBuffer2.5μl，dNTPMix2μl，上下游引物各1μl，模板1μl,Taq酶0.5μl，双蒸水17μl。

PCR程序如下：94℃预变性4min，98℃变性10s，68℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，10℃保持。

扩增的PCR产物通过质量比1％琼脂糖凝胶电泳检测，OsPT6启动子大小为2860bp，序列如SEQIDNO.5所示；Pr基因大小为1432bp，序列如SEQIDNO.6所示。

实施例2.植物表达载体pS1aG‐3‐OsPT6‐Pr的构建：

1）OsPT6启动子和Pr基因中间载体的构建将OsPT6启动子和Pr基因的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段分别与pMD19-T载体连接，酶连体系总体积10μl，包含5μl连接液，1μl的pMD19-T载体，3-4μl的PCR纯化产物，用水补足10μl，然后16℃连接过夜；再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中涂在含有100μg/mL安苄的LB固体培养基上生长12h-14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序。将测序正确的菌液加入等体积体积比30％甘油于-70℃保存备用，分别获得含有OsPT6启动子序列和Pr基因全长序列的重组质粒，命名为OsPT6-T和Pr-T。

2）OsPT6基因启动子特异调控Pr基因植物表达载体的构建用PacI和AscI双酶切OsPT6-T，将OsPT6启动子片段从中间载体切下，回收片段。同时用PacI和AscI双酶切表达载体pS1aG-3（EamensAL,BlanchardCL,DennisES,etal.AbidirectionalgenetrapconstructsuitableforT‐DNAandDs‐mediatedinsertionalmutagenesisinrice(OryzasativaL.)[J].Plantbiotechnologyjournal,2004,2(5):367-380.），回收剩余的线性片段，与从中间载体上切下的OsPT6启动子片段通过T4DNA连接酶定向连接。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂在含有50μg/ml壮观霉素的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性克隆，经PacI和AscI酶切验证片段大小无误后(图1)，保存阳性克隆，构建的重组表达载体命名为pS1aG-3-OsPT6。同样的，用AscI和KpnI双酶切Pr-T，将Pr基因片段从中间载体切下，回收片段。同时用AscI和KpnI双酶切重组表达载体pS1aG-3-OsPT6，回收剩余的线性片段，与从中间载体上切下的Pr基因片段通过T4DNA连接酶定向连接。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂在含有50μg/ml壮观霉素的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性克隆，经AscI和KpnI酶切验证片段大小无误后(图1)，保存阳性克隆，构建的二次重组表达载体命名为pS1aG-3-OsPT6-Pr（图2）。

最后通过电击法将pS1aG-3-OsPT6-Pr质粒转化至农杆菌EHA105的感受态细胞中，涂在含有壮观霉素和链霉素均为50μg/ml的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经PacI/AscI和AscI/KpnI两个酶切体系验证无误后，菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，转基因备用。

3）转基因烟草的获得将以上获得的转有pS1aG-3-OsPT6-Pr质粒的农杆菌，侵染烟草外植体，共培养2.5天后转入含50μg/ml潮霉素和250μg/ml羧苄青霉素的选择分化培养，每2周换一次培养基，3-6周后，将分化的小苗切下，转入含有50μg/ml潮霉素和250μg/ml羧苄青霉素的生根培养基中生根，2-4周后开盖炼苗转入营养土中培养至收获，得到T1代转基因种子。

3.1）各类常用培养基配方（1L）

注：上述2种培养基均用双蒸水定溶到1L,配成固体时需另加琼脂15‐20g/L。高压灭菌20min后备用。

3.2）激素及常用抗生素配制方法

3.3）烟草组培用MS培养基母液配方

3.4）烟草转化用MS共培养培养基（1L用量）

注：高压灭菌20min后冷却至55℃，分别加潮霉素终浓度为50mg/L和Car终浓度为250mg/L

4）转基因烟草的PCR检测根据OsPT6启动子序列在靠近3'端设计一条正向引物：Iden-F:5'-AAGGGAGATTCCGTTTGAGTAGG-3'（SEQIDNO.7），根据Pr基因序列在靠近5'端设计一条反向引物：Iden-R:5'-CACCAGCATAAACAACATATTCCAC-3'（SEQIDNO.8），对不同株系转基因烟草进行PCR鉴定，目的片段大小为623bp。

实施例3.转基因烟草的缺磷指示效果验证

1）野生型和T1代转基因烟草培养将野生型和T1代转基因烟草种子放入1.5ml无菌离心管中，加30%次氯酸钠溶液浸泡10min；倒去次氯酸钠溶液，无菌水清洗4-5遍，最后一遍浸泡30min。将种子小心转移到无菌滤纸上吸干，用无菌的镊子将种子小心地置入灭菌的1/2MS固体培养基上，在组培室中28℃培养4-6周。

2）转基因烟草的缺磷处理将长到两片真叶无菌培养的野生型和转基因烟草移入灭过菌的沙子中，先用1/4浓度的营养液培养10天，再换成不含磷的营养液培养14天，营养液的配方及浓度为：2mMKNO₃，1mMNH₄NO₃，1mMNaH₂PO₄，0.5mMCa(NO₃)₂，0.25mMCaCl₂，0.5mMMgSO₄，20μMFe-EDTA，9μMMnCl₂，46μMH₃BO₃，8μMZnSO₄，3μMCuSO₄，0.03μM(NH₄)₂MoO₄，pH调至5.5左右。

2.1）缺磷条件下野生型和转基因烟草Pr基因的表达鉴定

2.1.1）总RNA的提取取缺磷处理14天的野生型和转基因烟草叶片迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右样品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1mlTrizol试剂，加入0.2mL氯仿，离心后吸取上清，加入0.5mL异丙醇，离心后弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀，RNA溶于DEPC水中(体积比为1‰)，用质量比为1.7％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。

2.1.2）总cDNA合成每个RNA样品2μg，加入50μmol/LOligodT18，加体积比1‰DEPC水补足10μl，70℃下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNaseinhibitor0.5μl和5xRTbuffer5μl，10mMdNTP2.5μl，M‐MLV反转录酶1μl，体积比1‰DEPC水补足25μl，42℃水浴60min后，70℃水浴10min终止反应(OligodT18由南京金思瑞公司合成；反转录试剂盒购自Fermentas公司，Canada)。

2.1.3）qPCR分别以反转录出来的野生型和转基因烟草的cDNA为模板，设计特异性烟草内参和Pr基因引物，引物序列见表1。按表2组份配制PCR反应液（冰上配制反应液）。

表1烟草花青素合成调控途径中相关基因的定量PCR引物

表2

2.2）缺磷条件下野生型和转基因烟草不同叶片花青素含量的测定首先记录样品鲜重，然后将样品放置研钵中，在液氮中用杵子磨碎至粉末。加入2.5ml含1%HCl的甲醇提取液,在黑暗中室温条件下于摇床上轻轻摇动下抽提2小时以上，然后加入2.5ml氯仿涡旋混匀，接着加入5ml的超纯水再次涡旋混匀，在4℃条件下12,000rpm离心分10钟，吸取上清液，每个样品设置三个重复，生物学重复两次，吸取200μl上清，以1%HCl甲醇为空白对照，用分光光度计MultiskanSpectrum(ThermoElectronCorporation,Vantaa,Finland)，在530nm波长下测定光密度值。

2.3）缺磷条件下野生型和转基因烟草不同叶片磷含量的测定

2.3.1）所需试剂的配制

2.3.1.1）100mll0%(w/v)的HClO₄取7.874ml72%的HClO₄溶液，定容至100ml。

2.3.1.2）1L5%(w/v)的HClO₄取39.3676ml72%的HClO₄溶液，定容至1L。

2.3.1.3）250ml硫酸‐钼酸铵溶液(溶液A)溶解1.0g钼酸铵(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O于100ml水中；然后徐徐加入6.25ml的浓H₂SO₄；充分混匀，冷却后加水至250ml。

2.3.1.4）50ml10%(w/v)抗坏血酸溶液(溶液B)溶解5g抗坏血酸于水中，最后加dH₂O定容至50ml，贮于棕色瓶中，在4℃冰箱保存。

2.3.1.5）工作溶液按体积比6:1混合溶液A和溶液B，配好后放置2小时后再使用。

2.3.2）磷含量测定取0.5g鲜样用液氮研磨成粉末，在4℃放置(冰上或者冰箱)至样品冻融，加入1ml10%(w/v)的HClO4研磨均匀。匀浆液用5%(w/v)的HClO₄稀释10倍，于冰上放置30min后，4℃，10,000g离心10min，上清液用于磷含量的测定(钼蓝法)。取2ml工作溶液与1ml样品上清液混合，于40℃温育20min。反应液在冰上冷却后，于820nm可见光波长下测定吸收值。

2.3.3）磷标准曲线的制作将60ppmP的标准P溶液用提取剂(包括工作液)稀释，制成0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0ppmP的系列标准溶液。提取剂用10%(w/v)的HClO₄和5%(w/v)的HClO₄按体积比1:9混合配制。用提取剂与工作溶液的反应液作空白。

在缺磷处理14天后，野生型的叶片仍为绿色，而转基因烟草PT6pro-Pr叶片呈现紫色（如图3a所示）。对Pr基因表达量的定量检测显示，转基因植株体内Pr基因大量表达。说明该转基因烟草在缺磷情况下过量表达Pr基因，时叶片变成深紫色，从而达到指示磷素养分状况的目的。在缺磷时，植物体会将老叶里的磷再运输到新叶，保障植物体的生长发育。叶片磷素的缺乏是由叶尖开始，逐步深入到叶基部。而该转基因烟草叶片的紫色变化可以准确地反映植株体内磷素的动态平衡（如图3b所示）：在幼嫩的新叶中（第1-2片），紫色主要集中在叶尖；成熟的叶片（第3-4片）完全呈现深紫色；而靠下的老叶（第5-6片）由于叶片的衰老紫色有少许积累。这种不同叶片紫色的积累模式与植物体内本身对磷素缺乏的响应模式完全一致。对不同叶片可提取磷含量和花青素含量的测定进一步证明了转基因烟草不同叶位的叶片中磷含量的降低与花青素的积累呈现负相关（如图3d,e所示）。而野生型与转基因烟草的叶片磷含量没有显著性差异，说明该转基因烟草可以充分反映烟草植株体内磷含量。

实施例4.转基因烟草对不同缺磷和恢复供磷时间的响应

1）野生型和T1代转基因烟草培养同实施例3。

2）转基因烟草的缺磷处理同实例3。

3）野生型和转基因烟草不同叶片花青素含量的测定同实例3。

在缺磷7天时，转基因烟草叶片已经有肉眼可见的紫色出现；到缺磷21天时，紫色的积累达到饱和，整个转基因植物呈现为深紫色接近于黑色。在恢复后，转基因烟草的紫色从新叶至老叶，从叶基部至叶尖逐渐褪去。供磷三天时，转基因烟草的新叶从叶基部至叶尖紫色逐渐消褪；在供磷7天时，成熟叶片仅有少许紫色积累；在供磷14天时，紫色完全褪去，表现为与正常颜色相同的绿色（如图4a所示）。说明转基因烟草可以快速准确地动态检测植物体内磷素养分的变化。对不同缺磷和恢复供磷时间的野生型和转基因烟草的花青素含量的测定同样定量地反映出转基因烟草可通过叶片花青素的积累准确反映植物体内磷素养分状况（如图4b所示）。

实施例5.转基因烟草响应不同磷浓度的灵敏度验证

1）野生型和T1代转基因烟草培养同实施例3。

2）转基因烟草的不同磷浓度处理方法同实例3，仅营养液中磷浓度不同。营养液中分别添加0、0.2、0.4、0.6、0.8mMP。

3）不同磷浓度条件下野生型和转基因烟草叶片花青素含量的测定同实例3。

4）不同磷浓度条件下野生型和转基因烟草叶片磷含量的测定同实例3。

如图5a所示，在磷饥饿状态下（0mMPi），转基因烟草叶片呈现出深紫色；在磷供应不充足的状态下（0.2‐0.4mMPi），转基因烟草叶片紫色呈现斑点状分布；在磷供应充足的状态下（0.6‐0.8mMPi），转基因烟草表现为与正常烟草一样的绿色。对野生型和转基因烟草叶片花青素和磷含量的测定定量地反映了转基因烟草在不同供磷水平下叶片花青素的积累（如图5b,c所示）。

实施例6.野生型和转基因烟草中磷含量与花青素含量的相关性

1）野生型和T1代转基因烟草培养同实施例3。

2）转基因烟草的不同磷浓度处理同实施例5。

3）野生型和转基因烟草不同供磷水平下磷含量和花青素含量的测定同实施例3。

野生型和转基因烟草磷含量和花青素含量的相关性分析应用Origin8.0数据分析软件，对不同磷浓度处理下野生型和转基因烟草磷含量和花青素含量进行相关性分析。野生型烟草花青素与磷含量的相关性仅0.42，而转基因烟草的花青素与磷含量相关性达到0.94（图6）。因此转基因烟草的花青素含量可以准确反映植物体内磷含量。

实施例7.内源花青素合成调控基因的表达分析

1）野生型和T1代转基因烟草培养同实施例3。

2）野生型和转基因烟草的缺磷处理同实施例3。

3）缺磷条件下野生型和转基因烟草内源花青素合成调控基因的表达分析同实例3。各基因的特异引物序列见表1，表达情况见图7。

对烟草花青素合成途径中的内源相关基因（如图7a）的检测表明，烟草内源花青素合成途径中的相关基因被激活。在合成途径上游的PAL和4CL有略微上调，CHI和F3H上调了将近4倍，下游的DFR和ANS在野生型植株体内基本无表达，而在转基因烟草体内其相对表达量分别达到17.8和147（如图7b所示）。这一结果说明外源Pr基因的表达可以激活烟草内源花青素合成途径相关基因的表达，从而实现花青素的大量积累。

实施例8.转基因烟草缺磷指示特异性的验证

1）野生型和T1代转基因烟草培养同实施例3。

2）不同缺素处理是在灭过菌的沙子中进行，其他胁迫处理在营养土中进行。低温胁迫是将烟草置于光照培养箱中4℃处理3周；盐胁迫是对烟草浇灌含200mMNaCl的水处理3周；干旱胁迫是对烟草停止供水处理3周。在缺氮、钾、铁及低温、盐、干旱胁迫条件下转基因烟草均与野生型表现出相同的表型，肉眼观测不到花青素积累（图8），说明该转基因烟草对缺磷的指示具有特异性，不受外界其他主要非生物胁迫的影响。

实施例9.高光谱遥感技术在转基因烟草上的应用

1）野生型和T1代转基因烟草培养同实施例3。

2）转基因烟草的不同磷浓度处理同实施例5。

野生型和转基因烟草的光谱测定采用美国AnalyticalSpectralDevice(ASD)公司生产的FieldSpec3地物光谱仪。波段值为350～2500nm，其中350～1050nm光谱采样间隔为1.4nm，光谱分辨率为3nm;1000～2500nm光谱采样间隔为2nm，光谱分辨率为10nm。光谱测定选择在天气晴朗、无风或风速很小时进行,时间范围为10:00～14:00。测量时传感器探头垂直向下，光谱仪视场角为25b，距叶面垂直高度约5cm，地面视场范围直径为0.44cm。以10个光谱为一采样光谱,每个观测点记录10个采样光谱,以其平均值作为该观测点的光谱反射值。测量过程中，及时对每组目标的观测前后进行标准白板校正(标准白板反射率为1,因此所得目标物光谱为无量纲的相对反射率)。

在缺磷条件下（0mMPi），与野生型相比，转基因烟草的光谱特征有明显差异，在绿光、近红外、热红外和中红外波段均低于野生型，在554nm处的反射率变化尤其显著；在磷供应充足的条件下（0.8mMPi），转基因烟草的光谱特征与野生型无明显差异（如图9所示）。不同供磷水平下转基因烟草在554nm处的光谱反射率与野生型相比，随着磷浓度的升高其反射率逐渐升高，在0.8mM供磷水平下与野生型完全重合（如图10所示）。说明可以用554nm处的转基因烟草光谱反射率反映植物磷素养分供应状况。

实施例10.转基因烟草叶片光谱反射率与磷含量的相关性分析

1）野生型和T1代转基因烟草培养同实施例3。

2）转基因烟草的不同磷浓度处理同实施例5。

3）野生型和转基因烟草不同供磷水平下磷含量和反射率的测定同实例9。

4）野生型和转基因烟草磷含量和反射率的相关性分析应用Origin8.0数据分析软件，对不同磷浓度处理下野生型和转基因烟草磷含量和反射率进行相关性分析。

转基因烟草的磷含量与光谱反射率呈指数相关，R2=0.94（图11），说明转基因烟草在554nm处的光谱反射率可以用于预测植物磷素养分供应状态。

实施例11.在土壤环境中验证利用光谱反射率检测转基因烟草磷素养分状况的效果

1）野生型和T1代转基因烟草培养同实施例3。

2）转基因烟草在土壤中的培养所用土壤采自南京东郊，选用贫瘠的磷含量极低的黄棕壤（本底磷含量为3mg/kg土）。每20kg土壤中添加NH₄NO₃5.6249g，K₂SO₄5.7526g作为缺磷处理的土壤，正常供磷的土壤是在缺磷土壤基础上添加KH₂PO₄5.5666g。将长到两片真叶的野生型和转基因烟草幼苗移入缺磷和正常供磷的土壤中，培养3周。转基因烟草在缺磷土壤环境中仍表现为明显的紫色，与野生型对比强烈。

3）野生型和转基因烟草反射率的测定同实施例9。

4）野生型和转基因烟草叶片磷含量的预估将转基因烟草的叶片反射率数值代入实施例10提供的转基因烟草磷含量和反射率的指数相关性方程，用Excel计算转基因烟草叶片磷含量的预估值。

5）野生型和转基因烟草叶片磷含量的测定同实施例3。

在-P条件下转基因烟草叶片呈现紫色，而在+P条件下与野生型无明显差异（如图12a所示）。在土壤环境中对转基因烟草554nm处的光谱反射率和磷含量分析表明（图12b），当反射率在0.16以下时，植物体内可提取磷含量低于40mg/kg，为缺磷状态，此时需施加磷肥；当反射率高于0.16时，植物体内可提取磷含量高于40mg/kg，为磷充足状态，此时不需要施加磷肥。结合高光谱遥感技术，该转基因烟草完全可应用于田间对植物磷素营养状况的实时动态检测。

Claims (3)

1.一种烟草磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于将特异地响应缺磷信号的启动子水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子特异调控花椰菜花青素合成基因Pr的植物表达载体转化到烟草中获得转基因烟草，在磷素供应充足时，水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT6启动子无法驱动花青素合成基因Pr表达，转基因烟草叶片保持原有的绿色；在磷素缺乏时水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT6启动子特异地驱动花青素合成基因Pr在烟草叶片中过量表达，使转基因烟草叶片上花青素大量积累，烟草叶片变成深紫色；在重新供应充足磷素养分时，转基因烟草可在短期内恢复绿色；烟草叶片颜色的变化通过肉眼观测或者高光谱遥感技术测定从而达到快速诊断植物磷素营养状况，以及可视化动态监测烟草磷素养分的目的；所述的水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT1;6启动子特异调控花青素合成基因Pr的重组表达载体为重组表达载体pS1aG-3-OsPT6-Pr，是将OsPT6启动子和Pr基因分别插入到pS1aG-3表达载体的PacI,AscI和AscI,KpnI位点所得；植物叶片颜色的变化采用高光谱遥感技术测定时，检测波段为554nm波长，当554nm波长的反射率在0.16以下时，表明植物体内可提取磷含量低于40mg/kg，为缺磷状态，此时需施加磷肥；当554nm波长的反射率高于0.16时，植物体内可提取磷含量高于40mg/kg，为磷充足状态，此时不需要施加磷肥；其中，所述的花椰菜花青素合成基因Pr以花椰菜叶片基因组DNA为模板，以引物Pr-G3-F/Pr-G3-R克隆得到；Pr-G3-F序列如SEQIDNO.3所示，Pr-G3-R序列如SEQIDNO.4所示。

2.根据权利要求1所述的一种烟草磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于权利要求1中所述的重组表达载体pS1aG-3-OsPT6-Pr的构建方法：以水稻日本晴基因组DNA为模板，以引物OsPT6-G3-F/OsPT6-G3-R克隆得到所述的OsPT6启动子，以花椰菜叶片基因组DNA为模板，以引物Pr-G3-F/Pr-G3-R克隆得到所述的Pr基因，将其分别插入到克隆载体pMD19-T上，分别经PacI/AscI和AscI/KpnI双酶切后依次连接到pS1aG-3表达载体进行两次重组反应而得到；其中，所述的OsPT6-G3-F序列如SEQIDNO.1所示，OsPT6-G3-R序列如SEQIDNO.2所示，Pr-G3-F序列如SEQIDNO.3所示，Pr-G3-R序列如SEQIDNO.4所示。

3.根据权利要求1所述的一种烟草磷素营养快速诊断及可视化动态监测方法，其特征在于所述的重组表达载体pS1aG-3-OsPT6-Pr的构建方法包含以下步骤：

（1）设计两对特异性引物

OsPT6-G3-F:SEQIDNO.1，OsPT6-G3-R:SEQIDNO.2，以及Pr-G3-F:SEQIDNO.3，Pr-G3-R:SEQIDNO.4；

（2）以水稻日本晴基因组DNA为模板，OsPT6-G3-F和OsPT6-G3-R为引物，用高保真酶进行PCR反应，扩增OsPT6启动子，以花椰菜基因组DNA为模板，Pr-G3-F和Pr-G3-R为引物，用高保真酶进行PCR反应，扩增Pr基因片段；

（3）分别将这两个PCR产物连接到pMD19-T载体，得到OsPT6-T和Pr-T中间载体，转化大肠杆菌感受态细胞，提取阳性克隆质粒进行测序验证；

（4）测序验证无误后，用PacI/AscI对OsPT6-T和pS1aG-3载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到pS1aG-3-OsPT6重组表达载体；再用AscI/KpnI对Pr-T和pS1aG-3-OsPT6表达载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到所述的重组表达载体，命名为pS1aG-3-OsPT6-Pr。