CN102492777B

CN102492777B - 用于转基因玉米Mon810检测的标准质粒分子及其构建方法

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Publication number: CN102492777B
Application number: CN2011104304407A
Authority: CN
Inventors: 杨正友; 郭燕风; 田园; 赵凤春; 李文华
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2031-12-20
Also published as: CN102492777A

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种遗传改良玉米品系Mon810检测用标准质粒分子及其构建方法。所述的质粒标准分子包含遗传改良玉米品系Mon810的品系特异性序列、构建特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb特异性片段；通过对遗传改良玉米品系Mon810的外源插入载体边界序列及Hsp70和cryIA （ b ）两个元件的连接区的序列分析，设计品系特异性和构建特异性PCR引物，扩增获得遗传改良玉米品系Mon810的品系特异性片段和构建特异性片段，以及玉米内标准基因特异性序列；通过分子克隆的方法构建到一个质粒分子中，获得人工重组质粒分子pMHZ。本发明构建的标准质粒分子完全可以替代遗传改良玉米品系Mon810阳性标准品，用于对遗传改良玉米品系Mon810样品的定量PCR分析和检测。

Description

用于转基因玉米Mon810检测的标准质粒分子及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种用于转基因玉米Mon810检测的标准质粒分子及其构建方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

基因工程技术的出现和应用为农业、医学等领域开辟了一个全新的发展时代。自1983年首例转基因烟草作物问世以来, 基因工程技术发展日新月异, 转基因作物新品种不断涌现，在短短20多年时间内得到了飞跃发展，据国际农业生物技术应用署(ISAAA)的最新资料表明，自1996年到2010年，全球的转基因作物种植总面积增加了87倍，达到了1.48亿公顷。与此同时,大量的遗传改良农产品涌入我国市场，我国农业转基因生物安全管理办公室已经为棉花、玉米、大豆、油菜四种作物颁发了安全进口证书。转基因玉米有11个品系允许进口用于加工原料，其中包括转基因玉米Mon810。随着遗传改良作物的广泛种植，转基因作物的生态风险,可能带来的环境问题、转基因产品作为食品、饲料对人类及动物的可能带来健康问题、国际贸易问题、知识产权问题等生物安全性问题已引起世界性的广泛关注,国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良作物及其产品实施标识制度。

为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，建立高效、快速、特异的检测技术十分必要，它是各国际组织和国家管理遗传改良作物的有力技术支撑。基于核酸的聚合酶链反应（PCR）检测技术因具有高灵敏度和特异性强的优点，已成为目前最重要、应用最广泛的遗传改良作物及其产品检测技术。PCR检测方法建立的主要依据是特异性的扩增遗传改良植物的外源基因片段。在转基因植物中，稳定表达的外源DNA插入片段一般包括启动子、目的基因和终止子三类元件。针对扩增的外源DNA片段差异，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性PCR检测。筛选PCR检测主要是以转基因植物的通用元件和标记基因作为特异性扩增片段，由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因植物的研究与生产中，从而大大降低了筛选PCR检测的特异性，但可用于转基因植物检测的初步筛选，检测到这些通用元件也预示着检测样品中存在有转基因成分。基因特异性PCR检测以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段，相比筛选PCR特异性增强。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表达形成新的具有相似农艺性状的品系或新的转基因植物，因此基因特异性PCR检测方法不能异性的区分具有相似农艺性状的转基因植物及其品系。构建特异性PCR检测是通过检测外源插入载体中两个元件的连接区DNA序列实现的。这种方法具有相对较高的特异性，在转基因植物及其产品检测中使用较多。但是由于相同的转基因外源表达载体在基因转化过程中，可能以一个、两个或者多个拷贝的形式插入到不同或者相同的植物基因组中，形成具有相同农艺性状的不同的转基因品系，因此构建特异性PCR检测不能区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。品系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每个遗传改良作物品系，都具有特异性的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，因此品系特异性检测方法具有较筛选、基因特异性和构建特异性PCR检测方法更高的特异性和准确性，能够特异性的检测专一的遗传改良作物品系。虽然，四种PCR检测策略特异性有所差异，但各有所长，目前所建立并应用于转基因作物检测的PCR方法主要围绕这四种策略。

在实际检测中，标准物质十分重要。然而，由于专利权和现有技术的限制，遗传改良作物标准物质的获得相对较难。目前，用于转基因检测的阳性标准物质主要是用纯合的转基因植物材料配置的，到目前为止仅得到了十几种遗传改良作物的标准物质在市场上销售。但这类来源于农产品的标准物质，其必须有专门的研究机构来制备，贮存和测定过程受很多因素影响，很难维持恒定的量，而且，这些标准物质的转基因含量范围一般是从0.1%到5%，而实际检测的样品中的转基因含量可能会超出这个范围。标准物质的缺乏已成为检测方法建立和应用的瓶颈，阻碍了转基因产品标识制度的顺利实施。

标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在遗传改良作物鉴定检测中是很好的标准物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因和内标准基因，经济高效。近年来，越来越受到各国转基因检测专家和学者们的重视，并逐渐取代传统阳性标准品用于转基因品系及其加工产品的定量PCR检测。现在文献报道的用于检测转基因玉米的质粒标准分子中，涉及转基因玉米Mon810的有pMu15、pMD-ZM、p3SNTM-9和ERM-AD413等，但是它们有的只能用于检测构建特异与筛选特异性，有的只能用于检测品系特异性，不能满足一种标准物质对筛选特异性检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测的要求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于转基因玉米Mon810检测的标准质粒分子及其构建方法，具体涉及转基因玉米Mon810筛选特异性检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测用标准质粒分子及其构建方法，使其可以代替转基因玉米Mon810的阳性标准物质用于遗传改良玉米的定性、定量PCR检测。

根据转基因玉米Mon810的品系特异性序列、构建特异性序列和内标准基因序列，首先利用重叠PCR反应的原理设计特异PCR引物，经过PCR扩增获得转基因玉米Mon810的品系特异性序列和构建特异性序列的重组DNA片段，利用分子克隆技术将重组DNA片段克隆到pMD18-T载体中。然后，利用设计的特异性引物扩增玉米内标准基因zSSIIb的一段序列，按照设计的限制性内切酶酶切位点连接到pMD18-T质粒中重组DNA片段的上游，获得标准质粒分子，命名为pMHZ。本发明构建的标准质粒分子pMHZ可代替转基因玉米Mon810原有的阳性标准物质，用于定性和定量PCR检测，彻底解决转基因玉米Mon810检测中标准物质缺乏的难题。同时，该质粒含有CaMV35S和CryIA（b）序列，可以用于其他含有CaMV35S启动子和CryIA（b）的转基因品系的定性和定量检测。

本发明所述标准质粒分子pMHZ，同时含有转基因玉米Mon810的品系特异性序列、构建特异性序列和内标准基因的一段序列，用以代替转基因玉米Mon810的阳性标准物质，可用于转基因玉米Mon810定性和定量PCR检测。

本发明所述标准质粒分子pMHZ构建方法，包括如下步骤：

① 利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，获得转基因玉米Mon810的品系特异性序列、构建特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb特异性序列。

所述的转基因玉米Mon810的品系特异性序列，指的是转基因玉米Mon810外源插入载体与玉米基因组邻接区的一段DNA序列，其序列如Seq ID No:1 所示。

所述的构建特异性序列，指的是外源插入载体的Hsp70和cryIA（b）两个元件的连接区的一段DNA序列，其序列如Seq ID No:2 所示。

所述的玉米内标准基因zSSIIb，指的是编码玉米淀粉合酶异构体zSTSⅡ-2的基因，其在玉米基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数的特点；玉米内标准基因zSSIIb GenBank中登录号为AF019297。所述的玉米内标准基因zSSIIb特异性序列，指的是玉米内标准基因zSSIIb的296nt-536nt，其序列如Seq ID No:3 所示。

② 设计PCR特异引物。

所述的PCR特异性引物，指的是与玉米遗传改良品系Mon810的品系特异性序列、构建特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb基因序列完全相同或互补的寡聚核苷酸链，分别为：

MT-F,其序列如Seq ID No:4所示，

MT-R,其序列如Seq ID No:5 所示，用于扩增Mon810玉米的品系特异性序列；

HC-F,其序列如Seq ID No:6所示，

HC-R,其序列如Seq ID No:7 所示，用于扩增Mon810玉米的构建特异性序列；

ZB-F,其序列如Seq ID No:8所示，

ZB-R,其序列如Seq ID No:9 所示，用于扩增玉米的内标准基因zSSIIb基因的特异性序列。

③特异性扩增转基因玉米Mon810的品系特异性序列、构建特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb的特异性序列。

所述的特异性扩增，指的是利用设计的PCR引物分别扩增转基因玉米Mon810的品系特异性序列（Seq ID No:1）、构建特异性序列（Seq ID No:2）和内标准基因zSSIIb的特异性序列（Seq ID No:3）。

③ 转基因玉米Mon810的品系特异性序列和构建特异性序列的拼接。

所述的拼接，指的是利用重叠PCR技术将转基因玉米Mon810的品系特异性序列和构建特异性序列连接融合成一个重组的DNA片段，其序列如Seq ID No:10 所示。

④ 重组DNA片段及玉米内标准基因zSSIIb的特异性片段克隆进入pMD18-T载体

首先将上述得到的重组DNA片段用酶切位点BamH I和Hind III连接到质粒载体pMD18-T（TAKARA公司）中；然后将PCR特异性扩增的玉米内标准基因zSSIIb的DNA片段（Seq ID No:11）用酶切位点BamH I和EcoR I连接到pMD18-T质粒中重组DNA片段的上游，因此获得将转基因玉米Mon810的品系特异性序列、构建特异序列以及玉米内标准基因zSSIIb的特异性序列融合在pMD18-T上的标准质粒分子pMHZ，其序列如Seq ID No:12 所示。

⑤ 标准质粒分子pMHZ的定性和定量PCR检测方法验证。

所述的定性PCR检测方法验证，是指利用标准质粒分子pMHZ构建的品系特异性片段只能在转基因玉米Mon810基因组DNA中扩展获得，而不能在其他玉米品系，和其他遗传改良作物基因组中扩增得到。

所述的定量PCR检测方法验证，是指检测标准质粒分子pMHZ在进行定量PCR分析时的特异性、灵敏度、重复性和重演性等特性，以鉴定该标准分子替代转基因玉米Mon810阳性标准物质的能力，以及实际应用于定量PCR检测转基因玉米Mon810的测定有效性。

本发明的有益效果在于，利用重叠PCR和分子亚克隆的方法首次构建了含有玉米内标准基因zSSIIb特异性序列和转基因玉米Mon810的品系特异性序列和构建特异性序列的标准质粒分子pMHZ。本发明中制备的标准质粒分子pMHZ可以代替转基因玉米Mon810的阳性标准物质，很好的解决了该品系检测过程中阳性标准物质缺乏的问题。标准质粒分子pMHZ对实际样品分析的结果比较准确，检测结果的偏差在ISO遗传改良食品检测标准允许的0-0.25范围内。因此，本发明中构建的标准质粒分子完全适用于对转基因玉米Mon810样品及其加工产品中的遗传改良成分进行定量分析。

附图说明

图1标准质粒分子pMHZ的示意图；

图中pMD-18T表示构建标准质粒分子的载体；EcoR I表示该位点含有限制性内切酶EcoR I的酶切位点；BamH I表示该位点含有限制性内切酶BamHⅠ的酶切位点；Hind III表示该位点含有限制性内切酶Hind III的酶切位点，“zSSIIb”表示玉米内标准基因zSSIIb的一段特异性序列；“品系特异性序列”表示转基因玉米Mon810外源插入载体与玉米基因组邻接区的一段DNA序列；“构建特异性序列”表示外源插入载体的Hsp70和cryIA（b）两个元件的连接区的一段DNA序列。

具体实施方式

下面以实施例为例对本发明作详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：标准分子的构建

1、构建标准质粒分子pMHZ的PCR引物序列设计

根据GenBank中公布的转基因玉米Mon810外源插入载体与玉米基因组邻接区的基因序列（登录号 AF434709 ），外源载体主要元件的序列信息（登录号AY326434 ）以及玉米内标基因zSSIIb的序列信息（登录号AF019297），利用软件Primer 5.0设计三对特异性引物（如表1），分别为:

MT-F,其序列如Seq ID No:4所示，序列3-8碱基对处为BamHⅠ的酶切位点，

MT-R,其序列如Seq ID No:5 所示；MT-F位于玉米基因组上，MT-R位于转基因玉米Mon810的外源插入载体的CaMV35S启动子序列上，用于扩增Mon810玉米的品系特异性序列；

HC-F,其序列如Seq ID No:6所示，

HC-R,其序列如Seq ID No:7 所示，序列3-8碱基对处为Hind III的酶切位点；HC-F位于Hsp70序列上，HC-R位于cryIA(b)序列上，用于扩增Mon810玉米的外源插入载体的Hsp70和cryIA（b）两个元件的连接区的构建特异性序列；

ZB-F,其序列如Seq ID No:8所示，序列3-8碱基对处为EcoRⅠ的酶切位点，

ZB-R,其序列如Seq ID No:9 所示，序列3-8碱基对处为BamHⅠ的酶切位点,用于扩增玉米的内标准基因zSSIIb基因的特异性序列。

2、转基因玉米Mon810内源标准基因序列、品系特异性序列和构建特异性序列的扩增

以转基因玉米Mon810基因组DNA为模板，利用以下设计的三对引物分别对玉米内标准基因zSSIIb 的特异性序列（位于玉米内标准基因zSSIIb 296nt-536nt）、品系特异性序列和构建特异性序列进行PCR扩增。扩增条件均为：

PCR反应体积为50μl,包括以下成分：

10×PCR缓冲液 5μl

dNTPs 4μl

上游引物（20μM) 1μl

下游引物（20μM) 1μl

模板 5μl

Taq DNA聚合酶 0.5μl

ddH₂O 33.5μl

PCR反应条件为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 50秒， 55℃ 50秒,72℃ 60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟。

经过PCR扩增后得到了长257bp的玉米内标准基因片段（其序列如Seq ID No:10所示）、长392bp的品系特异性序列片段（其序列如Seq ID No:13所示）和长440bp的外源插入载体的构建特异性序列片段（其序列如Seq ID No:14所示），将上述PCR扩增得到的品系特异性序列片段和构建特异性序列片段产物分别记为PMT和PHC。对扩增得到的条带进行回收纯化，通过测序分析表明获得的序列与目的扩增片段序列一致。

表1. 构建标准质粒分子pMHZ的PCR引物序列

Figure 2011104304407100002DEST_PATH_IMAGE001

3、利用重叠PCR方法对品系特异性序列片段和构建特异性序列片段进行连接

用上述PCR得到的品系特异性序列产物PMT和构建特异序列产物PHC为模板，以MT-F(Seq ID No:3 )和HC-R(Seq ID No:6)作为重叠PCR的引物对，进行PCR扩增，实现品系特异性序列和构建特异序列的重组拼接。重叠PCR分两步扩增：

第一步：扩增的条件为：

PCR反应体积为50μl,包括以下成分：

10×PCR缓冲液 5μl

dNTPs 4μl

PMT 5μl

PHC 5μl

Taq DNA聚合酶 0.5μl

ddH₂O 30.5μl

PCR反应条件为：94℃ 4分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环。

第二步：扩增条件为：

PCR反应体积为100μl,包括以下成分：

10×PCR缓冲液 5μl

dNTPs 4μl

MT-F（20μM) 1μl

HC-R（20μM) 1μl

上步PCR反应产物 50μl

Taq DNA聚合酶 0.5μl

ddH₂O 38.5μl

PCR反应条件为：94℃ 4分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟。

经过重叠PCR扩增得到了814bp的品系特异性序列和构建特异序列的重组片段（Seq ID No:10）。

4、重组DNA片段及玉米内标准基因zSSIIb的特异性片段克隆进入pMD18-T载体

首先用限制性内切酶BamH I和Hind III将上述得到的重组DNA片段（Seq ID No:10）和pMD18-T载体分别进行双酶切。然后用T₄连接酶将二者连接。连接产物转化DH5α细胞，并在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，筛选阳性克隆；使用Axygen质粒抽提试剂盒抽提获得含重组DNA片段的pMD18-T重组质粒。

接着用限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ将PCR特异性扩增的玉米内标准基因zSSIIb的DNA片段（Seq ID No: 11）和含有重组DNA片段的pMD18-T重组质粒分别进行双酶切。然后用T₄连接酶将二者连接。连接产物转化DH5α细胞，并在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，筛选阳性克隆；使用Axygen质粒抽提试剂盒抽提获得将转基因玉米Mon810的品系特异性序列、构建特异序列以及玉米内标准基因zSSIIb的特异性序列融合在pMD18-T上的标准质粒分子pMHZ，其序列如Seq ID No:12所示。上述所述的酶切及连接等各种生物技术，均采用现有地相应技术。

本发明构建的标准质粒分子pMHZ的简要图谱如附图1所示。图中pMD-18T表示构建标准质粒分子的载体；EcoR I表示该位点含有限制性内切酶EcoRI的酶切位点；BamH I表示该位点含有限制性内切酶BamHⅠ的酶切位点；Hind III表示该位点含有限制性内切酶Hind III的酶切位点，“zSSIIb”表示玉米内源标准基因zSSIIb的一段特异性序列；“品系特异性序列”表示转基因玉米Mon810外源插入载体与玉米基因组邻接区的一段DNA序列；“构建特异性序列”表示外源插入载体的HSP70和cryIA（b）两个元件的连接区的DNA序列。

实施例2：构建的质粒标准分子在实际检测中的应用

一、实验材料

转基因玉米Mon810。

常规玉米品种。

其他遗传改良植物：大豆GTS 40-3-2、圣棉1号、玉米BT11、玉米Mon863、水稻SK-2。

二、实验方法与过程

1、基因组DNA提取与检测

1）植物基因组DNA提取

a、取适量玉米样品，加入研钵中，在液氮存在下研磨成粉末，称取约200mg磨碎的样品转入2ml离心管中；

b、加入1mL 65℃预热的提取液（20mM EDTA,2% CTAB, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 1.4mol/L NaCl, 1% PVP），轻轻混匀后，65℃水浴保温30min，期间间或振荡混匀；

c、在管中加入等体积酚/氯仿溶液(24:1)，上下颠倒充分混匀，常温静置抽提10min；

d、12000rpm离心10min，吸取上清液到一新离心管中；

e、加入两倍上清液体积的-20℃预冷的乙醇，混匀，-20℃放置30分钟后，12000rpm离心10分钟，去上清液，保留沉淀；

f、用500μl 70%的乙醇溶液清洗沉淀两次；沉淀于室温下晾干，后溶于100μl 无菌ddH₂O。

2）质粒基因组DNA提取

a、将37℃过夜的1-2ml菌培养物于6000rpm离心1分钟，彻底弃上清液；

b、加入菌液250μl含有RNase A的Buffer A1溶液，将菌体重新充分悬浮细胞，；

c、加入250μl Buffer B1，轻轻地反转10次以混合混匀，然后静止5min至溶液粘稠而澄清；

d、加入350μl Buffer N1，立即上下颠倒数次，使之充分混匀；

e、室温13000rpm离心10分钟, 将上清转移到套放于2ml收集管内的DNA吸附柱中，于室温13000rpm离心１min；

f、取出DNA吸附柱，倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Buffer KB, ，于室温13000rpm离心１min；倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中；

g、向DNA吸附柱中加入500μl DNA Wash Buffer，室温13000rpm离心１min，；倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中;

h、打开管盖室温放置5分钟使残余的乙醇挥发，后在DNA吸附柱膜中央加入50μl Elution Buffer，室温放置2分钟；

i、将DNA吸附柱放入干净1.5ml离心管中，；

k、于室温13000rpm离心1分钟洗脱膜上的DNA。

3）DNA检测

取5μl提取的DNA样品，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。

利用微量核酸和蛋白分析仪测定所提DNA的浓度与纯度。

2、转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR引物的特异性分析

优化确定转基因玉米Mon810品系特异性PCR检测体系及反应条件，并分别以其他遗传改良植物为检测模板定性扩增转基因玉米Mon810品系特异性的目的片段，确定针对转基因玉米Mon810设计的定量PCR引物特异性。

3、标准质粒分子pMHZ用于定量PCR检测的检测极限（LOD）和定量极限（LOQ）

优化确定转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR检测体系及反应条件，分别以不同浓度的标准质粒分子pMHZ基因组DNA样品（如2×10⁹copics/μl、2×10⁸copics/μl、2×10⁷copics/μl、2×10⁶copics/μl、2×10⁵copics/μl、2×10⁴copics/μl、2×10³copics/μl、2×10²copics/μl、2×10¹copics/μl和2×10⁰copics/μl）作为标准品测试建立的定量PCR检测方法的LOD和LOQ。每个反应重复三次，根据定量PCR扩增的标准曲线与扩增荧光信号间的线性关系，确定利用构建的标准质粒分子pMHZ代替阳性标准物质时，转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR检测方法的LOD和LOQ。

4、标准质粒分子pMHZ定量PCR检测体系的重复性和重演性

优化确定转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR检测体系反应条件，分别以不同浓度标准质粒分子pMHZ基因组DNA样品（2×10⁶copics/μl、2×10⁵copics/μl、2×10⁴copics/μl、2×10³copics/μl、2×10²copics/μl和2×10¹copics/μl）进行重复性和复现性测试，每个反应重复三次。根据定量PCR扩增的标准曲线，确定根据标准质粒分子pMHZ建立的转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR反应的可重复性和重演性。

5、标准质粒分子pMHZ定量PCR检测校正系数测定

在利用标准质粒分子pMHZ进行定量分析时，必须考虑标准质粒分子pMHZ DNA和玉米基因组DNA在PCR反应中的效率差异，这一差异可以通过校正系数（Calibration Factor，Cf）进行校正。Cf值的测定方法是用标准质粒分子pMHZ建立定量PCR检测体系，对纯合的转基因玉米Mon810标准标准阳性材料进行定量分析，通过比较定量分析的结果计算标准质粒分子pMHZ的校正Cf。Cf值可通过公式1计算得到。在获得Cf值后，通过公式2可以分析获得待测遗传改良样品中遗传改良成分的含量。

公式1：Cf＝纯合的遗传改良植物外源检测目的基因拷贝数/纯合的遗传改良植物内源基因拷贝数

公式2：遗传改良成分含量%＝（样品外源检测目的基因拷贝数×100）/（样品内源基因拷贝数×Cf）

6、应用标准质粒分子对实际转基因玉米Mon810样品的定量分析

根据测定的标准质粒分子pMHZ的校正系数和绘制的转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR标准曲线，分别对4个转基因玉米Mon810混合样品（遗传改良成分含量分别为0.5%、1.0%、2.0%和5.0%）进行分析。

三、实验结果

1、转基因玉米Mon810品系特异性PCR检测体系及反应条件

经过优化，转基因玉米Mon810的品系特异性PCR检测体系和PCR扩增条件分别见表2和表3。

表2. 转基因玉米Mon810的品系特异性PCR检测体系

反应试剂	体积（μl）	终浓度
			10×PCR缓冲液	5	1×（50mM KCl,10mMTris-HCl,pH8.3,1.5mM MgCl₂）
dNTPs	4	200μM
			上游引物	1	400μM
下游引物	1	400μM
			Taq酶	0.5	2.5单位/反应
DNA模板	1
			ddH₂O	补足50μl

表3. 转基因玉米Mon810的品系特异性定性PCR扩增条件

2、转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR引物的特异性分析

根据表4中的引物序列，对转基因玉米Mon810及其它遗传改良作物如GTS 40-3-2大豆、BT11玉米、Mon863玉米等的基因组样品进行定性PCR扩增。结果表明，只有在转基因玉米Mon810中，扩增得到了大小为173bp的目的片段条带，而在其它遗传改良作物中没有检测到该条带。因此，本发明设计的Mon810玉米品系的定量PCR引物具有高度特异性。

表4. 转基因玉米Mon810的品系特异性定量PCR引物及探针序列

Figure 2011104304407100002DEST_PATH_IMAGE003

3.转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR检测体系的优化和建立

根据定量PCR反应体系的优化方法，寻找最适宜的转基因玉米Mon810的品系特异性定量PCR引物和探针的浓度，保证定量PCR的反应效率达到90%以上。经过优化，当引物和探针的浓度为400nM和300nM时，PCR扩增曲线的效率最高，荧光信号最强。因此该浓度用于建立转基因玉米的定量PCR反应体系，其它成分量详见表5，PCR扩增条件见表6。

表5.转基因玉米Mon810的品系特异性定量PCR检测体系

反应试剂	体积（μl）
		2× Premix Ex Taq	12.5
上游引物	1
		下游引物	1
探针	1
		DNA模板	1
ddH₂O	补足25μl

表6.转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR检测扩增条件

4、标准质粒分子pMHZ进行定量PCR检测的检测极限（LOD）和定量极限（LOQ）

利用优化好的转基因玉米Mon810特异性定量PCR反应体系，分别以不同浓度的标准质粒分子pMHZ基因组样品（如5×10⁹copics/μl、5×10⁸copics/μl、5×10⁷copics/μl、5×10⁶copics/μl、5×10⁵copics/μl、5×10⁴copics/μl、5×10³copics/μl、5×10²copics/μl、5×10¹copics/μl和5×10⁰copics/μl）作为标准样品测试本发明建立的定量PCR检测体系的LOD和LOQ。经过3次重复实验确定该体系的LOD为5个拷贝，LOQ为50个拷贝。说明构建的pMHZ标准质粒分子可以代替转基因玉米Mon810阳性标准品定量检测转基因玉米Mon810及其加工产品遗传改良成分含量。

以浓度为5×10⁹copics/μl、5×10⁸copics/μl、5×10⁷copics/μl、5×10⁶copics/μl、5×10⁵copics/μl、5×10⁴copics/μl、5×10³copics/μl、5×10²copics/μl、5×10¹copics/μl和5×10⁰copics/μl的pMHZ玉米标准质粒分子基因组DNA样品为标准品绘制转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR标准曲线。根据定量标准曲线及该体系的LOD和LOQ结果可以认为，本发明通过构建的标准质粒分子建立的转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR检测系统具有很高的准确性和灵敏度，完全可以用于转基因玉米Mon810及其加工产品的实际检测。

5、利用标准质粒分子pMHZ建立定量PCR检测体系的重复性和重演性测定

在优化的转基因玉米特异性定量PCR反应条件下（表2和表3），分别以不同浓度标准质粒分子pMHZ基因组DNA样品（5×10⁹copics/μl、5×10⁸copics/μl、5×10⁷copics/μl、5×10⁶copics/μl、5×10⁵copics/μl、5×10⁴copics/μl、5×10³copics/μl、5×10²copics/μl和5×10¹copics/μl）进行重复性和可复现性的测试，3个平行反应间和3次不同重复实验间获得的Ct值标准偏差基本上都小于0.2，说明根据构建的pMHZ标准质粒分子建立的转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR反应的充分性和重演性好，可用于实际转基因玉米Mon810样品的定量分析。

6、利用标准质粒分子pMHZ建立定量PCR检测体系校正系数确定

利用玉米标准质粒分子pMHZ建立代替转基因玉米Mon810阳性标准品用于定量PCR检测时，通过标准质粒分子建立了定量PCR检测方法，对纯合的转基因玉米Mon810标准阳性材料进行定量分析，通过比较定量分析的结果计算标准质粒分子pMHZ的校正系数，为1.22，见表7。

表7. 标准质粒分子pMHZ用于定量PCR分析的校正系数测定

7、应用pMHZ标准质粒分子对实际转基因玉米Mon810样品的定量分析

根据测定的标准质粒分子pMHZ的校正系数和绘制的转基因玉米Mon810品系特异性定量PCR标准曲线，分别对4个转基因玉米Mon810混合样品（遗传改良成分含量分别为0.5%、1.0%、2.0%和5.0%）进行了分析，定量分析结果显示4个转基因玉米Mon810混合样品的遗传改良成分含量分别为0.513%、1.115%、2.046%和5.021%，与真实值的偏差分别为2.6%、11.5%、2.3%和4.2%，定量结果的标准偏差(SD)小于0.2，相对标准偏差小于16%（具体数据见表8）。因此，利用标准质粒分子pMHZ对实际样品分析的结果比较准确，检测结果的偏差在ISO转基因食品检测标准允许的0-0.25范围内，表明本发明构建的转基因玉米Mon810标准质粒分子pMHZ完全可以代替该品系的阳性标准品，适用于转基因玉米Mon810样品的品系特异性定量PCR分析和检测。

表8. 转基因玉米Mon810样品的定量分析结果

Claims

1.一种用于转基因玉米Mon810检测的标准质粒分子，其特征在于，其核苷酸序列中具有转基因玉米Mon810的品系特异性序列、构建特异性序列及玉米内源标准基因zSSIIb的特异性序列的三者串联序列，其序列如Seq ID No:12所示；

其中，转基因玉米Mon810的品系特异性序列，指的是转基因玉米Mon810外源插入载体与玉米基因组左邻接区的核酸序列，包含玉米基因组的部分序列与35S启动子的部分序列，其序列如Seq ID No:1所示；

构建特异序列，指的是转基因玉米Mon810外源插入载体的hps70基因与cryIA(b)邻接区的序列，其序列如Seq ID No:2所示；

玉米内标准基因zSSIIb的特异性序列，指的是玉米淀粉合酶异构体zSTSⅡ-2基因的特异性片段，其序列如Seq ID No:3所示。

2.一种如权利要求1所述的用于转基因玉米Mon810检测的标准质粒分子的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计PCR特异性引物；

上游引物：MT-F,其序列如Seq ID No:4所示，

下游引物：MT-R,其序列如Seq ID No:5所示，用于扩增Mon810玉米的品系特异性序列；

上游引物：HC-F,其序列如Seq ID No:6所示，

下游引物：HC-R,其序列如Seq ID No:7所示，用于扩增Mon810玉米的构建特异性序列；

上游引物：ZB-F,其序列如Seq ID No:8所示，

下游引物：ZB-R,其序列如Seq ID No:9所示，用于扩增玉米的内标准基因zSSIIb基因的特异性序列；

（2）利用步骤（1）中所述的特异性引物分别扩增遗传改良玉米品系Mon810品系特异性序列、构建特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb的特异性序列：

扩增条件均为：

PCR反应体积为50μl,包括以下成分：

所述上游引物和下游引物的浓度均为20μM；

PCR反应条件为：94℃5分钟；然后进入以下循环94℃50秒，55℃50秒,72℃60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；

将PCR扩增得到的品系特异性序列片段和构建特异性序列片段产物分别命名为PMT和PHC；

（3）遗传改良玉米品系Mon810品系特异性序列和构建特异性序列的拼接：

用上述PCR得到的品系特异性序列产物PMT和构建特异序列产物PHC为模板，以MT-F和HC-R作为重叠PCR的引物对，进行PCR扩增，实现品系特异性序列和构建特异序列的重组拼接；重叠PCR分两步扩增：

第一步：扩增的条件为：

PCR反应体积为50μl,包括以下成分：

PCR反应条件为：94℃4分钟；然后进入以下循环94℃1分钟，60℃4分钟，共7个循环；

第二步：扩增条件为：

PCR反应体积为100μl,包括以下成分：

所述上游引物和下游引物的浓度均为20μM；

PCR反应条件为：94℃4分钟；然后进入以下循环94℃1分钟，55℃2分钟72℃2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；

经过重叠PCR扩增得到814bp的品系特异性序列和构建特异序列的重组片段，其序列如SeqID No:10所示；

（4）重组DNA片段及玉米内标准基因zSSIIb的特异性片段克隆进入pMD18-T载体

首先用限制性内切酶BamH I和Hind III将上述得到的重组DNA片段Seq ID No:10和pMD18-T载体分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接；连接产物转化DH5α细胞，并在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，筛选阳性克隆；使用Axygen质粒抽提试剂盒抽提获得含重组DNA片段的pMD18-T重组质粒；接着用限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ将PCR特异性扩增的含有玉米内标准基因zSSIIb的DNA片段的扩增产物Seq ID No:11和含有重组DNA片段的pMD18-T重组质粒分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接；连接产物转化DH5α细胞，并在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，筛选阳性克隆；使用Axygen质粒抽提试剂盒抽提获得将遗传改良玉米品系Mon810的品系特异性序列、构建特异序列以及玉米内标准基因zSSIIb的特异性序列融合在pMD18-T上的标准质粒分子pMHZ。

3.如权利要求1所述的用于转基因玉米Mon810检测的标准质粒分子在定量PCR检测遗传改良玉米品系Mon810中用于对遗传改良玉米品系Mon810样品及其加工产品中的遗传改良成分进行定量分析。