CN116732226A - 一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及育种技术领域，公开了一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用，包括一种转基因玉米事件检测引物，包括特异性KASP检测引物、侧翼标记KASP检测引物以及纯杂合子检测引物，还包括一种用于快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，包括以下步骤：S1种植回交用的供体材料和受体材料，将供体材料和受体材料进行杂交得到杂交F1玉米种子；S2将F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选含有转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC1F1世代玉米种子。本发明提供了一套高通量、低成本、快速进行玉米转基因回交转育的技术方案，提高回交转育效率和节省回交转育成本。
Description
技术领域
本发明涉及育种技术领域，尤其涉及一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用。
背景技术
转基因玉米品种选育通常采用回交法。由于转基因遗传转化效率受材料影响较大，通常优良的玉米自交系因转化效率太低而不适合做遗传转化材料，因此转基因性状不能直接通过遗传转化方法导入优良玉米自交系中。另外，特定的玉米转基因事件在玉米基因组上的插入位置是唯一的，具有特异的玉米基因组侧翼序列以及转基因序列，而通过遗传转化的方法将转基因元件转入玉米基因组时，转基因元件整合到玉米基因组上的位置是随机的。因此，转基因玉米自交系一般只能通过回交法获得，即以遗传转化得来的具有特定转基因事件的玉米转基因材料为供体，以优良的非转基因玉米骨干自交系为受体，杂交一代后用受体材料多代杂交，也就是回交法，来获得含有特定转基因性状的优良转基因玉米自交系。
常规的回交法主要通过在田间多代种植和筛选来完成。种植供体玉米材料和受体玉米材料，在花期进行授粉杂交，待玉米完全成熟后收获，获得第一代的玉米材料，然后将第一代玉米材料和受体玉米材料继续在田间进行种植，授粉杂交，获得第二代玉米材料，如此重复种植和授粉杂交，并在高世代进行自交，可以在第十代左右获得含有转基因性状纯合基因型转基因玉米自交系，如果一年种植三个世代，需要三年半时间。
常规的回交法具有周期长和转基因目标性状选择有一定的假阳性概率等缺点。随着分子标记技术的发展，利用分子标记技术协助回交法进行转基因玉米自交系选育，可以有效的加快选育进度，且对转基因目标性状选择的准确性高，可以在第六代获得含有转基因性状纯合基因型的转基因玉米单株。如果一年种植三个世代，需要两年时间，相比常规的回交方法可以节省四个种植世代，节省一年半时间。
然而常规的分子标记辅助选择方法存在检测通量低，成本高，周期仍相对较长的缺点。在商业化转基因育种过程中，需要回交转育大批量的优良玉米骨干自交系，以及每年新选育出来的优良玉米自交系。另外随着目前玉米新品种井喷，大量新品种涌现，玉米新品种的生命周期缩短，因此转基因品种尽快上市可以抢占市场先机，延长品种生命周期，从而对转基因玉米选育速度和质量提高了要求，为此提出一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用。
发明内容
为解决现有转基因玉米育种效率低、时间长、准确性差等技术问题，本发明提供一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用。
本发明采用以下技术方案实现：一种转基因玉米事件检测引物，包括特异性KASP检测引物、侧翼标记KASP检测引物以及纯杂合子检测引物。
作为上述方案的进一步改进，所述特异性KASP检测引物包括：SK12-5R-FAM、SK12-5R-COM、ZSSIIb-1HEX和ZSSIIb-1COM。
作为上述方案的进一步改进，所述侧翼标记KASP检测引物包括检测分布玉米转基因插入点位置的12Mb的物理区间内的SNP标记位点的引物。
作为上述方案的进一步改进，所述纯杂合子检测引物包括Taqman探针qSK125R-P、zSSIIb-P和引物qSK125R-F1、qSK125R-R1、zSSIIb-3F、zSSIIb-4R。
作为上述方案的进一步改进，所述特异性KASP检测引物用于对玉米植株进行转基因事件的检测。
侧翼标记KASP检测引物用于对转基因玉米植株进行转基因插入点的侧翼标记检测。
纯杂合子检测引物用于转基因玉米植株的转基因纯合基因型和转基因杂合基因型检测。
一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，包括以下步骤：
S1种植供体材料和受体材料，将供体材料和受体材料进行杂交得到杂交F1玉米种子。
S2将F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选含有转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC1F1世代的玉米种子。
S3将BC1F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在、背景回复率高、且在左侧或右侧发生重组交换的玉米植株b在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC2F1世代的玉米种子。
S4将BC2F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在、背景回复率高，且在左右两侧均发生重组交换玉米植株c在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC3F1世代的玉米种子。
S5将BC3F1世代的玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在，背景回复率高，且在左右两侧进一步发生重组交换的植株进行自交授粉，得到BC3F2世代的玉米种子。
S6将BC3F2世代的玉米种子进行播种，利用检测引物对BC3F2世代的玉米植株进行转基因纯杂合基因型检测，对检测出的纯合转基因单株进行自交授粉，从而筛选得到稳定性一致的纯合基因型转基因玉米自交系。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S1中，以瑞丰125转基因玉米材料作为供体材料，以优良的非转基因玉米自交系为受体材料进行杂交得到杂交F1玉米种子。
步骤S2中，将F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物筛选含有转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC1F1世代玉米种子。
步骤S3中，将BC1F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用侧翼标记KASP检测引物对玉米幼苗进行侧翼标记检测，筛选在转基因插入位置左侧或者右侧发生重组交换的幼苗，然后对发生重组交换的幼苗进行1K SNP标记靶向测序panel(包含两侧侧翼SNP标记)背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选转基因事件存在、背景回复率高、且在左侧或右侧发生重组交换的玉米植株b在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC2F1世代的玉米种子。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S4中，将BC2F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物，对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用侧翼标记KASP检测引物对玉米幼苗进行检测，筛选在转基因插入位置左右两侧均发生重组交换的幼苗，对发生重组交换的幼苗进行1K SNP标记靶向测序panel背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选背景回复率高，且在左右两侧都发生重组交换的玉米植株c在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC3F1世代的玉米种子。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S5中，将BC3F1世代的玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物，对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用1K SNP标记靶向测序panel(包含两侧侧翼SNP标记)背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选背景回复率高，且在左右两侧进一步发生重组交换的幼苗，背景回复率达预期数值时，选择两侧连锁累赘片段最小的植株进行自交授粉。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S6中，将BC3F2世代的玉米种子进行播种，利用纯杂合子检测引物对BC3F2世代的玉米植株进行转基因纯杂合基因型检测，对检测出的转基因纯合单株自交授粉获得到稳定性一致的转基因纯合系。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S1至S6中采用玉米胚挽救技术加快转基因事件的回交转育进程，其步骤为：在玉米授粉后，将未成熟果穗从玉米植株上取下；在实验室超净工作台上将玉米籽粒幼胚剥出，放置培养基上进行暗培养和光培养，然后移栽到穴盘中，对穴盘中的幼苗叶片取样检测，根据检测结果挑选优良单株移栽到大田。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用开发的转基因事件特异性KASP检测引物，可以准确地检测转基因事件是否存在于玉米幼苗中；采用侧翼标记检测KASP引物，可以有效筛选出重组交换单株，减少转基因片段带入的连锁累赘；采用转基因纯杂合子检测引物可以对自交后代进行高通量、准确的纯杂合基因型检测，加速转基因目标性状的纯合。
2、本发明利用玉米胚挽救技术，结合分子检测结果，只移栽发生重组交换的幼苗(约总苗数的10％-15％)至大田，节省了85％-90％的种植面积，同时减少后期的田间管理和收获工作；同时应用胚挽救技术，一年可种植四代，完成整个回交转育仅需要一年半年，比不利用胚挽救技术缩短半年时间。
3、本发明可以实现同时对100个以上回交群体进行高通量检测，完成一个转基因玉米自交系的回交转育时间相对于常规回交方法，育种年限缩短两年左右，相对于常规分子标记辅助方法，分子检测费用节省80％。
4、本发明提供了一套高通量、低成本、快速进行转基因玉米回交转育的技术方案，提高回交转育效率和节省回交转育成本。
附图说明
图1为本发明提供的瑞丰125转基因事件特异性KASP引物组合SK12-5R-FAM、SK12-5R-COM、ZSSIIb-1HEX、ZSSIIb-1COM对玉米DNA样本进行检测的效果图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1：
一种转基因玉米事件检测引物，包括特异性KASP检测引物、侧翼标记KASP检测引物以及纯杂合子检测引物。
所述特异性KASP检测引物包括：SK12-5R-FAM、SK12-5R-COM、ZSSIIb-1HEX和ZSSIIb-1COM其中至少任意一种。
所述侧翼标记KASP检测引物包括玉米转基因插入点位置的12Mb的物理区间内的SNP标记位点的引物。
所述纯杂合子检测引物包括Taqman探针qSK125R-P、zSSIIb-P和引物qSK125R-F1、qSK125R-R1、zSSIIb-3F、zSSIIb-4R。
所述特异性KASP检测引物用于对玉米植株进行转基因事件的检测。
侧翼标记KASP检测引物用于对玉米植株进行转基因插入位点的侧翼标记检测。
纯杂合子检测引物用于玉米植株的转基因纯合基因型和转基因杂合基因型检测。
一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，包括以下步骤：
S1种植供体材料和受体材料，将供体材料和受体材料进行杂交得到杂交F1玉米种子。
S2将F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选含有转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC1F1世代的玉米种子。
S3将BC1F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在、背景回复率高、且在左侧或右侧发生重组交换的玉米植株b在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC2F1世代的玉米种子。
S4将BC2F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在、背景回复率高，且在左右两侧均发生重组交换玉米植株c在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC3F1世代的玉米种子。
S5将BC3F1世代的玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在，背景回复率高，且在左右两侧进一步发生重组交换的植株进行自交授粉，得到BC3F2世代的玉米种子。
S6将BC3F2世代的玉米种子进行播种，利用检测引物对BC3F2世代的玉米植株进行转基因纯杂合基因型检测，对检测出的纯合基因型转基因单株进行自交授粉，从而筛选得到稳定性一致的纯合转基因玉米自交系。
所述步骤S1中，以瑞丰125转基因玉米材料作为供体材料，以优良的非转基因玉米自交系为受体材料；
步骤S2中，将F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物筛选含有转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC1F1世代玉米种子。
步骤S3中，将BC1F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用侧翼标记KASP检测引物对玉米幼苗进行侧翼标记检测，筛选在转基因插入位置左侧或者右侧发生重组交换的幼苗，然后对发生重组交换的幼苗进行1K SNP标记靶向测序panel(包含两侧侧翼SNP标记)背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选转基因事件存在、背景回复率高、且在左侧或右侧发生重组交换的玉米植株b在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC2F1世代的玉米种子。
所述步骤S4中，将BC2F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物，对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，后利用侧翼标记KASP检测引物对玉米幼苗进行检测，筛选在转基因插入位置左右两侧均发生重组交换的幼苗，对发生重组交换的幼苗进行1KSNP标记靶向测序panel包含两侧侧翼SNP标记)背景检测，同时进行侧翼标记检测确认，挑选背景回复率高，且在左右两侧均发生重组交换的玉米植株c在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC3F1世代的玉米种子。
所述步骤S5中，将BC3F1世代的玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物，对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用1K SNP标记靶向测序panel(包含两侧侧翼SNP标记)背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选背景回复率高，且在左右两侧进一步发生重组交换的幼苗，背景回复率达预期数值时，选择两侧连锁累赘片段最小的植株进行自交授粉。
所述步骤S6中，将BC3F2世代的玉米种子进行播种，利用纯杂合子检测引物对BC3F2世代的玉米植株进行转基因纯杂合基因型检测，对检测出的转基因纯合基因型单株进行自交授粉获得到稳定性一致的转基因纯合系。
所述步骤S1至S6中采用玉米胚挽救技术加快转基因事件的回交转育进程，其步骤为：在玉米授粉后，将未成熟果穗从玉米植株上取下；在实验室超净工作台上将玉米籽粒幼胚剥出，放置培养基上进行暗培养和光培养，然后移栽到穴盘中，对穴盘中的幼苗叶片取样检测，根据检测结果挑选优良单株移栽到大田。
实施例2：
转基因事件的特异性KASP检测引物筛选
根据瑞丰125转基因事件在玉米基因组上的插入序列，以及侧翼玉米基因组序列，玉米淀粉合成酶异构体基因ZSSⅡb的部分序列作为内标准基因序列，设计特异性KASP检测引物。
以下是转基因插入及侧翼玉米基因组序列(5’-3’)，其中1-867bp(小写字母碱基)为插入RB端的侧翼玉米基因组序列，12039-12599bp(小写字母碱基)为插入LB端的侧翼玉米基因组序列，868-12038bp大写字母为转基因插入序列。
以下是玉米淀粉合成酶异构体基因ZSSⅡb的部分序列(5’-3’)
其中，利用primer5引物设计软件进行引物设计，引物设计遵循以下基本原则：
引物扩增片段大小最小为50bp，最大为150bp，最优为50bp。
引物退火温度最低为55℃，最高为63℃，最优为57℃，引物之间最大退火温度差不超过2℃。
针对转基因插入位置右端的玉米基因组序列和转基因插入序列，以及ZSSⅡb的序列设计出以下引物组合，针对转基因事件的检测引物SK12-5R-FAM和SK12-5R-COM，分别与转基因插入位置的玉米基因组序列和转基因插入序列互补，扩增片段将是瑞丰转基因事件的特异性序列。引物组合中的4条引物与目的序列的互补位置如表1所示。
表1特异性KASP检测引物名称及碱基序列
| 引物名称 | 碱基序列 |
| SK12-5R-FAM | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcgacgctacaacgagactgatagtt |
| SK12-5R-COM | gcttgagcttggatcagattgtcgtt |
| ZSSIIb-1HEX | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTggcggtgctcgcgctgct |
| ZSSIIb-1COM | cctttgacatctgctccgaagcaaa |
注：大写碱基序列为FAM和HEX的荧光标签序列；
将四条引物按照表2所示的比例进行混合，配制成引物工作液。
表2特异性KASP检测引物工作液配比体系
其中，特异性KASP检测引物检测的PCR配置见表3；
表3特异性KASP检测引物PCR反应体系
| 内容 | 体积/ul |
| DNA | 0.8 |
| 引物工作液 | 0.8/36 |
| 2×KASPmastermix | 0.8×35/36 |
| 总计 | 1.6 |
其中，特异性KASP检测引物检测的PCR反应程序如表4所示。
表4特异性KASP检测引物PCR反应程序
2021年11月，对以玉米自交系23112为受体，以瑞丰125(PH4CV)为转基因供体的回交BC1F1群体的186个单株进行瑞丰125转基因事件检测。
DNA快速提取：
采用Hotshot法对玉米叶片进行快速DNA提取；Hotshot提取DNA的方法不仅在试剂耗材成本上低廉，而且整个流程的耗时非常短，在大规模提取DNA时可以节省大量的人力物力和时间；高通量分子标记检测，利用LGC生产的高通量实时荧光检测系统和水浴PCR仪，对DNA样品进行高通量的分子标记检测；186个单株的检测结果见表5所示。
表5 186个BC1F1单株瑞丰125转基因事件检测结果
/>
其中YES表示含有瑞丰125转基因事件，NO表示不含有瑞丰125转基因事件。经检测，186个单株中有162个单株含有瑞丰125转基因事件，24个单株不含瑞丰125转基因事件。
如图1所示为瑞丰125转基因事件特异性KASP引物组合SK12-5R-FAM、SK12-5R-COM、ZSSIIb-1HEX、ZSSIIb-1COM对玉米DNA样本进行检测的效果图，其中实心圆点为同时含有瑞丰125转基因事件片段以及玉米淀粉合成酶异构体基因ZSSⅡb片段的玉米DNA样本，空心圆点为只含有玉米淀粉合成酶异构体基因ZSSⅡb片段的玉米DNA样本，实心三角形点为空白对照组。
实施例3：
侧翼标记KASP检测引物筛选
首先，根据瑞丰125转基因事件的侧翼玉米基因组序列，将该序列与玉米参考基因组B73 V3进行比对，在maizegdb网站上进行比对。比对结果显示瑞丰125转基因事件在玉米B73 V3基因组上的插入位置在9号染色体，第89650962-96744907个碱基之间，在包含转进插入位置的12Mb的物理区间内，从隆平高科SNP数据库中选取了39个SNP标记，作为侧翼标记，这39个SNP标记均匀分布在12Mb的物理区间内，具体见表6。
表6 39个SNP标记名称及对应物理位置
| 标记名称 | SNP | 染色体 | 物理位置 | 标记名称 | SNP | 染色体 | 物理位置 |
| SK12-5f-6 | C/T | 9 | 86,303,875 | SK12-5f-36 | C/A | 9 | 92,482,021 |
| SK12-5f-7 | C/T | 9 | 86,664,733 | SK12-5f-37 | A/C | 9 | 92,908,285 |
| SK12-5f-46 | A/T | 9 | 87,002,953 | SK12-5f-38 | C/T | 9 | 93,319,006 |
| SK12-5f-8 | T/G | 9 | 87,200,001 | SK12-5f-39 | T/G | 9 | 93,597,646 |
| SK12-5f-27 | A/G | 9 | 87,869,369 | SK12-5f-40 | C/T | 9 | 93,922,586 |
| SK12-5f-10 | C/T | 9 | 88,138,001 | SK12-5f-17 | T/G | 9 | 94,042,204 |
| SK12-5f-11 | T/C | 9 | 88,427,731 | SK12-5f-41 | T/C | 9 | 94,358,617 |
| SK12-5f-28 | T/C | 9 | 88,819,087 | SK12-5f-42 | C/A | 9 | 94,818,681 |
| SK12-5f-12 | G/C | 9 | 89,000,677 | SK12-5f-18 | G/A | 9 | 94,912,446 |
| SK12-5f-13 | G/A | 9 | 89,298,798 | SK12-5f-19 | A/G | 9 | 95,501,127 |
| SK12-5f-29 | C/G | 9 | 89,530,821 | SK12-5f-20 | A/G | 9 | 95,801,076 |
| SK12-5f-30 | G/C | 9 | 89,800,197 | SK12-5f-43 | G/A | 9 | 96,140,990 |
| SK12-5f-31 | A/G | 9 | 900,411,462 | SK12-5f-21 | A/G | 9 | 96,397,197 |
| SK12-5f-14 | G/A | 9 | 90,552,759 | SK12-5f-22 | G/A | 9 | 96,707,439 |
| SK12-5f-15 | A/G | 9 | 90,801,952 | SK12-5f-23 | A/G | 9 | 97,000,811 |
| SK12-5f-16 | A/C | 9 | 91,003,138 | SK12-5f-24 | G/A | 9 | 97,311,174 |
| SK12-5f-32 | G/A | 9 | 91,195,903 | SK12-5f-44 | A/G | 9 | 97,666,348 |
| SK12-5f-33 | T/C | 9 | 91,601,371 | SK12-5f-45 | A/G | 9 | 98,027,863 |
| SK12-5f-34 | G/A | 9 | 91,919,105 | SK12-5f-26 | C/T | 9 | 98,204,260 |
| SK12-5f-35 | T/C | 9 | 92,255,498 |
39个SNP标记序列内容如核酸序列如SEQ ID NO.1-39所示；
此后，对以上SNP标记设计KASP检测引物，根据每个SNP标记在玉米B73 V3基因组上的物理位置，提取每个SNP标记左右两侧各200bp的基因组序列，然后进行KASP检测引物设计。
2020年10月，对自交系23112回交群体的317个BC2F1世代单株进行转基因插入位置左侧侧翼SNP标记检测和转基因事件检测。通过在供体亲本与受体亲本之间筛选具有多态性的侧翼标记，将四个标记SK12-5f-48、SK12-5f-51、SK12-5f-52和SK12-5f-62作为左侧侧翼标记，用于检测回交群体单株的连锁累赘情况；用SK12-5R标记检测瑞丰125转基因事件。
侧翼标记KASP检测引物PCR反应体系如表7所示；侧翼标记KASP检测引物PCR反应程序如表8所示。
表7侧翼标记KASP检测引物PCR反应体系
| 内容 | 体积/ul |
| DNA | 0.8 |
| 引物工作液 | 0.8/36 |
| 2×KASPmastermix | 0.8×35/36 |
| 总计 | 1.6 |
表8侧翼标记KASP检测引物PCR反应程序
对于侧翼标记，检测出的基因型与受体亲本基因型一致的单株，被认为是在该标记位点发生了重组交换，去除了连锁累赘；发生重组交换的侧翼标记的数目越多的单株，被认为是去除了越多的连锁累赘；对于SK12-5R，检测出为YES的单株，表示含有瑞丰125转基因事件，检测出为NO的单株，表示不含有瑞丰125转基因事件，317个单株具体检测结果见表9。
表9 317个BC2F1世代单株转基因事件及侧翼检测结果
/>
/>
实施例4：
用1K SNP标记靶向测序panel对回交群体进行背景检测
将隆平高科1K SNP panel总计1462个SNP标记，均匀分布于玉米的10条染色体上；利用1K SNP标记靶向测序panel对回交单株进行背景检测，挑选与轮回亲本的基因型相似度较高的单株。
背景回复率＝NS/NA
NS：与受体亲本基因型一致的SNP标记数目，NA：所用的SNP标记的总数目。
2020年10月，对受体自交系LP04的184个BC2F1回交群体单株进行1K SNP标记靶向测序panel(包含两侧侧翼SNP标记)背景检测，检测结果见表10。
表10受体亲本LP04的184个BC2F1回交单株1K SNP标记靶向测序panel检测结果
/>
/>
实施例5：
纯杂合子检测引物筛选
根据瑞丰125转基因事件在玉米基因组上的插入序列，以及侧翼玉米基因组序列，设计瑞丰125纯杂合子检测的Taqman探针和引物。具体见表11。检测瑞丰125纯杂合子Taqman探针和引物荧光定量PCR反应体系和反应程序分别见表12和表13。
表11检测瑞丰125纯杂合子的Taqman引物和探针详表
| 引物和探针名称 | 序列(5’-3’) | 荧光标记 |
| qSK125R-F1 | GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT | |
| qSK125R-R1 | GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA | |
| qSK125R-P | AGCTCAACCACATCGCCCGACGC | 5’FAM，3’BQ1, |
| zSSIIb-3F | CGGTGGATGCTAAGGCTGATG | |
| zSSIIb-4R | AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC | |
| zSSIIb-P | TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG | 5’VIC，3’BQ1, |
表12检测瑞丰125纯杂合子的荧光定量PCR反应体系
| 内容 | 体积/ul |
| Primer1(10μM) | 0.8/25 |
| Primer2(10μM) | 0.8/25 |
| TaqmanProbe(10μM) | 0.8/50 |
| TaqmanMasterMix | 0.8-2/25 |
| TemplateDNA/cDNA | 0.8 |
| 总计 | 1.6 |
表13检测瑞丰125纯杂合子荧光定量PCR反应程序
利用LGC生产的高通量实时荧光定量系统进行瑞丰125转基因事件的纯杂合子的检测，系统采用相对定量的方法进行计算，计算出转基因的拷贝数。拷贝数为1的即为杂合子以Aa表示，拷贝数为2的即为纯合子以AA表示，拷贝数小于0.1的为阴性以aa表示。
2020年2月，对以玉米自交系L239为受体，以瑞丰125(Z58)为转基因供体的回交BC4S1群体的357个单株进行瑞丰125转基因事件纯杂合基因型检测。
利用LGC生产的高通量实时荧光检测系统对357个单株的检测结果如表14所示。
表14 357个BC4S1单株纯杂合基因型检测结果
/>
其中，2表示转基因纯合基因型，1表示转基因杂合基因型。357个单株经检测，103个单株为转基因纯合基因型株，254个单株为转基因杂合基因型株。
实施例6：
玉米胚挽救技术
在玉米授粉后14天左右，将幼胚发育到3mm-4mm的玉米果穗从玉米植株上取下。在实验室超净工作台上将籽粒幼胚剥出，放置培养基上进行暗培养和光培养，培养7天左右后，将长根的胚移栽到穴盘中，在穴盘中缓苗3天左右，对穴盘中的幼苗进行叶片取样，提取DNA进行转基因事件和侧翼标记检测。然后待7天左右后，根据检测结果将优良单株挑选出来移栽到大田。利用玉米胚挽救技术，每个世代可以节约一个月左右的种植时间，这样可实现一年四代玉米种植，加快回交转育进程。
本发明利用转基因事件特异性KASP检测引物，可以准确地检测转基因事件是否存在于玉米幼苗中；采用侧翼标记检测KASP引物，可以有效筛选出重组交换单株，减少转基因片段带入的连锁累赘；采用纯杂合子检测引物检测准确区分转基因纯合基因型和杂合基因型，协助快速获得目标基因纯合单株。
利用玉米胚挽救技术，结合分子检测结果，只移栽发生重组交换的幼苗(约占总苗数的10％-15％)至大田，节省了85％-90％的种植面积，同时减少后期的田间管理和收获工作。
可以实现同时对100个以上回交群体进行高通量检测，完成一个转基因玉米自交系的回交转育时间相对于常规回交方法，缩短育种年限两年左右，相对于常规分子标记辅助方法，分子检测费用节省80％。
提供了一套高通量、低成本、快速进行玉米转基因回交转育的技术方案，提高回交转育效率和节省回交转育成本。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种转基因玉米事件检测引物，其特征在于，包括特异性KASP检测引物、侧翼标记KASP检测引物以及纯杂合子检测引物。
2.如权利要求1所述的一种转基因玉米事件检测引物，其特征在于，所述特异性KASP检测引物包括：SK12-5R-FAM、SK12-5R-COM、ZSSIIb-1HEX和ZSSIIb-1COM。
3.如权利要求1所述的一种转基因玉米事件检测引物，其特征在于，所述侧翼标记KASP检测引物包括检测分布玉米转基因插入点位置的12Mb的物理区间内的SNP标记位点的引物。
4.如权利要求1所述的一种转基因玉米事件检测引物，其特征在于，所述纯杂合子检测引物包括Taqman探针qSK125R-P、zSSIIb-P和引物qSK125R-F1、qSK125R-R1、zSSIIb-3F、zSSIIb-4R。
5.如权利要求1所述的一种转基因玉米事件检测引物，其特征在于，所述特异性KASP检测引物用于对玉米植株进行转基因事件的检测；
侧翼标记KASP检测引物用于对玉米植株进行转基因插入点的侧翼标记检测；
纯杂合子检测引物用于转基因玉米植株的转基因纯合基因型和转基因杂合基因型检测。
6.一种如权利要求1-5任意一项所述的检测引物用于快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1种植供体材料和受体材料，将供体材料和受体材料进行杂交得到杂交F1玉米种子；
S2将F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选含有转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC1F1世代的玉米种子；
S3将BC1F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在、背景回复率高、且在左侧或右侧发生重组交换的玉米植株b在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC2F1世代的玉米种子；
S4将BC2F1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在、背景回复率高，且在左右两侧都发生重组交换玉米植株c在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC3F1世代的玉米种子；
S5将BC3F1世代的玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在，背景回复率高，且在左右两侧进一步发生重组交换的植株进行自交授粉，得到BC3F2世代的玉米种子；
S6将BC3F2世代的玉米种子进行播种，利用检测引物对BC3F2世代的玉米植株进行转基因纯杂合检测，对检测出的纯合转基因单株进行自交授粉，从而筛选得到稳定性一致的纯合转基因玉米自交系。
7.如权利要求6所述的一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，其特征在于，所述步骤S1中，以瑞丰125转基因玉米材料作为供体材料，以优良的非转基因玉米自交系为受体材料；
步骤S2中，将F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物筛选具备转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC1F1世代的玉米种子；
步骤S3中，将BC1F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用侧翼标记KASP检测引物对玉米幼苗进行侧翼标记检测，筛选在转基因插入位置左侧或者右侧发生重组交换的幼苗，然后对发生重组交换的幼苗进行1KSNP标记靶向测序panel(包含两侧侧翼SNP标记)背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选转基因事件存在、背景回复率高、且在左侧或右侧发生重组交换的玉米植株b在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC2F1世代的玉米种子。
8.如权利要求6所述的一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，其特征在于，所述步骤S4中，将BC2F1玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物，对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用侧翼标记KASP检测引物对玉米幼苗进行检测，筛选在转基因插入位置左右两侧均发生重组交换的幼苗，对发生重组交换的幼苗进行1KSNP标记靶向测序panel背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选背景回复率高，且在左右两侧均发生重组交换的玉米植株c在授粉期与受体材料进行杂交，得到BC3F1世代的玉米种子。
9.如权利要求6所述的一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，其特征在于，所述步骤S5中，将BC3F1世代的玉米种子进行播种，利用特异性KASP检测引物，对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用1KSNP标记靶向测序panel(包含两侧侧翼SNP标记)背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选背景回复率高，且在左右两侧进一步发生重组交换的幼苗，背景回复率达预期数值时，选择两侧连锁累赘片段最小的植株进行自交授粉，得到BC3F2世代的玉米种子；
步骤S6中，将BC3F2世代的玉米种子进行播种，利用纯杂合子检测引物对BC3F2世代的玉米植株进行转基因纯杂合基因型检测，对检测出的转基因纯合单株进行自交授粉，获得到稳定性一致的转基因纯合系。
10.如权利要求6所述的一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，其特征在于，所述步骤S1至S6中采用玉米胚挽救技术加快转基因事件的回交转育进程，其步骤为：在玉米授粉后，将未成熟果穗从玉米植株上取下；在实验室超净工作台上将玉米籽粒幼胚剥出，放置培养基上进行暗培养和光培养，然后移栽到穴盘中，对穴盘中的幼苗叶片取样检测，根据检测结果挑选优良单株移栽到大田。
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