CN110541046A

CN110541046A - 一种与玉米籽粒产量及品质相关的分子标记

Info

Publication number: CN110541046A
Application number: CN201910921828.3A
Authority: CN
Inventors: 崔钰; 李永祥; 卢嘉雯; 陈林; 张洁; 李春辉; 王国英; 黎裕; 王天宇
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: CN110541046B

Abstract

本发明公开了一种与玉米籽粒产量及品质相关的分子标记。本发明公开的分子标记(chr3.S_215018483)为玉米基因组中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸，该分子标记为T或C。玉米中，两条染色体的chr3.S_215018483均为T的TT基因型玉米籽粒的粒长和百粒重均低于两条染色体的chr3.S_215018483均为C的CC基因型玉米，TT基因型玉米籽粒的二十酸含量高于CC基因型玉米；TT基因型玉米籽粒的亚油酸含量低于CC基因型玉米。在育种中可以选择CC基因型的玉米作为亲本进行育种，以提高籽粒相关性状—粒长和百粒重以及提高玉米籽粒亚油酸含量。

Description

一种与玉米籽粒产量及品质相关的分子标记

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种与玉米籽粒产量及品质相关的分子标记。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是粮、经、饲兼用的高产粮食作物。玉米生产在保障全球粮食安全方面具有重要作用。随着世界人口的持续增加，人类对粮食的需求将与日俱增。但在当前耕地面积持续减少的形式下，提高单产水平成为解决玉米供需矛盾的根本途径。籽粒是玉米生产过程中的主要收获目标，而不断增加籽粒产量是玉米高产育种的最终目标。籽粒重量的基本的玉米产量三要素之一(粒重、穗粒数、亩穗数)。因此，籽粒大小(如长、宽、重量等)对玉米产量水平的提高至关重要。尽管玉米籽粒大小的遗传结构复杂，受多个基因位点控制，但玉米籽粒大小遗传力高，且存在控制籽粒大小的主效基因。同时，随着社会生产需求的不断变化，籽粒营养品质受到越来越多的重视，而玉米的产量性状和营养品质性状之间存在复杂的关系，在此条件下，挖掘并鉴定出与籽粒大小及营养品质相关的优良等位变异，并且开发相应等位变异的分子标记，对玉米高产优质育种过程中的分子标记辅助具有重要的生产应用价值。

单核甘酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列的多态性。随着基因组重测序技术的发展及其成本的大幅降低，SNP分子标记检测经济高效，成为当前新一代分子标记类型之一，已被应用于玉米遗传图谱的构建、玉米重要农艺性状相关基因的定位和基因组关联分析等方面。

发明内容

本发明的目的是提供一种与玉米籽粒产量及品质相关性状相关的分子标记。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了玉米分子标记或检测所述玉米分子标记的物质在检测或辅助检测玉米产量相关性状或品质相关性状中的应用；

所述玉米分子标记为a1)或a2)：

a1)玉米基因组中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸，所述玉米分子标记为T或C；

a2)含有a1)所述玉米分子标记的DNA片段。

上述应用中，所述检测所述玉米分子标记的物质可为引物对，所述引物对满足：在以玉米基因组为模板利用所述引物对进行PCR扩增时，得到的扩增产物中含有所述玉米分子标记。

所述引物对可为A1，所述A1由名称分别为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述P2为序列表中序列2所示的单链DNA。

所述玉米分子标记可为序列表中序列3或4所示的DNA片段。

所述玉米基因组可为玉米的基因组DNA或转录组。所述转录组可为玉米总RNA或以玉米总RNA反转录得到的cDNA。所述玉米总RNA通过提取玉米整株或其部分组织的RNA得到。所述玉米总RNA具体可通过提取玉米成熟或未成熟籽粒的RNA得到。

上述应用中，所述玉米产量相关性状可为玉米籽粒粒长和/或玉米籽粒粒重，所述品质相关性状可为玉米籽粒亚油酸含量和/或玉米籽粒二十酸含量。

所述粒重可体现在百粒重上。

本发明还提供了检测玉米基因型的方法，所述基因型为TT基因型、CC基因型和TC基因型；所述方法包括：检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸，如所述待测玉米两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测玉米为CC基因型玉米；如所述待测玉米两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测玉米为TT基因型玉米；如所述待测玉米两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测玉米为CT基因型玉米；

g1)对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸为C；

g2)对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸为T。

上述方法中，检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸可采用所述A1进行，所述方法包括L1)和L2)：

L1)以待测玉米基因组为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；

L2)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物序列确定玉米基因型：如所述PCR产物中含有序列4所示的DNA片段、且不含有序列表中序列3所示的DNA片段，所述待测玉米为TT基因型玉米；如所述PCR产物中含有序列3所示的DNA片段、且不含有序列表中序列4所示的DNA片段，所述待测玉米为CC基因型玉米；如所述PCR产物中含有序列3和4所示的DNA片段，所述待测玉米为CT基因型玉米。

利用所述A1进行PCR扩增，所述P1和所述P2在反应体系中的浓度均可为1/3μmol/L。具体可采用如下反应体系(30μL)进行PCR扩增：ddH₂O 11.0μL、所述P1和所述P2(所述P1和所述P2在体系中的浓度均为1/3μmol/L)、2×Rapid Taq Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)15.0μL、基因组DNA(100ng/μL)2.0μL。

利用所述A1进行PCR扩增的退火温度可为59℃。利用所述A1进行PCR扩增可采用如下反应条件：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃1min，35次循环；72℃7min；25℃保存。

上述方法中，检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸还可包括：对待测玉米的基因组进行测序，得到测序数据，将所述测序数据与玉米参考基因组序列进行比对，确定所述待测玉米染色体中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸。

所述玉米参考基因组序列可为玉米B73_RefGen_V3参考基因组序列。

本发明还提供了下述X1)或X2)或X3)或X4)或X5)的方法：

X1)检测玉米产量相关性状的方法，所述玉米产量相关性状为玉米籽粒粒长，所述方法包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，CC基因型玉米籽粒粒长长于或候选长于TT基因型玉米；

X2)检测玉米产量相关性状的方法，所述玉米产量相关性状为玉米籽粒粒重，所述方法包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，CC基因型玉米籽粒粒重高于或候选高于TT基因型玉米；

X3)检测玉米品质相关性状的方法，所述玉米品质相关性状为玉米籽粒亚油酸含量，所属方法包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，CC基因型玉米籽粒亚油酸含量高于或候选高于TT基因型玉米；

X4)测玉米品质相关性状的方法，所述玉米品质相关性状为玉米籽粒二十酸含量，所属方法包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，CC基因型玉米籽粒二十酸含量低于或候选低于TT基因型玉米；

X5)玉米育种方法，包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，选择CC基因型玉米作为亲本进行育种。

X1)、X2)、X3)和X4)中所述待测玉米均不为CT基因型玉米。

本发明还提供了所述玉米分子标记。

本发明还提供了检测所述玉米分子标记的物质，所述物质包括所述A1。

所述物质可仅由所述A1组成。

所述物质可为试剂盒。

实验证明，本发明的玉米分子标记(chr3.S_215018483)与籽粒产量相关性状(粒长和粒重)及品质相关性状(籽粒亚油酸含量和二十酸含量)，玉米中两条染色体的chr3.S_215018483均为T的TT基因型玉米籽粒的粒长和百粒重及亚油酸含量均低于两条染色体的chr3.S_215018483均为C的CC基因型玉米；而玉米中两条染色体的chr3.S_215018483均为T的TT基因型玉米籽粒的二十酸含量高于两条染色体的chr3.S_215018483均为C的CC基因型玉米。在育种中可以选择CC基因型的玉米作为亲本进行育种，以提高籽粒相关性状—粒长和百粒重以及品质相关性状—籽粒亚油酸含量。

附图说明

图1为玉米籽粒产量相关性状关联SNP标记的鉴定。

图2为141份玉米自交系不同基因型间籽粒产量相关性状的比较。

图3为236份玉米自交系不同基因型间籽粒产量相关性状的比较。

图4为236份玉米自交系不同基因型间籽粒品质相关性状的比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

2×Rapid Taq Master Mix：南京诺唯赞生物科技有限公司。

实施例1、chr3.S_215018483是与玉米籽粒产量及品质相关性状相关的SNP

一、与玉米籽粒产量相关性状相关SNP的发现

1.材料

植物材料：141份玉米自交系，见表1。

2.转录组分析样品的准备

在田间种植141份玉米自交系材料，单行小区种植，行长3米，行宽0.6米，每小区种植玉米13株。授粉前将小区内植株进行套袋，以隔绝自然花粉。待小区内80％以上的玉米植株吐出花丝，取粉统一进行自交，并记载每个小区的授粉时间。在每个小区授粉后15天当天，每个小区取3个相对一致的果穗，取每个果穗中部的5粒籽粒，进行混合，作为每个玉米自交系授粉后15天籽粒的样品，用于后续的转录组测序分析。

3.籽粒样品的转录组测序与基因型分析

提取籽粒样品的总RNA，然后利用二代重测序技术进行了全部141份玉米自交系的转录组测序，获得转录组的重测序数据后，以玉米B73_RefGen_V3参考基因组序列为基准(http://www.maizesequence.org)，通过与参考基因组比对，鉴定出与参考基因组不同的SNP位点，以获得全部141份玉米自交系材料的基因型数据，用于后续的分析。

4.玉米籽粒产量相关性状关联标记的鉴定与优良单倍型分析

统计141份玉米自交系成熟后籽粒产量相关性状——籽粒粒长和百粒重，利用获得的基因型数据与籽粒产量相关性状数据，开展141份玉米自交系群体的全基因组关联分析，在第3染色体的Bin3.08遗传区段检测到强烈的关联信号(图1)，在此基础上，获得了1个与玉米籽粒产量相关性状显著关联的SNP分子标记，将其记为chr3.S_215018483(表2)，在玉米中该SNP为C或T。在141份玉米自交系中，有96个自交系两条染色体的该SNP位点均为C，即这些玉米均为CC基因型玉米，有45个自交系两条染色体的该SNP位点均为T，即这些玉米均为TT基因型玉米，表1。CC基因型玉米籽粒粒长(9.46±0.56mm)显著高于TT基因型玉米籽粒粒长(8.83±0.66mm)；CC基因型玉米籽粒百粒重(23.34±3.42g)显著高于TT基因型玉米籽粒百粒重(20.51±2.99g)(图2)。表明，在141份玉米自交系材料中利用该SNP位点可显著区分籽粒粒长和百粒重，可以作为育种实践中的分子标记。

表1、141份玉米自交系的基因型与产量相关性状

表1中，各自交系均来源于国家种质资源库(网址为：http://www.cgris.net)。

表2.鉴定出的玉米籽粒产量相关性状显著关联SNP标记信息

根据chr3.S_215018483上下游序列设计引物对，该引物对由P1和P2组成，P1和P2分别为序列表中序列1和2所示的单链DNA。从表1中的141份玉米自交系中随机选取40份(CC基因型26份(表1中序号为1-26的自交系)，TT基因型14份(表1中序号为97-110的自交系))，以各自的籽粒样品基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，得到PCR产物，对得到的PCR产物进行测序，结果显示，CC基因型玉米得到的PCR产物序列均为序列表中序列3，TT基因型玉米得到的PCR产物序列均为序列表中序列4，chr3.S_215018483为序列3中189位的核苷酸。表明，利用玉米B73_RefGen_V3参考基因组序列获得的玉米基因型是准确的。

其中，PCR扩增的反应体系(30μL)为：ddH₂O 11.0μL、P1(浓度为10μmol/L)和P2(浓度为10μmol/L)各1.0μL、2×Rapid Taq Master Mix 15.0μL、基因组DNA(100ng/μL)2.0μL。

PCR扩增的反应条件为：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃1min，35次循环；72℃7min；25℃保存。

二、与玉米籽粒产量及品质相关性状相关SNP的验证

Junjie Fu等于2013年在Nature Communications的4:2832上发表了“RNAsequencing reveals the complex regulatorynetwork in the maize kernel”，在该研究中，研究者公布了368个玉米自交系授粉后15天籽粒的转录组测序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP026161)。发明人随机选取了其中的236份玉米自交系(表3)开展了玉米籽粒产量相关性状关联SNP标记chr3.S_215018483的应用价值评估相关工作。首先，利用公布的236份玉米自交系转录组重测序数据，按照141份玉米自交系基因型分析的相同方法，获得了236份玉米自交系的基因型数据，结果显示，这236份玉米自交系中，有97个自交系两条染色体的该SNP位点均为C，即这些玉米均为CC基因型玉米，有139个自交系两条染色体的该SNP位点均为T，即这些玉米均为TT基因型玉米，表3。

从236份玉米自交系随机选取40份(CC基因型25份(表3中序号为1-25的自交系)，TT基因型15份(表3中序号为98-112的自交系))，以各自的籽粒样品基因组DNA为模板，利用步骤一中的引物对按照步骤一的反应体系和反应条件进行PCR扩增，得到PCR产物，对得到的PCR产物进行测序，结果显示，CC基因型玉米得到的PCR产物序列均为序列表中序列3，TT基因型玉米得到的PCR产物序列均为序列表中序列4。

然后统计了这236份玉米自交系成熟期籽粒粒长和百粒重(表3)，结果显示，在这236份玉米自交系中，CC基因型玉米籽粒粒长(9.34±0.52mm)显著高于TT基因型玉米籽粒粒长(8.86±0.53mm)；CC基因型玉米籽粒百粒重(22.63±2.17g)显著高于TT基因型玉米籽粒百粒重(21.59±2.06g)(图3)。以上结果，表明分子标记chr3.S_215018483是与籽粒粒长和百粒重有关的分子标记，可用于检测不同籽粒粒长和百粒重的玉米。

另外，发明人统计了236份玉米自交系成熟期籽粒的脂肪酸含量，包括亚油酸和二十酸(表3)。脂肪酸含量数据来自Hui Li等于2013年在Natue Genetics的45:43上发表的文献“Genome-wide association study dissects the genetic architecture of oilbiosynthesis in maize kernels”。在该研究中，研究者公布了368个玉米自交系授粉后15天籽粒的包含脂肪酸组分的表型数据。统计结果显示，在236份玉米自交系中，长籽粒和高百粒重基因型CC材料的玉米籽粒亚油酸含量(53.26±5.23mg/g)显著高于TT基因型玉米籽粒亚油酸含量(49.95±5.56mg/g)；短籽粒和低百粒重基因型TT玉米籽粒二十酸含量(0.56±0.10mg/g)显著高于CC基因型玉米籽粒二十酸含量(0.50±0.08mg/g)(图4)。以上结果表明分子标记chr3.S_215018483可应用于籽粒品质性状的区分，可同时应用于高产和高营养品质育种的分子标记辅助选择。

表3、236份玉米自交系的基因型与产量及品质相关性状

表3中各自交系均记载在文献“Fu et al.RNA sequencing reveals the complexregulatorynetwork in the maize kernel.Nature Communications,2013,4:2832.”中。

结果表明该SNP标记可同样在独立的236份玉米自交系中显著地区分籽粒粒长和百粒重以及籽粒品质相关性状—亚油酸含量和二十酸含量。因此，利用本发明的SNP可以检测玉米育种过程中材料的籽粒产量相关性状—粒长和百粒重，以及籽粒品质相关性状—亚油酸含量和二十酸含量：玉米中两条染色体的chr3.S_215018483均为T的TT基因型玉米籽粒的粒长和百粒重均低于两条染色体的chr3.S_215018483均为C的CC基因型玉米；玉米中两条染色体的chr3.S_215018483均为T的TT基因型玉米籽粒的二十酸含量高于两条染色体的chr3.S_215018483均为C的CC基因型玉米；玉米中两条染色体的chr3.S_215018483均为T的TT基因型玉米籽粒的亚油酸含量低于两条染色体的chr3.S_215018483均为C的CC基因型玉米。在育种中可以选择CC基因型的玉米作为亲本进行育种，以提高籽粒相关性状—粒长和百粒重，以及获得高亚油酸含量的亲本。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种与玉米籽粒产量及品质相关的分子标记

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<400> 1

ctcggctccc tctctacca 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<400> 2

cgaccttccc caccagtatc 20

<210> 3

<211> 340

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<400> 3

ctcggctccc tctctaccac aaccgcgacg cgcagtttct cgatctcttc tcccgggttt 60

aaaagcttcg ttgtggagtc cgaccttgag aacgagcacg accagccccc cgcggaccag 120

aaccgccagc agacgtcgaa cagcccgcgc ccgcccgaca ccacccgccc tctcgagaac 180

ggcctcgacc ccggcatcta caaggttgga ttagacctct tgatcctcct ctcccatttc 240

gggtttagtt attttgctgc cagctgatct gagctcgcat ggtgctttcc ggcttttggc 300

ggggctgtga ctgtgaaggc gatactggtg gggaaggtcg 340

<210> 4

<211> 340

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<400> 4

ctcggctccc tctctaccac aaccgcgacg cgcagtttct cgatctcttc tcccgggttt 60

aaaagcttcg ttgtggagtc cgaccttgag aacgagcacg accagccccc cgcggaccag 120

aaccgccagc agacgtcgaa cagcccgcgc ccgcccgaca ccacccgccc tctcgagaac 180

ggcctcgatc ccggcatcta caaggttgga ttagacctct tgatcctcct ctcccatttc 240

gggtttagtt attttgctgc cagctgatct gagctcgcat ggtgctttcc ggcttttggc 300

ggggctgtga ctgtgaaggc gatactggtg gggaaggtcg 340

Claims

1.玉米分子标记或检测所述玉米分子标记的物质在检测或辅助检测玉米产量相关性状或品质相关性状中的应用；

所述玉米分子标记为a1)或a2)：

a2)含有a1)所述玉米分子标记的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测所述玉米分子标记的物质为引物对，所述引物对满足：在以玉米基因组为模板利用所述引物对进行PCR扩增时，得到的扩增产物中含有所述玉米分子标记。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述引物对为A1，所述A1由名称分别为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述P2为序列表中序列2所示的单链DNA；

和/或，所述玉米分子标记为序列表中序列3或4所示的DNA片段。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述玉米产量相关性状为玉米籽粒粒长和/或玉米籽粒粒重，所述品质相关性状为玉米籽粒亚油酸含量和/或玉米籽粒二十酸含量。

5.检测玉米基因型的方法，其特征在于：所述基因型为TT基因型、CC基因型和TC基因型；所述方法包括：检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸，如所述待测玉米两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测玉米为CC基因型玉米；如所述待测玉米两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测玉米为TT基因型玉米；如所述待测玉米两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测玉米为CT基因型玉米；

g1)对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸为C；

g2)对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸为T。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸采用权利要求3中所述A1进行，所述方法包括L1)和L2)：

L1)以待测玉米基因组为模板，采用权利要求3中所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；

L2)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物序列确定玉米基因型：如所述PCR产物中含有序列4所示的DNA片段、且不含有序列表中序列3所示的DNA片段，所述待测玉米为TT基因型玉米；如所述PCR产物中含有序列3所示的DNA片段、且不含有序列表中序列4所示的DNA片段，所述待测玉米为CC基因型玉米；如所述PCR产物中含有序列3和4所示的DNA片段，所述待测玉米为TC基因型玉米。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸包括：对待测玉米的基因组进行测序，得到测序数据，将所述测序数据与玉米参考基因组序列进行比对，确定所述待测玉米染色体中对应于序列表中序列3的第189位的核苷酸。

8.下述X1)或X2)或X3)或X4)或X5)的方法：

X1)检测玉米产量相关性状的方法，所述玉米产量相关性状为玉米籽粒粒长，所述方法包括：按照权利要求5-7中任一所述的方法检测待测玉米的基因型，CC基因型玉米籽粒粒长长于或候选长于TT基因型玉米；

X2)检测玉米产量相关性状的方法，所述玉米产量相关性状为玉米籽粒粒重，所述方法包括：按照权利要求5-7中任一所述的方法检测待测玉米的基因型，CC基因型玉米籽粒粒重高于或候选高于TT基因型玉米；

X5)玉米育种方法，包括：按照权利要求5-7中任一所述的方法检测待测玉米的基因型，选择CC基因型玉米作为亲本进行育种。

9.权利要求1-3任一中所述玉米分子标记。

10.检测权利要求1-3任一中所述玉米分子标记的物质，包括权利要求3中所述A1。