CN118308524A - 一种与小麦每穗小穗数相关的snp位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与小麦每穗小穗数相关的SNP位点及其应用，所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第723位碱基，该位点为T/T纯合时，相对应的基因型是甲；该位点为C/C纯合时，相对应的基因型是乙；对于小麦每穗小穗数表型而言，基因型甲纯合的小麦＜基因型乙纯合的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种的理论和实际应用层面均具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术相关领域，尤其是一种与小麦每穗小穗数相关的SNP位点及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L)是我国重要的粮食作物之一，随着人口的增长，生物和非生物灾害的频发等都威胁着小麦的产量，因此提高小麦的高产稳产水平显得尤为重要。作物产量的三要素中，每穗粒数是决定作物单产的重要性状。增加每穗小穗数能够增加每穗粒数并最终增加产量。
近年来，与小穗数相关基因陆续被克隆，利用提高小穗数育种方面也取得了一定的进展。Muqaddasi、Kuzay和Voss-Fels等通过不同方法鉴定到7AL染色体上WAPO1/TaAPO-A1正向调控小麦每穗小穗数。Li等鉴定了上百个种植于中国北方的小麦品种的穗部结构，发现了一个多小穗地方品种YM44，并克隆到WFZP。对该基因进行单倍型分析显示，小麦的自然群体中WFZP-A的单SNP差异导致其表达量不同进而影响了每穗小穗数和千粒重，该单倍型在育种进程中得到了选择。Zhang等通过对水稻与拟南芥的MOC1进行比较认为TaMOC1可能与小麦小穗发育有关。进一步研究表明TaMOC1在长2、3、6cm的穗部高表达。TaMOC1-7A单倍型与每穗小穗数之间存在显著相关，聚合有利等位基因TaMOC1-7A和TaSnRK2.10能同时提高每穗小穗数和千粒重。
在产量构成三要素中，在单株或群体穗数不变的情况下，增加有效小穗数更有利于提高单穗粒重，进而实现产量的增长。
因此，在现有技术的基础上，开发设计一种用于鉴定小麦每穗小穗数的引物及相关分子标记，在理论和实际应用层面均具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与小麦每穗小穗数相关的SNP位点及其应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
本发明包括一种与小麦每穗小穗数相关的SNP位点，对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第723位碱基，该位点为T/T纯合时，相对应的基因型是甲；该位点为C/C纯合时，相对应的基因型是乙；对于小麦每穗小穗数表型而言，基因型甲纯合的小麦＜基因型乙纯合的小麦。
本发明还创制了一种分子标记，对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第568-742bp；通过对此分子标记进行PCR扩增产及酶切鉴定以区分权利要求1所述SNP位点的基因型。
本发明还创制了一种引物组合，包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，以及SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R；此引物组合作为权利要求2所述PCR扩增的特异性引物。
本发明还创制了一种用于检测权利要求1所述SNP位点基因型的试剂盒，至少包括权利要求3所述的引物组合。
作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒还包括必要的限制性内切酶组件。
作为本发明的一种优选技术方案，所述限制性内切酶为TaqI酶。
作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒还包括PCR扩增所需的缓冲液、dNTPs和/或其他必要组件。
本发明还创制了所述的SNP位点，或所述的分子标记，或所述的引物组合，或所述的试剂盒的用途，用于鉴定或辅助鉴定小麦的每穗小穗数性性状。
作为本发明的一种优选技术方案，在分子标记辅助选择育种MAS早期，通过对所述SNP位点的基因型进行鉴定，定向获取具有更高或更低每穗小穗数的小麦品种，由此进行小麦的定向育种或辅助定向育种。
本发明还创制了一种鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法，对待测小麦基因组DNA中任意一段包含权利要求1所述SNP位点在内的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定；所述PCR扩增的DNA片段为SEQ ID NO.1中5’末端568-742bp；所述PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，以及SEQ ID NO.4和SEQID NO.5组成的引物对2F和2R；所述酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到PCR产物；将此PCR产物稀释10倍，以其作为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到PCR产物；用限制性内切酶TaqI酶切PCR产物；若PCR产物可以被切开，则该核苷酸多态性位点为T/T，基因型为甲；若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为C/C，基因型为乙；对于小麦每穗小穗数表型而言，基因型甲纯合的小麦＜基因型乙纯合的小麦。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明课题组基于对小麦自然变异群体基因的遗传变异分析发现有1个主效SNP，对应于序列表1自5’端第723位。通过对该SNP位点设计dCAPS标记，发现该SNP存在两种基因型：基因型甲(T)、基因型乙(C)。通过关联分析证明，这两种基因型的纯合类型中，每穗小穗数大小为：基因型甲纯合的小麦＜基因型乙纯合的小麦。本发明还提供了检测所述SNP的dCAPS标记。实验证明，通过检测所述该SNP，即可找到每穗小穗数较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种的理论和实际应用层面均具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的SNP开发dCAPS标记酶切产物电泳检测结果；其中，用到M为分子量标准；泳道T为不能被TaqI切开的条带，泳道C为被TaqI切开的条带。
图2为自然群体中基因多态性位点的情况与每穗小穗数的关联分析结果示意图。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。
另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库(http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网，网址：http://icgr.caas.net.cn。
实施例1、扩增含小麦该SNP的基因组片段的特异引物及序列分析
在小麦基因组上发现了1个SNP，分别对应于序列表1自5’端第723位。基于该科学发现创制了本发明。
具体的，通过对该SNP位点设计dCAPS标记，发现该位点在小麦自然变异群体中存在两种基因型：
基因型甲：T
基因型乙：C
根据小麦不同基因组的序列差异，设计特异性引物PCR扩增分别包含该SNP位点在内的DNA片段：
F1：CTCGAAGGATTTCTCTCTCATAGTCG(SEQ ID NO.2)；
R1：TACAGGTTCTGTGGCAGATAGCCTGTGG(SEQ ID NO.3)；
F2：TGACGACTGAGCCTGTTCC(SEQ ID NO.4)；
R2:CAACCGCATACCAATTATC(SEQ ID NO.5)。
以F1和R1为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列序列1所示的100-1710位序列；以F2和R2为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列序列1所示的568-742位序列。酶切分析显示，该多态性可分别被TaqI识别。
实施例2、PCR-酶切多态性检测及基因分型方法的建立
1)提取待测小麦的基因组DNA；
2)以步骤1)的基因组DNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR扩增的体系(20μL)为：ddH2O 7μL、2×TaqMix 10μL、引物F1(10μmol/L)和引物R1(10μmol/L)各1μL、模板(50ng/μL)1μL。
PCR扩增条件为95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min，16℃保存。
3)将步骤2)的PCR产物稀释10倍，以其为模板，用引物F2和R2进行PCR扩增，PCR扩增的体系(20μL)为：ddH2O 7μL、2×TaqMix 10μL、引物F1(10μmol/L)和引物R1(10μmol/L)各1μL、模板(50ng/μL)1μL。
PCR扩增条件为95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，32次循环；72℃10min，16℃保存。
4)将步骤3)得到的PCR产物用TaqI酶切，获得酶切产物，进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，记录PCR产物是否被切为两个片段，并根据如下方法判断并记录待测小麦在所述位点的情况：
若所述酶切产物为一个较大片段:175bp，则待测小麦在所述位点为T纯合(表示为T/T)的小麦(图1中的泳道T)；
若所述酶切产物为一个较小片段:156bp，则待测小麦在所述位点为C纯合(表示为C/C)的小麦(图1中的泳道C)。
5)根据步骤4)的结果，将小麦分为在所述位点的情况为如下I、II两种类型：
I：T/T(即基因型甲纯合)；
II：C/C(即基因型乙纯合)；
所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。
实施例3、利用dCAPS标记对自然群体进行分型并与每穗小穗数性状进行关联分析
以323份六倍体小麦组成的自然群体中各小麦分别作为待测小麦，按照步骤2的方法进行分型，随机对部分小麦的扩增产物进行测序验证，结果如表1所示。
表1.小麦自然群体中所述多态性位点的情况
实施例4、自然群体中基因多态性位点的情况与每穗小穗数的关联分析
在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(北京顺义)的水热地和水地，翌年在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(北京顺义和昌平)的水热地和水地种植上述自然群体小麦，调查各小麦品种的每穗小穗数，用Tassel2.1软件对每穗小穗数和所述多态性位点的情况进行关联分析，选择混合线性模型+群体结构(MLM+(Q+K))方法进行分析，以P<0.05为显著性水平，结果如表2及附图2所示。
表2自然群体中基因多态性位点的情况与每穗小穗数的关联分析结果
表2的关联分析结果表明，表1所示的323份六倍体小麦组成的自然群体形成的两种类型的每穗小穗数差异均达到显著水平(P<0.05或P<0.01)。其中，类型II的小麦每穗小穗数低于类型II的小麦每穗小穗数。几个环境中，类型I的小麦材料的每穗小穗数分别较II的小麦少0.26、0.22、0.57、0.35、0.25、0.38和0.26个小穗。对自然群体的研究表明，类型II是提高小麦每穗小穗数的优异基因型。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.与小麦每穗小穗数相关的SNP位点，对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第723位碱基，该位点为T/T纯合时，相对应的基因型是甲；该位点为C/C纯合时，相对应的基因型是乙；对于小麦每穗小穗数表型而言，基因型甲纯合的小麦＜基因型乙纯合的小麦。
2.分子标记，对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第568-742bp；通过对此分子标记进行PCR扩增产及酶切鉴定以区分权利要求1所述SNP位点的基因型。
3.引物组合，包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，以及SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R；此引物组合作为权利要求2所述PCR扩增的特异性引物。
4.用于检测权利要求1所述SNP位点基因型的试剂盒，至少包括权利要求3所述的引物组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括必要的限制性内切酶组件。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述限制性内切酶为TaqI酶。
7.根据权利要求4或5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR扩增所需的缓冲液、dNTPs和/或其他必要组件。
8.权利要求1所述的SNP位点，或权利要求2所述的分子标记，或权利要求3所述的引物组合，或权利要求4所述的试剂盒的用途，用于鉴定或辅助鉴定小麦的每穗小穗数性性状。
9.根据权利要求8的应用，其特征在于：在分子标记辅助选择育种MAS早期，通过对所述SNP位点的基因型进行鉴定，定向获取具有更高或更低每穗小穗数的小麦品种，由此进行小麦的定向育种或辅助定向育种。
10.一种鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法，其特征在于：对待测小麦基因组DNA中任意一段包含权利要求1所述SNP位点在内的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定；所述PCR扩增的DNA片段为SEQ ID NO.1中5’末端568-742bp；所述PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，以及SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5组成的引物对2F和2R；所述酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到PCR产物；将此PCR产物稀释10倍，以其作为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到PCR产物；用限制性内切酶TaqI酶切PCR产物；若PCR产物可以被切开，则该核苷酸多态性位点为T/T，基因型为甲；若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为C/C，基因型为乙；对于小麦每穗小穗数表型而言，基因型甲纯合的小麦＜基因型乙纯合的小麦。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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