CN114480717A - 玉米籽粒颜色相关的InDel标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了玉米籽粒颜色相关的InDel标记及其应用。本发明人发现在玉米5号染色体193500159bp位置的基因型，其与玉米品种籽粒颜色显著关联，其中InDel基因型为A型CTACCGG时籽粒颜色为黄色，InDel基因型为H型CTACCGG/C时籽粒颜色为白色，该位置的基因型可以作为检测玉米籽粒颜色的InDel标记。利用该InDel标记可用于培育高微量元素的玉米自交系。

Description

玉米籽粒颜色相关的InDel标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米籽粒颜色相关的InDel标记及其应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是世界三大主粮之一，是重要的饲用和工业作物。玉米籽粒颜色是评价其品质和商品价值的一个重要指标。玉米籽粒中的色素具有较大的营养价值和保健功能，是健康的天然食用色素。随着对人工合成色素危害的深入认识，人们更加青睐于天然色素的开发与应用。玉米籽粒色素主要包括类胡萝卜素和花色苷两种天然色素。其中，类胡萝卜素具有抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老的功能，是天然的抗氧化剂、着色剂，也是人体内维生素A的主要来源；花色苷属于黄酮类色素，也具有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗衰老和护肤养颜的良好功效，具有很高的医疗应用价值。因此，解析玉米籽粒颜色性状的遗传机制，对玉米营养品质和商品质量的提高都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种与玉米籽粒颜色相关的InDel标记，其可用于玉米籽粒颜色检测。
一种与玉米籽粒颜色相关的InDel标记位于玉米5号染色体193500159bp的位置。
在其中一些实施例中，玉米5号染色体193500159bp的位置基因型为A型CTACCGG。
在其中一些实施例中，玉米5号染色体193500159bp的位置基因型为H型CTACCGG/C。
本发明的另一目的是提供一种玉米籽粒颜色的检测方法。
一种玉米籽粒颜色的检测方法，通过对玉米5号染色体193500159bp位置的基因型进行检测来判断玉米籽粒颜色。
在其中一些实施例中，玉米5号染色体193500159bp的位置基因型为A型时，玉米籽粒颜色为黄色。
在其中一些实施例中，玉米5号染色体193500159bp的位置基因型为H型时，玉米籽粒颜色为白色。
在其中一些实施例中，所述检测方法是直接测序、特异性探针杂交法、特异性引物延伸法或PCR法等方法中任一种。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测上述InDel标记的引物，所述引物为F：5'-CGAGGTGACCGACAGACAC-3'，R：5'-ACTCACCCAATCTCACTCAATCT-3'。
本发明的另一个目的是提供一种检测玉米籽粒颜色的试剂盒。
一种检测玉米籽粒颜色的试剂盒，包括检测玉米5号染色体193500159bp位置的基因型的试剂。
优选的，所述的试剂盒应用于直接测序、特异性探针杂交、特异性引物延伸或PCR检测。
本发明的另一个目的是提供上述的InDel标记、上述的引物和上述的试剂盒在检测玉米籽粒颜色中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述的InDel标记在培育高微量元素的玉米自交系中的应用。
本发明人发现，在玉米5号染色体193500159bp位置的基因型，其与玉米品种籽粒颜色高度相关，其中InDel基因型为A型CTACCGG时籽粒颜色为黄色，InDel基因型为H型CTACCGG/C时籽粒颜色为白色，该位置的基因型可以作为检测玉米籽粒颜色的InDel标记。利用该InDel标记，可用于培育高微量元素的玉米自交系。
附图说明
图1为玉米籽粒颜色分级。
图2为GWAS分析结果曼哈顿图。箭头所指为5号染色体193472410bp位置的SNP。
图3为引物Chr5RG1在自然群体样本中的扩增结果。W、Y分别代表前期已验证白色和黄色样本，泳道1～14是白色籽粒的不同样本，泳道15～67是黄色籽粒的不同样本。
具体实施方式
下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1
1、研究方法
(1)表型测定
本研究使用244份自交系组成的自然群体，于2020年下半年种植于广东省韶关市翁源县。种植材料自交授粉，成熟后选取自然群体中自交系外观一致的、典型的种子30粒，整齐排列后使用EPSON EU-88扫描设备和EPSON Scan软件进行图像采集，获得原始图片。然后基于图像在RGB颜色系统对籽粒花柱遗迹附近位置的颜色值进行提取和计算获得244份材料籽粒颜色相关指标的R值、G值、B值、RGB值和Gray数据，每份材料取30个重复的平均数为自交系的籽粒颜色表型值(表1)。此外，依据观察对所有自交系依据籽粒颜色进行等级划分，共分为A至G 7个等级(图1)；以此作为籽粒颜色的视觉分级表型数据。
(2)全基因组关联分析(GWAS)
使用测定的玉米籽粒颜色相关表型数据，结合覆盖玉米全基因组的12284796个SNPs，使用混合线性模型(MLM)进行全基因组关联分析。选择关联分析显著性p-value≤1/198910，即P≤1×10-6，该值作为GWAS结果的显著性相关阈值。
(3)基因型鉴定
以一个籽粒颜色为白色的骨干玉米自交系YK6为轮回亲本，以黄色籽粒背景的材料为供体亲本，经过2代回交选育，获得了BC2黄白籽粒颜色分离的种质资源库。把上述的籽粒颜色分离群体材料作为开发玉米黄白籽粒颜色分子标记的供试群体，同时将前期GWAS定位实验使用的自然群体中颜色性状差异明显的极端材料作为反向验证分子标记有效性的实验材料。根据前阶段的GWAS定位实验结果，选择显著性较强的SNP位点以及显著性位点较集中的SNP区域，同时根据Mo17在B73v4参考基因组上报告的InDel位置，设计InDel分子标记在BC2颜色分离群体中进行筛选验证。
2、研究结果
(1)玉米关联群体籽粒颜色表型分布
本发明的研究共测定244份玉米自交系籽粒颜色，获得籽粒颜色level、R、G、B、Gray和RGB值6个相关性状指标，对测定的籽粒颜色数据进行描述性统计分析显示见表1。
表1玉米群体籽粒颜色性状描述统计
Figure BDA0003533108410000041
Figure BDA0003533108410000051
(2)全基因组关联分析
结合已得到的上千万个SNP标记以及籽粒颜色表型数据，采用全基因组关联分析方法，本发明人鉴定到位于玉米5号染色体193472410bp位置的SNP标记与玉米自交系籽粒颜色显著关联(图2)。选择与该位点连锁的多态性位点chr5:193500159bp，设计引物Chr5RG1 F：5'-CGAGGTGACCGACAGACAC-3'，R：5'-ACTCACCCAATCTCACTCAATCT-3'扩增该位点，检测此多态性位点与籽粒颜色的相关性。从自然群体中挑选出的黄白颜色性状的籽粒，其中包含白色和黄色的颜色表型分别14个和53个，以这些样本的基因组DNA为模板进行PCR扩增，验证该标记在自然群体中的扩增产物是否具有多态性。PCR扩增条件：PCR反应条件参数设置为98℃预变性5min，98℃变性10s，退火温度为58℃、时间为30s，72℃延伸30s，共35个循环次数，72℃最终延伸5min。PCR反应体系为2×Pro Taq Mix 5μL，引物-F(10μM)1μL，引物-R(10μM)1μL，DNA模板(50ng/μL)1μL，ddH2O 2μL，总体系10μL。
扩增产物的电泳结果显示在14份白色籽粒材料的扩增结果中，基因带型为H型CTACCGG/C；在53份黄色籽粒材料的扩增结果中49个的带型为A型CTACCGG(图3)。在置信水平为0.01情况下，对电泳结果数据统计并进行方差分析(表2)，结果显示2组数据存在极显著差异。因此，认为该引物基于玉米自然群体来鉴别黄白籽粒颜色表型仍然具有有效性，能够为指导籽粒颜色选择育种提供部分理论支持。
表2自然群体2组数据方差分析
Figure BDA0003533108410000061
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种与玉米籽粒颜色相关的InDel标记，其特征在于，所述的InDel标记位于玉米5号染色体193500159bp的位置。
2.根据权利要求1所述的与玉米籽粒颜色相关的InDel标记，其特征在于，所述的玉米5号染色体193500159bp的位置的基因型为单一带型A型CTACCGG。
3.根据权利要求1所述的与玉米籽粒颜色相关的InDel标记，其特征在于，所述的玉米5号染色体193500159bp的位置的基因型为杂合带型H型CTACCGG/C。
4.一种玉米籽粒颜色的检测方法，其特征在于，通过对玉米5号染色体193500159bp位置的基因型进行检测来判断玉米籽粒颜色为黄色或白色。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的玉米5号染色体193500159bp的位置的基因型为A型时，玉米籽粒颜色为黄色；所述的玉米5号染色体193500159bp的位置的基因型为H型时，玉米籽粒颜色为白色。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括直接测序、特异性探针杂交法、特异性引物延伸法或PCR法。
7.一种用于检测权利要求1所述InDel标记的引物，其特征在于，所述引物为F：5'-CGAGGTGACCGACAGACAC-3'，R：5'-ACTCACCCAATCTCACTCAATCT-3'。
8.一种检测玉米籽粒颜色的试剂盒，其特征在于，包括检测玉米5号染色体193500159bp位置的基因型的试剂。
9.权利要求1所述的InDel标记、权利要求7所述的引物和权利要求8所述的试剂盒在检测玉米籽粒颜色中的应用。
10.权利要求1所述的InDel标记在培育高微量元素的玉米自交系中的应用。
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