CN115947810B - 转录因子hy5在提升石斛品质中的应用和提升石斛品质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了转录因子HY5在提升石斛品质中的应用和提升石斛品质的方法，属于分子生物学技术领域。本发明实验证明高光照射石斛有利于增加茎中花青素含量同时促进多糖积累，为提升石斛品质提供了一种简便可行的方法。同时本发明还提供了HY5在提升石斛品质中的应用，HY5通过结合花青素生物合成基因F3H1和多糖生物合成基因GMPP2、PMT28的启动子，激活相应基因的转录，从而促进铁皮石斛花青素和多糖生物合成。可见本发明提供的方法和应用对揭示HY5在高光胁迫下介导花青素及多糖生物合成途径调控铁皮石斛花青素及多糖的积累有重要的意义。

Description

转录因子HY5在提升石斛品质中的应用和提升石斛品质的 方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及转录因子HY5在提升石斛品质中的应用和提升石斛品质的方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科多年生附生草本植物，具有较高的观赏和药用价值。根据茎的着色情况分为：青杆铁皮石斛和红杆铁皮石斛。铁皮石斛是我国著名的名贵中药之一，味甘，性微寒，具有生津养胃；滋阴清热；润肺益肾；明目强腰。同时铁皮石斛也是一种开发成熟的保健食品，常被广泛用作膳食补充剂、营养饮料和食品。现代药理研究表明，铁皮石斛具有多种生物学功能，如：具有免疫调节、抗肿瘤、胃肠保护、抗糖尿病、抗炎、保肝、抗衰老、抗骨质疏松等多种生物学作用。目前，已有大量研究报道铁皮石斛含有多种生物活性成分，如多糖、黄酮类、生物碱、酚类、菲和双苄基化合物。其中，多糖是铁皮石斛的主要生物活性成分之一，主要由葡萄糖和甘露糖组成，并以不同摩尔比和不同类型的糖苷键与半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖聚合形成不同类型的多糖。多糖含量的高低是目前判断铁皮石斛品质优劣的主要依据。

铁皮石斛主要生长在热带和亚热带地区，野生资源的铁皮石斛己经濒临灭绝。目前市场上销售的铁皮石斛以仿野生种植模式为主，主要分布在云南、浙江、广东、广西、安徽及福建等地区。同一品种铁皮石斛在不同地区种植受纬度、温度、湿度、光照等生态因子影响，其多糖、生物碱、黄酮、醇溶性浸出物、叶绿素、微量元素的含量差异显著。在人工种植过程中常会因为种植产地、品种、气候等因素的不同，出现多种表型性状差异的栽培类型，影响了铁皮石斛的药效、口感、外观性状等，从而引起铁皮石斛药材在质量上参差不齐。因此，了解环境因素对铁皮石斛生长发育、药效成分积累的影响，对于提高铁皮石斛的品质至关重要。

光照是植物光合作用的能量来源，是植物生长发育过程中最重要的环境因素之一。植物在植物生长发育的过程中，为适应光环境的变化进化出了一组复杂的光感测途径以响应光环境的变化。这些光感测途径能够响应光强、光质、光照方向和日长等。其中植物主要靠不同光受体感知不同波长的光并传递光信号。光受体对光信号的感应可以激活光受体下游不同家族的转录因子以传递光信号。目前已报道，在光受体下游起作用的转录因子家族有bZIP、bHLH、MYB、Zinc-finger、GATA和GT1，这些转录因子传递光信号主要是通过结合下游基因启动子上的光响应元件如：G-box、GATA、MYB等，从而启动下游基因的转录。HY5属于bZIP转录因子家族，HY5编码的蛋白是光受体下游光信号传导途径上的核心光信号调节因子，在光信号传导过程中具有十分重要的作用，可直接调控或通过与其他转录因子互作启动调控下游基因的表达。HY5可以直接结合基因的启动子上“含ACGT元件”的结合位点，例如G-box(CACGTG)、A-box(TACGTA)、Z-box(ATACGGT)和C-box(GACGTC)。G-box广泛存在于光控基因及一些关键代谢途径酶基因的启动子中，具有高度保守的核心基序CACGTG，是植物响应外界环境胁迫的通用调控元件，同时也是目前在植物领域中研究得最清楚的植物调控元件。HY5作为一种转录因子，其发挥转录调控的方式是先与“含ACGT元件”的顺式元件结合，进而控制众多靶基因的表达，以响应光信号，最终达到调节植物的生理和生物学过程。HY5可调控植物生长发育过程中的细胞伸长、细胞增殖、叶绿体发育、色素积累和营养同化等许多重要环节。近年来，有研究也报道了HY5在其他方面的作用，如激素信号转导、次级代谢产物合成、植物防御和外界环境响应等。然而，铁皮石斛中HY5转录因子在光诱导下的代谢调控并不明确。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种转录因子HY5在提升石斛品质中的应用，高光诱导转录因子HY5表达，提高绿茎石斛中花青素的含量和多糖积累。

本发明还提供了一种提高石斛品质的方法，能够简便快速提高石斛的多糖含量和花青素含量。

本发明提供了转录因子HY5在提高石斛品质中的应用。

优选的，所述转录因子HY5的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述石斛品质包括石斛中花青素和/或多糖的含量。

优选的，所述转录因子HY5激活花青素和/或多糖生物合成途径关键酶基因使石斛茎颜色由绿向红转变和/或多糖含量的积累。

优选的，所述石斛包括铁皮石斛。

优选的，所述花青素生物合成途径关键酶基因包括F3H1；

所述多糖生物合成途径关键酶基因包括GMPP2、PMT28。

优选的，所述转录因子HY5激活花青素和/或多糖生物合成途径关键酶基因的方法为所述转录因子HY5结合到所述花青素和/或多糖生物合成途径关键酶基因的启动子区，提高相应基因的表达量。

本发明提供了一种促进转录因子HY5表达的方法在提高石斛品质中应用；所述促进转录因子HY5表达的方法包括高光照射；

所述高光照射中高光的光强为800～1200μmol·m^-2·s^-1。

本发明提供了一种提高石斛品质的方法，包括以下步骤：

将石斛植株置于高光下照射；所述高光的光强为800～1200μmol·m^-2·s^-1；所述高光照射的光照周期为12h/12h；所述高光照射的时间为15～30d。

优选的，所述石斛植株为石斛组培苗；

所述石斛组培苗预先培养45～90d后再进行高光照射；

所述石斛的培养温度为22～25℃。

本发明提供了转录因子HY5在提高石斛品质中应用。石斛含有许多活性成分，包括类黄酮、花青素和多糖。黄酮和多糖的含量和组成是判断黄酮质量的主要标准。本发明实验证明转录因子HY5的表达能够促进石斛中花青素及多糖代谢途径中关键基因的表达，提高石斛在茎着色及多糖积累，为铁皮石斛色泽品质的改良与调控提供了新的理论和技术依据，同时为阐明铁皮石斛药材品质的形成机制奠定基础。

附图说明

图1为正常光、高光处理后铁皮石斛植株表型及花青素、多糖含量测定结果，其他图1A为铁皮石斛正常光、高光处理后的表型形态，图1B为正常光、高光处理后铁皮石斛茎表皮色素的分布，图1C为铁皮石斛正常光、高光处理后的花青素提取液，图1D为正常光、高光处理后铁皮石斛的花青素检测结果，图1E为正常光、高光处理后铁皮石斛的多糖检测结果；

图2为正常光、高光处理组铁皮石斛各单糖组成的组成情况；图2A为单糖混合标准品色谱图，图2B为正常光、高光处理组单糖含量测定的色谱图，图2C为正常光、高光处理组甘露糖含量测定结果，图2D为正常光、高光处理组葡萄糖含量测定结果，图2E为正常光、高光处理组半乳糖含量测定结果，图2F为正常光、高光处理组阿拉伯糖含量测定结果；

图3为铁皮石斛多糖、花青素生物合成关键酶基因启动子元件分布及高光下转录因子的表达水平结果，图3A为多糖、花青素生物合成关键酶基因启动子元件分布图，图3B为多糖、花青素生物合成关键酶基因启动子序列中光响应相关元件分布图，图3C为DoHY5在正常光、高光处理组的表达水平，图3D为DoMYB17在正常光、高光处理组的表达水平，图3E为DoMYB27在正常光、高光处理组的表达水平；

图4为DoHY5与多糖、花青素生物合成关键酶基因启动子的结合情况图，图4A为正常光、高光处理后DoHY5 Chip-qPCR检测结果，图4B为DoF3H1、DoGMPP2和DoPMT28启动子元件分布的结构示意图；

图5为DoHY5对多糖、花青素生物合成关键基因启动子的激活活性情况图，图5A为双荧光素酶报告检测实验的载体构建示意图，图5B为活体成像直观观察目标启动子的激活活性结果，图5C为定量检测DoHY5激活目标启动子的活性检测结果；

图6为瞬时沉默DoHY5条件下铁皮石斛表型、花青素提取液和多糖、花青素生物合成关键酶基因及其含量变化情况图；图6A为瞬时沉默DoHY5后铁皮石斛的植株表型及花青素提取液颜色变化结果，图6B为瞬时沉默DoHY5后铁皮石斛多糖、花青素生物合成关键酶基因的表达水平，图6C为瞬时沉默DoHY5后铁皮石斛花青素含量测定结果，图6D为瞬时沉默DoHY5后铁皮石斛多糖含量测定结果，图6E为瞬时沉默DoHY5后铁皮石斛中甘露糖含量测定结果，图6F为瞬时沉默DoHY5后铁皮石斛中葡萄糖含量测定结果，图6G为瞬时沉默DoHY5后铁皮石斛中半乳糖含量测定结果，图6H为瞬时沉默DoHY5后铁皮石斛中阿拉伯糖含量测定结果；

图7为瞬时过表达DoHY5条件下铁皮石斛表型、花青素提取液和多糖、花青素生物合成关键酶基因及其含量变化情况图，图7A为瞬时过表达DoHY5后铁皮石斛的植株表型及花青素提取液颜色变化图结果，图7B为瞬时过表达DoHY5后铁皮石斛多糖、花青素生物合成关键酶基因的表达水平，图6C为瞬时过表达DoHY5后铁皮石斛花青素含量测定结果，图7D为瞬时过表达DoHY5后铁皮石斛多糖含量测定结果，图7E为瞬时过表达DoHY5后铁皮石斛中甘露糖含量测定结果，图7F为瞬时过表达DoHY5后铁皮石斛中葡萄糖含量测定结果，图7G为瞬时过表达DoHY5后铁皮石斛中半乳糖含量测定结果，图7H为瞬时过表达DoHY5后铁皮石斛中阿拉伯糖含量测定结果。

具体实施方式

本发明提供了转录因子HY5在提高石斛品质中的应用。

在本发明中，所述转录因子HY5的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。

在本发明中，所述石斛优选包括铁皮石斛。所述铁皮石斛品质优选包括铁皮石斛中花青素和/或多糖的含量。

在本发明中，与正常光处理相比，高光处理铁皮石斛显著提高铁皮石斛花青素和多糖含量，说明高光促进铁皮石斛中花青素和多糖的积累。同时，利用启动子分析预测网站PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析了花青素和多糖生物合成基因的启动子区域结合元件分布情况，并对各启动子元件的类型及分布进行筛选分析，结果表明，花青素和多糖合成相关的酶基因启动子上包含了大量的光响应元件；对转录因子表达水平进行检测发现，结果显示DoHY5、DoMYB17、DoMYB27在高光处理条件下显著上调。对花青素、多糖生物合成基因的启动子结合元件进一步分析发现花青素合成相关酶基因DoF3H1、DoC4H3和多糖合成相关酶基因GMPP2和PMT28启动子序列包含了一个或多个HY5结合位点(“ACGT”核心序列)。提示光可能通过光调节因子HY5上调下游花青素、多糖合成相关酶基因的表达，从而促进花青素、多糖的合成积累。另外，本发明为了验证DoHY5正调控DoF3H1、DoGMPP2启动子的转录激活活性，分别采用病毒诱导的基因沉默和瞬时过表达DoHY5，揭示了DoHY5上调下游花青素、多糖合成相关酶基因的表达，从而促进花青素、多糖的合成积累。

在本发明中，为了探究转录因子DoHY5如何影响花青素和/或多糖生物合成途径关键酶基因表达，又开展了双荧光素酶报告检测实验，结果表明所述转录因子DoHY5激活花青素和/或多糖生物合成途径关键酶基因的方法优选为所述转录因子DoHY5结合到所述花青素和/或多糖生物合成途径关键酶基因的启动子区，提高相应基因的表达量。

基于转录因子HY5正调控花青素和/或多糖生物合成途径关键酶基因表达来促进石斛中花青素和多糖的积累，因此，本发明提供了一种促进转录因子HY5表达的方法在提高石斛品质中应用；所述促进转录因子HY5表达的方法包括高光照射；所述高光的光强为800～1200μmol·m^-2·s^-1。

本发明提供了一种提高石斛品质的方法，包括以下步骤：

将石斛植株置于高光下照射；所述高光的光强为800～1200μmol·m^-2·s^-1；所述高光照射的光照周期为12h/12h；所述高光照射的时间为15～30d。

在本发明中，所述高光的光强优选为1000μmol·m^-2·s^-1。所述高光照射的时间优选为20～25d。所述石斛植株优选为石斛组培苗。所述石斛组培苗优选预先培养45～90d后再进行高光照射，更优选为50～80d，最优选为65d；所述石斛的培养温度优选为22～25℃，更优选为23℃。

在本发明实施例中，经高光照射处理后，铁皮石斛茎均表现为红色的表型，且采用紫外分光光度法(UV)和高效液相色谱法(HPLC)检测分析高光处理后铁皮石斛茎中花青素和多糖的含量及单糖的组成，说明持续高光处理铁皮石斛促进花青素及多糖的积累。

下面结合实施例对本发明提供的转录因子HY5在提升石斛品质中的应用和提升石斛品质的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例中所用的引物和序列信息见表1。

表1引物序列信息

实施例1

一种高光处理铁皮石斛的方法1.1铁皮石斛及烟草植株生长条件

实验植物材料为铁皮石斛(绿茎)组培幼苗，铁皮石斛组培幼苗在光暗周期12/12h、温度23℃的培养温室中培养65天后，然后分别置于正常光(光强100μmol·m^-2·s^-1)和高光(光强1000μmol·m^-2·s^-1)下处理30d后，取下各处理组铁皮石斛的茎段后用液氮急速冷冻后存于-80℃超低温冰箱以备后续总花青素和总多糖的测定。

1.2UV法检测总花青素含量

分别取不同处理组的铁皮石斛样品0.15g，精密加入1ml 1％HCl-甲醇溶液，氯仿萃取以去除提取液中叶绿素对测定的干扰。取上述水相于玻璃比色皿中测A₅₃₀(吸收值)和A₆₅₇(修正值)两个光吸收值。按照公式I计算总花青素含量。

总花青素含量＝(A₅₃₀-A₆₅₇)/FW(g)公式I

其中，FW(g)表示称样量。

1.3UV法检测总多糖含量

分别取不同处理组的铁皮石斛样品0.15g，精密加入蒸馏水5ml，超声提取铁皮石斛中的多糖成分，多糖提取液用无水乙醇纯化，得到纯多糖提取液，然后根据2020版《中国药典》项下的浓硫酸-苯酚法分别对正常组(GL)、高光组(HL)铁皮石斛总多糖的含量。

1.4HPLC检测多糖的组成

精密称取不同处理组的铁皮石斛样品约0.2g，精密加入蒸馏水5ml，超声提取铁皮石斛中的多糖成分，分别精密吸取多糖上清液1mL，加入适量盐酸，对铁皮石斛多糖进行水解，进一步加入PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液衍生化多糖，使多糖在衍生剂的作用下衍生化为单糖，氯仿萃取，0.2μm微孔滤膜过滤，注入液相色谱仪，测定。

2.结果

强光促进铁皮石斛中花青素和多糖的积累。

光是影响花青素合成的关键环境因子。自然界中大多数植物在持续强光的胁迫下会出现紫色或紫红色的表型。本研究以铁皮石斛(绿茎)组培幼苗(90d苗龄)为试验材料，持续高光(HL，1000μmol·m^-2·s^-1)、正常光(GL，100μmol·m^-2·s^-1)处理30d，观察分析各处理组铁皮石斛茎颜色的变化，并采用UV、HPLC定量分析各试验组的铁皮石斛中花青素及多糖的含量。

结果显示，绿茎的铁皮石斛在高光的持续刺激下，其茎呈现紫红色或红色(图1A)；体式显微镜下观察显示高光试验组的铁皮石斛茎表皮细胞中积累了丰富的紫红色色素(图1B)，而正常光处理组的铁皮石斛茎表皮细胞仅有轻微的色素沉着。分别提取GL、HL组铁皮石斛茎的花青素，可明显观察到高光处理组的花青素提取液颜色呈粉红色，且明显深于正常光处理组(图1C)。采用紫外分光光度法对上述得到的花青素提取液进行定量检测，结果显示高光处理组铁皮石斛茎中花青素含量显著高于正常光处理组，约1.3倍(图1D)，表明高光胁迫下铁皮石斛茎中积累了大量的花青素，与肉眼观察到的铁皮石斛茎颜色表型变化一致。为研究强光胁迫是否也影响铁皮石斛茎中多糖的合成积累，本研究采用浓硫酸-苯酚法定量测定GL和HL处理30d后铁皮石斛茎中总多糖积累的变化。结果显示，强光处理后总多糖含量显著高于正常光处理组(图1E)，与花青素含量变化趋势一致，表明高光处理铁皮石斛可同时促进花青素、多糖的积累，且花青素、多糖的积累表现出正相关的趋势。

为进一步探究高处理对多糖中单糖的组成或含量的影响，本实施例采用柱前衍生化高效液相色谱法对HL、GL处理条件下铁皮石斛多糖中单糖的组成及含量进行分析，结果显示：铁皮石斛中所含的多糖是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖单糖组成(图2A～图2B)，GL、HL组中的单糖组成一致。甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖在高光处理后其含量均表现出增加的趋势，且以甘露糖含量增加最为明显(图2C、图2E、图2F)；然而，与GL处理相比，GL处理组中的葡萄糖含量呈现下降趋势(图2D)；木糖、鼠李糖在本研究所用的铁皮石斛中含量非常低，不能稳定地被检出(图2B)。

实施例2

铁皮石斛花青素、多糖生物合成酶基因启动子元件分析及转录因子调控方式探究

为进一步探索光信号通过哪些信号转导途径同时调控花青素和多糖生物合成的分子机制，本实施例利用启动子分析预测网站PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析了花青素和多糖生物合成基因的启动子区域结合元件分布情况，并对各启动子元件的类型及分布进行筛选分析(图3A)。结果显示花青素和多糖合成相关的酶基因启动子上包含了大量的光响应元件，其次是MYB结合元件、激素响应元件(图3B)。为进一步挖掘光调控花青素、多糖生物合成的分子机制，对光响应因子HY5、MYBs转录因子的表达水平进行检测。

1.1铁皮石斛总RNA的提取

本发明中所有样品的总RNA提取，均使用Magen生物科技有限公司的试剂盒，按照试剂盒的说明书进行RNA提取。1.5％的变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；微量分光光度计(NanoDrop2000)检测RNA浓度，记录OD₂₆₀和OD₂₈₀吸光值以评价RNA的纯度。-80℃保存质量合格的RNA以用于后续实验。

1.2qRT-PCR检测DoHY5、DoMYB17、DoMYB27基因的表达水平

分别取正常组、高光组铁皮石斛茎，组织研磨仪快速研磨成细粉，将1.1提取RNA。通过RNA浓度测定结果，计算在1μgRNA下进行反转录的体积。按照Evo RT Kit(withgDNase)的说明书将质量合格的RNA去除gDNA后(见表2)进行反转录(见表3)，获得cDNA。以Actin为内参基因，对筛选出的目的基因进行荧光定量PCR(见表4)。

表2去除基因组DNA

反转录反应条件为：42℃，2min，反应体系见表2。

表3反转录反应体系

反应条件为：37℃，15min；85℃，5s。

按表4中各体系配制定量PCR体系。

表4定量PCR体系

其中所涉及的引物见表1。

将配制的定量PCR反应体系进行定量PCR反应，反应条件为：95℃，15 min；95℃，20s；55℃，20 s；72℃，20 s；40个循环。

结果显示，DoHY5、DoMYB17、DoMYB27在高光处理条件下显著上调(图3C-图3D)。对花青素、多糖生物合成基因的启动子结合元件进一步分析发现花青素合成相关酶基因DoF3H1、DoC4H3和多糖合成相关酶基因DoGMPP2和DoPMT28启动子序列包含了一个或多个HY5结合位点(“ACGT”核心序列)(图3B)。提示光可能通过光调节因子HY5上调下游花青素、多糖合成相关酶基因的表达，从而促进花青素、多糖的合成积累。

实施例3

DoHY5结合花青素和多糖生物合成相关基因的启动子并激活其表达

HY5是一种参与光形态建成的转录因子，在植物生长发育中起着多方面的作用。HY5可通过直接结合调控光诱导基因启动子上的光响应元件来调控基因的转录，其调控方式是：HY5直接结合光响应基因启动子上“含ACGT元件”的结合位点，例如G-box(CACGTG)、Z-box(ATACGGT)、A-box(TACGTA)和C-box(GACGTC)来调控下游基因的转录。为确定DoHY5是可以直接结合DoGMPP2和DoF3H1启动子上“含ACGT元件”的结合位点，进而调控花青素和多糖的生物合成。本实施例采用染色质免疫共沉淀(ChIP)研究体内DoHY5蛋白质与DoGMPP2、DoF3H1、DoC4H3和DoPMT28基因的相互作用，同时采用荧光定量的方法检测铁皮石斛染色质免疫沉淀的基因组DNA片段中DoGMPP2、DoF3H1、DoC4H3和DoPMT28基因启动子与DoHY5的结合能力强度。

1.1染色质免疫共沉淀(ChIP)

收集不同处理组的铁皮石斛样品1～2g，置于一定浓度的甲醛溶液中，抽真空，使蛋白质与DNA交联，超声破碎处理使其形成染色质小片段，电泳检测超声效果。加入HY5抗体与靶蛋白-DNA复合物相互结合，加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合蛋白。经洗脱后得到富集的靶蛋白-DNA复合物，解交联，纯化富集的DNA-片段，最后采用实时荧光定量分析各处理组的目标DNA片段富集量，其中涉及的引物见表1，方法见实施例1记载的定量PCR扩增方法。

结果显示，在强光条件下，DoHY5与DoGMPP2、DoF3H1和DoPMT28基因启动子的结合显著高于正常光处理组，其HL处理组中DoGMPP2和DoF3H1启动子富集了10倍以上，DoPMT28启动子富集了4倍(图4A)。DoF3H1、DoGMPP2和DoPMT28启动子的结构及其与G-box结合(5'-CACGTG-3'或5'-CACGTT-3')和“ACGT”结合(5'-ACGT-3')的一致序列分别用绿色条和蓝色条表示(图4B)，表明强光诱导下DoHY5直接靶向结合DoGMPP2、DoPMT28和DoF3H1启动子区的G-box或“ACGT”基序，启动调控下游基因的转录。

实施例4

双荧光素酶报告实验(Dual-Luc)

为了进一步验证DoHY5激活DoF3H1、DoGMPP2和DoPMT28启动子的转录激活活性，本实施例在本氏烟草的叶片中进行了双荧光素酶报告检测实验。将DoHY5的编码序列克隆到pGreenII 62-SK载体作为效应器；DoF3H1、DoGMPP2和DoPMT28启动子序列被独立插入pGreenII0800-Luc载体中，驱动萤火虫荧光素酶(LUC)的表达(图5A)。将DoHY5-62-SK与目标启动子(pGreenII0800-DoF3H1/DoGMPP2/DoPMT28-Luc)共注射到本氏烟叶片中，以pGreenII 62-SK与目标启动子的混合浸染液(1：1)作为对照。注射72 h后活体成像仪观察烟草叶片注射部位的发光信号。具体操作步骤如下。

本实施例中使用的烟草品种为本氏烟草(N.benthamiana)，培养于24℃、16小时光照的人工气候室中，用于后续的双荧光素酶报告检测实验。

将铁皮石斛DoF3H1-P1(SEQ ID NO:2)、DoF3H1-P2(SEQ ID NO:3)、DoGMPP2-P1(SEQ ID NO:4)、DoGMPP2-P2(SEQ ID NO:5)、DoPMT28-P1(SEQ ID NO:6)、DoPMT28-P2(SEQID NO:7)的启动子序列利用同源重组的方法，通过ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(诺唯赞，南京)分别插入pGreenII0800-LUC载体上，驱动萤火虫荧光素酶基因的表达。将铁皮石斛DoHY5的全长CDS序列(SEQ ID NO:1)用同源重组的方法构建到pGreenII62-SK载体中，得到效应载体。分别选取含pGreenII0800-DoF3H1/DoGMPP2/DoPMT28-Luc和pGreenII62-SK的GV3101(pSoup19)阳性菌株进行扩大培养，28℃摇床培养过夜；4000 rpm离心10 min收集菌体；注射液重悬菌体，按照体积1：1混合，注射混合菌液于烟草叶片下表皮；黑暗处理2天，然后光周期12/12h 3天；涂抹D-萤光素钾盐溶液至烟草叶片的注射区，活体成像仪检测烟草叶片的荧光强度，分别收集有荧光的烟草叶片。上述烟草样品用冷冻型组织研磨仪研磨至粉末状，然后根据双荧光素酶报告检测试剂盒的说明书操作，检测LUC、REN的荧光值，计算样品LUC/REN比值。

结果显示，DoHY5与DoF3H1、DoGMPP2、DoPMT28启动子共注射的烟草均显示出强烈的荧光(图5B)。此外，与阴性对照试验组相比，DoPMT28-P2在pGreenII-DoHY5-62-sk的激活下，其荧光素酶活性(LUC/REN)增加了12倍。DoF3H1和DoGMPP2启动子在DoHY5-62-SK在激活下，其荧光素酶活性(LUC/REN)增加了2～3倍(图5C)，表明DoHY5可直接结合DoF3H1、DoGMPP2和DoPMT28启动子并激活花青素合成基因DoF3H1和多糖合成基因DoGMPP2/DoPMT28基因的表达，从而启动转录调控影响下游产物的合成积累。

实施例5

采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)实验验证DoHY5正调控铁皮石斛中多糖、花青素的生物合成

DoHY5在高光诱导下可以直接结合多糖、花青素合成途径关键酶基因启动子，并激活下游基因的表达，影响花青素、多糖的生物合成。为进一步确认DoHY5转录因子对铁皮石斛多糖、花青素合成代谢的双重调控作用，本研究采用病毒诱导基因沉默(VIGS)法研究DoHY5基因沉默对花色素苷和多糖含量的影响。首先，将DoHY5片段(361bp)克隆到TRV2中，构建生成pTRV-DoHY5，并将TRV2作为阴性对照(pTRV)进行沉默分析。浸染铁皮石斛15天后，将铁皮石斛置于强光下处理15天。拍照记录各组铁皮石斛茎表型差异；UV、HPLC检测花青素、多糖含量差异水平。qRT-PCR检测DoHY5及花青素、多糖生物合成途径关键酶基因的表达情况。具体操作步骤如下。截取铁皮石斛DoHY5 CDS部分片段(SEQ ID NO:8)并利用同源重组的方法，通过同源重组连接方式插入pTRV2载体上，获得pTRV2-DoHY5载体。采用冻融法将pTRV2-DoHY5转化至根癌农杆菌(GV3101)，采用基因特异性引物的菌落PCR确认转化的农杆菌菌落。扩大培养pTRV1、pTRV2、pTRV2-DoHY5，收集菌液，浸染液重悬各组菌株至OD₆₀₀为1.00，将含有pTRV1和pTRV2、pTRV2-DoHY5的农杆菌悬浮液按等比混合，在渗透到植物之前，最终OD₆₀₀为1.0。以携带pTRV1和pTRV2载体的农杆菌混悬液为对照。采用真空渗透的方式浸染。将铁皮石斛幼苗(40d)分别浸入农杆菌悬浮液混合物(pTRV1+pTRV2；pTRV1+pTRV2-DoHY5)中，置于真空容器中进行真空渗透，将浸透的幼苗移栽至土壤中，并在室温下黑暗放置过夜。随后将幼苗置于23℃的光照下，光照时间为12h:12h(光:暗循环)。待浸染的幼苗生长7天后，将其转移至高光箱中进行高光处理15d，然后收集其茎，对花青素和多糖生物合成关键酶基因DoF3H1、DoGMPP2和DoPMT2的表达量进行qRT-PCR检测，采用紫外-可见分光光度法测定花青素含量检测(具体操作同实施例1中1.2项记载)，采用HPLC分析单糖含量(具体操作同实施例1中1.4项记载)等。

结果显示，pTRV对照组的铁皮石斛茎呈现红色表型，而pTRV-DoHY5实验的铁皮石斛茎颜色无明显变化，花青素提取液的颜色与其表型一致(图6A)。与PTV2空白对照组相比，pTRV2-DoHY5实验组中DoHY5的表达量显著减少，下降了30％以上。此外，DoHY5沉默植株中花青素和多糖生物合成关键酶基因DoF3H1、DoGMPP2和DoPMT2的表达量亦表现出下调的趋势(图6B)。紫外-可见分光光度法测定花青素的含量结果表明，DoHY5基因的沉默减弱了强光诱导下花青素的积累(图6C)。同时，与对照组相比，DoHY5沉默植株中多糖的含量显著降低(图6D)。HPLC分析结果显示，沉默转录因子DoHY5对甘露糖的合成影响较大，DoHY5沉默实验中甘露糖含量的积累较对照组的量少(图6E)，然而葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖含量没有明显变化(图6F-图6H)，原因可能是由于受VIGS系统基因沉默时间短的限制，HL处理时间短、多糖合成相对较缓慢而导致。这些结果进一步表明DoHY5是一个正转录调控因子，在铁皮石斛花青素和多糖的生物合成中发挥双重作用。

实施例6

瞬时过表达实验

为了进一步研究DoHY5对铁皮石斛花青素和多糖生物合成相关基因表达的调控作用，验证DoHY5在铁皮石斛花青素和多糖积累中的作用，采用真空浸润法在铁皮石斛茎中瞬时过表达DoHY5，浸染铁皮石斛15天后，将铁皮石斛置于强光下处理15天。拍照记录各组铁皮石斛茎表型差异；UV、HPLC检测花青素、多糖含量差异水平。具体操作步骤如下。

将DoHY5 CDS序列通过同源重组的连接方式插入pGreenII-62-SK载体上，获得pGreenII-DoHY5-62-SK载体。采用冻融法将pGreenII-DoHY5-62-SK转化至根癌农杆菌EHA105(pSoup)，采用基因特异性引物的菌落PCR确认转化的农杆菌菌落，并进行扩大培养，收菌，浸染液重悬菌体至OD₆₀₀为1.0。采用真空渗透的方式浸染。将铁皮石斛幼苗(40d)分别浸入农杆菌悬浮液混合物(pGreenII-62-SK；pGreenII-DoHY5-62-SK)中，置于真空容器中进行真空渗透，将浸透的幼苗移栽至土壤中，并在室温下黑暗放置一夜。随后将幼苗置于23℃的光照下，光照时间为12h:12h，光:暗循环，待浸染的幼苗生长7天后，将其转移至高光箱中进行高光处理15d，然后收集其茎，待后续进行DoHY5和花青素和多糖生物合成途径中的生物合成酶基因的qRT-PCR检测及花青素、多糖含量检测等。

实验结果显示铁皮石斛茎均表现出红色的表型，过表达DoHY5铁皮石斛茎的颜色较空白对照植株深，此外，瞬时过表达DoHY5组铁皮石斛花青素提取液的颜色与铁皮石斛茎表型一致均高于空白对照组(图7A)。

qRT-PCR结果显示，DoHY5在与对照浸润的植株中表达量增加约3倍。花青素和多糖生物合成途径中的生物合成酶基因(DoF3H1、DoGMPP2和DoPMT28)在过表达的DoHY5植株中也被上调(图7B)。

此外，瞬时过表达DoHY5的铁皮石斛茎组织，结果发现与空载体对照相比，DoHY5载体浸润的铁皮石斛茎组织中花青素和多糖含量均显著增加，花青素含量约增加2倍(图7C)。过表达DoHY5的植物多糖总含量显著增加(图7D)。

HPLC分析表明，过表达DoHY5植株在强光处理后甘露糖含量的积累增加(图7E)，而葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖浓度无显著变化(图7F-图7H)。这些结果进一步说明DoHY5是一个正转录调控因子，同时调控下游花青素和多糖生物合成基因的表达，促进花青素和多糖的合成积累。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.转录因子HY5在提高石斛中多糖含量的积累中的应用，所述转录因子HY5的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述石斛包括铁皮石斛。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述转录因子DoHY5激活多糖生物合成途径关键酶基因使多糖含量的积累。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述多糖生物合成途径关键酶基因包括GMPP2、PMT28。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述转录因子HY5激活多糖生物合成途径关键酶基因的方法为所述转录因子HY5结合到多糖生物合成途径关键酶基因的启动子区，提高相应基因的表达量。