CN102787175A - 转bar基因农作物的可视化检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种转基因农作物的检测技术，具体涉及转BAR基因农作物的可视化检测方法。利用在PCR体系中加入DNAzyme标记的检测BAR基因的特异性探针，用正反引物对BAR基因进行扩增，利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性将探针中的DNAzyme标记释放，通过检测PCR产物中释放出的标记物来判断该样品是否为转基因样品。本发明具有高效、简便、成本低等特点。

Description

转BAR基因农作物的可视化检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种转基因农作物的检测技术，具体涉及转BAR基因农作物的可视化检测方法。

背景技术

转基因农作物是利用组织培养技术和基因重组技术引入其它生物或物种的基因而培育出来的，这种农作物往往具有抗病虫害、抗除草剂或者营养高于非转基因作物等特性。目前中国的转基因植物已经超过20种，其中转基因大豆、马铃薯、玉米、烟草、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模应用，国外转基因大豆等也大量进入我国。虽然转基因作物有诸多优势，但是转基因农作物的安全性问题以及转基因作物对生态环境的潜在影响，仍然是我们必须谨慎对待的问题。特别是对于国外进口的产品，更应该确定其是否为转基因产品。

目前转基因产品的检测方法根据检测靶标的不同可分为基于核酸(DNA)的检测方法和基于外源蛋白质的检测方法。其中以第一类方法使用较为广泛，基于核酸的检测方法主要是建立在荧光定量PCR之上的检测方法，荧光定量PCR有很多优势，包括灵敏度高，特异性性高，既可定性又可定量等，但是其所需要用的仪器设备，以及荧光探针的检测成本都要远远高于普通PCR。本发明利用DNAzyme的特性，可以建立一种基于普通PCR反应的可视化检测方法，同时这种非标记的探针成本也大大下降，显色反应的操作也非常简单方便，可以实现高通量，多样本的检测。

BAR基因是一种来自于吸水链霉菌的抗除草剂基因，它在作为抗除草剂基因使用的同时，也被广泛地用作显性的选择标记，在现有的转基因产品中含有BAR基因的转基因作物的数量是非常可观的，这也预示着研究高效、简单的转BAR基因农作物检测方法具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因农作物的检测方法。

本发明上述方法是利用在PCR体系中加入DNAzyme标记的检测BAR基因的特异性探针CCCTACCCAGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH2，用正反引物(BAR-2：GCACCATCGTCAACCACTACATC BAR-6：GAGGTCGTCCGTCCACTC)对BAR基因进行扩增，利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性将探针中的DNAzyme标记释放，通过检测PCR产物中释放出的标记物来判断该样品是否为转基因样品。

本发明上述方法包括下列步骤：

DNA的提取；

PCR反应：

显色反应。

本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

1.快速性。采用本发明方法检测十分快速，3-4小时即可得知检测结果。

2.通用性。本发明所涉及的PCR检测方法，对于含有BAR基因的不同样品均可检测。

实用性。现有的实时荧光PCR技术通常对检测设备具有较高的要求，从而使检测具有一定的局限性，而本发明检测方法仅需要普通PCR仪，因此，使得转基因产品的检测变得更加简单、实用、方便。

经济性。现有的实时荧光PCR技术，试剂和探针的合成费用都较高，而本发明中所涉及的探针序列和标记物都由普通的核苷酸组成，不用修饰和改性，合成方便，试剂较为廉价，因此，大大降低了检测成本。

对于含有转BAR基因的转基因作物，只要检测到BAR基因的存在，就可以判断该样品是转基因产品。所以本方法可以为海关，出入境检验检疫局、商检、食品药品的监督管理等提供一种高效、简便且成本合理的转基因产品的检测技术。

附图说明

图1是转BAR基因水稻的检测结果，其中：1为阴性对照，为非转基因水稻，检测结果为无色；2为转基因水稻，检测结果为绿色；3为阳性对照，含BAR基因质粒，检测结果为绿色。

图2是转BAR基因棉花的检测结果，其中：1为阴性对照，为非转基因棉花，检测结果为无色；2为转基因棉花，检测结果为绿色；3为阳性对照，含BAR基因质粒，检测结果为绿色。

具体实施方式

下面将结合附图举例说明本发明的方法。

实施例1：水稻中BAR基因的检测

1.水稻基因组DNA的提取；

水稻基因组DNA的提取是采用改良的CTAB法提取。①水稻叶片或种子适量在液氮保护下于研钵中研磨成细粉取粉末少量于1.5mL EP管中，加入65℃预热的CTAB提取缓冲液700μl，充分振荡混匀，65℃温浴2h；②样品冷却至室温后加氯仿-异戊醇(24∶1)600μl，颠倒混匀5分钟；③7500r.min-1离心10分钟，转移上清液至一新的EP管中；④加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，20℃放置30分钟；⑤10,000r.min-1离心15分钟，弃上清液；⑥沉淀用70％乙醇、无水乙醇各洗涤一次，10,000r.min-1离心3分钟，弃上清液，室温挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。所述CTAB提取缓冲液含有：2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，100mM Tris(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，2.5M NaCl。

PCR反应；

10×Taq buffer 5μl；        Taq酶5个单位；

正向引物1μM；               反向引物1μM；

dNTPs0.2mM；        DNA提取液1μl；

探针0.6μM；        灭菌水补足50μl。

95℃3分钟；94℃30秒，60℃1分钟30秒，循环35次；72℃延伸5分钟，得扩增样品。分别设置1：阴性对照，为非转基因水稻；2：转基因水稻；3：阳性对照，为含BAR基因质粒。

3.显色反应；

将PCR产物加200mM NaCl，94℃加热1min，室温放置1h，加1.8μM hemin，2.1μM ABTS，2.1μM H2O2，用肉眼观察颜色变化。

4.检测结果

如附图1所示，阴性对照不显色，样品与阳性对照都可见浓绿的颜色。

实施例2：棉花中BAR基因的检测

1.棉花基因组DNA的提取；

棉花基因组DNA的提取是采用改良的CTAB法提取。①棉花叶片或种子适量在液氮保护下于研钵中研磨成细粉取粉末少量于1.5mL EP管中，加65℃预热的CTAB提取缓冲液700μl，充分振荡混匀，65℃温浴2h；②样品冷却至室温后加氯仿-异戊醇(24∶1)600μl，颠倒混匀5分钟；③7500r.min-1离心10分钟，转移上清液至一新的EP管中；④加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，20℃放置30分钟；⑤10,000r.min-1离心15分钟，弃上清液；⑥沉淀用70％乙醇、无水乙醇各洗涤一次，10,000r.min-1离心3分钟，弃上清液，室温挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。

PCR反应；

10×Taq buffer5μl；        Taq酶5个单位；

正向引物1μM；              反向引物1μM；

dNTPs0.2mM；                DNA提取液1μl；

探针0.6μM；                灭菌水补足50l。

95℃3分钟；94℃30秒，60℃1分钟30秒，循40次；72℃延伸5分钟，得扩增样品。分别设置1：阴性对照，为非转基因棉花；2：转基因棉花；3：阳性对照，为含BAR基因质粒。

3.显色反应；

将PCR产物加200mM NaCl，94℃加热1min，室温放置1h，加1.8μM hemin，2.1μM ABTS，2.1μM H2O2，用肉眼观察颜色变化。

4.检测结果

如附图2所示，阴性对照不显色，样品与阳性对照都可见浓绿的颜色。

Claims (7)

1.一种转BAR基因农作物的PCR可视化检测方法，其特征在于，所述方法是利用在PCR体系中加入DNAzyme标记的检测BAR基因的特异性探针，用正反引物对BAR基因进行扩增，利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性将探针中的DNAzyme标记释放通过检测PCR产物中释放出的标记物来判断该样品是否为转基因样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测BAR基因的探针是：CCCTACCCAGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-N H2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反应中特异性的引物是：

BAR-2：GCACCATCGTCAACCACTACATC

BAR-6：GAGGTCGTCCGTCCACTC。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

1)DNA的提取；

2)PCR反应；

3)显色反应。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR反应体系及条件：

95℃3分钟；94℃30秒，60℃1分钟30秒，循环35-40次；72℃延伸5分钟，得扩增样品。

6.根据权利要求1所述PCR产物中释放出的DNAzyme标记物，其特征在于，该标记物是与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性DNAzyme，可在PCR反应结束后，加入hemin、显色底物(ABTS、DAB等)、H₂O₂，在室温下显色，直接用肉眼观察颜色变化从而判断该样品是否为转基因。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所检测对象为转BAR基因的农作物，包括水稻、小麦、棉花等。

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