CN102286624A

CN102286624A - 一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法

Info

Publication number: CN102286624A
Application number: CN2011102478599A
Authority: CN
Inventors: 潘爱虎; 李鹏; 贾军伟; 蒋玲曦; 朱宏; 白蓝; 王金斌; 唐雪明
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-08-26
Also published as: CN102286624B

Abstract

本发明公开了一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤：1)转基因香石竹Moonlite基因组DNA的提取；2)转基因香石竹Moonlite外源基因插入位点左边界旁邻序列的扩增和确认；3)转基因香石竹Moonlite定性PCR检测方法的建立和验证；4)转基因香石竹Moonlite定量PCR检测方法的建立和验证。本发明成功建立了适用于转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证该检测方法的特异性和灵敏度，为转基因香石竹的进口检测、监管及环境安全评价提供依据。

Description

一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法

技术领域

本发明属于转基因植物检测技术领域，具体涉及一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法。

背景技术

自从1994年第一个转基因番茄FLAVR SAVR被美国农业部批准进行商业化生产种植以来，越来越多的转基因植物已用于农业生产。转基因植物的产业化，尤其是转基因农作物的产业化可以减少农业对环境的影响，增加粮食产量，有助于解决全球粮食问题。据统计，1996年至2010年的15年期间，转基因农作物种植总面积超过十亿公顷。转基因农作物的种植面积从1996年的1.7万公顷到2010年的148万公顷，增长了87倍。2010年，全世界种植转基因农作物的国家数量达到29个，其中19个是发展中国家。随着转基因植物产业化水平不断提高，其安全问题已经引起国际社会和各国政府的广泛关注，并成为国家之间环境保护、国际贸易等合作的敏感议题，致使转基因产品的安全性问题由学术观点分歧，发展到环境问题、经济问题甚至政治问题。为了加强对转基因植物的管理，世界各国纷纷制定了相应的法律法规。转基因产品标识制度已成为国际公约。澳大利亚和新西兰从2001年7月开始对所有转基因食物实施标识制度，阈值为每种成分的1％，即当某一种成分内的转基因成分超过1％，则必须标识为转基因食物。巴西、以色列等国也把转基因成分阈值定为1％。韩国和日本分别为3％和5％。

建立健全转基因产品标识制度，转基因产品的检测技术是关键。目前世界上常用的转基因检测方法主要有两种：一种是基于核酸的检测方法，一种是基于蛋白质的免疫学检测方法。在转基因植物及其加工产品的检测过程中，以DNA检测为基础的核酸检测方法已经成为最主要、最适用的转基因植物及其加工产品的检测方法。基于DNA分子为基础的转基因产品检测方法经历了四个发展阶段，即(1)针对启动子、终止子、标记基因的筛选检测；(2)目的基因特异性检测；(3)基因构建特异性检测；(4)品系特异性(转化事件)检测。由于品系特异性检测方法具有高度特异性，目前国际上对于转基因产品检测方法已逐步过渡到品系特异性基因片段的检测方法。

品系特异性检测是通过分析外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。基于上述优点，品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点，并将为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。许多国家已经明确规定了转基因标签的阈值，定量PCR检测已经成为转基因检测的必须方法，该方法已经为各国转基因检测实验室广泛使用。近年来，一些转基因植物的品系特异性定性、定量PCR检测方法已经建立，例如，MON863，Oxy-235，MIR 604，Topas 19/2，MON15985等。

香石竹(康乃馨)是最重要的切花品种之一，其生产面积和销售量居切花品种之首。随着经济发展和社会进步，人们对花卉尤其是对改变色、香、形的新品种的需求不断增加。澳大利亚Florigene公司和日本Suntory公司将二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)和类黄酮-3′，5′-羟基化酶基因(F3′5′H)，通过农杆菌介导转化花色为白色的香石竹品种FE123，经筛选获得花色呈蓝紫色的转基因香石竹Moonlite。目前Moonlite已经在日本、澳大利亚、加拿大、美国、厄瓜多尔、哥伦比亚等国家通过了安全性评价，批准商品化种植。截止2008年，在美国、日本等国家销售的Moonlite已超过一千五百万支。

目前日本Suntory公司正在申请将转基因香石竹Moonlite进口到中国并进行销售，因此研究开发准确、高效的转基因香石竹Moonlite品系特异性检测方法，已成为一项重要而紧迫的任务。目前国内科研单位尚未进行转基因香石竹检测技术的研究。为了保护知识产权，便于农业行政主管部门对转基因香石竹的监管，保护国家在世界贸易活动中的经济利益，有必要建立转基因香石竹Moonlite品系特异性定性、定量PCR检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种转基因花色香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法。本发明利用TAIL-PCR技术，测序分析了外源基因插入位点左边界旁邻序列，并设计特异性引物和探针序列，建立了适用于转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证该检测方法的特异性和灵敏度。

本发明的原理为：根据已知表达载体左边界序列，设计三条同向且退火温度较高的特异性引物和退火温度较低的随机引物，进行TAIL-PCR反应，得到外源基因插入香石竹基因组DNA位点的旁邻序列。据此设计特异性引物和探针，优化PCR扩增条件，建立标准曲线，确定检测的灵敏度，对混合样品进行分析检测，建立适合于转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

利用Primer Express software version 3.0(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计特异性引物和荧光探针。特异性引物和探针的序列具体参见表1。引物和探针由上海英骏公司(Invitrogen Co.，Ltd，Shanghai)合成。采用ans基因作为香石竹的内标准基因。特异性引物LB 1R/2R/3R和随机引物AD2用于TAIL-PCR扩增。LiteC1F/1R用于品系特异性定性PCR扩增。LiteR1F/1R和探针Lite-Probe用于品系特异性定量PCR扩增。ANS-F 1/R1用于内标准基因ans定性PCR扩增。ANS-F2/R2和ANS-Probe用于内标准基因ans定量PCR扩增。GenomeC1F/1R用于香石竹基因组DNA定性PCR扩增。

表1.PCR体系所用的特异性引物和探针

本发明所述的转基因花色香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测的方法，包括如下步骤：

1、提取转基因香石竹Moonlite基因组DNA。

2、转基因香石竹Moonlite外源基因插入位点左边界旁邻序列的扩增和确认，其三条巢式引物LB 1R/2R/3R序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3，随机引物AD2序列如SEQ ID No 4，香石竹基因组定性PCR扩增引物对GenomeC1F/1R序列如SEQ ID No 9和SEQ ID No 10。

所述外源基因插入位点左边界旁邻序列的扩增利用TAIL-PCR方法。

所述TAIL-PCR方法的扩增反应体系为：第一轮扩增反应：总体积20μL，2μL 1×PCR缓冲液，0.8μL 2mM dNTPs，0.3μL 10μM所述特异性引物LB 1R，4μL 10μM所述随机引物AD2，0.2μL 5U Taq DNA聚合酶，2μL MoonliteDNA，10.7μL双蒸水；第二轮反应：总体积25μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，1μL2mM dNTPs，0.5μL 10μM所述特异性引物LB2R，5μL 10μM所述随机引物AD2，0.16μL 5U Taq DNA聚合酶，14.84μL双蒸水和1μL 40倍稀释的第一轮PCR产物；第三轮反应：总体积50μL，5μL 1×PCR缓冲液，2μL 2mMdNTPs，1μL 10μM所述特异性引物LB3R，10μL 10μM所述随机引物AD2，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，30.7μL双蒸水和1μL 10倍稀释的第二轮PCR产物。

3、转基因香石竹Moonlite定性PCR检测方法的建立和验证，其Moonlite品系特异性定性引物对LiteC1F/1R序列如SEQ ID No 7和SEQ ID No 8，内标准基因ans特异性定性引物对ANS-F1/R1序列如SEQ ID No 5和SEQ IDNo 6。

所述定性PCR检测方法的定性PCR反应体系为：反应体系总体积25μL，5μL Moonlite DNA，2.5μL 1×PCR缓冲液，2.5μL 2mM dNTPs，12.7μL双蒸水，10μM所述Moonlite品系特异性定性引物对LiteC1F/1R或所述内标准基因ans特异性定性引物对ANS-F 1/R1各1μL和0.3μL 5U Taq DNA聚合酶；反应程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35循环；72℃，7min。

4、转基因香石竹Moonlite定量PCR检测体系的建立和验证。

(1)为了获得高效、灵敏的定量PCR反应系统，通过不同引物、探针浓度的比例对Moonlite品系特异性定量PCR反应体系进行优化，从中筛选荧光信号指数期上升较快，荧光信号强且反应重复性好的体系作为最终定量PCR检测反应的体系。

其中，所用Moonlite品系特异性定量引物对LiteR1F/LiteR1R和探针Lite-Probe序列分别为SEQ ID No 13、SEQ ID No 14和SEQ ID No 16，内标准基因ans特异性引物对ANS-F2/ANS-R2和探针ANS-Probe序列分别为SEQID No 11、SEQ ID No 12和SEQ ID No 15；

所述最终定量PCR反应条件为：反应体系总体积25μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，2.5μL 2mM dNTPs，5μL 25mM MgCl₂，10μM所述Moonlite品系特异性定量引物对LiteR1F/LiteR1R或所述内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2各0.5μL，0.5μL 10μM所述探针Lite-Probe或ANS-Probe，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，5μL Moonlite DNA和8.2μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，45s，45循环。

(2)定量PCR检测标准曲线的建立、检测极限和重复性分析。

使用5μL连续稀释的基因组DNA作为模板，其连续稀释的浓度为15ng/μL，3ng/μL，0.6ng/μL，0.12ng/μL，0.024ng/μL，0.0048ng/μL。

在定量分析中，检测极限(Limit ofDetection，LOD)和定量极限(Limit ofQuantitation，LOQ)指的是定量分析过程的最低检测极限和最低有效定量极限，即被检测的样品在95％的精确度水平上能被检测出和可被定量的最低含量或质量。LOD和LOQ是评价定量方法有效检测范围和准确定量范围的重要参数，可通过低浓度样品多次重复数值的再现性来确定。

定量检测体系的重复性(Repeatability)是指在不同时间段重复实验之间的差异，用标准偏差(Standard Deviation，SD)来表示。每个浓度试样平行做3个反应，重复试验3次。

(3)混合样品的定量PCR分析

本发明中，实际样品的定量分析是采用相对定量法，即用外源基因和内标准基因含量的比值来表示检测样品中转基因成分的含量。首先将非转基因香石竹基因组DNA与转基因香石竹Moonlite基因组DNA混合，配制含转基因香石竹5％、3％、1％(W/W)的混合样品。再次，将混合样品在相同阈值下的Ct值分别代入建立的ans PCR反应体系和Moonlite品系特异性PCR反应体系的标准曲线，得到对应值。最后，根据公式(转基因成分含量＝转基因成分拷贝数/内标准基因拷贝数)进行转基因含量的计算。

经过上述方法可检测得：本发明中定性PCR检测方法的灵敏度0.05ng，约为香石竹单倍体基因组79拷贝；定量PCR检测方法的最低检测极限(LOD)和定量极限(LOQ)分别为0.024ng和0.12ng，为香石竹单倍体基因组38和190个拷贝。

本发明的有益效果：

本发明通过Tail-PCR技术获得转基因香石竹Moonlite外源基因插入位点的887bp香石竹基因组DNA序列，设计了定性、定量PCR反应引物、探针，优化定性、定量PCR检测体系，首次建立了转基因香石竹Moonlite品系特异性的检测方法。相对与现有技术，其灵敏度更高、特异性更强。可为转基因香石竹的监管提供检测依据，为转基因香石竹检测标准的制定及转基因香石竹的定性、定量检测试剂盒的开发提供技术支持。

附图说明

图1为本发明中Moonlite插入的外源基因示意图，其中，包含以下元件：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，突变型乙酰乳酸合成酶基因(SuRB)，查尔酮合成酶基因(CHS)启动子，二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)、类黄酮-3′，5′-羟基化酶基因(F3′5′H)，来源于矮牵牛编码磷脂转移蛋白基因的D8终止子，来源于农杆菌的Mac组成型启动子和Mas终止子。

图2为本发明中Moonlite转化载体与香石竹基因组相邻序列；

图3为本发明香石竹基因组DNA的定性PCR扩增，其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1：空白对照(NTC)，2-8：Moonlite，Moonshade，FE123，Master，BT11，RRS，MON 531；

图4为本发明Moonlite品系特异性PCR扩增，其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1：空白对照(NTC)，2-7：Moonlite，Moonshade，FE123，BT11，RRS，MON 531；

图5为本发明内标准基因PCR扩增，其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1：空白对照(NTC)，2-7Moonlite，Moonshade，FE123，BT11，RRS，MON 531；

图6为本发明Moonlite品系特异性定性PCR检测的灵敏度分析，其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1：空白对照(NTC)，2-7：含有10.0、5.0、1.0、0.1、0.01、0.001％转基因香石竹的混合样品；

图7为本发明内标准基因ans定性PCR检测的灵敏度分析，其中，箭头所示为扩增目的条带，M：DL2000DNA marker，1：空白对照(NTC)，2-7：含有10.0、5.0、1.0、0.1、0.01、0.001％转基因香石竹的混合样品；

图8为本发明Moonlite品系特异性定量PCR扩增曲线：5条曲线从左到右分别代表以75、15、3、0.6、0.12ng的转基因香石竹Moonlite基因组DNA扩增结果；

图9为本发明Moonlite品系特异性定量PCR扩增标准曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

本发明以转基因香石竹Moonlite品系特异性检测研究为例，

具体方法如下：

1、提取转基因香石竹Moonlite基因组DNA。

采用植物基因组提取试剂盒“Plant DNA Mini-prep kit”(瑞丰生物科技有限公司，上海)提取转基因香石竹Moonlite基因组DNA。利用分光光度计(Thermo Company EV60)测定DNA浓度和纯度分别为10ng/μL-100ng/μL和OD260/280＝1.7-2.0，根据香石竹基因组DNA大小(Royal botanic Gardens，Kew.Plant c-DNA value database(release 4.0，October 2005)确定其拷贝数为15873-158730copy/μL。

2、外源基因插入位点左边旁邻序列的扩增和确认。

根据已知的表达载体左边界的序列(参见图1)设计三条巢式引物LB1R/2R/3R和随机引物AD2。将随机引物AD2与三条巢式引物配对进行TAIL-PCR扩增，可以得到约1.0kb扩增产物，而对照的亲本材料没有得到扩增片段。对第三轮的PCR扩增产物经过回收试剂盒(申能博彩生物科技有限公司)回收、克隆至pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)，送测序公司(上海英骏生物技术有限公司)测序。所得序列经过网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对。图2显示了Moonlite外源基因插入位点的旁邻序列。这个序列包含了93bp的载体序列和887bp的未知序列。

其中，TAIL-PCR扩增反应体系：第一轮扩增反应：总体积20μL，2μL1×PCR缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl₂)，0.8μL2mM dNTPs，0.3μL 10μM特异性引物LB1R，4μL 10μM随机引物AD2，0.2μL 5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd，Dalian，China)，2μL Moonlite DNA，10.7μL双蒸水；第二轮反应：总体积25μL，2.5μL 1×PCR缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl₂)，1μL 2mMdNTPs，0.5μL 10μM特异性引物LB2R，5μL 10μM随机引物AD2，0.16μL 5UTaq DNA聚合酶，14.84μL双蒸水和1μL 40倍稀释的第一轮PCR产物。第三轮反应：总体积50μL，5μL 1×PCR缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl₂)，2μL 2mM dNTPs，1μL 10μM特异性引物LB3R，10μL10μM随机引物AD2，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，30.7μL双蒸水和1μL 10倍稀释的第二轮PCR产物。TAIL-PCR反应程序参见表2。所有PCR反应在GeneAmp PCR 9700PCR仪进行(Applied Biosystems)。

表2.TAIL-PCR反应程序

依据887bp的未知序列设计引物GenomeC1F/1R，进行PCR扩增，其扩增条件与步骤3中转基因香石竹Moonlite定性PCR反应体系和反应程序一致。结果转基因香石竹Moonlite，转基因香石竹Moonshade，非转基因香石竹亲本FE123和香石竹本地种Master均可以得到扩增449bp的产物，而转基因玉米BT11，转基因大豆RRS和转基因棉花MON 531中均无扩增产物(参见图3)。因此可以证明887bp的未知序列为香石竹基因组序列。

3、转基因香石竹Moonlite定性PCR检测和验证

定性PCR反应体系：反应体系总体积25μL，5μL Moonlite DNA，2.5μL1×PCR缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl₂)，2.5μL2mM dNTPs，12.7μL双蒸水，10μM引物(Moonlite品系特异性定性引物对LiteC1F/1R或内标准基因ans特异性定性引物对ANS-F1/R1)各1μL和0.3μL5U Taq DNA聚合酶(Takara Biotechnology Co.，Ltd，Dalian，China)。PCR仪为GeneAmp PCR 9700systems(Applied Biosystems)。反应程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35cycles；72℃，7min。反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳，100v，20min。

对于特异性定性引物对LiteC1F/1R，转基因香石竹Moonlite可以扩增到327bp的条带，其他转基因香石竹Moonshade，其他转基因作物Bt11、RRS、Mon531以及亲本中没有扩增到目的条带(参见图4)。对于内标准基因ans特异性定性引物ANS-F1/R1，Moonlite、Moonshade和亲本均扩增到356bp的条带，而Bt11、RRS、Mon531中没有扩增到目的条带(参见图5)。结果表明，这对引物特异性较好，可以用于Moonlite的特异性检测。

最低检测限(LOD)是衡量定性PCR检测方法是否理想的一个重要指标。用非转基因香石竹DNA分别稀释转基因香石竹Moonlite的DNA，分别配制成含有10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％(W/W)转基因香石竹Moonlite基因组DNA的混合样品(浓度为100ng/μL)。将此浓度梯度的混合样品作为模板，测试转基因香石竹Moonlite品系特异性定性PCR检测方法的检测下限。结果发现，除了0.001％样品不能被检测到，其他混合样品中在327bp处均能扩增到比较清晰、特异的条带，且随着DNA质量浓度的增加，扩增条带亮度增加(参见图6)。所有样品的内标准基因，均可以扩增到356bp的目标条带(参见图7)。结果表明，采用此对引物，转基因香石竹Moonlite定性PCR检测的灵敏度0.05ng(5μL(混合样品DNA体积)×100ng/μL(混合样品DNA浓度×0.01％(质量比))，约为香石竹单倍体基因组79拷贝。

4、转基因香石竹Moonlite定量PCR检测体系的建立和验证

(1)最终定量PCR反应条件为：反应体系总体积25μL，2.5μL 1×PCR缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.3)，2.5μL 2mM dNTPs，5μL25mM MgCl₂，10μM引物(Moonlite品系特异性定量引物对LiteR1F/LiteR1R或内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2)各0.5μL，0.5μL 10μMTaqMan探针(Lite-Probe或ANS-Probe)，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，5μLMoonlite DNA和8.2μL双蒸水。反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，45s，45cycles。在退火阶段进行荧光信号的收集。采用ABI7500software version V2.0.1(Applied Biosystems)对数据进行分析。

(2)标准曲线的建立和检测极限分析

利用最终定量PCR反应条件，分别以5μL不同浓度转基因香石竹Moonlite基因组样品(15ng/μL，3ng/μL，0.6ng/μL，0.12ng/μL，0.024ng/μL，0.0048ng/μL)为模板，确定定量PCR的最低检测极限(LOD)和定量极限(LOQ)。经过三次重复试验，三组定量PCR检测方法的LOD和LOQ分别为0.024ng和0.12ng，约为香石竹单倍体基因组38和190个拷贝，具体参见表3)。

表3.定量PCR的检测极限和定量极限的分析

在确定了定量PCR检测的LOD和LOQ值后，在定量允许范围内选择合适浓度的转基因香石竹Moonlite基因组DNA作为标准DNA样品，进行定量PCR检测。标准DNA浓度分别为15ng/μL、3ng/μL、0.6ng/μL、0.12ng/μL、0.024ng/μL，每个定量PCR反应中加入5μL模板，因此每个反应中转基因香石竹基因组DNA绝对含量分别是75ng、15ng、3ng、0.6ng、0.12ng，对应的香石竹基因组单倍体拷贝数约为119048、23810、4762、952、190。由转基因香石竹基因组DNA作为标准品建立的定量分析方法，其扩增曲线和标准曲线如图8和图9。其中扩增效率为0.93，相关系数为0.9999。结果说明本发明所述方法适合于Moonlite的定量PCR检测。

(3)定量PCR检测的重复性分析

在优化后的定量PCR反应条件下，分别以不同浓度的转基因香石竹Moonlite基因组DNA(15ng/μL，3ng/μL，0.6ng/μL，0.12ng/μL，0.024ng/μL)作为标准品进行重复性测试，每次实验重复三次，每次设立三个平行。结果如表4所示，Ct的范围是24.38-34.59，标准偏差(SD)的范围是0.06-0.16。内标准基因ans定量PCR的Ct的范围是20.08-30.48，标准偏差(SD)的范围是0.01-0.10(参见表4)。结果表明，定量PCR反应的重复性很好，具有很高的稳定性，可以用于样品的定量分析。

表4.Moonlite品系特异性定量PCR反应的重复性分析

(4)转基因香石竹Moonlite品系特异性定量PCR检测体系对混合样品的定量分析

基于Moonlite品系特异性定量PCR检测体系建立定量标准曲线以及已经建立的香石竹内标准基因ans的定量标准曲线，利用相对定量法分别对含有不同含量水平的(5％、3％、1％，W/W)转基因香石竹品系Moonlite和非转基因香石竹的混合样品进行了定量分析。如表5所示，根据建立的标准曲线，混合样品的转基因香石竹含量的计算值与其真实值之间的偏差小于25％。因此，我们可以推断转基因香石竹品系Moonlite的品系特异性定量检测方法具有高的精确性和准确性。

表5.混合样品的定量PCR分析

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims

1.一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1)转基因香石竹Moonlite基因组DNA的提取；

2)转基因香石竹Moonlite外源基因插入位点左边界旁邻序列的扩增和确认，其三条巢式引物LB 1R/2R/3R序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示，随机引物AD2序列如SEQ ID No 4所示，香石竹基因组定性PCR扩增引物对GenomeC1F/1R序列如SEQ ID No 9和SEQ ID No 10所示；

3)转基因香石竹Moonlite的定性PCR检测方法的建立和验证，其Moonlite品系特异性定性引物对LiteC1F/1R序列如SEQ ID No 7和SEQ IDNo 8所示，内标准基因ans特异性定性引物对ANS-F1/R1序列如SEQ ID No5和SEQ ID No 6所示；

4)转基因香石竹Moonlite定量PCR检测方法的建立和验证，其Moonlite品系特异性定量引物对LiteR1F/LiteR1R和探针Lite-Probe序列分别如SEQID No 13、SEQ ID No 14和SEQ ID No 16所示，内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe序列如SEQ ID No 11、SEQID No 12和SEQ ID No 15所示。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述外源基因插入位点左边界旁邻序列的扩增利用TAIL-PCR方法。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述TAIL-PCR方法的扩增反应体系为：第一轮扩增反应：总体积20μL，2μL 1×PCR缓冲液，0.8μL2mM dNTPs，0.3μL 10μM所述特异性引物LB1R，4μL 10μM所述随机引物AD2，0.2μL 5U Taq DNA聚合酶，2μL Moonlite DNA，10.7μL双蒸水；第二轮反应：总体积25μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，1μL 2mM dNTPs，0.5μL 10μM所述特异性引物LB2R，5μL 10μM所述随机引物AD2，0.16μL 5U Taq DNA聚合酶，14.84μL双蒸水和1μL 40倍稀释的第一轮PCR产物；第三轮反应：总体积50μL，5μL 1×PCR缓冲液，2μL 2mM dNTPs，1μL 10μM所述特异性引物LB3R，10μL 10μM所述随机引物AD2，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，30.7μL双蒸水和1μL 10倍稀释的第二轮PCR产物。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定性PCR检测方法的定性PCR反应体系为：反应体系总体积25μL，5μL Moonlite DNA，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL 2mM dNTPs，12.7μL双蒸水，10μM所述Moonlite品系特异性定性引物对LiteC1F/1R或所述内标准基因ans特异性定性引物对ANS-F1/R1各1μL和0.3μL 5U Taq DNA聚合酶；反应程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35循环；72℃，7min。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定量PCR检测方法的PCR反应条件为：反应体系总体积25μL，2.5μL 1×PCR缓冲液，2.5μL2mM dNTPs，5μL 25mM MgCl₂，10μM所述Moonlite品系特异性定量引物对LiteR1F/LiteR1R或所述内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2各0.5μL，0.5μL 10μM所述探针Lite-Probe或所述探针ANS-Probe，0.3μL 5U Taq DNA聚合酶，5μL Moonlite DNA和8.2μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，45s，45循环。