CN111733220B - 一种高特异性鉴定转基因康乃馨的方法 - Google Patents

一种高特异性鉴定转基因康乃馨的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于物种分析和鉴定领域，涉及一种高特异性鉴定转基因康乃馨的方法。本发明建立和优化的转基因康乃馨检测方法及检测试剂，适用于康乃馨及其来源产品的转基因筛查检测，为防止未经允许的转基因物种非法进入中国提供了必要的技术支撑。

Description

一种高特异性鉴定转基因康乃馨的方法
技术领域
本发明属于物种分析和鉴定领域，更具体地，本发明涉及一种高特异性鉴定转基因康乃馨的方法。
背景技术
康乃馨(D.caryophyllus L.)，是一种多年生草本植物，是全球四大鲜切花之一。它起源于欧洲南部、地中海沿岸至印度，有一千年的栽培历史。康乃馨作为重要的观赏花卉，多年来通过杂交育种、诱变育种等方法获得了很多颜色、株形各异的品种，但仍无法满足人们对康乃馨优良性状的迫切需求。以基因工程技术为核心的现代分子育种技术使各种花色、花型丰富，长插瓶期的转基因康乃馨品种走入大众视野。根据ISAAA(TheInternational Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，国际农业生物技术应用服务组织)数据库统计，目前全世界已批准商业化种植的转基因康乃馨品系有19个，其中以改变花色的性状为主，由澳大利亚Florigene公司和日本Suntory公司研发的多个品系已先后在澳大利亚、日本、挪威等国家批准种植，中国尚未批准任何转基因康乃馨产品进口。随着经济的发展和人民生活水平的日益提高，国内市场对进口鲜切花的需求日渐旺盛，且呈现快速增长趋势，同时中国也出口鲜切花至日本、韩国等国家，康乃馨切花和种苗的进出口量与日俱增。
自然界中的康乃馨品种花瓣可呈现大红、紫红、粉红和白色等颜色，但不会呈现蓝色。而蓝色花瓣是由于花瓣中含有飞燕草色素苷及其衍生物，即3’,5’-羟基花色素苷。类黄酮-3’,5’-羟化酶基因(flavonoid 3’,5’-hydroxylase，F3’5’H)是合成3’,5’-羟基花色素苷的关键酶，也被称为蓝色基因。然而，自然界中康乃馨不含有F3’5’H基因，故康乃馨的花瓣虽颜色多样，却不会呈现紫罗兰色或蓝色。基因工程技术通过外源导入F3’5’H基因获得了花瓣呈现蓝色的花卉新品种。
飞燕草色素仅在花瓣中累积并显色，在根、茎、叶片等其他组织中无法观察到，鉴于进出口的花卉绝大多数并非为已经开花的植物，要准确判定是否为转基因花卉及产品，需要通过基于核酸或蛋白检测的方法。
本领域中，对于转基因植物的检测，目前最常用的是实时荧光定量PCR(qPCR)方法，尽管其被较多运用，但目前这种检测方法仍然存在一定的缺陷，包括检测易于被干扰，实验条件难优化的难题。一些对于检测具有较高准确性要求的人员一般认为，常规的荧光定量PCR技术并不适合对复杂的转基因作物进行高通量的筛查与检测。此外，尽管PCR方法操作上较为标准化，均是通过设计引物/探针进行扩增和检测，但是当针对不同样品，特别是复杂的植物样品时，其检测的灵敏度和准确性仍然是较难把握的，假阳性、假阴性现象较为常见。
综上，本领域还需要建立高特异性、高准确性地鉴定转基因康乃馨的方法，从而为进出口业或海关提供更好的技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高特异性鉴定转基因康乃馨的方法。
在本发明的第一方面，提供一种特异性鉴定转基因康乃馨的方法，包括：以待测样品的DNA为模板，进行以下(a)和/或(b)步骤：(a)以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行普通PCR扩增；和/或，以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物进行实时荧光PCR扩增；(b)以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物进行普通PCR扩增；和/或，以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物进行实时荧光PCR扩增；(a)和/或(b)中，若发生特异性扩增，则表明待测样品包含有转基因康乃馨。
在一个优选例中，(a)中，所述实时荧光PCR扩增中，运用SEQ ID NO:7所示的探针。
在另一优选例中，(b)中，所述实时荧光PCR扩增中，运用SEQ ID NO:10所示的探针。
在另一优选例中，在进行检测时，还包括以扩增康乃馨内标序列的引物进行扩增，进行质量控制；所述引物的序列为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
在另一优选例中，扩增的产物以SEQ ID NO:13所示的序列为探针进行检测。
在另一优选例中，在进行PCR扩增时，(a)中，所述普通PCR的退火温度为61±0.5℃；或，所述实时荧光PCR的延伸温度为58±0.5℃。和/或
在另一优选例中，在进行PCR扩增时，(b)中，所述普通PCR的退火温度为59±0.5℃；或，所述实时荧光PCR的延伸温度为58±0.5℃。
在另一优选例中，所述的待测样品包括：康乃馨植物(包括鲜花，干花，苗，种子，接穗等)、其来源产品或其加工产品(如干花，食品，茶品等)，与康乃馨具有亲缘关系或与其近似的花卉植物或其加工产品。
在另一优选例中，所述转基因康乃馨为转入类黄酮-3’,5’-羟化酶基因的康乃馨。
在本发明的另一方面，提供一种用于特异性鉴定转基因康乃馨的试剂盒，其中包括：(a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对；(b)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对。
在一个优选例中，(a)中还包括：SEQ ID NO:7所示的探针；(b)中还包括：SEQ IDNO:10所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明同时鉴定转基因康乃馨的方法的使用说明书。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的试剂盒的用途，用于特异性鉴定转基因康乃馨。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、bp40基因普通PCR引物筛选图。M：DL2000 DNA Marker；泳道1-2：bp40F1/R1扩增条带；泳道3-4：bp40F2/R2扩增条带；泳道5-6：分别为bp40F1/R1、bp40F2/R2空白对照。
图1B、建立的bp40基因及hf1基因普通PCR方法反应条件优化扩增图。
bp40基因(A)和hf1基因(B)普通PCR扩增结果。M：DL2000 DNA Marker；泳道1～6：分别为退火温度为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃和61℃时的扩增条带；泳道7：阴性对照。
图2、建立的bp40基因及hf1基因普通PCR方法特异性与灵敏度测试结果。
(A-B)bp40基因(A)和hf1基因普通PCR方法特异性测定结果。M：DL2000DNAMarker；泳道1-17：采用不同植物材料的扩增。1.bp40质粒DNA(A)/hf1质粒DNA(B)；2.非转基因康乃馨；3.玉米；4.大豆；5.水稻；6.玫瑰；7.百合；8.石竹；9.分药花；10.美丽月见草；11.大花芙蓉；12.紫娇花；13.漏斗菜；14.美国薄荷；15.柳叶马鞭草；16.香雪球；17.矮牵牛(A)/三色堇(B)。泳道18：阴性对照。
(C-D)bp40基因(C)和hf1基因(D)普通PCR方法灵敏度测定结果。M：DL2000 DNAMarker；泳道1-10：不同浓度模板的扩增。1-2：5000拷贝；3-4：500拷贝；5-6：50拷贝；7-8：25拷贝；9-10：12.5拷贝。
图3、建立的bp40基因及hf1基因实时荧光PCR方法特异性与灵敏度测试结果。
(A-B)bp40基因(A)和hf1基因实时荧光PCR特异性测试结果。阳性扩增曲线分别来自bp40及hf1基因质粒分子DNA为模板的扩增。
(C-D)bp40基因(C)和hf1基因(D)实时荧光PCR灵敏度测试结果。1-5分别为模板含量2000拷贝、200拷贝、20拷贝、10拷贝和5拷贝，各两个重复。
图4、bp40基因无效引物探针。实时荧光PCR引物探针Bp40-FP1/RP1/P测试图。
具体实施方式
本发明人致力于提高转基因康乃馨的检测准确性以及检测效率，经过深入研究后，优化了一组可特异性提高转基因康乃馨的试剂，所述的试剂包括引物和探针。本发明人还优化了PCR检测的方案，以及优化了探针设计。本发明的试剂以及方法具有极为优异的准确性和灵敏度。
本领域在进行物种鉴定时，PCR技术是较多被应用的，但稳定性、准确性相对而言不能满足精细检测的需要，特别是针对一些基因组复杂的转基因植物样品。各个国家对于转基因植物的规定不同，中国目前尚没有批准任何转基因康乃馨产品进口，为了避免此类被禁止的转基因物种流入中国，进行准确的检测、鉴定是非常关键的。此前的一些研究也显示，关于hfl普通PCR方法，灵敏度仅为0.5％，以康乃馨基因组622Mb来计算，即相当于可检出的最低拷贝数为500拷贝，无法满足日常检测。如何准确地、无任何疏漏地检出此类物种，假阳性和假阴性现象，是本领域尚需解决的问题。
本发明人经过广泛的研究后，制备了可特异区分康乃馨转基因植物的检测试剂/试剂盒。所述检测试剂是在经过本发明人广泛筛选和实验室论证后获得的，特异性良好，可实现无疏漏地检测转基因康乃馨，避免假阴性现象；同时，本发明对于目前所有品系的转基因康乃馨均能检出(目前已商业化种植的外源转入F3’5’H基因转基因康乃馨品系有18个，其中7个品系转入了来源于矮牵牛的F3’5’H基因(hf1基因)，11个品系转入来源于三色堇的F3’5’H基因(bp40基因))。
试剂及试剂盒
本发明人通过对康乃馨转基因植物及其它物种在基因层面的比较和筛选，经大量的比对分析和反复试验，获得了特异性地检测康乃馨转基因的试剂，并建立了用于检测转基因康乃馨的PCR方法，达到准确鉴定转基因康乃馨的目的。本发明的试剂盒，可以包含进行普通PCR扩增的引物或进行实时荧光PCR的引物和探针。在本发明的优选方式中，所述试剂盒可以同时包含进行该两种PCR扩增的引物和探针，实现最优化、最具准确性的检测结果。
在本发明的一种方式中，所述特异性鉴定转基因康乃馨的试剂盒，其中包括：(a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对，用于通过普通PCR来高效地检测bp40基因；SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对，用于通过实时荧光PCR来高效地检测bp40基因；(b)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对，用于通过普通PCR来高效地检测hf1基因；以SEQID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对，用于通过实时荧光PCR来高效地检测hf1基因。在本发明的更为优选的方式中，所述试剂盒中除了含有上述引物对，还含有SEQ ID NO:7所示的探针，SEQ ID NO:10所示的探针。
本发明的试剂盒中，还可包括用于鉴定内标序列区段的引物/探针，其具有针对康乃馨这一物种的种间特异性以及种内非特异性的特征。以待测物种为模板，利用所述的引物/探针的扩增结果为阳性时，表明该物种为康乃馨。其也可以作为证明扩增成功的内参。在本发明的更为优选的方式中，所述鉴定内标序列区段的引物序列为SEQ ID NO:11和SEQID NO:12所示；更优选地，以SEQ ID NO:13所示的序列作为探针。
本发明的上述检测试剂，并不会因体系复杂而导致假阳性以及假阴性，特异性和灵敏度均非常理想。
本发明的这些引物和/或探针还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。
此外，所述的试剂盒还可含有其它用于鉴定转基因康乃馨的试剂，包括如(但不限于)：
(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或
(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或
(C)提取DNA的试剂盒。
此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定转基因康乃馨的使用说明书和/或标准操作程序。
本发明所述的试剂盒可实现快速灵敏检测定转基因康乃馨的目的，准确性非常理想。
PCR方法
基于本发明所提供的适用于鉴定转基因康乃馨的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定转基因康乃馨的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，进行以下(a)和/或(b)步骤：(a)以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行普通PCR扩增；和/或，以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物进行实时荧光PCR扩增；(b)以SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示的引物进行普通PCR扩增；和/或，以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物进行实时荧光PCR扩增；(a)和/或(b)中，若发生特异性扩增，则表明待测样品包含有转基因康乃馨。
聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。
更为优选地，本发明人还比较了PCR过程中所涉及的多种条件，包括反应体系、反应组分的添加量、退火时间、退火温度等等，并且发现普通PCR中的退火温度的高低与反应的扩增效率显著性相关，实时荧光PCR中的延伸温度与反应的扩增效率显著性相关。
作为本发明的优选方式，在进行PCR扩增时，(a)中，所述普通PCR的退火温度为61±0.5℃，从而提高普通PCR扩增产物的检测效果(条带更为明亮，易于判断)；或，所述实时荧光PCR的延伸温度为58±0.5℃，从而提高实时荧光PCR扩增产物的检测效果(Ct值较低，反应灵敏)。
作为本发明的优选方式，在进行PCR扩增时，(b)中，所述普通PCR的退火温度为59±0.5℃，从而提高普通PCR扩增产物的检测效果(条带更为明亮，易于判断)；或，所述实时荧光PCR的延伸温度为58±0.5℃，从而提高实时荧光PCR扩增产物的检测效果(Ct值较低，反应灵敏)。
利用本发明的引物及探针，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有转基因康乃馨，而且所需的样品量很少，对于微量的转基因康乃馨也能检出，灵敏度非常高。
经全面测试，本发明建立的检测方法是特异于转基因康乃馨的检测，该检测方法绝对检测下限可为5拷贝；且具有良好的可重复性，因此建立的该检测方法效果特别优异，检测的准确性可达到100％。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明针对两种植物来源的F3’5’H基因，分别建立和优化的普通PCR和实时荧光PCR检测方法及试剂。所述的检测方法特异性良好，对于转基因康乃馨能够实现特异性扩增，准确性可高达100％。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。
(2)本发明人经过优化而建立的转基因康乃馨PCR检测技术特异性高、灵敏度高、可重复性好，可满足口岸和相关实验室高精度的检测要求，对于口岸转基因康乃馨及其来源产品的检测至关重要。
(3)基于本发明所建立和优化的检测技术，将被作为转基因康乃馨检测行业标准，为防止转基因康乃馨种苗、鲜切花等未经批准非法进入中国，保障中国转基因产品标识制度的顺利实施，保障中国农产品进出口贸易的顺利进行提供了技术支撑。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1材料与方法
(1)植物材料
三色堇(V.wittrockiana)、非转基因康乃馨、非转基因玫瑰(Rosa rugosa)、及百合叶片和花瓣，非转基因玉米、非转基因大豆和非转基因水稻籽粒粉末均来源于市场且经实验室鉴定无误并保存。
须苞石竹(Dianthus barbatus L.)、分药花(Perovskia abrotanoides Karel.)、美丽月见草(Oenothera speciosa)、大花芙蓉(Hibiscus grandiflorus)、紫娇花(Tulbaghia violacea)、漏斗菜(Aquilegia viridiflora Pall.)、美国薄荷(Monardadidyma L.)、柳叶马鞭草(Verbena bonariensis)、香雪球(Lobularia maritima)及杂交矮牵牛(P.hybrida)叶片来源于上海辰山植物园。所有花卉材料均经上海辰山植物园植物分类学专家鉴定。
(2)PCR试剂及实验仪器
普通PCR反应预混液Premix TaqTM，DL2000 DNA Marker、核糖核酸酶(RnaseA)等均购自宝生物工程(大连)有限公司；实时荧光PCR预混液LightCycler480 Probe Master购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；DNA抽提试剂盒购自天根生物科技(北京)有限公司，其它试剂均为国产分析纯。
实验所用的主要仪器为：美国Thermo Fisher公司AB梯度PCR仪；瑞士Roche公司LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪；美国SPEX SamplePrep公司6875型冷冻研磨机；德国Hettich公司离心机；美国Bio-Rad公司凝胶成像仪等。
(3)植物总DNA提取
分别取叶片、花瓣或籽粒等组织5～10g，加入液氮，研磨至均匀的粉末。取约200mg粉末样品转入2.0mL离心管中，按照试剂盒说明书进行DNA提取和纯化。
(4)引物探针设计
根据转基因康乃馨的bp40基因与hf1基因的序列，以及考虑到所述的基因在转基因后的邻近位置的序列及其构建特点，以及考虑到类似物种或其它植物物种等一些可能混淆、干扰因素，本发明人设计了大量的普通PCR和实时荧光PCR引物和探针，并进行比较，本发明人将其中的部分引物和探针序列列于表1中(引物探针稀释至10mmol/L备用)。
表1、引物及探针列表
表1中包括经深入实验论证而筛选获得的可高效扩增且鉴定准确性好、灵敏度高的检测试剂；以及一组代表性的比较例bp40-F1/bp40-R1、bp40-FP1/bp40-RP1/bp40-P(为代表性的示例，以直观体现不同检测试剂的差异)。
(5)bp40质粒分子、hfl质粒分子构建
以三色堇基因组DNA为模板，使用bp40-F2/R2引物扩增bp40基因，获得426bp片段。以矮牵牛基因组DNA为模板，采用F35H-1F/2R引物扩增hf1基因，获得364bp片段。扩增后，分别将扩增产物通过T-A克隆插入pESI-T载体的多克隆位点，后进行测序，并与bp40基因、hf1基因序列进行比对，确定质粒序列的准确性。对构建成功的bp40基因质粒及hf1基因质粒进行DNA提取和纯化。
鉴定结果(bp40F2/R2)显示，PCR扩增在426bp有单一明亮的条带；同时，测序结果表明bp40基因质粒分子构建成功，该质粒分子被用于后续检测。鉴定结果(hf1-F/hf1-R)也显示，PCR扩增在218bp有单一明亮的条带。同时，测序结果表明hf1基因质粒分子构建成功。该质粒分子可用于后续检测。
(6)PCR扩增体系及反应条件优化
普通PCR扩增体系组成为：Premix TaqTM 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA样品2μL，用灭菌双蒸水补足至25μL。
对退火温度进行优化，设置反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，设置6个温度梯度(51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃)退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃最后延伸5min。PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像系统观察并拍照，确定最佳退火温度。
荧光定量PCR扩增体系组成为：Lightcycler 480Probe Master 12.5μL，上下游引物各1μL，探针0.5μL，DNA样品2μL，用灭菌双蒸水补足25μL。
对延伸温度进行优化，设置条件为：50℃2min；95℃预变性10min；95℃15s，设置3个温度梯度(56℃、58℃、60℃)1min，40个循环。
(7)引物探针特异性测定
采用bp40与hfl质粒分子DNA、转基因康乃馨、非转基因康乃馨、玉米、大豆、水稻、玫瑰、百合、石竹、分药花、美丽月见草、大花芙蓉、紫娇花、漏斗菜、美国薄荷、柳叶马鞭草、香雪球、矮牵牛和三色堇基因组DNA为模板，分别对建立的普通PCR及实时荧光PCR检测方法进行特异性测试。
(8)引物探针灵敏度测试
采用0.1×TE缓冲液将bp40及hf1 DNA梯度稀释至2500拷贝/μL、250拷贝/μL、25拷贝/μL、12.5拷贝/μL和6.25拷贝/μL，进行普通PCR扩增，每个浓度设置2个平行重复，对建立的普通PCR方法的灵敏度进行测试。
采用0.1×TE缓冲液将bp40及hf1 DNA梯度稀释至1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL和5拷贝/μL，进行实时荧光PCR扩增，每个浓度设置2个平行，对建立的实时荧光PCR方法灵敏度进行测试。
实施例1、靶向bp40基因的鉴定
1、普通PCR检测体系建立
(1)不同引物的扩增
使用相同浓度三色堇DNA为模板进行引物筛选(bp40F1/R1、bp40F2/R2)。
普通PCR扩增体系组成为：Premix TaqTM 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA样品2μL，用灭菌双蒸水补足至25μL。
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃最后延伸5min。PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像系统观察并拍照。
结果如图1A，普通PCR扩增后，bp40-F1/bp40-R1的扩增产物的条带(泳道1和2)黯淡不明显，而bp40-F2/bp40-R2则明亮、易于辨析(泳道3和4)。
因此，本发明人从一系列预设引物中，找到当用于普通PCR检测时效果特别理想的检测引物。
(2)扩增条件优化
对bp40基因普通PCR扩增的退火温度进行优化，结果如图1A所示。引物(bp40-F2/R2)在各退火温度均获得了单一的明亮条带，但当退火温度为61℃时，条带最亮，表明反应效率最高，且无非特异性扩增条带，故61℃为引物bp40-F2/R2最适退火温度，进行后续测试。
(3)特异性测试
以bp40-F2/R2为引物，采用bp40质粒分子DNA、16种植物物种DNA为模板进行PCR扩增，结果如图2A所示。仅bp40质粒DNA为模板的扩增获得了阳性条带，其它植物DNA样品为模板的扩增均无条带产生，表明本发明设计的引物特异于bp40基因检测。
(4)灵敏度测试
采用5个浓度(5000拷贝、500拷贝、50拷贝、25拷贝和12.5拷贝)的bp40基因质粒DNA模板进行扩增。
bp40基因灵敏度检测结果如图2C所示。5000拷贝、500拷贝、50拷贝和25拷贝四个浓度的样品可稳定扩增获得目的条带，12.5拷贝的样品未扩增出阳性条带，因此建立的bp40基因普通PCR方法的检测灵敏度为25拷贝。
经多次实验，结果均显示bp40基因普通PCR方法的检测灵敏度为25拷贝或更低。
2、实时荧光PCR检测体系建立
(1)扩增条件优化
以bp40-F/bp40-R/bp40-R为引物探针，本发明人对于实时荧光PCR反应的温度进行了优化，在各种温度下扩增效果差距较大。本发明人发现，当延伸温度为58℃时，bp40基因扩增的Ct值均最小(模板浓度相同时，56℃、58℃、60℃的最优Ct值分别为27.87、26.95、27.80)，故反应效率最高，选择58℃为该基因的延伸温度，进行后续实时荧光PCR反应。
同时，本发明人发现，不管怎样优化条件，运用其它一些引物探针时，存在检测效果不理想或测不出。例如，图4为一具体的实验例，利用bp40-FP1/bp40-RP1/bp40-P’作为引物探针时，经多次测试均无明显扩增曲线，引物探针无效。
(2)特异性测试
采用bp40质粒分子DNA、16种植物物种DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。结果如图3A所示。仅当以bp40质粒DNA为模板进行扩增时，可以获得阳性扩增曲线，以其它植物物种DNA样品为模板的扩增均无明显的荧光增幅，表明本发明设计的实时荧光PCR引物及探针特异于bp40基因检测。
(3)灵敏度测试
采用5个浓度的bp40质粒DNA模板进行扩增，结果如图3C所示。2000拷贝、200拷贝、20拷贝、10拷贝和5拷贝五个浓度的样品均可稳定得到阳性扩增曲线，最低浓度的5拷贝样品Ct值在36-38之间，因此建立的bp40基因实时荧光PCR方法的检测灵敏度为5拷贝。
3、联合运用普通PCR检测和实时荧光PCR检测bp40
在大批量的检测中，本发明人分别统计了上述普通PCR检测以及上述实时荧光PCR检测的准确性。
本发明人发现，普通PCR检测结合实时荧光PCR检测，可以把检测的准确性提高至约100％，把检测误差降低至0。
实施例2、靶向hf1基因的检测
1、普通PCR检测体系建立
(1)扩增条件优化
对hf1基因普通PCR扩增的退火温度进行优化，结果如图1B所示。引物(F35H-1F/F35H-1R)在各退火温度均获得了单一的明亮条带，但当退火温度为59℃时，条带最亮，表明反应效率最高，且无非特异性扩增条带，故59℃为引物F35H-1F/2R最适退火温度，进行后续测试。
(2)特异性测试
采用hf1质粒分子DNA、16种植物物种DNA为模板进行PCR扩增，结果如图2B所示。仅hf1质粒DNA为模板的扩增获得了阳性条带，其它植物DNA样品为模板的扩增均无条带产生，表明本发明设计的引物特异于hf1基因检测。
(3)灵敏度测试
采用5个浓度(5000拷贝、500拷贝、50拷贝、25拷贝和12.5拷贝)的hf1基因质粒DNA模板进行扩增，hf1基因灵敏度检测结果如图2D所示。测试的五个浓度样品均可稳定扩增获得目的条带，因此建立的hf1基因普通PCR方法的检测灵敏度为12.5拷贝。
2、实时荧光PCR检测体系建立
(1)扩增条件优化
本发明人对于实时荧光PCR反应的温度进行了优化，在各种温度下扩增效果差距较大。本发明人发现，当延伸温度为58℃时，hf1基因扩增的Ct值均最小(模板浓度相同时，56℃、58℃、60℃的最优Ct值分别为24.9、22.71、25.22)，故58℃反应效率最高。因此，选择58℃为该基因的延伸温度，进行后续实时荧光PCR反应。
(2)特异性测试
采用hf1质粒分子DNA、16种植物物种DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。
结果如图3B所示。仅当以hf1质粒分子DNA为模板进行扩增时，可以获得阳性扩增曲线，表明本发明设计的实时荧光PCR引物及探针特异于hf1基因检测。
(3)灵敏度测试
以5个浓度的hf1质粒DNA模板进行扩增，结果如图3D所示。五个浓度的样品均可稳定得到阳性扩增曲线，故建立的hf1基因实时荧光PCR方法的检测灵敏度也为5拷贝。
3、联合运用普通PCR检测和实时荧光PCR检测hf1
在大批量的检测中，本发明人分别统计了上述普通PCR检测以及上述实时荧光PCR检测的准确性。
本发明人发现，普通PCR检测结合实时荧光PCR检测，可以把检测的准确性提高至约100％，把检测误差降低至0。
实施例3、康乃馨样品检测
选用冻存的近5年来康乃馨鲜切花、接穗和种苗样品分别研磨后，提取样品DNA，对两个基因进行普通PCR和实时荧光PCR检测。以内标引物(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)进行荧光PCR检测(探针为SEQ ID NO:13)。
结果如表2所示。普通PCR和实时荧光PCR的检测结果一致。10个样品的内源基因均为阳性，Ct值在23-30之间，但均未检出bp40基因与hf1基因。
表2、实际样品检测结果
注：“+”表示基因检测结果为阳性，“-”表示基因检测结果为阴性。
据上述，运用本发明的检测方法和检测试剂进行康乃馨的转基因检测，准确性为100％，检测误差为0。
讨论
康乃馨作为重要的鲜切花，消费者钟爱颜色、花型新奇的品种，中国每年有大量康乃馨切花和种苗进出口，所以对转基因康乃馨的检测对于保障国内种质资源、生物安全及出口贸易有非常重要的作用。目前转基因康乃馨检测方法尚不完善，尽管也有一些相关的PCR检测技术进行鉴定，但尚在准确性、灵敏性以及稳定性方面存在缺陷，严重制约了口岸转基因产品的检测监管。为此，本发明针对18个品系的已商业化转基因康乃馨品系，建立和优化了检测方案以及检测试剂。
本发明建立的普通PCR和实时荧光PCR方法特异性好。普通PCR方法灵敏度可达到或低于25拷贝或12.5拷贝，实时荧光PCR方法检测灵敏度可达到或低于10拷贝。经适用性测试，所述的普通PCR和实时荧光PCR方法可满足精确性检测要求，且组合应用的准确性高达100％。
中国的花卉产业发展迅速，康乃馨鲜切花及种苗进出口量逐年稳步增长。随着科技的发展和需求的提升，将有越来越多的转基因康乃馨品种诞生，因此建立健全转基因康乃馨外源基因及品系特异性检测的方法，对于保证中国生物安全、种质资源有着非常重要的意义。基于本发明建立的转基因康乃馨的检测方法，即将作为转基因康乃馨检测方法行业标准，为全国各口岸转基因产品的检测监管提供必要的技术标准，为防止转基因产品未经批准非法进入中国，保障中国农产品进出口贸易的顺利、有序进行提供技术支撑。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心
<120> 一种高特异性鉴定转基因康乃馨的方法
<130> 204139
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 1
cgttgtcgcg gctataattt tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 2
accctcacat ttgcccaatc atc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 3
ccatgcatag tcgatggtta tta 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
ttggagtaac catagcttca aga 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
aaactcgcta agaagtatgg tcc 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
gaggtctagc gttttgagga a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 探针(Probe)
<400> 7
cgacatggtg gtcgcgtcca c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
ccgaaagatt cttgagtgga ag 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
caaattcttc gtccagcacc 20
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 探针(Probe)
<400> 10
cgagggaacg attttgaatt gatacc 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 11
cctaaatgta agaacaacgc aatca 25
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 12
gcgtagcgct gaacatcgt 19
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 探针(Probe)
<400> 13
tataagacca ataaatggtt gatggatgga g 31
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 14
gatgattggg caaatgtgag ggt 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 15
tgactcgtcg ctctatgctc ctt 23
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 16
gcactagcca aactcgctaa g 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 17
tagcgttttg aggaaggctc 20
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 探针(Probe)
<400> 18
tggtccgatc atgcacctaa aaatg 25

Claims (2)

1.一种特异性鉴定转基因康乃馨的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，进行以下步骤(a)和步骤(b)，若步骤(a)或步骤(b)中发生特异性扩增，则表明待测样品含有转基因康乃馨；所述待测样品为康乃馨或转基因康乃馨；
所述步骤(a)为以核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的引物进行普通PCR扩增，以及以核苷酸序列如SEQ ID NO:5-7所示的引物及探针进行实时荧光PCR扩增；
所述步骤(a)中普通PCR扩增的退火温度为61±0.5℃；
所述步骤(a)中实时荧光PCR扩增的延伸温度为58±0.5℃；
所述步骤(b)为以核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示的引物进行普通PCR扩增，以及以SEQ ID NO:8-10所示的引物及探针进行实时荧光PCR扩增；
所述步骤(b)中普通PCR扩增的退火温度为59±0.5℃；
所述步骤(b)中实时荧光PCR扩增的延伸温度为58±0.5℃。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(a)和步骤(b)的实时荧光PCR中还以扩增康乃馨内标的引物及探针进行扩增；所述扩增康乃馨内标的引物及探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:11-13所示。
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