CN107980065A - 用于减少核酸扩增抑制的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于减少污染物对核酸扩增的抑制作用的组合物。所述组合物包含多个氧化锆颗粒、非离子表面活性剂和有机铁螯合试剂。所述有机铁螯合试剂相对于三价铁的第一亲和常数大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中所述第一亲和常数和第二亲和常数在pH 8.45和20℃下的去离子水中测定。任选地，所述组合物包含聚乙烯吡咯烷酮。任选地，所述组合物包含水。所述组合物的pH为约8.45至8.85。也提供使用所述组合物来制备用于核酸扩增的样本的方法。

Description

用于减少核酸扩增抑制的组合物
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2015年5月11日提交的美国临时专利申请号62/159,733和2015年7月8日提交的美国临时专利申请号62/189,991的优先权，这些临时申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
本申请已与其序列表(文件名为Sequence_Listing_76042US003.TXT，2016年4月25日创建)相关联。此序列表文件包含1,885字节并且其全文以引用方式并入本文。
背景技术
用于检测病原体和其它微生物的常规方法是基于培养的方法，但是这些方法是耗时的、费力的，并且不再符合质量控制和诊断实验室提供快速的结果的需求。
克服培养微生物、在病原体检测中的假阳性等问题的努力已经引起了诸如基于DNA的诊断方法或核酸增殖方法的基因测试的开发。使用基于DNA的方法来源于每种病原体物种携带将其与其它生物体区分开的独特的DNA或RNA标记的前提。这些技术是最有前途的，并且越来越多地用于微菌的快速、敏感和特异性检测。
生物技术的进步已经引起各种各样的用于有效的核酸扩增的测定的开发。
含有微生物/病原体的样本的有效基因检测需要快速敏感的测定方法，其给出即时或实时的结果。分析和抑制由样本中的抑制物质引起的核酸扩增的时间和敏感性与基因测试的有用性有某些限制。
希望具有有效地且快速地减少或消除预期靶的核酸扩增的抑制的组合物和方法。
发明内容
本公开提供了用于消除核酸扩增反应中的样本抑制的组合物以及使用该组合物的核酸扩增方法。
在第一方面，提供了用于消除核酸扩增反应中的样本抑制的组合物，所述组合物包含多个氧化锆颗粒、非离子表面活性剂和有机铁螯合剂。组合物的pH可以为约8.45至8.85。有机铁螯合试剂相对于三价铁的第一亲和常数可以大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中第一亲和常数和第二亲和常数在pH 8.45下在20℃去离子水中测定。
在任何上述实施方案中，组合物还可以包含水，其中表面活性剂在组合物中的浓度大于或等于0.005％(质量/体积)。在任何上述实施方案中，组合物还可以包含三价铁。在任何上述实施方案中，氧化锆颗粒的中值粒径可以小于约1微米。在任何上述实施方案中，有机铁螯合剂可以包含EGTA，其中三价铁与EGTA的摩尔比可以为约0.04至约0.28。在任何上述实施方案中，组合物还可包含聚乙烯吡咯烷酮。在任何上述实施方案中，所述组合物还可包含纳米颗粒分散稳定剂。
在第二方面，本公开提供了一种核酸扩增方法，所述方法包括：a)将包含多个氧化锆颗粒、非离子表面活性剂和有机铁螯合剂的组合物与目标样本接触以形成水性混合物；其中所述组合物的pH为约8.45至8.85；其中所述表面活性剂以大于或等于0.005％(质量/体积)的浓度在所述混合物中；其中所述有机铁螯合剂相对于三价铁的第一亲和常数大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中第一亲和常数和第二亲和常数在pH8.45下在20℃去离子水中测定；b)使步骤a)的混合物经受热裂解；和c)在步骤b)之后，对所述混合物的一部分进行核酸扩增过程。
在一个实施方案中，本公开提供等温扩增方法，所述方法包括：a)将包含多个氧化锆颗粒、非离子表面活性剂和有机铁螯合剂的组合物与目标样本接触以形成水性混合物；其中所述组合物的pH为约8.45至8.85；其中所述表面活性剂以大于或等于0.005％(质量/体积)的浓度在所述混合物中；其中所述有机铁螯合剂相对于三价铁的第一亲和常数大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中第一亲和常数和第二亲和常数在pH8.45下在20℃去离子水中测定；b)使步骤a)的混合物经受热裂解；和c)在步骤b)之后，对所述混合物的一部分进行等温核酸扩增。
在第三方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含多个氧化锆颗粒、非离子表面活性剂和有机铁螯合剂。有机铁螯合试剂相对于三价铁的第一亲和常数可以大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中第一亲和常数和第二亲和常数在pH 8.45下在20℃去离子水中测定。
在任何上述实施方案中，所述试剂盒还可包含三价铁。在试剂盒的任何上述实施方案中，三价铁可以作为柠檬酸铁铵存在于试剂盒中。在试剂盒的任何上述实施方案中，氧化锆颗粒的中值粒径可以小于约1微米。在试剂盒的任何上述实施方案中，有机铁螯合试剂可以包含EGTA。在任何上述实施方案中，试剂盒还可包含有效量的脱脂奶。
前面已经概述了本公开的一些相关目的。这些目的应该被解释为仅仅是对本公开的一些更突出特征和应用的说明。本公开包括从以下对实施方案的更详细描述中将描述或将变得显而易见的其它特征和优点。
本发明的上述发明内容并非旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施方式。以下描述更具体地例示了示例性实施方案。在本申请全文的若干处，通过实施例列表提供了指导，这些实施例可以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表都只用作代表性的组，并且不应理解为排它性列表。
下面将结合附图和描述介绍上述及其它实施方案的附加细节。通过具体实施方式、附图和权利要求书，其它特征、目的和优点将变得显而易见。
具体实施方式
在详细解释本公开的任何实施方案之前，应当了解，本发明在其应用中不仅限于下文说明中所提及或下文附图中所示出的构造细节和部件布置方式。本发明能够具有其它实施方案，并且能够以各种方式实践或进行。另外，应当理解，本文使用的措词和术语是用于说明目的而不应被视为限制性的。本文使用的“包括”、“包含”或“具有”及其变型形式意在涵盖其后列出的项目及其等同形式以及附加项目。应当理解，可利用其它实施方案，并且可以在不偏离本公开范围的情况下作出结构或逻辑改变。现在将在下文中更全面地描述本公开。为了下列详细说明的目的，除了有明确相反规定之外，应该理解的是本公开可假定各种替代的改变和步骤顺序。因此，在详细地描述本公开之前，应当理解，本公开并不限于具体例举说明的系统或实施方案，所述系统或实施方案当然可变化。在本说明书中的任何地方使用示例，包括本文所讨论的任何术语的示例仅是例示性的，并且绝不限制本公开或任何示例术语的范围和含义。同样，本公开不限于本说明书中给定的各种实施方案。
如本文所用，单数形式“一”和“所述”包括指代复数，除非上下文另有清晰的表示。术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或者所列要素的任意两个或更多个的组合。
当术语“约”用于描述值或范围的端值时，本公开应被理解为包括所提及的具体值和端值两者。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“涵盖”、“内含”、“含有”、“其特征在于”、“具有”或它们的任何其它变型旨在涵盖非排它性的包含之意。
如本文所用，短语“核酸”和“核酸序列”是可互换的，且并非旨在限制性的。“核酸”应具有本领域已知的含义，并指DNA(例如基因组DNA、cDNA或质粒DNA)、RNA(例如，mRNA、tRNA或rRNA)和PNA。其可以是多种形式，包括但不限于双链或单链构形、圆形形式、质粒、相对短的寡核苷酸、也称为PNA的肽核酸等。核酸可以是基因组DNA，其可以包括整个染色体或染色体的一部分。DNA可以包括编码(例如，用于编码mRNA、tRNA和/或rRNA)和/或非编码序列(例如着丝粒、端粒、基因间区域、内含子、转座子和/或微卫星序列)。核酸可以包括任何天然存在的核苷酸以及人造或化学改性的核苷酸、突变核苷酸等。核酸可以包括非核酸组分，例如肽(如在PNA中)、标记(放射性同位素或荧光标记物)等。
如本文所用，“扩增了”和“扩增”是指线性或指数增加多核苷酸序列的广泛范围的技术。示例性的扩增技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)或采用引物延伸步骤的任何其它方法。扩增的其它非限制性示例包括但不限于连接酶检测反应(LDR)和连接酶链反应(LCR)。扩增方法可以包括热循环或可以等温进行，诸如环介导的等温扩增(LAMP-BART)。在各种实施方案中，术语“扩增产物”或“扩增的产物”包括来自任意数量的扩增反应循环的产物。
如本文所用，“聚合酶链反应”或PCR是由以下项组成的核酸的扩增：分离双链核酸样本的链的初始变性步骤，随后重复(i)允许扩增引物对靶序列侧翼位置特异性退火的退火步骤；(ii)在5'至3'方向上延伸引物从而形成与靶序列互补的扩增子多核苷酸的延伸步骤，以及(iii)引起扩增子与靶序列分离的变性步骤。上述各步骤可以在不同的温度下进行，优选地使用自动热循环仪。
如本文所用，“等温扩增的”或“等温扩增”等类似术语是指与常规PCR反应不同，与需要在高温和低温之间循环的扩增相比，在恒定温度下进行扩增核酸的方法。这需要DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶。等温扩增通常在基本上单一温度下进行，因为引物与经置换的DNA链结合。在等温扩增中，可以将包含核酸样本和任选的所有引物的反应混合物加热到变性温度，在该变性温度下，在扩增前以及任选地当DNA聚合酶在变性温度下失活时加入DNA聚合酶之前，反应混合物中的双链核酸变性为单链(例如，至少85℃至90℃)。
如本文所用，术语“预期靶”、“靶核酸区域”、“靶特异性核酸”、“靶区域”、“靶标记序列”、“一个或多个靶核酸”、“靶核酸序列、“靶”或“靶多核苷酸序列”是指感兴趣的核酸。
如本文所用，“检测了”或“检测”是指靶多核苷酸序列或扩增的靶多核苷酸序列产物的样本中存在或不存在的公开或揭示。检测可以通过终点、实时、酶促，并且通过在凝胶上解析(resolving)扩增产物并确定预期的扩增产物是否存在，或本领域的技术人员已知的其它方法。
如本文所用，术语“样本”是指怀疑含有核酸的原料。检测样本中的核酸使人们能够检测微生物的存在。样本的示例包括但不限于食品样本(包括但不限于旨在用于人或动物消费的食品的样本，诸如加工食品、食品原料、农产品(例如水果和蔬菜)、豆类、肉类(来自牲畜和/或狩猎动物)、鱼、海产食品、坚果、饮料、酒水、发酵液和/或包含任意以上所列食物的选择性富集的食物基质)、水样、环境样本(例如土壤样本、污垢样本、垃圾样本、污水样本、工业废水样本、空气样本或来自各种水体诸如湖泊、河流、池塘等的水样)、空气样本(来自环境或来自室内或建筑物)、临床样本，从怀疑患有疾病或病症的人获得的样本、兽医样本、法医样本、农业样本、药物样本、生物制药样本，来自食品加工和制造表面的样本，和/或生物样本。根据本公开的非食品样本的示例可以是培养液。如本文所用的“培养液”是指用于培养微生物的液体培养基。
如本文所用，“抑制剂”意指任何化合物、物质或组合物或其组合，其作用是相对于当抑制剂不存在时测定的活性、精确度或准确性，直接或间接地降低测定的活性、精确度或准确性。抑制剂可以是分子、原子，或者分子或原子的组合，而不受限制。
根据本公开的一个方面，如本文所用的术语“抑制剂”是指例如用于扩增反应中的酶的抑制剂。此类抑制剂的示例通常包括但不限于蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、多酚、血红素及其降解产物、尿素、胆汁酸、腐殖酸、多糖、细胞膜和胞质组分。用于PCR的人血液中的主要抑制剂是分别存在于红细胞、白细胞和血浆中的血红蛋白、乳铁蛋白和IgG。抑制剂的示例还包含铁离子或其盐，其它金属盐诸如碱金属离子、过渡金属离子等，以及存在于生长培养基中的指示剂染料。
在本公开的一个实施方案中，作为指示剂染料的七叶灵可以充当抑制剂。七叶灵是从七叶树(Aesculus hippocastanum)(欧洲七叶树)获得的香豆素葡糖苷(6-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮，CAS号531-75-9)并且其特征在于其细小的蓝色荧光溶液。通常将七叶灵作为指示剂加入到细菌培养液中；例如在李斯特氏菌(Listeria)培养物中。在demi-Fraser(DF)、UVM和Fraser肉汤基础培养基(其是李斯特氏菌选择性富集肉汤基础培养基)中的七叶灵反应被突出为测定抑制的高度可能的贡献者。在该反应中，七叶灵
被特定细菌水解成6,7二羟基香豆素(秦皮乙素)和葡萄糖。秦皮乙素：
然后与铁离子络合以形成黑色络合物。秦皮乙素处于香豆素类药物中，且已知香豆素改性DNA作用酶的活性。
如本文所用，“表面活性剂”的含义是由本领域的普通技术人员容易认识到的最宽泛的定义。也就是说，表面活性剂是降低液体的表面张力和/或降低两种液体之间的界面张力的润湿剂。在水中不具有正电荷或负电荷但仍溶于水的表面活性剂是“非离子表面活性剂”。
如本文所用，“非离子表面活性剂”是指其极性基团未带电荷的表面活性剂分子。两种或更多种非离子表面活性剂的组合涵盖在术语“非离子表面活性剂”内。在某些实施方案中，可以使用一种或多种表面活性剂。
如本文所用，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是由单体N-乙烯基吡咯烷酮制成的水溶性聚合物。聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)是PVP的高度交联改性。如本文所述，聚乙烯吡咯烷酮或其改性物可以包括在扩增反应混合物中，以便减少或消除抑制物质。改性PVP包括但不限于为PVP的不溶性高度交联改性的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)。应当理解，本文涉及PVP的公开内容可以适用于PVPP。
在一个实施方案中，组合物可以包含非离子聚合物含氟化合物表面活性剂，其属于一类涂料添加剂，该涂料添加剂在用于热处理应用时提供低表面张力并且表现出良好的热稳定性。根据本公开的某些实施方案的非离子聚合物含氟化合物表面活性剂可以是作为3MTMNovecTM含氟表面活性剂的FC-4430。
如本文所用，术语“乙二醇四乙酸”和“EGTA”是指为螯合剂的乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸。EGTA是对镁具有较低亲和力的无色固体，使其对钙离子更有选择性。如在活细胞中发现的，当钙离子浓度低于镁时，EGTA可用于制备缓冲液以螯合钙离子。EGTA也可用于酶测定。
如本文所用，术语“细胞裂解”是指通过破坏细胞膜释放细胞中的材料的过程，并且具体地是从细胞提取细胞内材料以在扩增前分离DNA或RNA的过程，诸如PCR、LAMP BART方法以及同样的方法。
根据本公开的实施方案，细胞裂解可以通过热方法进行。根据细胞样本的形式和反应容器的特性，本领域的技术人员可以适当地选择热方法。
如本文所用，术语“微生物”或“微菌”是指任何微观生物体，其可以是单细胞或多细胞生物体。该术语通常用于指能够在合适的培养基中生长和繁殖的任何原核或真核微观生物体，包括但不限于细菌中的一种或多种。由本发明的范围涵盖的微生物包括原核生物，即细菌和古细菌；和各种形式的真核生物，其包括原生动物、真菌、藻类等。如本文所用，微生物的术语“培养”或“生长”是指通过使微生物体在预定培养基中在有助于其生长的条件下繁殖来使其倍增的方法。更具体地，其为提供合适的培养基和条件以有利于微生物的至少一个细胞分裂的方法。培养基可以是包含微生物生长所需的所有营养物和必需物理生长参数的固体、半固体或液体介质。术语“靶微生物”是指期望被检测的任何微生物。
如本文所用，术语“富集”是指通过以下方式选择性地富集特定微生物的生长的培养方法：提供具有有利于具体微生物的生长的特定的和已知属性的培养基和条件。富集培养的环境将支持所选微生物的生长，而抑制其它微生物的生长。
常规的基于DNA的方法的使用在某种程度上受限于抑制剂的存在。包含对核酸增殖反应具有负面作用的所有物质的此类所谓的抑制剂的出现是基因检测的缺点中的一个。这些抑制剂可以源于样本本身，或者可以在样本处理或核酸提取期间被引入。部分或全部核酸增殖反应的抑制后果分别是灵敏度降低或假阴性结果。
尽管有许多基于基因的方法的可用性，但是不存在单一的快速、灵敏、廉价和更少费力的方法来有效和快速地减少或消除对预期靶的核酸扩增的抑制。为了迅速确定靶样本中病原体的存在，需要开发可靠和准确的测定方法，该方法可以满足越来越多的寻找更快、准确和更少耗时且更少费力的测定技术的需求。
在竞争性PCR系统中，对易于使用的挑战是包括蛋白酶步骤。该蛋白酶步骤用于通过消化食物蛋白质(尤其是红肉)以及裂解细胞来减少样本抑制。令人惊奇的是，已经发现，根据本公开的组合物和方法通过使用氧化锆颗粒与有机铁螯合试剂的组合来中和抑制性蛋白质消除了对样本进行蛋白化的需要。有利地，本公开消除了分离/纯化的步骤，其使得目前的测定方法更快且更简单。
本公开描述了核酸扩增的组合物和方法，其消除了对蛋白酶的需要或以其他方式从样本中降低背景蛋白质。这继而也引起消除常规核酸扩增方法中的一个测定步骤。
本公开一般涉及样本的核酸增殖的新型组合物和方法，样本的核酸增殖包括细胞裂解步骤和核酸扩增步骤，而不需要分离/纯化步骤，诸如在其间的色谱法、离心法以及同样的方法。
本公开的组合物或方法可用于检测在食品或饮料材料(例如，成分、过程中组合物和成品)中发现的各种微生物。组合物和方法可特别用于检测食品或饮料材料中相对较少数量的病原微生物。
可以使用本公开的组合物和方法检测的病原微生物的非限制性示例包括沙门氏菌属(Salmonella)物种(例如，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、梭菌属(Clostridium)物种(例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum))、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)物种(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、大肠杆菌(Escherichia coli)(例如大肠杆菌O157:H7)、李斯特氏菌属(Listeria)物种(例如单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes))、弧菌属(Vibrio)物种(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus))和耶尔森菌属(Yersinia)物种(例如，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis))。
本公开的组合物通常用作包含相应化学组分的水性溶液。因此，在任何实施方案中，本公开的组合物包含水。预定体积的水性组合物可以与预定量(例如体积)的样本混合以形成经过处理(例如通过加热)的混合物，以裂解样本中的任何微生物(如果存在)。所得裂解物的一部分可用于核酸扩增过程中，以检测指示初始样本中一种或多种靶微生物的存在的核酸序列。
通常，将样本(例如碎牛肉、胴体冲洗、工业用水、来自环境(例如食品加工设备)拭子或海绵的残留物)悬浮在水性液体(例如水或缓冲液)中。因此，第一预定体积的水性样本与第二预定体积的包含本公开的组合物的水性溶液混合，以形成经历裂解处理的混合物。因此，当样本与组合物混合时，本公开的组合物中的每种组分以考虑所发生的稀释的浓度存在于水性组合物中。
根据本公开，第一预定体积与通过混合第一预定体积和第二预定体积而形成的混合物的体积的比小于或等于1:10。在任何实施方案中，第一预定体积与通过混合第一预定体积和第二预定体积而形成的混合物的体积的比为约1:10至约1:300。在任何实施方案中，第一预定体积与通过混合第一预定体积和第二预定体积而形成的混合物的体积的比为约1:10、约1:20、约1:25、约1:30、约1:40、约1:50、约1:100、约1:200、约1:250，或约1:300。
因此，本公开提供了包含多个氧化锆颗粒、有机铁螯合剂和非离子表面活性剂的组合物(例如水性液体组合物)，其浓度大于或等于0.005％(质量/体积)。该组合物的pH为约8.45至8.85。该组合物可用于核酸扩增方法以减少和/或消除核酸扩增反应的样本抑制。任选地，组合物可以包含如本文所述的三价铁离子和/或聚乙烯吡咯烷酮。
在任何实施方案中，组合物的合适pH为至少8.45。在任何实施方案中，pH可以在8.45至8.85的范围内。在某些实施方案中，可以使用8.65至8.75的pH。在其它实施方案中，可以使用8.75至8.85的pH。
在任何实施方案中，氧化锆颗粒可以包含纳米颗粒(例如，中值粒径为约100nm至小于1.0μm的氧化锆颗粒)。在任何实施方案中，氧化锆颗粒的平均粒度可以为约100nm至约200nm。在任何实施方案中，氧化锆颗粒的平均粒度可以为约100nm至约250nm。在任何实施方案中，氧化锆颗粒的平均粒度可以为约100nm至约500nm。这些颗粒可以通过添加柠檬酸盐稳定剂在上述pH下以稳定的分散体形式存在。
氧化锆纳米颗粒的分散体可以通过其每单位体积的表面积来表征。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为至少10m2/L的纳米颗粒。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为约10m2/L至约600m2/L(包括端值在内)的纳米颗粒。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为至少约25m2/L至约600m2/L的纳米颗粒。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为至少约50m2/L至约600m2/L的纳米颗粒。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为至少约100m2/L至约600m2/L的纳米颗粒。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为至少约200m2/L至约600m2/L的纳米颗粒。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为至少约300m2/L至约600m2/L的纳米颗粒。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为至少约400m2/L至约600m2/L的纳米颗粒。在任何实施方案中，本公开的组合物可以包含表面积为约600m2/L的纳米颗粒。
可以使包含ZrO2纳米颗粒的本公开的组合物稳定化，使得颗粒基本上保持悬浮长时间(例如，数月和/或年)和/或以最小的努力重新悬浮。这可以通过向组合物中加入分散稳定剂来实现。可用于本公开的组合物中的特别优选的分散稳定剂包括多元羧酸化合物如2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸(柠檬酸)或其盐，例如柠檬酸钾、柠檬酸铁铵。
有机铁螯合试剂对于三价铁(Fe+3)的铁离子具有预定义的亲和常数。在pH 8.45和20℃下的去离子水中，有机铁螯合试剂相对于三价铁离子的亲和常数大于或等于104.2。有机铁螯合试剂对于镁(Mg+2)离子还具有预定义的亲和常数。在pH 8.45和20℃下的去离子水中，有机铁螯合试剂相对于镁离子的亲和常数小于103.8。因此，在本公开的水性组合物中，在pH 8.45下，有机铁螯合试剂对于三价铁离子比对于镁离子具有更高的亲和力。
合适的有机铁螯合试剂包含有机分子。在任何实施方案中，有机铁螯合试剂是水溶性的。在任何实施方案中，有机铁螯合试剂包含多个羧酸根基团。合适的有机铁螯合试剂的非限制性示例包括乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)；N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙烷-1,2-二胺(TPEN)；1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N′,N′-三乙酸(HEDTA)；以及它们的盐。
在任何实施方案中，组合物任选地包含三价铁。因此，本公开的水性组合物可以包含三价铁离子。在任何实施方案中，可以通过柠檬酸铁铵在组合物中提供三价铁。因此，组合物还可以包含柠檬酸根离子。有利地，柠檬酸根离子可以促进和/或稳定氧化锆颗粒在本发明的水性组合物中的分散。
在任何实施方案中，三核铁可以以约55μM至385μM的铁离子浓度(即溶解的三价铁)存在于根据本公开的水性液体组合物中。在某些实施方案中，铁离子的浓度可以为至少110μM，在某些其它实施方案中，其可以是至少165μM。在其它实施方案中，铁离子的浓度可以为至少220μM，并且在其它实施方案中，其可以为至少275μM或至少330μM。根据本公开，在其中有机铁螯合试剂包括EGTA的水性溶液中，组合物的溶解的三价铁/EGTA的摩尔比为约0.04至约0.28。在某些优选实施方案中，水性组合物的溶解的三价铁/EGTA的摩尔比为约0.14至约0.18。
在根据本公开的液体(例如，水性液体)组合物的任何实施方案中，存在三价铁(被提供为柠檬酸铁铵)，以产生(当组合物与样本混合时)约50μM至350μM的铁离子浓度。在某些实施方案中，铁离子的浓度可以为至少100μM，在某些其它实施方案中，其可以是至少150μM。在其它实施方案中，铁离子的浓度可以为至少200μM，并且在其它实施方案中，其可以为至少250μM或至少300μM。根据本公开，在其中有机铁螯合试剂包括EGTA的水性溶液中，组合物的Fe3+/EGTA的摩尔比为约0.04至约0.28。在某些优选的实施方案中，组合物的Fe3+/EGTA的摩尔比为约0.14至约0.18。
在一个实施方案中，本公开的组合物包含至少一种非离子表面活性剂。因此，组合物可以包含任何非离子表面活性剂中的一种或多种。优选地，非离子表面活性剂的亲水-亲脂平衡值为约11至约16。具有亲水-亲脂平衡的表面活性剂在该范围内准许DNA聚合酶在PCR和LAMP核酸扩增反应中的足够活性，以及准许在BART报告技术中的足够的荧光素酶和ATP硫酸化酶活性。合适的非离子表面活性剂的示例包括但不限于TRITONTM系列洗涤剂，包括但不必限于例如TRITON X-100(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)及其衍生物、TRITON X-114、TRITON X-405、TRITON X-101、TRITON N-42、TRITON N-57、TRITON N-60、TRITON X-15、TRITON X-35、TRITON X-45、TRITON X-102、TRITON X-155、TRITON X-165、TRITON X-207、TRITON X-305、TRITON X-705-70和TRITON B-1956；脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯(POE)脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如吐温)、POE烷基醚(例如Brij)、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段聚合物、POE烷基胺和POE脂肪酸双苯醚和含氟表面活性剂，诸如3M NovecTM工程液体表面活性剂FC-4430和FC4432，以及陶氏化学品公司(Dowchemical)的FS系列含氟表面活性剂。
在根据本公开的液体(例如，水性液体)组合物的任何实施方案中，组合物中此类表面活性剂的浓度没有具体限制，只要可以实现本发明的有益效果(即相对于促进核酸扩增)即可。在任何实施方案中，本公开的组合物包含约0.005％(w/v)至约0.3％(w/v)的表面活性剂。因此，在任何实施方案中，本公开的组合物包含至多约0.3％(w/v)的表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂的浓度可以为至少0.01％(w/v)，并且在某些其它实施方案中其可以为至少0.025％(w/v)，且在另一个实施方案中为0.032％(w/v)。
任选地，在本公开的任何实施方案中，可以使用标称分子量为30KDa至1.3MDa的PVP。在本公开的一个方面，PVP的标称分子量为360KDa。
在本公开的一个实施方案中，当使用少量的表面活性剂时，PVP可以包含在组合物中。在根据本公开的液体(例如，水性液体)组合物的一个实施方案中，组合物(添加样本之前)可以包含0％w/v至多约0.0473％w/v的PVP。当非离子表面活性剂以0.0055％w/v至0.011％w/v的浓度存在于组合物中时，组合物可以包含约0.011％w/v至约0.0473％w/v的PVP。上述浓度中的每个也应用于改性PVP。
在本公开的一个实施方案中，当使用少量的表面活性剂时，PVP可以包含在组合物中。在根据本公开的液体(例如，水性液体)组合物的一个实施方案中，组合物(添加样本之后)可以包含0％w/v至多约0.043％w/v的PVP。当非离子表面活性剂以0.005％至0.01％w/v的浓度存在于组合物中时，组合物可以包含约0.01％w/v至约0.043％w/v的PVP。上述浓度中的每个也应用于改性PVP。
在本公开的某些实施方案中(例如，当非离子表面活性剂浓度>0.01％w/v时)，PVP可不包含在组合物中。
在本公开的任何实施方案中，有机铁螯合试剂包括EGTA。在任何实施方案中，有机铁螯合试剂可以以盐的形式提供给组合物。在某些实施方案中，组合物可以包含例如EGTA的钠盐。在本公开的另一个实施方案中，组合物可以包含例如EGTA的钾盐。
根据本公开的组合物可以包含Fe3+(例如，经由柠檬酸铁铵提供)和乙二醇四乙酸(例如经由乙二醇四乙酸的盐(例如单价阳离子盐)提供)。因此，在组合物中，可以存在乙二醇四乙酸和Fe3+的摩尔比。在任何实施方案中，乙二醇四乙酸与Fe3+的摩尔比为约0.04至约0.28。
在根据本公开的液体(例如，水性液体)组合物的任何实施方案中，EGTA可以以0.5mM至5mM的浓度存在。
在任何实施方案中，根据本发明的组合物任选地包含有效量的预定的蛋白质来源(例如，脱脂奶)。来源中的蛋白质可以有利地去除或以其它方式结合否则会干扰核酸扩增过程的物质(例如多酚或其它物质，例如在香料或其它食品中发现的)。
在任何实施方案中，根据本公开的组合物任选地可以包含镁或其盐和/或钾或其盐。因此，根据本公开内容的水性组合物任选地可以包含镁离子或钾离子。这些可以存在于组合物中以促进在样本制备步骤之后的核酸扩增反应(例如，PCR(例如，qPCR)、LAMP)。在任何实施方案中，根据本公开的水性组合物可以包含约1mM至约15mM的镁离子和/或约5mM至约500mM的钾离子。在任何实施方案中，水性组合物可以包含约20mM至约60mM的钾离子。
根据本公开的一个实施方案，样本可以被直接测试，或者可以在测试之前以某种方式制备或处理。例如，可以处理样本以富集任何污染微菌，并且可以进一步处理以分离和/或裂解其中所含的微生物细胞/病毒细胞/真菌细胞。可以另外处理来自样本的裂解的微生物细胞，或准备从微菌中分离和/或提取基因物质用于分析以检测和/或鉴定污染微菌。一些实施方案是指“样本中的核酸”或“样本衍生的核酸”，并且是指包含在样本中或从样本获得的核酸。可以通过本文所述的方法以及使用组合物来测试此类核酸。
在本公开的某些实施方案中，可以将样本进行分离，以最初将感兴趣的微菌与其它微菌和其它样本组分分开。例如，对于具有络合组分的络合食品样本，分离方法可用于将微生物与食物分离。在分析前与样本分离的微菌也可富集。样本的分析可以包括一种或多种分子方法。例如，根据本公开的一些示例性实施方案，可以使用适合的寡核苷酸引物对样本进行核酸扩增(例如通过LAMP-BART)，该寡核苷酸引物对于样本被怀疑污染的一个或多个微菌核酸序列是特异性的。然后可以将扩增产物进一步用特异性探针(或报告探针)进行测试，以允许检测已经从样本中扩增的微生物核酸序列。在一些实施方案中，如果从样本中扩增微生物核酸序列，则可以对扩增产物执行进一步分析，以进一步鉴定、定量和分析所检测的微菌(确定参数，诸如但不限于微生物菌株、病原性、数量等)。
本公开通常提供核酸扩增方法，所述方法包括a)使根据本公开的任何组合物(例如，水性组合物)与靶样本接触以形成水性混合物，其中混合物的pH为约8.45至8.85；b)使步骤a)的水性混合物经历热裂解；以及c)在步骤b)之后，使一部分水性混合物经历等温核酸扩增。
在本公开的任何实施方案中，核酸扩增方法包括a)使根据本公开的任何组合物(例如，水性组合物)与靶样本接触以形成水性混合物，其中水性混合物的pH为约8.45至8.85；b)使步骤a)的水性混合物经历热裂解；以及c)在步骤b)之后，使水性混合物经历等温核酸扩增，其中所述方法消除了由样本中存在的干扰组分引起的核酸扩增的抑制。
根据本公开的方法中所使用的扩增方法可以等温进行。等温技术包括但不限于环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)，基于核酸序列的扩增(NASBA)。使用链置换反应在恒定温度下进行反应。通过在恒温下培育样本、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶以及底物的混合物，可以在单个步骤中完成扩增。除了增加靶核酸序列的拷贝数的步骤或反应之外，扩增方法还可包括检测扩增的靶核酸序列的步骤或反应。此类检测步骤或反应是本领域的普通技术人员所熟知的，并且包括例如生物发光实时报告(BART)步骤或反应。
在本公开的一个实施方案中，等温扩增反应是环介导的等温扩增(LAMP-BART)方法。LAMP可以在等温条件下以高特异性、高效率和快速性扩增DNA。LAMP方法需要Bst DNA聚合酶和一组四至六个特异性设计的引物，其识别总共六个不同序列的靶DNA并具有链置换活性。在环介导的等温扩增(LAMP)中，通过使用具体设计用于分别识别靶基因上6至8个不同区域的4至6种不同引物来实现靶特异性扩增。此类方法通常在15分钟至60分钟内扩增核酸拷贝109至1010次。此外，扩增反应中例如ATP-硫酸化酶、腺苷-5'-O-过硫酸盐、虫荧光素和荧光素酶的存在准许经由生物发光(即BART反应)检测LAMP介导的扩增反应。
除了引物之外，LAMP-BART技术还使用Tris、硫酸盐化合物(诸如MgSO4、NH4SO4)和氯化钾来保持酶功能性。因此，此类化合物充当促进LAMP-BART偶联反应的增强剂。Tris是有机化合物(更形式地称为三(羟甲基)氨基甲烷，具有式(HOCH2)3CNH2)。链置换技术，诸如LAMP，使用Tris作为缓冲液，保持反应在最佳pH下。
本公开的组合物任选地可以包含指示剂染料以监控包含组合物的水性溶液的近似温度。有利地，指示剂染料可以提供第一视觉指示(例如，第一可观察到的颜色)，以指示包含组合物的水性混合物已达到大约在适于与组合物接触的微生物细胞的热裂解的范围内的温度(例如约100℃)。此外，指示剂染料可以提供第二视觉指示(例如，第二种颜色)，以指示包含组合物的水性混合物已经冷却到适合于去除一部分混合物并将其置于核酸扩增反应中的温度(例如，≤℃)。当在加热和冷却步骤期间水性混合物的pH改变时，可以容易地监测某些pH指示剂(例如，具有至少部分在约8.8至约7.2的pH范围内延伸的过渡范围的那些)。
合适的可见染料包括例如甲酚红，当pH高于8.8时，其为红紫色，且当pH小于7.2时为黄色。
在本公开的任何实施方案中，指示剂染料可以是甲酚红。
使用LAMP，使用两对或三对引物以及除了复制活性之外具有高链置换活性的聚合酶，在60℃至65℃的恒温下扩增靶核酸序列。环介导的等温扩增(LAMP)反应是高度特异性、敏感的等温核酸扩增反应。LAMP采用被称为正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向置换引物(F3)和反向置换引物(B3)的四个必需引物的引物组。这四种不同的引物用于鉴定靶基因上的6个不同区域，这高度增加特异性。由于这些引物的作用的具体性质，LAMP中所产生的DNA的量显着高于基于PCR的扩增。此外，可以包括有效加速反应的两种任选的引物；这些称为正向环引物(LF)和反向环引物(LB)。内引物(FIP和BIP)含有靶DNA的有意链和反意义链的序列，而置换引物(F3和B3)和环引物(LF和LB)各含有单个靶序列。当反应中包含环引物(LF和LB)时，总共识别出八个靶序列。DNA聚合酶用于扩增感兴趣的靶序列。可以使用许多不同的DNA聚合酶，包括非天然存在的工程化DNA聚合酶，最常见的是Bst DNA聚合酶，而常常较少使用土芽孢杆菌大片段(GspSSD)DNA聚合酶。
LAMP反应通过由内引物(FIP和BIP)所引发的DNA合成发起。之后进行通过释放单链DNA的置换引物(F3或B3)所引发的DNA合成。该单链DNA用作DNA合成的模板，DNA合成由与靶的另一端杂交的第二内引物和置换引物引发。这产生了茎环DNA结构。在随后的LAMP循环中，一个内引物与产物上的环杂交，并发起置换DNA合成。这产生了初始茎环DNA以及具有两倍长的茎的新的茎环DNA。循环反应在不到一小时内继续积聚约109份拷贝。除了通过内引物杂交以及引发链置换DNA合成的环之外，包含一个或两个环引物(LF和/或LB)通过与茎环杂交来加速LAMP反应。存在各种LAMP扩增检测方法。非特异性靶检测可以通过视觉鉴定浑浊样本获得，因为焦磷酸镁在阳性LAMP反应中沉淀。为了阳性反应的更好的可视性，可以向反应中加入各种试剂，诸如羟基萘酚蓝或钙黄绿素。另选地，可以使用DNA嵌入染料诸如甲酚红、SYBR绿、Picogreen或碘化丙啶来实现荧光检测，将DNA嵌入染料加入到反应试剂中或在用于终点分析的反应完成后加入。
在一个实施方案中，本公开提供了方法，其包括使悬浮在根据本公开的组合物中的样本与用于靶核酸物质的等温核酸扩增反应的组分接触，从而提供扩增反应混合物；在足以进行等温核酸扩增反应的条件下温育扩增反应混合物，从而提供产物；以及确定产物中是否存在靶核酸物种的指示剂。
在另一个实施方案中，本公开的特征在于方法，其包括执行扩增反应混合物的等温反应以提供产物，包含裂解物的混合物包含与根据本公开的组合物混合的样本以及用于靶核酸物质的核酸扩增反应的组分；以及确定产物中是否存在靶核酸物种的指示剂。
在本文公开的方法的任何实施方案中，对一部分水性混合物进行核酸扩增方法包括扩增与病原微生物相关的靶多核苷酸。可以通过所述方法检测的病原微生物的非限制性示例包括选自沙门氏菌属、梭菌属、蜡状芽孢杆菌、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、李斯特氏菌属、弧菌属和耶尔森氏菌属的病原微生物。
等温扩增反应的组分可以以溶液和/或干燥(例如冻干)的形式提供。当以干燥形式提供一种或多种组分时，还可以使用再悬浮或重构缓冲液。另选地，在形成包含样本和本公开的组合物的水性混合物之后，且在使水性混合物经历热裂解过程之后，可以使用水性混合物来重构等温反应的组分。
基于具体类型的扩增反应，反应混合物可以含有缓冲液、盐、核苷酸以及对于进行反应所需的其它组分。反应混合物可以在适于反应的特定温度下温育。
靶核酸可以是存在于动物(例如人)、植物、真菌(例如酵母)、原生动物、细菌或病毒物种中的核酸。例如，靶核酸可以存在于感兴趣的生物体的基因组中(例如染色体上)或染色体外的核酸上。在一些实施方案中，靶核酸是RNA，例如mRNA。在具体实施方案中，靶核酸对于所感兴趣的生物体是特异性的，即靶核酸在其它生物体中不存在，或者在与感兴趣的生物体类似的生物体中不存在。
本公开在各种领域中具有需要检测样本中的微生物的方法的多种应用，其中组合物可以用作在热裂解步骤期间将样本容纳在其中的悬浮培养基，并且组合物可用作水性培养基，其中将LAMP-BART核酸扩增试剂的冻干小球溶解并使其反应。
本公开毫不费力地允许使用者仅使样本与包含本文所述的多种氧化锆颗粒、有机铁螯合剂和非离子表面活性剂、任选的三价铁、以及任选的聚乙烯吡咯烷酮的组合物在pH为约8.4至8.85下接触，以形成水性混合物；随后将水性混合物进行裂解程序(例如，热裂解程序)；并且在冷却水性混合物后，使水性混合物进行用于检测微生物的核酸扩增反应(例如，等温核酸扩增反应或热循环核酸扩增反应)。
在另一个实施方案中，本公开提供了试剂盒。通常，试剂盒包含如本文所述的多种氧化锆颗粒(例如纳米颗粒)、根据本公开的有机铁螯合剂、非离子表面活性剂、任选的三价铁、以及任选的聚乙烯吡咯烷酮。
在一个实施方案中，试剂盒包含本文所述的多个氧化锆颗粒、有机铁螯合剂和非离子表面活性剂。有机铁螯合试剂相对于三价铁的第一亲和常数可以大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中第一亲和常数和第二亲和常数在pH 8.45和20℃下的去离子水中测定。
在试剂盒的任何实施方案中，有机铁螯合试剂可包含多个羧酸根基团。在任何上述实施方案中，试剂盒还可以包含2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸(柠檬酸)或其盐如钠盐或钾盐。在试剂盒的任何上述实施方案中，有机铁螯合试剂可以包括EGTA，其中三价铁与EGTA的摩尔比为约0.04至约0.28。
在另一个实施方案中，试剂盒还可包含选自含氟表面活性剂、指示剂染料、防腐剂、缓冲剂和LAMP-BART反应的增强剂以及它们的组合的组分。在试剂盒的任何实施方案中，任意一种或多种前述组分可以存在于组合物中的试剂盒中。试剂盒可以包含用于靶核酸的扩增的至少一种引物，诸如两种引物。试剂盒还可以包含用于靶核酸的扩增的至少一种其它引物，其可以但不一定是作为用于试剂盒中一种或多种其它引物的靶的相同核酸(以及甚至相同核酸内的相同序列)。在一些实施方案中，试剂盒包含用于扩增一种或多种独特基因组序列的两种或更多种引物。
在另一个实施方案中，试剂盒在单个包装中或在同一试剂盒内的多于一个包装中包含组分(即组合物、其组分、含氟表面活性剂、指示剂染料、防腐剂、缓冲剂和/或LAMP-BART反应的增强剂)。在试剂盒内包括多于一个包装的情况下，每个包装可以独立地含有单个组分或以任何合适的组合多个组分。如本文所用，单个试剂盒中的两个或更多个包装或容器的组合被称为“包装组合”。
在试剂盒的任何实施方案中，多个锆颗粒、有机铁螯合试剂、三价铁、聚乙烯吡咯烷酮、非离子表面活性剂、含氟表面活性剂、指示剂染料、防腐剂、缓冲剂或增强剂中的任意一者或多者设置在水性溶液中。在任何实施方案中，水性溶液的pH可以为约8.45至8.85。
试剂盒和试剂盒内的容器可以用任何已知的材料制成。例如，试剂盒本身可以由塑性材料或硬纸板制成。容纳组分的容器可以是例如塑性材料或玻璃。一个试剂盒内的不同容器可以由不同的材料制成。在实施方案中，试剂盒可在其内含有另一试剂盒。
本公开的试剂盒可以包含一种或多种可用于扩增靶序列的组分。在实施方案中，试剂盒中包括对于执行LAMP-BART方法所需的一些或所有试剂和用品。试剂的非限制性示例是缓冲液(例如，含有Tris、HEPES等的缓冲液)、盐以及模板依赖性核酸延伸酶(诸如耐热酶，诸如Taq聚合酶)、适用于酶的活性的缓冲液以及由酶所需的附加试剂，诸如dNTP、dUTP和/或UDG酶。在实施方案中，试剂盒包含增强剂，诸如氯化钾和硫酸铵，以促进酶促反应。用品非限制性示例是反应容器(例如，微量离心管)。
在任何实施方案中，本公开的试剂盒还包含用于扩增靶多核苷酸的试剂(例如引物)。在任何实施方案中，靶多核苷酸与病原微生物相关联(例如，特异性相关联)。在任何实施方案中，病原微生物选自沙门氏菌属、梭菌属、蜡状芽孢杆菌、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、李斯特氏菌属、弧菌属和耶尔森氏菌属。
试剂盒具有高灵敏度、高特异性、易于操作、通过肉眼判断结果的能力等优点。
示例性实施方案
实施方案A是组合物，所述组合物包含多个氧化锆颗粒、非离子表面活性剂和有机铁螯合剂，其中所述组合物的pH为约8.45至8.85，其中所述有机铁螯合试剂相对于三价铁的第一亲和常数可以大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中第一亲和常数和第二亲和常数在pH 8.45和20℃下的去离子水中测定。
实施方案B是根据实施方案A所述的组合物，还包含水，其中所述非离子表面活性剂以大于或等于0.005％(质量/体积)的浓度存在于所述组合物中。
实施方案C是根据实施方案A或实施方案B所述的组合物，其中所述多个颗粒的平均粒度小于约1μm。
实施方案D是根据实施方案A至C中任一项所述的组合物，其中所述多个氧化锆颗粒的表面积为约10m2/L至约600m2/L。
实施方案E是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述有机铁螯合试剂包含多个羧酸根基团。
实施方案F是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述有机铁螯合剂选自乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸；N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙烷-1,2-二胺；1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N′,N′-三乙酸；以及它们的盐。
实施方案G是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，还包含三价铁。
实施方案H是根据实施方案G所述的组合物，其中所述三价铁包括溶解的三价铁离子。
实施方案I是根据实施方案G或实施方案H所述的组合物，其中所述三价铁以约50μM至约350μM的浓度存在。
实施方案J是根据实施方案G至I中任一项所述的组合物，其中所述有机铁螯合试剂包括EGTA，其中所述三价铁与所述EGTA的摩尔比为约0.04至约0.28。
实施方案K是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，还包含纳米颗粒分散稳定剂。
实施方案L是根据实施方案K所述的组合物，其中所述纳米颗粒分散稳定剂包含2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸或其盐。
实施方案M是根据实施方案K或实施方案L所述的组合物，其中所述有机铁螯合剂和所述纳米颗粒分散稳定剂是不同的分子。
实施方案N是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂的亲水-亲脂平衡值为约11至约16。
实施方案O是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂选自叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段聚合物、聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯脂肪酸双苯基醚。
实施方案P是根据实施方案B至M中任一项所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂以至多约0.3％(质量/体积)的浓度存在。
实施方案Q是根据实施方案N所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂以0.005％至0.05％w/v的浓度存在。
实施方案R是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，所述组合物还包含聚乙烯吡咯烷酮。
实施方案S是根据实施方案R所述的组合物，其中所述聚乙烯吡咯烷酮以至多0.043％w/v的浓度存在。
实施方案T是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含含氟表面活性剂。
实施方案U是根据实施方案T所述的组合物，其中含氟表面活性剂是FC-4430TM。
实施方案V是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含指示剂染料。
实施方案W是根据实施方案V所述的组合物，其中所述指示剂染料是甲酚红。
实施方案X是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含有效量的防腐剂。
实施方案Y是根据实施方案X所述的组合物，其中所述防腐剂是甲基异噻唑啉酮。
实施方案Z是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，还包含有效量的脱脂奶。
实施方案AA是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于检测样本中的微生物。
实施方案AB是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述样本是食品样本、临床样本或培养液。
实施方案AC是根据实施方案AB所述的组合物，其中所述食品样本包含蛋白质。
实施方案AD是根据实施方案AC所述的组合物，其中蛋白质是铁蛋白。
实施方案AE是根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述样本包括培养液。
实施方案AF是根据实施方案AE所述的组合物，其中所述样本包含七叶灵(esculin)。
实施方案AG是一种核酸扩增方法，所述方法包括：
a)将包含多个氧化锆颗粒、非离子表面活性剂和乙二醇四乙酸(EGTA)的一价盐的组合物与目标样本接触以形成水性混合物，其中所述组合物的pH为约8.45至8.85；
b)使步骤a)的水性混合物经历热裂解过程；以及
c)在步骤b)之后，使所述水性混合物的一部分经历核酸扩增过程。
实施方案AH是根据实施方案AG所述的方法，其中所述多个氧化锆颗粒的表面积为约10m2/L至约600m2/L。
实施方案AI是根据实施方案AG或实施方案AH所述的方法，其用于消除由存在于样本中的干扰组分引起的核酸扩增的抑制。
实施方案AJ是根据实施方案AG至AI中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增方法包括环介导的等温扩增。
实施方案AK是根据实施方案AG至AI中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增方法包括热循环聚合酶链式反应过程。
实施方案AL是根据实施方案AG至AK中任一项所述的方法，其中所述组合物包含水。
实施方案AM是根据实施方案AG至AL中任一项所述的方法，其中所述样本是食品样本、临床样本或培养液。
实施方案AN是根据实施方案AG至AM中任一项所述的方法，其中所述食物样本包含蛋白质。
实施方案AO是根据实施方案AN所述的组合物，其中蛋白质是铁蛋白。
实施方案AP是根据实施方案AG至AO中任一项所述的方法，其中所述样本是培养液。
实施方案AQ是根据实施方案AP所述的方法，其中所述样本包含七叶灵。
实施方案AR是根据实施方案AG至AQ中任一项所述的方法，其中在步骤a)之前，将所述样本在约41.5℃下的培养液中温育。
实施方案AS是根据实施方案AG至AR中任一项所述的方法，其中组合物还包含缓冲剂和用于促进LAMP-BART核酸扩增反应的增强剂或促进qPCR反应的增强剂。
实施方案AT是根据实施方案AS所述的方法，其中所述增强剂选自氯化钾、硫酸铵、七水合硫酸镁以及它们的组合。
实施方案AU是根据实施方案AS所述的方法，其中所述缓冲剂包含Tris碱。
实施方案AV是根据实施方案AG至AU中任一项所述的方法，其中使所述混合物经历热裂解过程包括将所述混合物加热至约100℃约15分钟，且随后将所述混合物冷却至约40℃约5分钟。
实施方案AW是根据实施方案AV所述的方法，其中在将所述混合物冷却至约40℃后，所述方法还包括使所述混合物与用于LAMP-BART等温扩增的试剂接触。
实施方案AX是根据实施方案AG至AW中任一项所述的方法，其中使一部分所述水性混合物进行核酸扩增过程包括扩增与致病微生物相关联的靶多核苷酸。
实施方案AY是根据实施方案AX所述的方法，其中扩增与病原微生物相关联的靶多核苷酸包括扩增与选自沙门氏菌属、梭菌属、蜡状芽孢杆菌、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、李斯特氏菌属、弧菌属和耶尔森氏菌属的病原微生物相关联的靶多核苷酸。
实施方案AZ是一种试剂盒，其包含：
多个氧化锆颗粒；
非离子表面活性剂；和
有机铁螯合试剂；
其中所述有机铁螯合试剂相对于三价铁的第一亲和常数大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中第一亲和常数和第二亲和常数在pH 8.45下在20℃去离子水中测定。
实施方案BA是根据实施方案AZ所述的试剂盒，其中所述多个颗粒的平均粒度小于约1μm。
实施方案BB是根据实施方案AZ或实施方案BA所述的试剂盒，其中所述有机铁螯合试剂包含多个羧酸根基团。
实施方案BC是根据实施方案AZ至BB中任一项所述的试剂盒，其中所述有机铁螯合剂选自乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸；N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙烷-1,2-二胺；1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N′,N′-三乙酸；以及它们的盐。
实施方案BD是根据实施方案AZ至BC中任一项所述的试剂盒，还包含三价铁。
实施方案BE是根据实施方案BD所述的试剂盒，其中所述三价铁作为柠檬酸铁铵存在于所述试剂盒中。
实施方案BF是根据实施方案AZ至BE中任一项所述的试剂盒，还包含纳米颗粒分散稳定剂。
实施方案BG是根据实施方案BF所述的试剂盒，其中所述纳米颗粒分散稳定剂包含2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸或其盐。
实施方案BH是根据实施方案BF或实施方案BG所述的试剂盒，其中所述有机铁螯合剂和所述纳米颗粒分散稳定剂是不同的分子。
实施方案BI是根据实施方案AZ至BH中任一项所述的试剂盒，其中所述非离子表面活性剂的亲水-亲脂平衡值为约11至约16。
实施方案BJ是根据实施方案AZ至BI中任一项所述的试剂盒，其中所述非离子表面活性剂选自叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段聚合物、聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯脂肪酸双苯基醚。
实施方案BK是根据实施方案AZ至BJ中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含聚乙烯吡咯烷酮。
实施方案BL是根据实施方案AZ至BK中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含含氟表面活性剂。
实施方案BM是根据实施方案BL所述的试剂盒，其中含氟表面活性剂是FC-4430TM。
实施方案BN是根据实施方案AZ至BM中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含指示剂染料。
实施方案BO是根据实施方案BN所述的试剂盒，其中所述指示剂染料是甲酚红。
实施方案BP是根据实施方案AZ至BO中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含防腐剂。
实施方案BQ是根据实施方案BP所述的试剂盒，其中所述防腐剂是甲基异噻唑啉酮。
实施方案BR是根据实施方案AZ至BQ中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含缓冲剂。
实施方案BS是根据实施方案AZ至BR中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含缓冲剂、促进LAMP-BART反应或qPCR反应的增强剂、以及任何两种或更多种前述组分的组合。
实施方案BT是根据实施方案BS所述的试剂盒，其中所述增强剂选自氯化钾、硫酸铵、七水合硫酸镁以及它们的组合。
实施方案BU是根据实施方案BS所述的试剂盒，其中所述缓冲剂包含Tris碱。
实施方案BV是根据实施方案AZ至BU中任一项所述的试剂盒，还包含有效量的脱脂奶。
实施方案BW是根据实施方案AZ至BV中任一项所述的试剂盒，其中将柠檬酸铁铵、聚乙烯吡咯烷酮、非离子表面活性剂和乙二醇四乙酸的一价盐中的至少一种设置于水性介质中。
实施方案BX是根据实施方案BW所述的试剂盒，其中所述水性培养基的pH为约8.45至8.85。
实施方案BY是根据实施方案AZ至BX中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于扩增靶多核苷酸的试剂。
实施方案BZ是根据实施方案BY所述的试剂盒，其中所述靶多核苷酸与病原微生物相关联。
实施方案CA是根据实施方案BZ所述的试剂盒，其中所述病原微生物选自沙门氏菌属、梭菌属、蜡状芽孢杆菌、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、李斯特氏菌属、弧菌属和耶尔森氏菌属。
实施方案CB是根据实施方案AZ至CA中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含使用说明书。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明的目的和优点，但是在这些实施例中所述的具体材料和其量以及其它条件和细节不应被理解为不适当地限制本发明。除非另外指明，否则所有的份数和百分比均以重量计，所有的水为蒸馏水，并且所有的分子量为重均分子量。
实施例1-8：包含三价铁离子和各种量的氧化锆颗粒的组合物。
从西格玛化工有限公司(Sigma Chemical Co.)中得到氧化锆纳米颗粒分散体(10％w/w的水溶液；≤100nm平均粒径(BET)；表面积11m2/mL；部件号643025)。将各组分以表1中指定的顺序添加到去离子水中来制备测试组合物。如实施例1所述制备比较例1，不同之处在于，不向组合物中加入氧化锆颗粒和不加柠檬酸钾。实施例1-8和比较例1的各组合物包含200mg/L柠檬酸铁铵和320mg/L TRITON X-100。每个实施例和比较例1中使用的柠檬酸钾和氧化锆分散体的量示于表2中。
表1：实施例1-8与比较例1的测试组合物。也示出了组合物的各组分的添加顺序。
表2：添加到实施例1-8的各组合物中的柠檬酸铁铵、TRITON X-100、氧化锆颗粒分散体和附加的柠檬酸盐稳定剂的量。
包含三价铁离子的组合物中氧化锆颗粒表面积对从核酸扩增反应中去除抑制性物质的影响。
溶菌酶是已知抑制LAMP-BART核酸扩增和/或检测反应的蛋白质(酶)。
溶菌酶(部件号L3790)可购自密苏里州圣路易的西格玛化工有限公司(SigmaChemical Co.(St.Louis，MO))。用溶菌酶溶解于缓冲蛋白胨水中以2.5mg/mL的溶菌酶浓度制备样本。将20微升等分的溶菌酶溶液加入到海王星(2600.X)裂解管(加利福尼亚州圣地亚哥的Biotix公司(Biotix，Inc.San Diego，CA 92121))的580微升上述测试组合物(表2)中。
将含有溶菌酶和各测试组合物的混合物的每个管在100℃的加热块中加热15分钟，冷却至约40℃，然后将20μL等分的混合物加入含有通用基质对照LAMP-BART小球(部件号MDMC96NA，可得自明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN))的反应管。溶解小球后，将反应管置于MDS仪器(部件号MDS 100；可得自明尼苏达州圣保罗的3M公司(3MCompany,St.Paul,MN))中，并记录生物发光(即BART反应)75分钟。记录BART反应的至阳性的时间(TTP)，并且如表3所示(n＝3)。
表3：使用通用反应对照的LAMP-BART核酸扩增反应的平均至阳性的时间(TTP)。
表3中的数据表明，通过减少已知的溶菌酶的抑制作用，氧化锆颗粒的存在降低了TTP(即，检测到扩增的核酸所需的最小时间)。数据进一步表明颗粒的剂量依赖性效应，其中将颗粒的表观表面积增加多至约50m2/L导致较低的TTP。光强度依据直接与核酸扩增成比例的相对光单位(RLU)来测量。
实施例9-14：包含氧化锆颗粒和各种浓度的表面活性剂和三价铁离子的组合物。
以表4所示的组分和其添加到去离子水的各自顺序制备测试组合物。在这些实施例中，三价铁离子和非离子表面活性剂浓度根据表5而变化。氧化锆表面积保持恒定在20m2/L。如实施例1和比较例2-7所述制备样本(600μL)。在海王星(2600.X)裂解管中将等分试样(20μL)的溶菌酶溶液加入到580微升的测试组合物中。
表4：实施例9-14与比较例2-7的测试组合物。示出了组合物的各组分的添加顺序。
表5：加入实施例9-14和比较例2-7的各组合物中的柠檬酸铁铵、TRITON X-100和氧化锆颗粒分散体的量。
实施例15：包含氧化锆颗粒的组合物中的表面活性剂和三价铁离子浓度对从等温 核酸扩增反应中除去抑制性物质的影响。
将自然被弯曲杆菌菌株污染的鸡的生块和部分在Whirl-Pak均质袋(部件号：B01195WA)中以230rpm以富集比1g/9mL含有裂解马血的博尔顿肉汤均质2分钟。将该均质化样本在41.5℃下温育24小时。对于阳性样本，将20μL这些富集的样本加入到表5中所述的580uL裂解组合物中(使用海王星(2600.X)裂解管。)将每个管在100℃的恒温仪(heatblock)中加热15分钟，冷却至约40℃，然后将20μL等分的混合物加入到含有海藻糖稳定的冷冻干燥的弯曲杆菌LAMP-BART小球的反应管，所述小球含有表6所示的成分。
表6：用于用20微升裂解物混合物水合的弯曲杆菌LAMP-BART小球中使用的成分。
组分 量
乙酸钾 22.5nmol
硫酸镁 30nmol
二硫苏糖醇 150nmol
虫荧光素 1.5μg
腺苷-5’-O-磷酸硫酸盐(APS) 3.75μmol
Ultra-Glo荧光素酶 84ng
ATP硫酸化酶 5.6mU
d-NTP混合物 6μmol(每种dNTP)
Bst 2.0 DNA聚合酶 1.2U
弯曲杆菌LAMP正向引物(SEQ ID NO:1) 12fmol
弯曲杆菌LAMP后向引物(SEQ ID NO:2) 12fmol
环正向引物(SEQ ID NO:3) 6fmol
环后向引物(SEQ ID NO:4) 6fmol
位移正向引物(SEQ ID NO:5) 3fmol
位移后向引物(SEQ ID NO:6) 3fmol
(SEQ ID NO:1)-GGGCTTTTCAACGCCTATGCGAAGTGATCTATCCATGAGCAA
(SEQ ID NO:2)-TCGTGATAGCTGGTTCTCTCCGCCATTCAGTGCTCTACCCCCTTAT
(SEQ ID NO:3)-TCTTACACTAGCTTCAACT
(SEQ ID NO:4)-ATATTTAGGTATAGCGTTGTGTC
(SEQ ID NO:5)-GCTTAGTCAGATGCTGCAGAC
(SEQ ID NO:6)–GCCGCCTGACTGCTGTG
溶解小球后，将反应管置于如实施例1所述的MDS仪器中，并且记录生物发光(即，BART反应)75分钟。记录实施例9-14和比较例2-7的BART反应的至阳性的时间(TTP)，并且如表7所示(n＝3)。
实施例16：包含氧化锆颗粒的组合物中的表面活性剂和三价铁离子浓度对从热循环核酸扩增反应中除去抑制性物质的影响。
将实施例15中描述的每种混合物的5微升等分试样加入到qPCR主混合物中，所述主混合物由以下组成：PCR缓冲液，0.2mM dNTP's，3mM MgCl2，2.5U Taq DNA聚合酶，0.625μM正向引物[SEQ ID NO：7(CTGCTTAACACAAGTTGAGTAGG)],0.625μM反向引物[SEQ ID NO:8(TTCCTTAGGTACCGTCAGAA)],Brilliant III主混合物(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))和0.156μM弯曲杆菌探针[SEQ ID NO:9(FAM-TGTCATCCTCCACGCGGCGTTGCTGC-TAMRA)]。注意：在加入裂解混合物后，将上述各浓度报告为最终浓度。
使用以下方案进行热循环反应40个循环：(1)变性(95℃，30秒)，(2)退火(58℃，30秒)，和(3)延伸(72℃，60秒)。所有热循环反应都在Agilent Stratagene 3005P热循环仪中进行。实施例9-14和比较例2-7的Ct值提供于表7(n＝3)中。
表7：LAMP-BART弯曲杆菌扩增反应的平均至阳性时间(TTP)和热循环弯曲杆菌扩增反应的qPCR Ct值。
数据显示，相对于不含有三价铁离子或非离子表面活性剂的对照反应，向组合物中加入三价铁离子或非离子表面活性剂改进了扩增反应。此外，数据显示，通过LAMP-BART至阳性的时间结果和qPCR Ct值测量，锆颗粒、非离子表面活性剂和三价铁离子的组合显著改善了扩增反应。
使用氧化锆颗粒去除经过LAMP-BART核酸扩增程序的香料样本的抑制性物质。
制备了两种不同富集方案的五种不同的香料样本。在第一种方案中，将5克香料加入到旋转均质袋中的95mL缓冲的蛋白胨水中，并以230rpm均质化2分钟。在第二种方案中，将5克香料加入到旋转均质袋中的95ml缓冲蛋白胨水中，该缓冲蛋白胨水补充有50g/L浓度的脱脂奶粉，并在230rpm下均质化2分钟。将样本在37℃下温育24小时。在温育期后，将20μL每个样本加入到含有580uL实施例14中所述的裂解组合物的各个管中。将所得混合物在100℃(恒温仪)中加热15分钟，冷却至约40℃，然后将每个混合物的20μL等分试样加入到含有3M MDs基质对照小球(目录号MDMC96NA)的各个反应管中。对每个管进行LAMP-BART扩增，如实施例1-8所述。每种反应的TTP列于表8。
表8：
本公开一般来讲适用于研究和诊断。也就是说，本公开的组合物、方法和试剂盒可以用于鉴定各种核酸或表达的基因的目的，或者用于其它研究目的。同样，组合物、方法和试剂盒可用于诊断许多人类和动物的疾病或病症。此外，它们可用于鉴定患病的或以其他方式污染的食物产品(例如，感染了一种或多种病原生物体/微生物的食物)，或者样本中毒性物质或毒素生产生物体的存在。因此，组合物和方法具有人体健康和兽医应用，以及食品测试和国土安全应用。
本文引用的所有专利、专利申请和专利公开的全部公开内容以及可供使用的电子版材料均以引用方式并入。在本申请的公开内容和以引用方式并入本文的任何文献的一个或多个公开内容之间存在任何矛盾的情况下，应以本申请的公开内容为准。上述具体实施方式和实施例仅为清楚理解本发明而给出。这些具体实施方式和实施例不应被理解为不必要的限制。本发明不限于示出的和描述的具体细节，对本领域的技术人员而言显而易见的变型形式将包括在由权利要求书所限定的本发明范围内。
所有的标题是为了阅读者方便，而不应该用于限制该标题后面的正文的含义，除非如此规定。
本文例示性地描述的本发明可在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素的情况下进行适当地实践。因此，例如，在本文的每个实例中，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个可被替换为其它两个术语中的任一个。尽管将已采用的术语和表达用作描述而非限制术语，并且非旨在使用此类术语和表达而排出所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，但是已经认识到，在所要求保护的本发明的范围内的各种修改是可行的。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选的实施方案和任选的特征而具体公开，但是本领域的技术人员可推出本文所公开的概念的修改和变型，并且此类修改和变型被视为在由所附的权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (20)

1.一种用于消除核酸扩增反应中的样本抑制的水性组合物，所述水性组合物包含：
多个氧化锆颗粒；
非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂的浓度大于或等于0.005％(质量/体积)；和
有机铁螯合试剂；
其中所述组合物的pH为约8.45至8.85；
其中所述有机铁螯合试剂相对于三价铁的第一亲和常数大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中所述第一亲和常数和所述第二亲和常数在pH 8.45下在20℃去离子水中测定。
2.根据权利要求1所述的水性组合物，其中所述多个颗粒的平均粒度小于或等于100nm。
3.根据前述权利要求中任一项所述的水性组合物，其中所述有机铁螯合试剂包含多个羧酸根基团。
4.根据前述权利要求中任一项所述的水性组合物，所述水性组合物还包含三价铁。
5.根据前述权利要求中任一项所述的水性组合物，所述水性组合物还包含纳米颗粒分散稳定剂。
6.根据前述权利要求中任一项所述的水性组合物，其中所述非离子表面活性剂的亲水-亲脂平衡值为约11至约16。
7.根据前述权利要求中任一项所述的水性组合物，所述水性组合物还包含聚乙烯吡咯烷酮。
8.根据前述权利要求中任一项所述的水性组合物，所述水性组合物还包含指示剂染料。
9.一种核酸扩增方法，所述方法包括：
a)将包含多个氧化锆颗粒、非离子表面活性剂和乙二醇四乙酸(EGTA)的一价盐的组合物与目标样本接触以形成水性混合物，其中所述组合物的pH为约8.45至8.85；
b)使步骤a)的所述水性混合物经历热裂解过程；以及
c)在步骤b)后，使所述水性混合物的一部分经历核酸扩增过程。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤a)之前将所述样本在培养液中温育。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述组合物还包含缓冲剂、用于促进LAMP-BART核酸扩增反应的增强剂或用于促进qPCR反应的增强剂。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中使所述混合物经历热裂解包括将所述混合物加热至约100℃持续约15分钟。
13.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
多个氧化锆颗粒；
非离子表面活性剂；以及
有机铁螯合试剂；
其中所述有机铁螯合试剂相对于三价铁的第一亲和常数大于或等于104.2并且相对于镁的第二亲和常数小于103.8，其中所述第一亲和常数和所述第二亲和常数在pH 8.45下在20℃去离子水中测定。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述有机铁螯合试剂包含多个羧酸根基团。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的试剂盒，所述试剂盒还包含三价铁。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含纳米颗粒分散稳定剂。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的试剂盒，其中所述非离子表面活性剂的亲水-亲脂平衡值为约11至约16。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含聚乙烯吡咯烷酮。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含选自含氟表面活性剂、指示剂染料、防腐剂、缓冲剂、LAMP-BART反应或qPCR反应的增强剂以及前述组分中的任意两种或更多种的组合的组分。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的试剂盒，其中所述锆颗粒、所述三价铁、所述聚乙烯吡咯烷酮、所述非离子表面活性剂、所述含氟表面活性剂、所述指示剂染料、所述防腐剂、所述缓冲剂或所述增强剂中的任一者或多者置于水性溶液中，其中所述水性溶液的pH为约8.45至8.85。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107109402A (zh) * 2014-12-23 2017-08-29 3M创新有限公司 用于减少核酸扩增抑制的组合物
CN109161582A (zh) * 2018-08-14 2019-01-08 关明 一种用于环介导等温扩增的试剂及其试剂盒和应用
CN113420497A (zh) * 2021-06-01 2021-09-21 中国科学院南京地理与湖泊研究所 浑浊湖泊总磷浓度遥感估算方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072286B (zh) 2016-04-08 2023-08-11 3M创新有限公司 细胞裂解和核酸扩增的方法
JP2018007580A (ja) * 2016-07-11 2018-01-18 東ソー株式会社 非イオン性界面活性剤存在下の核酸の増幅方法
WO2020142255A1 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Abbott Molecular Inc. Improved amplification of nucleic acids
TW202246523A (zh) * 2021-01-15 2022-12-01 普渡研究基金會 用於病原目標之環介導恆溫擴增(lamp)分析
WO2023031691A1 (en) * 2021-09-01 2023-03-09 3M Innovative Properties Company Compositions and methods of detecting analytes

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0937780A1 (en) * 1998-01-21 1999-08-25 Becton, Dickinson and Company Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization
CN101321877A (zh) * 2005-10-03 2008-12-10 阿普里拉股份有限公司 用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒
KR20090084364A (ko) * 2008-02-01 2009-08-05 주식회사 인트론바이오테크놀로지 금속 이온에 의해 발생하는 ｐｃｒ 저해 및 비특이 증폭을완화시키거나 막을 수 있는 에틸렌글리콜테트라아세틱 산을킬레이트제로 포함하는 ｐｃｒ 반응용 조성물
WO2010004785A1 (ja) * 2008-07-09 2010-01-14 ベックマン・コールター社 全血試料の前処理方法及び核酸増幅方法
WO2014029791A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Qiagen Gmbh Method for isolating nucleic acids from a formaldehyde releaser stabilized sample

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0443959A (ja) * 1990-06-11 1992-02-13 Mitsubishi Petrochem Co Ltd 蛋白質の除去方法
CA2214495C (en) 1996-09-25 2002-02-05 Daniel L. Woodard Hydrated zirconium silicate composition for purification of nucleic acids
EP0897978A3 (en) 1997-08-22 2001-10-17 Becton, Dickinson and Company Zirconium oxide and related compounds for purification of nucleic acids
US7964380B2 (en) 2005-01-21 2011-06-21 Argylia Technologies Nanoparticles for manipulation of biopolymers and methods of thereof
US20090208919A1 (en) 2005-01-21 2009-08-20 Argylla Technologies, Llp Particle matrix for storage of biomolecules
US8288169B2 (en) 2005-01-21 2012-10-16 Argylla Technologies Surface mediated self-assembly of nanoparticles
JP5363766B2 (ja) * 2008-07-03 2013-12-11 東京エレクトロン株式会社 プラズマ処理装置システムの制御装置、プラズマ処理システムの制御方法および制御プログラムを記憶した記憶媒体
US9334531B2 (en) 2010-12-17 2016-05-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US20120003710A1 (en) 2010-02-19 2012-01-05 Barbara Dawn Leinweber Isolation of Biomolecules from Biological Samples
JP5899731B2 (ja) 2011-09-13 2016-04-06 ソニー株式会社 核酸精製方法、核酸抽出方法、及び核酸精製用キット

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0937780A1 (en) * 1998-01-21 1999-08-25 Becton, Dickinson and Company Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization
CN101321877A (zh) * 2005-10-03 2008-12-10 阿普里拉股份有限公司 用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒
KR20090084364A (ko) * 2008-02-01 2009-08-05 주식회사 인트론바이오테크놀로지 금속 이온에 의해 발생하는 ｐｃｒ 저해 및 비특이 증폭을완화시키거나 막을 수 있는 에틸렌글리콜테트라아세틱 산을킬레이트제로 포함하는 ｐｃｒ 반응용 조성물
WO2010004785A1 (ja) * 2008-07-09 2010-01-14 ベックマン・コールター社 全血試料の前処理方法及び核酸増幅方法
WO2014029791A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Qiagen Gmbh Method for isolating nucleic acids from a formaldehyde releaser stabilized sample

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107109402A (zh) * 2014-12-23 2017-08-29 3M创新有限公司 用于减少核酸扩增抑制的组合物
CN107109402B (zh) * 2014-12-23 2020-09-25 3M创新有限公司 用于减少核酸扩增抑制的组合物
CN109161582A (zh) * 2018-08-14 2019-01-08 关明 一种用于环介导等温扩增的试剂及其试剂盒和应用
CN113420497A (zh) * 2021-06-01 2021-09-21 中国科学院南京地理与湖泊研究所 浑浊湖泊总磷浓度遥感估算方法
CN113420497B (zh) * 2021-06-01 2024-04-19 中国科学院南京地理与湖泊研究所 浑浊湖泊总磷浓度遥感估算方法

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