JP2018007580A - 非イオン性界面活性剤存在下の核酸の増幅方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料中に含まれる標的核酸を、簡便かつ効率よく増幅する方法を提供する。【解決手段】非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル又はソルビタンエステルｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル）の共存下、等温増幅反応によりインフルエンザウイルス等の核酸を増幅させる。【選択図】 なし

Description

本発明は、非イオン性界面活性剤存在下の核酸の増幅方法に関する。

試料中に含まれる標的核酸の有無または量に基づき診断を行なう遺伝子診断では、前記標的核酸の量が極めて少なく、そのままでは充分な検出感度が得られないことから、多くの場合、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）といった核酸増幅方法を用いて前記標的核酸を増幅させてから行なう。しかしながら、検出時間の短縮が望まれており、簡便な操作で、より効率よく核酸を増幅する方法が求められていた。

特許第２６５０１５９号公報 特許第３１５２９２７号公報 特許第３２４１７１７号公報 特開２０００−０１４４００号公報

Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）

本発明の目的は、試料中に含まれる標的核酸を、簡便に、より効率よく増幅させる方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、非イオン性界面活性剤を共存させることで、操作の簡易性はそのままで、より効率よく増幅が可能になることを見出した。

すなわち本発明は以下の態様を包含する：
（１）非イオン性界面活性剤の共存下、等温増幅反応により核酸を増幅させることを特徴とする、核酸の増幅方法。
（２）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン骨格を有するものである、（１）に記載の方法。
（３）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル又はソルビタンエステルｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）核酸がインフルエンザウイルスの核酸である、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明において非イオン性界面活性剤とは特に限定はなく、例えばポリオキシエチレン骨格を有するものが好ましく、またポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルもしくはソルビタンエステルｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル類が好ましい。例えば、Ｓｐａｎ ２０（商品名）、ＭＥＧＡ−８（商品名）、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ＣＡ−６３０（商品名）、Ｂｒｉｊ３５（商品名）、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、Ｓａｐｏｎｉｎ、Ｓａｐｎ８０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ４０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ６０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ８０（商品名）等があげられる。

また本発明では非イオン性界面活性剤はＨＬＢ１０以上であることが好ましく、さらに好ましくはＨＬＢ１４以上である。非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、かつＨＬＢが１４以上であるものが特に好ましい。特にＴｗｅｅｎ ２０（商品名）が好ましい。

共存させる非イオン性界面活性剤の濃度は特に限定はないが、好ましくは０．５％以下、更に好ましくは０．１％以下、とりわけ好ましくは０．０５％以下である。非イオン性界面活性剤濃度の下限は特に限定はないが、好ましくは０．０３％である。本発明においては、非イオン性界面活性剤の濃度は０．０３％以上、０．０５％以下であることが特に好ましい。なお濃度はｗ／ｖ％である。

本発明において増幅させる核酸とは、細胞、細菌、真菌、ウイルスなどに由来した核酸が例示でき、天然の核酸でも非天然の核酸でも良く、中でもインフルエンザウイルスの核酸が好ましい。それらの核酸のうち、少なくとも１種類のＤＮＡまたはＲＮＡのうち、増幅されうる領域を言う。増幅されうる領域は一本鎖もしくは二本鎖であって良く、その相補鎖も標的核酸に含まれる。

本発明に用いられる核酸の等温増幅反応は、温度の昇降を行う比較的複雑な装置が不要である。このような核酸増幅法として、核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモーター配列を付加している方法（例えば、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法）が例示される。当該方法は一本鎖ＲＮＡを標的として核酸増幅する方法であるが、特開２０１５−１１６３６号公報等に開示される方法を用いることで、二本鎖ＤＮＡ等を増幅することもできる。

本発明の方法により、特別な操作を必要とせず、簡便かつ効率よく核酸を増幅することができる。

以下、インフルエンザウイルスＲＮＡを標的核酸とした場合の実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。

実施例１ 標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したインフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）は下記に示す方法で調製した。
（１）配列番号１（Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目まで）、配列番号２（Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００７３６９の４５５番目から９７５番目まで（ただし６６３番目のＣはＴ））および配列番号３（Ｂ型インフルエンザウイルス、セグメント７、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の２０６番目から７３５番目まで）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。

（２）（１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡの５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（３）（２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。

なお、本実施例で調製した標準ＲＮＡの全長は約５００塩基と、インフルエンザウイルスＲＮＡの全長（セグメント５：約１５００塩基、セグメント７：約１１００塩基）の一部であるが、インフルエンザウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。

実施例２ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号４に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７２４番目から７４６番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間、および配列番号５に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６３番目から４８３番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から８番目のＡと９番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してチアゾールオレンジもしくはＢＯを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を調製した。その構造式を化１に示す。

式中、Ｂ^１、Ｂ^２、Ｂ^３、Ｂ^４は塩基を示す。なお、３’末端側−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端側−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。

実施例３ 非イオン性界面活性剤を添加した核酸増幅反応
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加する非イオン性界面活性剤の効果を検討した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号１に相当するもの）、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号２に相当するもの）またはＢ型インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号３に相当するもの）を、注射用水を用いて１０^４コピー／５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した。
反応液の組成：濃度は抽出液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
表３に記載の濃度のＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表３に記載の濃度の第一のプライマー
表３に記載の濃度の第二のプライマー。

（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成からなる抽出液１５μＬを添加した。抽出液には、あらかじめ前記ＲＮＡ試料０．５μＬを添加した。
抽出液の組成：濃度は抽出液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ 塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．５％ ＤＭＳＯ
表４に記載の各種濃度のＴｗｅｅｎ２０。

（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。抽出液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし検出時間とした。

結果を表４に示す。界面活性剤が高濃度では検出時間は遅くなるが、低濃度であれば早くなっていることがわかる。

Claims (4)

1. 非イオン性界面活性剤の共存下、等温増幅反応により核酸を増幅させることを特徴とする、核酸の増幅方法。
2. 非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン骨格を有するものである、請求項１に記載の方法。
3. 非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル又はソルビタンエステルｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 核酸がインフルエンザウイルスの核酸である、請求項１〜３いずれかに記載の方法。