JP5899731B2 - 核酸精製方法、核酸抽出方法、及び核酸精製用キット - Google Patents
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Description
また、上記陽イオン交換樹脂には、第1の陽イオン交換樹脂と、当該第1の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第2の陽イオン交換樹脂とを用いることが好ましい。ここで、排除限界分子量とは、イオン交換樹脂に吸着させようとした種々の化合物において、イオン交換樹脂の細孔内に侵入しづらくなる化合物、すなわちイオン交換樹脂の細孔内に吸着されづらくなる化合物のうち、最も低い分子量をもつものの分子量をいう。換言すれば、当該排除限界分子量より高い分子量を有する化合物については、イオン交換樹脂に吸着されづらくなる。
上記陽イオン交換樹脂のうち、より排除限界分子量が高い上記第1の陽イオン交換樹脂が、上記タンパク質を選択的に吸着しやすくなる。また、上記陽イオン交換樹脂のうち、より排除限界分子量が低い上記第2の陽イオン交換樹脂が、主に金属塩等のカチオンを選択的に吸着しやすくなる。
また、上記第1の陽イオン交換樹脂により上記物質を吸着してから、上記陰イオン交換樹脂と第2の陽イオン交換樹脂とにより上記物質を吸着することが好ましい。この場合、例えば、上層に上記第1の陽イオン交換樹脂を有し、下層に上記陰イオン交換樹脂と上記第2の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの上記上層側から上記サンプルを流入してもよい。このように、サンプル中の物質について、まず第1の陽イオン交換樹脂によりサンプル中のタンパク質を主に選択的に吸着し、次いで第2の陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂によりサンプル中の金属塩を主に選択的に吸着することで、よりサンプル中の物質の吸着効率は向上する。
また、上記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であってもよく、上記緩衝液のpHは4.0〜8.0であることが好ましい。
また、上記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂であることが好ましい。また、上記第1の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Na+(ナトリウムイオン)であることが好ましい。また、上記第2の陽イオン交換樹脂の対イオンは、H+(プロトン)であることが好ましい。
また、上記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂であることが好ましい。また、上記陰イオン交換樹脂の対イオンは、OH−(水酸化物イオン)であることが好ましい。
また、上記第2の陽イオン交換樹脂に対する上記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、50%〜150%であることが好ましい。ここで、イオン交換容量とは、イオン交換樹脂の単位量当たりの交換基の総数のことを指す。例えば、第2の陽イオン交換樹脂の対イオンがH+である場合、イオン交換容量とは、第2の陽イオン交換樹脂1ml中に含まれるH+の総数のことを指す。上記第2の陽イオン交換樹脂に対する上記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合が、50%〜150%であることで、イオン交換樹脂によるサンプルに含まれる物質の吸着をする前とその後のpHの変動をより安定に抑制することが可能になる。
また、上記核酸精製方法では、サンプルに非イオン性界面活性剤及び/又は非イオン性親水性高分子化合物を添加して上記物質を吸着することがより好ましい。サンプルに非イオン性界面活性剤及び/又は非イオン性親水性高分子化合物を添加することで、核酸の樹脂に対する物理的な吸着を抑制することが可能になる。
上記物質は、例えば、夾雑物である。当該夾雑物は、例えば、タンパク質と金属塩とを含有する。また、夾雑物は、タンパク質や金属塩の他にサンプル中の核酸の分析において不要な、種々のペプチド、糖、塩、低分子アニオン(例えば、フマル酸、フタル酸、フミン酸、フルボ酸)等の物質を含有していてもよい。
上記電気泳動は、アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について行われてもよい。また、上記電気泳動は、上記サンプルと、上記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、上記脱水縮合反応の縮合剤と、を混合して、上記核酸について行われてもよい。
1.本技術の第1実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
(1)核酸精製用キット
(2)核酸精製方法
2.本技術の第2実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
3.核酸抽出方法
(1)核酸精製用キット
まず、本技術の第1実施形態に係る核酸精製方法に用いる核酸精製用キットについて、図1(A)を参照しながら説明する。図1(A)〜(C)は、本技術の第1実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
次に、本技術の第1実施形態に係る核酸精製方法の手順について、図1(A)〜(C)を参照しながら説明する。
図4(A)〜(C)は、本技術の第2実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
次に、本技術の各実施形態に係る核酸精製方法を含む核酸抽出方法について説明する。本技術に係る核酸抽出方法は、核酸増幅反応を行うための前処理として、核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行うものである。
(1)核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂により吸着する手順を含み、前記イオン交換樹脂には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法。
(2)前記陽イオン交換樹脂には、第1の陽イオン交換樹脂と、当該第1の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が小さな第2の陽イオン交換樹脂とを用いる、前記(1)記載の核酸精製方法。
(3)前記第1の陽イオン交換樹脂により前記物質を吸着してから、前記陰イオン交換樹脂と第2の陽イオン交換樹脂とにより前記物質を吸着する、前記(2)記載の核酸精製方法。
(4)上層に前記第1の陽イオン交換樹脂を有し、下層に前記陰イオン交換樹脂と前記第2の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの前記上層側から前記サンプルを流入する、前記(2)又は(3)に記載の核酸精製方法。
(5)前記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であり、前記緩衝液のpHは4.0〜8.0である、前記(1)〜(4)のいずれか1つに記載の核酸精製方法。
(6)前記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂である、前記(1)〜(5)のいずれか1つに記載の核酸精製方法。
(7)前記第1の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Na+である、前記(2)〜(6)のいずれか1つに記載の核酸抽出方法。
(8)前記第2の陽イオン交換樹脂の対イオンは、H+である、前記(2)〜(7)のいずれか1つに記載の核酸抽出方法。
(9)前記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂である、前記(1)〜(8)のいずれか1つに記載の核酸精製方法。
(10)前記陰イオン交換樹脂の対イオンは、OH−である、前記(1)〜(9)のいずれか1つに記載の核酸精製方法。
(11)前記第2の陽イオン交換樹脂に対する前記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、50%〜150%である、前記(2)〜(10)のいずれか1つに記載の核酸精製方法。
(12)非イオン性界面活性剤及び/又は非イオン性親水性高分子化合物を用いて前記物質を吸着する、前記(1)〜(11)のいずれか1つに記載の核酸精製方法。
(13)前記物質は、少なくともタンパク質と金属塩とを含有する夾雑物である、前記(1)〜(12)のいずれか1つに記載の核酸精製方法。
(14)核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行う核酸抽出方法。
(15)アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について前記電気泳動を行う、前記(14)記載の核酸抽出方法。
(16)前記サンプルと、前記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、該脱水縮合反応の縮合剤と、を混合し、前記核酸について前記電気泳動を行う、前記(14)又は(15)に記載の核酸抽出方法。
(17)陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂と、前記陽イオン交換樹脂及び前記陰イオン交換樹脂を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具と、を含む核酸精製用キット。
<試験例1>
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm, Millipore製)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型(Bio Rad社製))を100mg計量して入れた。次いで、50mM MESバッファー(pH5)((株)同仁化学研究所製)を調製し、BSA (和光純薬工業(株)製)を0.5質量%となるように加え、さらにCy3修飾した20merオリゴDNA (Sigma Aldrich Co. 製)を5μMとなるように加えた。このタンパク質と核酸の混合液を、常温にて十分に攪拌させた後、強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。スピンダウンした液をNanoDrop D-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc. 製)にて吸光度測定し、強酸性陽イオン交換樹脂処理前後の吸光度の違いから、核酸精製能を評価した。BSAの吸光度はProtein A280モードで評価し、核酸の吸光度はmicro arrayモードでCy3の吸光度で評価した。さらに、生体環境下に近づけるため、上記タンパク質−核酸混合溶液に最終濃度が0.09質量%となるようにNaCl (和光純薬工業(株)製)を添加し、同様に強酸性イオン交換樹脂処理をおこなった。
<試験例2>
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型(Bio Rad社製)) を100mg計量して入れた。また、スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に上記陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型)を1M HCl溶液に通し、中性になるまで純水で洗浄することで調製した陽イオン交換樹脂(NuviaS H+型)を100mg計量して入れた。次いで、50mM MESバッファー(pH5)を調製し、BSAを0.5質量%となるように加え、Cy3修飾した20merオリゴDNAを4μMとなるように加え、さらにNaClを0.09質量%となるように加えた。このサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、Na+型又はH+型である強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに夫々200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。夫々の強酸性陽イオン交換樹脂による核酸精製能については、試験例1と同様にして評価した。Na+の濃度についてはHoriba Cardy Sodium Compact Ion Meter (C-122) ((株)堀場製作所製)により測定した。また、pHについては、ポケットpH計S2K712 (ISFETCOM(株)製)により測定した。評価結果を図7に示す。また、評価結果をまとめたものを表1に示す。
<試験例3>
本試験例では、陽イオン交換樹脂によりサンプル中の夾雑物を吸着する際におけるサンプル中の塩濃度の影響について検討した。
以下、実施例1〜3、及び比較例1、2でイオン交換樹脂種による脱塩に対する影響について検討した。
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを計量して入れた。吸着処理前のNa+の濃度は、0.45mg/mLであり、pHは4.9であった。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、ウシ全血を1/10倍に希釈するように加え、サンプルを調製した。このサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、上記イオン交換樹脂封入スピンカラムに200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。その後、サンプル中のNa+の濃度及びpHを測定した。
実施例1と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを用いた以外は、実施例1と同様にして評価した。
実施例2と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):70mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを用いた以外は、実施例2と同様にして評価した。
実施例1と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mgのみを用いた以外は、実施例1と同様にして評価した。
実施例1と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mgのみを用いた以外は、実施例1と同様にして評価した。
以下、実施例4、5、及び比較例3〜5で脱塩処理によるLAMP反応及びRT-LAMP反応に対する影響について検討した。
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にNaClを0.9mg/mLとなるように加えた。得られたサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、Na+型又はH+型である強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに夫々200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。LAMP反応及びRT−LAMP反応については、試験例1と同様の方法にして行った。
実施例4と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを用いた以外は、実施例4と同様にして評価した。
実施例4と比し、サンプルとしてNaClを添加していないものを用い、サンプルをイオン交換樹脂封入スピンカラムに滴下していないという点以外は、実施例4と同様にして評価した。
実施例4と比し、サンプルをイオン交換樹脂封入スピンカラムに滴下していないという点以外は、実施例4と同様にして評価した。
実施例4と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mgを用いた以外は、実施例4と同様にして評価した。
以下、実施例6及び実施例7で添加剤(Brij35及びEDTA)の影響について検討した。
<実施例6>
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)となるように調製し、ウシ全血を10体積%となるように加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にBrij35を0.5体積%となるように加え、EDTAを1mMとなるように加えた。得られた核酸を含有するサンプルについて、実施例4と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
実施例6に比し、Brij35及びEDTAをサンプルに添加していないという点以外は、実施例6と同様にして評価を行った。
以下、実施例8〜11で、界面活性剤/親水性高分子の影響について検討した。
<実施例8>
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)(Bio Rad社製)):100mg、強酸性陽イオン交換樹脂(AG1-X8 (H+型)(Bio Rad社製)):50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂(AG50W-X8 (OH-型) (Bio Rad社製)):50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)となるように調製し、ウシ全血を10体積%となるように加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にBrij35を0.5体積%となるように加えた。実施例7では、サンプルに非イオン界面活性剤又は非イオン性親水性高分子を加えなかった。得られた核酸を含有するサンプルについて、試験例1と同様に、核酸回収率を評価した。
実施例8に比し、イオン交換樹脂による吸着処理の前のサンプルに非イオン性界面活性剤としてBrij35を0.5体積%となるように添加したという点以外は、実施例8と同様にして評価を行った。
実施例9に比し、非イオン性界面活性剤として、Brij35の代わりに、Tween20を用いたという点以外は、実施例9と同様にして評価を行った。
実施例9に比し、Brij35の代わりに、非イオン性親水性高分子であるPEG20000を用いたという点以外は、実施例9と同様にして評価を行った。
以下、実施例12及び比較例6で本技術に係る吸着処理とゼオライトによる吸着処理との比較実験を行った。
<実施例12>
実施例7で用いたサンプルと同様にして調製したサンプルを準備した。同様の組成の3サンプル夫々について3回ずつ、実施例7と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、ウシ全血を5体積%加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、サンプルを調製した。次いで、サンプルを熱アルカリ処理し、ゼオライトで夾雑物の吸着処理を行った。得られた同様の組成の3サンプル夫々について3回ずつ、実施例4と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
Claims (15)
- 核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂により吸着する手順を含み、
前記イオン交換樹脂には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用い、
前記陽イオン交換樹脂には、第1の陽イオン交換樹脂と、当該第1の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第2の陽イオン交換樹脂とを用い、
前記第2の陽イオン交換樹脂に対する前記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、50%〜150%である、核酸精製方法。 - 前記第1の陽イオン交換樹脂により前記物質を吸着してから、前記陰イオン交換樹脂と第2の陽イオン交換樹脂とにより前記物質を吸着する、請求項1記載の核酸精製方法。
- 上層に前記第1の陽イオン交換樹脂を有し、下層に前記陰イオン交換樹脂と前記第2の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの前記上層側から前記サンプルを流入する、請求項1又は2記載の核酸精製方法。
- 前記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であり、
前記緩衝液のpHは4.0〜8.0である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸精製方法。 - 前記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸精製方法。
- 前記第1の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Na+である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸精製方法。
- 前記第2の陽イオン交換樹脂の対イオンは、H+である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸精製方法。
- 前記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸精製方法。
- 前記陰イオン交換樹脂の対イオンは、OH−である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸精製方法。
- 非イオン性界面活性剤及び/又は非イオン性親水性高分子化合物を前記サンプルに混合して前記物質を吸着する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸精製方法。
- 前記物質は、少なくともタンパク質と金属塩とを含有する夾雑物である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸精製方法。
- 核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、
第1の陽イオン交換樹脂と第2の陽イオン交換樹脂とからなる陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び
電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順
を行い、
前記第2の陽イオン交換樹脂に対する前記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、50%〜150%である、核酸抽出方法。 - アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について前記電気泳動を行う、請求項12記載の核酸抽出方法。
- 前記サンプルと、前記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、該脱水縮合反応の縮合剤と、を混合し、前記核酸について前記電気泳動を行う、請求項13記載の核酸抽出方法。
- 陽イオン交換樹脂と、
陰イオン交換樹脂と、
前記陽イオン交換樹脂及び前記陰イオン交換樹脂を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具と、を含み、
前記陽イオン交換樹脂は、第1の陽イオン交換樹脂と、当該第1の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第2の陽イオン交換樹脂とを備え、
前記第2の陽イオン交換樹脂に対する前記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、50%〜150%である、核酸精製用キット。
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