CN102753705A - 分离核酸物质的方法和材料 - Google Patents

Abstract

核酸物质可通过首先使流体与结合核酸物质的带正电荷的聚合物接触被有效地从流体分离。此后，具有结合于其的核酸物质的聚合物与包括碱性材料和二醇的溶液的释放剂接触。该溶液具有不超过12的pH，并起到在相对低温的条件下从聚合物释放核酸物质的作用，该温度通常不超过50℃，并且在具体例子中，不超过40℃。二醇材料可包括单体二醇，诸如乙二醇、丙二醇或类似物，或其可包括聚合的二醇，诸如聚乙二醇。也公开了可用于分离方法中的新型带正电荷的聚合物。该聚合物包括酸化多胺，诸如已经在偶联反应中与非酸化聚乙烯亚胺反应的聚乙烯亚胺。酸化聚乙烯亚胺可为羧化和/或磺化聚乙烯亚胺。

Description

分离核酸物质的方法和材料

相关申请的交叉引用

本申请请求于2009年12月14日提交的，题目为“Method andMaterials for Separating Nucleic Acid Materials(分离核酸物质的方法和材料)”的美国临时专利申请序列号61/286,082的优先权，其公开在此通过引用并入。

技术领域

本发明涉及从多种样品材料诸如全血、血清、血浆、固体组织、体液、组织、头发、指甲材料、口腔细胞、培养细胞、阴道拭子、细菌、真菌和植物组织中分离核酸物质。更具体地，本发明涉及允许在温和的温度和pH条件下有效和迅速分离核酸物质的方法和材料。

背景技术

经常需要从各种生物样品和其他流体诸如细胞溶解液、合成反应混合物、PCR反应混合物等等中分离合成和天然存在的核酸物质诸如DNA、RNA、寡核苷酸等等。这种分离可为各种分析过程、合成过程和研究活动中非常重要的步骤。任何这样的方法都应为可靠的、有效的、容易实施的并且不破坏核酸物质。

在很多例子中，带正电荷的聚合物诸如基于聚赖氨酸和聚乙烯亚胺的材料已经用于基因传递和多种核酸纯化方法，因为这些类型的分子可有效捕获和保留带负电荷的核酸物质。在这样的方法中，带电荷的聚合物通常被固定在固体表面上，诸如磁性颗粒、聚苯乙烯颗粒或类似物。通常在小于8的pH下，带电荷的聚合物随后与包含核酸物质的样品接触。这使核酸物质结合至带正电荷的聚合物。杂质诸如蛋白质和碳水化合物不结合并能从样品上洗掉。在高pH条件下，所结合的核酸物质随后从聚合物释放，以便实现纯化。然而，在很多例子中，核酸物质非常强地结合至聚合物，由此要求使用高pH和高温度条件，以便从聚合物释放所结合的核酸。然而，核酸物质可通过这样的高温度和碱性反应条件被永久变性。因此，需要允许在相对温和的pH和温度条件下分离和纯化核酸物质的方法和材料。如将在下文中详细解释的，本发明允许在室温和在温和的碱性条件下结合、分离和释放核酸物质。本发明的这些和其他优点根据随后的讨论和描述将是显而易见的。

发明内容

所公开的是从生物样品或其他流体混合物分离核酸物质的方法。根据该方法，其中具有核酸物质的样品在包括完整细胞的例子中首先用裂解缓冲剂进行裂解以释放核酸物质；在不包括完整细胞的样品中，该步骤可被省略。随后，流体与带正电荷的聚合物诸如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺或其他单独或结合使用的这样的多胺接触。未结合的杂质用清洗缓冲剂清洗掉。带正电荷的聚合物结合核酸物质于其；并且在本发明的第二步骤中，具有结合于其的核酸物质的聚合物与包括碱性材料和二醇的溶液的释放剂接触。溶液具有不超过12的pH，并且溶液有效地使核酸物质从聚合物释放。释放溶液可进一步包括缓冲剂，并且在具体的例子中，溶液具有不超过11的pH。碱性材料可包括I族金属氢氧化物，诸如氢氧化钠或氢氧化钾，并且在一些例子中，碱性材料的浓度可不超过50mM。

在一些例子中，二醇为聚合的二醇，诸如聚乙二醇，并且可具有200-2000范围内的分子量。在具体的例子中，将聚合物与释放剂接触的步骤在不超过40℃的温度下进行。

在一些例子中，带正电荷的聚合物为羧化多胺。带正电荷的聚合物可包括所有或部分配置为珠粒、片材、载玻片、管、移液管、拭子、磁性颗粒等等的基体。本发明的方法可在自动系统中或在手动基础上实施。

进一步公开的是制备部分带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物的方法。根据该方法，聚乙烯亚胺聚合物与酸化试剂诸如羧化试剂或磺化试剂反应，以便产生酸化聚乙烯亚胺，并且酸化聚乙烯亚胺随后与第二体积的聚乙烯亚胺反应，以便将至少一些酸化聚乙烯亚胺结合至第二体积的聚乙烯亚胺。在具体的例子中，酸化试剂为羧化试剂，其可为氯醋酸钠。

进一步公开的是实施本发明的方法的系统以及实施本发明方法的部件的试剂盒。

发明详述

根据本发明，已经被结合至分离反应剂诸如带正电荷的聚合物的核酸物质通过将它们与包括碱性材料和二醇(glycol)的释放反应剂接触从那里释放。释放溶液具有不超过12的，并且在一些例子中不超过11的pH。该溶液在相对低的温度诸如不超过50℃的温度下有效释放核酸物质。在具体的例子中，核酸物质的释放在室温下发生，室温通常理解为不超过40℃的温度。通常，释放在10分钟内完成，并且在具体的例子中不超过5分钟。这些温和的条件避免对核酸物质的损害，或将对核酸物质的损害极大地最小化。

在具体的例子中，释放剂中的碱性材料为I族金属氢氧化物诸如氢氧化钠、氢氧化钾或类似物。二醇材料可包括乙二醇；然而，在一些具体的例子中，已经发现聚合的二醇材料诸如聚乙二醇聚合物在本发明的实践中非常有效。在具体的例子中，碱性材料的浓度小于50mM，并且基于重量，二醇成分的浓度处于1-40%的范围内。在具体的例子中，聚乙二醇聚合物的分子量可在从200至2000的范围内。

在本发明的实践中具有实用性的一种具体的反应剂包括大约8mM的氢氧化钠水性溶液，其包含以重量计大约30%的聚乙二醇(PEG600)。其他类似的组合物对本领域技术人员将是显而易见的。已经发现该类型组合物通常具有不超过12的pH，并且通常不超过11的pH，并且已经显示这些组合物在4或5分钟内，在不超过50℃并且通常不超过40℃(室温)的温度下从带正电荷的聚合物诸如羧化聚乙烯亚胺(PEI)有效释放核酸物质。这些温和的pH和温度条件将对核酸物质的损害最小化。应当理解释放反应剂可进一步包括成分，诸如起维持适当pH水平作用的缓冲剂、表面活性剂、以及辅助成分诸如粘度控制试剂等等。

用于本发明的带正电荷的聚合物可包括块状聚合的材料，或它们可包括在基底诸如珠粒、颗粒、带状材料、载玻片、管或移液管上的涂层。基底也可包括吸水材料诸如拭子、海绵或类似物。在一些例子中，带正电荷的聚合的材料可通过衍生、移植或另外地改性块聚合体而制备。在一些情况下，带正电荷的聚合物被包被在磁性颗粒或磁性敏感颗粒上，以便于通过磁性方法收集颗粒。

进行了一系列说明本发明原理的实验。在第一个实验中，DNA样品被吸附至PEI改性的磁性颗粒上，该类型的颗粒在本领域中已知用于分离核酸物质。在这点上，PEI改性的磁性颗粒首先与200ng经纯化的小鼠基因组DNA样品在30微升的缓冲剂溶液中温育，该缓冲剂溶液包括具有pH 7.5的50mM Tris-HCl并进一步包含1%的TritonX-100。温育在室温下进行2分钟。一系列包含样品的管被放置在磁分离器中，并且上清液用移液管仔细清除，留下颗粒。结合的DNA从颗粒释放。在第一个例子中，利用包括10微升20mM NaOH的现有技术反应剂溶液进行释放。在第二个例子中，根据本发明，释放反应剂包括8mM NaOH和30%PEG 600的混合物。在任一个例子中，温育在室温下进行4分钟。所得溶液用10微升100mM Tris-HCl pH 8.0中和。每个样品的一部分随后经琼脂糖凝胶电泳进行分析。电泳分析说明本发明的8mM NaOH/PEG溶液在室温条件下从PEI聚合物有效释放DNA，而现有技术高pH溶液不能。

在第二个实验系列中，冷冻的人外周血首先在75微升裂解缓冲剂中裂解，该裂解缓冲剂由50mM Tris-HCl pH 7.5缓冲剂组成，该缓冲剂包含100mM KC1、1% Triton X-100和0.5% SDS。裂解在室温下进行2分钟。PEI改性的磁性颗粒(10微升，1.6%v/v)加入溶胞产物中，以结合释放的DNA。结合的DNA通过将管放入磁分离器2分钟来收集。上清液中的细胞碎片被清除，并且具有结合于其的DNA的磁性颗粒在60℃下与200微升包含20mM Tris-HCl pH 8.0、0.5%SDS和200微克蛋白酶K的清洗缓冲剂温育10分钟。磁性颗粒随后用相同的不包括蛋白酶K的缓冲剂溶液进行清洗。在此之后，颗粒用200微升包含10mM Tris pH 8.0的溶液进行清洗。DNA随后在室温下，在16微升包含8mM NaOH和30%PEG 600的本发明的释放溶液中释放4分钟。释放的DNA随后用4微升100mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲剂中和。利用包括现有技术不含二醇的20mM NaOH溶液的释放剂进行比较。如在实验1中，所得物质通过凝胶电泳进行分析，并且该实验证明本发明的溶液在释放结合的DNA中是非常有效的，而现有技术溶液不是。

进行进一步的实验系列，证明本发明的组合物对于释放结合的RNA的有效性。在该实验中，大约4×10⁶个293细胞通过离心分离快速从10厘米组织培养皿收获。丢弃上清液液体，并且细胞沉淀在使用前被保存在-80℃。为了分离RNA，400微升的裂解缓冲剂(25mM柠檬酸钠、4M异硫氰酸胍、5mM EDTA、2%TX-100)加入冷冻的细胞沉淀。在混合后，20微升的PEI磁性珠粒加入裂解缓冲剂并混合。包含该混合物的样品管被放置在磁架上，以便形成磁性珠粒的沉淀。丢弃上清液液体，并且珠粒用400微升的清洗缓冲剂(2mM柠檬酸钠，pH 6.0)清洗一次，并且随后在37℃下与100微升的DNase I溶液(40mMTris pH 7.5、8mM MgCl₂、5mM DTT和50个单位的DNase I)温育15分钟。随后，在DNase I处理后，珠粒用清洗缓冲剂清洗两次。结合的RNA随后用60微升的包括0.1M Bis-Tris pH 9.5和30%PEG 600的释放缓冲剂从珠粒释放。10微升的释放的RNA利用从Takara Bio Inc获得的M-MLV逆转录酶用于cDNA合成。来自50微升反应物的2微升合成的cDNA利用人类β-肌动蛋白cDNA的引物用于PCR。如此制备的cDNA通过凝胶电泳与对照样品比较进行分析。该分析证实了本发明的释放剂在从磁性颗粒释放RNA中是非常有效的。

在第四个实验中，根据本发明的另一方面制备新型带正电荷的PEI材料。在该方法的第一步骤中，氯醋酸钠羧化试剂用于羧化PEI材料(MW 200,000)的样品。该方法通过由Miroslav Macka et al.“Newisoelectric buffers for capillary electrophoresis:N-carboxymethylatedpolyethyleneimine as a macromolecular isoelectric buffer,”Analyst,2001,126,421-425描述的方法进行。此后，100mg如此制备的羧化PEI溶解在1微升乙醇中，并且在10-50微升范围内各种体积的羧化PEI加入50mM包含碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的MES缓冲剂-pH 6.1-中100微升PEI磁性颗粒。如此制备的磁性颗粒在室温下振荡2小时。此后，样品被放置在磁分离器中，并且任何未结合的羧化PEI被清除。如此产生的磁性颗粒用50mM MES清洗两次，并被保存在100微升50mM MES加0.1%Triton X-100中。应当理解到该方法可用于制备其他类型的带正电荷的(酸化的)聚合物。例如，PEI能与磺化反应剂反应，以便产生磺化PEI，其随后与一定量的未磺化PEI结合。

在随后的实验中，如此制备的羧化PEI磁性颗粒用于捕获DNA。在这点上，在大体类似于参考实施例1描述的方法中，用200-500纳克经纯化的小鼠基因组DNA测试各种羧化PEI磁性颗粒的结合能力。在这点上，在室温条件下，在将DNA与羧化PEI磁性颗粒在30微升包含50mM的Tris-HCl pH 7.5和1% Triton X-100的缓冲剂中温育后2分钟，收集上清液。结合的DNA在室温条件利用根据本发明的包括8mM NaOH和30% PEG 600的反应剂进行释放。结合和未结合DNA在0.8%琼脂糖凝胶上利用溴化乙锭染色可视化。发现羧化PEI磁性颗粒材料在上清液中没有留下DNA，证明该新型羧化材料作为分离核酸物质的带正电荷的聚合物的有效性。

在随后的实验中，评价各种释放溶液从本发明的羧化PEI材料和从现有技术的非羧化PEI释放DNA的它们的效力。发现如果聚合物不被羧化，则释放在某种程度上更难。具体地，对于非羧化PEI聚合物，发现需要氢氧化钠和PEG 600(pH 11-12)的组合物提供结合DNA的大于90%的回收率，而更温和的(较低pH)释放剂，诸如100mM Bis-TrispH 9.0溶液，不是同样有效。在那些使用羧化PEI聚合物的例子中，发现包括100mM Bis-Tris pH 9.0溶液的释放剂可以在室温下有效产生大约90%的DNA的释放。

在进一步的实验中，RNA利用羧化PEI聚合物分离。在这点上，RNA从Cos7细胞中提取。500纳克提取的RNA随后在室温下与羧化PEI磁性颗粒温育2分钟。在一个例子中，随后利用Bis-Tris pH 9.0缓冲剂释放结合的RNA，并且在另一个例子中，利用相同Bis-Tris缓冲剂和聚乙二醇。释放在42℃进行3分钟。如此释放的RNA用对于猴亲环蛋白A特异的引物进行定量SYBR绿色PCR。发现添加PEG至缓冲剂显著改善了RNA回收率。

前面的内容说明了本发明的一些实施方式。其他实施方式及其改进鉴于本文提出的教导对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，本发明的释放剂可利用不是所描述的氢氧化钠的碱性材料进行制备。同样地，其他包括聚合的和低聚的二醇以及单体二醇的二醇材料可用于本发明的实践中。同样，应当理解本发明可以以自动以及手动模式实施。并且，根据本发明，可制备实施该方法的试剂盒。所有这样的改进和变形都处于本发明的范围内。包括所有等价物的所附权利要求限定本发明。

Claims (20)

1.从流体分离核酸物质的方法，所述方法包括以下步骤：

使其中具有核酸物质的流体与带正电荷的聚合物接触，从而所述核酸物质结合至所述带正电荷的聚合物；和

使具有结合于其的所述核酸物质的所述聚合物与释放剂接触，所述释放剂包括碱性材料和二醇的溶液，所述溶液具有不超过12的pH，从而所述剂使所述核酸物质从所述聚合物释放。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述剂具有不超过11的pH。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述剂包括缓冲剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述碱性材料为I族金属氢氧化物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述碱性材料以不超过50mM的浓度存在。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述二醇为聚合的二醇。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述聚合的二醇为聚乙二醇。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚乙二醇具有200-2000范围内的分子量。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述使所述聚合物与所述释放剂接触的步骤在不超过40℃的温度下进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述使所述流体与所述聚合物接触的步骤进行不超过10分钟。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物包括选自多胺的一种。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物为羧化多胺。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物是包括以下的一种或多种的一部分基体：珠粒、片材、载玻片、管、移液管、拭子和磁性颗粒。

14.制备部分带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物的方法，所述方法包括以下步骤：

提供第一体积的聚乙烯亚胺聚合物；

使所述第一体积的聚乙烯亚胺聚合物与酸化试剂反应，以便产生酸化聚乙烯亚胺；

提供第二体积的聚乙烯亚胺聚合物；和

使所述第二体积的聚乙烯亚胺与所述酸化聚乙烯亚胺反应，以便将至少一些所述羧化聚乙烯亚胺连接至所述第二体积的聚乙烯亚胺。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述酸化试剂为羧化试剂或磺化试剂。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述酸化试剂为氯醋酸钠。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一体积的聚乙烯亚胺和/或所述第二体积的聚乙烯亚胺具有大约400至200,000的分子量。

18.用于从流体分离核酸物质的系统，所述系统包括：

带正电荷的聚合物，其可用于结合所述核酸物质；和

释放剂，所述释放剂包括碱性材料和二醇的溶液，所述溶液具有不超过12的pH，所述剂可用于使所述核酸物质从所述聚合物释放。

19.根据权利要求18所述的系统，其中衍生于固体基体材料的所述聚乙烯亚胺包括羧化聚乙烯亚胺聚合物。

20.部分带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物，其包括：羧化聚乙烯亚胺聚合物，其已经与非羧化聚乙烯亚胺聚合物反应，以便将所述羧化聚乙烯亚胺聚合物结合至所述非羧化聚乙烯亚胺聚合物。