CN108473983A - 使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液的核酸纯化系统 - Google Patents
使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液的核酸纯化系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108473983A CN108473983A CN201680076992.3A CN201680076992A CN108473983A CN 108473983 A CN108473983 A CN 108473983A CN 201680076992 A CN201680076992 A CN 201680076992A CN 108473983 A CN108473983 A CN 108473983A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- buffer solution
- iii
- present
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Abstract
本发明涉及通过高效且成本有效的方法纯化核酸。具体地，本发明通过使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液进行核酸纯化而解决了在多个纯化步骤期间使用不同洗涤和洗脱缓冲溶液造成的费时费力的问题。尤其是在小型化环境中使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液10呈现出获得大量经纯化的核酸的简化方法。
Description
本发明是在国防部高级研究计划局授予的HR0011-12-C-0007下由美国政府支持完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及用于使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液来纯化核酸的方法或试剂盒，并且更具体地涉及小型化设置。本发明还涉及使用具有低盐浓度和相对高pH的缓冲溶液来纯化核酸。
背景技术
核酸在许多不同的研究领域中发挥着重要作用。在工业环境中，可以在产品质量管理内部检测核酸，并且在临床环境中，核酸可以用于诊断和/或治疗。在核酸用于许多上述应用之前，需要纯化核酸。
核酸纯化通常包括几个步骤，例如暴露含有核酸的样品并将核酸选择性地结合到核酸结合相，对结合的核酸进行纯化并排出杂质，并且获得纯化的核酸。在样品制备、核酸结合、洗涤和洗脱步骤期间通常使用不同的缓冲溶液。
最常用的纯化方法通过使用不同的缓冲溶液，基于pH的变化或基于盐浓度的变化来实现核酸的结合/洗涤和随后的洗脱。
Qiagen的技术例如基于在核酸结合相上结合并洗涤带负电荷的核酸，当核酸浸入pH<6.5的缓冲溶液时带正电。为了洗脱核酸，使用pH为8.5的缓冲溶液，引起pH增大并且中和核酸结合相的正电荷，由此引起结合的核酸的释放。
另一种常用的方法是由Boom等人(EP 0 389 063)开发的，其基于核酸裂解并结合到核酸结合相，例如高浓度的离液盐(例如，硫氰酸胍)中存在硅藻土、玻璃或硅石，其允许带正电荷的离子在带负电荷的核酸与带负电荷的结合相之间形成盐桥。首先将结合的核酸在高盐缓冲溶液存在的条件下进行洗涤，然后用乙醇-水溶液洗涤，并且通过转变为低盐非乙醇缓冲溶液(例如，TE缓冲溶液)进行洗脱。
如上所述，当前的核酸纯化方法包括多个洗涤步骤，随后是使用以不同盐浓度和/或不同pH为特征的多种缓冲溶液的洗脱步骤，这使得这些方法耗时且成本高。
此外，结合和洗涤缓冲溶液的残留物有时在最终洗脱步骤期间难以除去，并且可能随后干扰下游流程，例如，PCR分析或测序反应。
发明内容
因此需要改进的手段和方法来进行简化、快速、低成本且高效的核酸纯化。
现有的用于核酸纯化的方法费时费力，因为它们包括多个洗涤步骤，常常使用不同的洗涤缓冲溶液，随后是使用洗脱缓冲溶液洗脱结合的核酸的最终步骤。
本发明通过提供一种用于纯化核酸的方法解决了这个问题，所述方法包括以下步骤：
(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，
(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，
(iii)使用步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸。
本发明的目的是实现大量对核酸的简化和快速纯化。尤其地，这种大量通常会改善现有的核酸纯化方法，现有的核酸纯化方法通常被设计为以大体积来执行(洗脱体积≥50μl)，这对于某些应用可能是不利的。
根据本发明，这能够通过采用单一缓冲溶液来洗涤结合到核酸结合相的核酸并随后从核酸结合相洗脱这些核酸的方法来实现。
根据本发明的方法的优点在于与现有技术中描述的用于洗涤和洗脱样品的不同缓冲溶液相反，仅需要提供一种缓冲溶液来执行该方法。这继而得到与现有技术相反的更简化的方法，并且因此更经济且更具重现性。
根据本发明，这也能够通过使用单一缓冲溶液来洗涤和洗脱核酸来实现，所述单一缓冲溶液的特征在于≤100mM的相对低的盐浓度和≥7.5的相对高的pH。
根据本发明的单一缓冲溶液的优点在于可以通过采用非常小的体积的所述缓冲溶液来实现高洗脱效率；此外，通过使用单一缓冲溶液，可以实现对核酸的更快处理，这在小型化环境中是特别有利的。
根据本发明，对核酸的这种简化且快速的纯化能够通过一种试剂盒来进一步实现，所述试剂盒包括：
-核酸结合相，
-缓冲溶液，其包括用于洗涤和洗脱所述核酸的缓冲剂或干燥形式的所述缓冲溶液，
-用于检测经纯化的核酸的器件。
根据本发明，对核酸的这种简化且快速的纯化能够通过一种筒来进一步实现，所述筒包括：
-包括核酸结合相的第一室，
-连接到所述第一室的第二室，所述第二室包括缓冲溶液，所述缓冲溶液包括用于洗涤和洗脱所述核酸的缓冲剂或干燥形式的所述缓冲溶液，
-连接到所述第二室的第三室，所述第三室包括含有所述第二室的所述缓冲溶液的缓冲溶液或干燥形式的所述缓冲溶液。
与现有技术相比，根据本发明的试剂盒和筒是有利的，因为它们其更容易制备并且因此更经济，尤其是对于大规模生产而言是有利的。此外，通过减少试剂盒或筒中包括的不同成分的数量，可变性也明显降低。
本发明的一个目的是实现通过使用本发明的缓冲溶液从核酸结合相进行核酸洗涤和洗脱，这将允许在洗脱之后直接且即时地进一步处理经纯化的核酸，例如在扩增或测序反应中。
用于核酸纯化的现有方法难以按比例缩小到在诸如微流体设备的微型化环境中执行。
因此，本发明的一个目的是在小型化环境中实现高效的核酸纯化，例如，使用微流体设备或使用磁性毛细管阀，其中，洗涤步骤和洗脱步骤分别在≤500μl或≤50μl的条件下执行。
参考下文描述的(一个或多个)实施例，本发明的这些方面和其他方面将变得明显并且得到阐明。
附图说明
图1磁性毛细管阀筒，左图：磁性毛细管阀筒的分解图(顶部)和组装图(底部)的方案，数字1-4表示不同的室；右图：组装的筒。
图2是使用MCV的ivRNA产量比较结果：黑色柱：通过参考方法获得的RNA产量；灰色柱：通过单一缓冲溶液方法获得的RNA产量。
图3是使用Eppendorf管的ivRNA产量比较结果：(a)黑色柱：使用珠通过参考方法获得的RNA产量；灰色柱：通过使用珠的单一缓冲溶液方法获得的RNA产量；(b)当利用参考方法(黑色柱)或单一缓冲溶液方法(灰色柱)使用珠时，x轴上指示的不同组分中检测到的RNA百分比；(c)黑色柱：使用硅石颗粒通过参考方法获得的RNA产量；灰色柱：使用硅石颗粒通过单一缓冲溶液方法获得的RNA产量；(d)当利用参考方法(黑色柱)或单一缓冲溶液方法(灰色柱)使用硅石颗粒时，x轴上指示的不同组分中检测到的RNA百分比。
具体实施方式
本发明描述了缓冲溶液以及方法和试剂盒，其用于使用单一缓冲溶液进行洗涤和洗脱，并因此用于高效纯化核酸分子。
尽管将关于特定实施方案描述本发明，但是该描述不应被解释为限制意义。
在详细描述本发明的示例性实施例之前，给出用于理解本发明的重要的定义。
如在说明书和权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则“一”、“一个”和“该”也包括多个。
还应当理解，术语“包括”、“例如”和“诸如”不是限制性的。术语“可能”既不被理解为强制性的，也不被理解为限制性的。
术语“任选地”应当被理解为替代方案或说明书。术语“尤其”被认为是本发明的优选实施例。
如本文中所使用的，术语“单一缓冲溶液”或“单一洗涤和洗脱缓冲溶液”是指具有相同组成、组分比例和特性的缓冲溶液。
术语“暴露/暴露于”和“结合/结合到”是指在样品的核酸能够结合核酸结合相的条件下使样品与核酸结合相接触。在本发明的某些实施例中，“结合/结合到”意指样品中存在≥25％的核酸结合，或样品中存在≥50％，或≥75％，或≥85％，或≥95％的核酸结合。
术语“洗涤/洗涤出”或“洗涤/洗涤步骤”是指结合之后的情况，其中，在很大程度上从与核酸结合相结合的核酸中除去来自裂解或结合流程的杂质(例如，碎片(例如，细胞器)、细胞壁的部分或细菌或病毒颗粒、蛋白质和/或残余物(例如，盐或去垢剂)。在本发明的某些实施例中，“洗涤/洗涤出”或“洗涤/洗涤步骤”意指除去结合到核酸结合相的≤25％的核酸，或者除去结合到核酸结合相的≤20％，或≤15％，或≤10％，或≤5％的核酸。
术语“洗脱/洗脱”或“洗脱步骤”是指结合的核酸最终从核酸结合相中释放的条件。在本发明的某些实施例中，“洗脱/洗脱”或“洗脱步骤”意指最初结合到核酸结合相的≥25％的核酸被洗脱，或者最初结合到核酸结合相的≥35％，或≥45％，或≥55％，或≥65％，或≥75％，或≥85％，或≥95％的核酸被洗脱。
在本发明的某些实施例中，“洗涤/洗涤出”或“洗涤/洗涤步骤”意指除去结合到核酸结合相的≤25％的核酸，或者除去结合到核酸结合相的≤20％，或≤15％，或≤10％，或≤5％的核酸，并且“洗脱/洗脱”或“洗脱步骤”意指最初结合到核酸结合相的≥25％的核酸被洗脱，或最初结合到核酸结合相的≥35％，或≥45％，或≥55％，或≥65％，或≥75％，或≥85％，或≥95％的核酸被洗脱。
如本文中所使用的，“室温”是指18℃至26℃，优选为20℃至23℃的温度。
如本文中所使用的，符号通常指示与±20％，优选为±15％，更优选为±10％，甚至更优选为±5％的指示数值的偏差。
本发明提供了一种用于纯化核酸的方法，包括以下步骤：
(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，
(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，
(iii)使用步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸。
在本发明的一个实施例中，所述的用于纯化核酸的方法包括以下步骤：
(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，
(ii)用缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，
(iii)使用步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸，
其中，在步骤(i)与步骤(ii)之间不执行另外的一个或多个步骤。
在本发明的另一实施例中，所述的用于纯化核酸的方法包括以下步骤：
(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，
(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，
(iii)使用步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸，
其中，在步骤(ii)与步骤(iii)之间不执行另外的一个或多个步骤。
在本发明的另外的实施例中，所述的用于纯化核酸的方法包括以下步骤：
(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，
(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，
(iii)使用步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸，
其中，在步骤(i)与步骤(ii)之间以及在步骤(ii)与步骤(iii)之间不执行另外的步骤。
在本发明的一个实施例中，所述的用于纯化核酸的方法包括以下步骤：
(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，
(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，
(iii)使用步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸。
在本发明的情境中，在本发明的方法的步骤(iii)中使用步骤(ii)的缓冲溶液意指使用具有与本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中相同的组成、组分比例和特性的缓冲溶液。为了简化主题，将在整个申请中使用术语“单一缓冲溶液”或“单一洗涤和洗脱缓冲溶液”来描绘在本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液。
使用单一缓冲溶液来洗涤和洗脱核酸，任选地以本发明的实施例中所述的方法或由本发明的试剂盒所提供的方法，使核酸的纯化快速、简单且成本高效。
暴露包括核酸的样品并将核酸结合到核酸结合相可以通过将样品加入到核酸结合相并任选地使样品通过核酸结合相或由核酸结合相流过来实现。也可以通过将样品与核酸结合相进行浸渍、重悬或混合来实现暴露。可以用任何合适的用于结合的缓冲溶液将样品在核酸结合相上或与核酸结合相一起在室温且pH为4-8的条件下温育1至30分钟。核酸可以在存在或不存在离液物质的情况下结合，例如，(异)硫氰酸胍胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、(异)硫氰酸钠、尿素或其组合。
在本发明的一个实施例中，样品在核酸结合相上或与核酸结合相一起在室温且pH为的条件下温育1至30分钟。
在本发明的另一实施例中，使用含有异硫氰酸胍的缓冲溶液将核酸结合到核酸结合相。
在本发明的另一实施例中，使用含有异硫氰酸胍的缓冲溶液在室温且pH为4的条件下持续1至30分钟来将核酸结合到核酸结合相。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法的步骤(i)在存在高盐浓度的条件下执行，例如在高盐的摩尔浓度和高毫摩尔范围内的盐浓度。
在本发明的优选实施例中，本发明的方法的步骤(i)在存在1M至6M的高盐浓度的条件下执行。
理想情况下，洗涤缓冲溶液可以除去不需要的细胞成分(例如，细胞、细菌、病毒碎片)；蛋白质，以及可能源自于先前的裂解或结合步骤的例如去垢剂和离液盐的残余物。
可以使用盐浓度为≤500mM，≤400mM，≤300mM，≤200mM，≤100mM，≤75mM，≤50mM，≤40mM，≤30mM，≤20mM，≤10mM，≤7.5mM，≤5mM，≤2.5mM的缓冲溶液来洗涤和洗脱结合的核酸。
在本发明的优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度。
可以用pH≥7.5，≥8，≥8.5，≥9，≥9.5或≥10的缓冲溶液来进一步洗涤和洗脱结合的核酸。
在本发明的优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度和≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的另一实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的另外的实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的更优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有10mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的最优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有10mM的盐浓度和9的pH值。
可以用包括以下缓冲剂的缓冲溶液来进一步洗涤和洗脱结合的核酸，所述缓冲剂例如为枸橼酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苹果酸盐、吡啶、二甲胂酸盐、琥珀酸盐、组氨酸、bis-tris、乙醇胺、ADA、ACES、PIPES、MOPSP、咪唑、BIS-TRIS丙烷、BES、MOPS、HEPES、TES、MOBS、DIPSO、TAPSO、三乙胺(TEA)、焦磷酸盐、HEPPSO、Tris-HCl、POPSO、甘氨酸、肼、甘氨酰甘氨酸、Trizma、EPPS、HEPPS、BICINE HEPBS、TAPS、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)、TABS、AMPSO、牛磺酸(AES)、硼酸盐、CHES、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、甘氨酸、氢氧化铵、CAPSO、碳酸盐、甲胺、哌嗪、CAPS和磷酸盐。
优选用包括以下缓冲剂的缓冲溶液来洗涤和洗脱结合的核酸，所述缓冲剂例如为DIPSO、TAPSO、三乙胺(TEA)、焦磷酸盐、HEPPSO、Tris-HCl、POPSO、甘氨酸、肼、甘氨酰甘氨酸、Trizma、EPPS、HEPPS、BICINE HEPBS、TAPS、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)、TABS、AMPSO、牛磺酸(AES)、硼酸盐、CHES、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、甘氨酸、氢氧化铵、CAPSO、碳酸盐、甲胺、哌嗪、CAPS和磷酸盐、MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)或TE(Tris-EDTA)。
最优选地可以用包括以下的缓冲剂的缓冲溶液来洗涤和洗脱结合的核酸，所述缓冲剂的缓冲范围为pH 7至11，例如为DIPSO、TAPSO、三乙胺(TEA)、焦磷酸盐、HEPPSO、Tris-HCl、POPSO、甘氨酸、肼、甘氨酰甘氨酸、Trizma、EPPS、HEPPS、BICINE HEPBS、TAPS、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)、TABS、AMPSO、牛磺酸(AES)、硼酸盐、CHES、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、甘氨酸、氢氧化铵、CAPSO、碳酸盐、甲胺、哌嗪、CAPS、磷酸盐和TE。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液中的缓冲剂是TE或Tris-HCl。
在本发明的另一实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液中的缓冲剂是Tris-HCl。
在本发明的另一实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的Tris-HCl浓度。
在本发明的另外的实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液的缓冲剂是Tris-HCl，并且缓冲溶液具有≥7.5或优选为≥9的pH值。
在本发明的优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的Tris-HCl浓度和≥7.5或优选≥9的pH值。
在本发明的另一优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤30mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另外的优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤30mM的Tris-HCl浓度和≥9的pH值。
在本发明的更优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤10mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的更为优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有≤10mM的Tris-HCl浓度和≥9的pH值。
在本发明最优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有10mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明极为优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中采用的缓冲溶液具有10mM的Tris-HCl浓度和9的pH值。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤50μl或≤20μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另外的实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≥50μl或≤20μl的缓冲溶液中执行，所述缓冲溶液的盐浓度≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM。
在本发明的另一实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≥50μl或≥20μl的pH≥7.5或≥9的缓冲溶液中执行。
在优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤50μl或≤20μl的pH≥7.5或≥9的缓冲溶液中执行，所述缓冲溶液的盐浓度≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM。
在本发明的另一优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl的盐浓度≤30mM且pH≥7.5的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl的盐浓度≤30mM且pH≥9的缓冲溶液中执行。
在本发明的最优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl的盐浓度≤10mM且pH≥7.5的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一最优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl的盐浓度≤10mM且pH≥9的缓冲溶液中执行。
在本发明极为优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl的盐浓度为10mM且pH为9的缓冲溶液中执行。
根据本发明的一个实施例，紧接着的上述实施例的缓冲溶液的缓冲剂是Tris-HCl。
在本发明的一个实施例中，在本发明的方法的步骤(ii)中将结合的核酸洗涤至少一次。
在优选实施例中，在本发明的方法的步骤(ii)中将结合的核酸洗涤至少两次，优选洗涤两次。
在本发明的更优选实施例中，在方法的步骤(ii)中将结合的核酸洗涤两次，其中，步骤(ii)在≤20μl的盐浓度≤10mM且pH值≥9的缓冲溶液中执行。
在本发明的最优选实施例中，在步骤(ii)中将结合的核酸洗涤两次，其中，步骤(ii)在≤20μl的盐浓度为10mM且pH为9的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一最优选实施例中，在步骤(ii)中将结合的核酸洗涤两次，其中，步骤(ii)在≤20μl的Tris-HCl浓度为10mM且pH为9的缓冲溶液中执行。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法的步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一实施例中，本发明的方法的步骤(iii)在≤5μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，并且本发明的方法的步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl，≤5μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度。
在本发明的另外的实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度和≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度和≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的另一优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的最优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一最优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的极为优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有10mM的盐浓度和9的pH值。
在本发明的另外的优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的Tris-HCl浓度和≥9的pH值。
在本发明的最优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一最优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的Tris-HCl浓度和≥9的pH值。
在本发明的极为优选实施例中，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有10mM的Tris-HCl浓度和9的pH值。
根据本发明的一个实施例，在本发明的紧接着的上述实施例中的任一个的步骤(ii)中将结合的核酸洗涤至少两次，优选洗涤两次。
根据本发明的一个实施例，本发明的方法的步骤(i)可以在存在高盐浓度的条件下执行，其中，如上述实施例所述地对结合的核酸进行洗涤和洗脱。
在本发明的一个实施例中，使用本发明的缓冲溶液或利用本发明的试剂盒在本发明的方法的步骤(iii)的洗脱液中获得存在于包括核酸的样品中的至少25％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％的核酸。
在本发明的另一实施例中，同时对不同的核酸进行纯化。一种常见的获得例如RNA或DNA的方法是分别将RNA酶或DNA酶添加到经纯化的核酸中。
在本发明的另外的实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品。已知的用于细胞裂解的方法适用于本发明，例如，物理破坏，例如通过混合，研磨，经由剪切力，通过声处理，超声，施加压力，打珠或冷冻和解冻；或者化学破坏，例如通过离液盐或离液序列高的盐(kosmotropic salt)，去垢剂(例如，Triton X、NP40、Tween或SDS)；或者酶破坏，例如通过溶菌酶、蛋白酶K或枯草杆菌蛋白酶。
在本发明的一个实施例中，包括核酸的样品不被离液盐或去垢剂裂解。
在本发明的另一实施例中，含有核酸的样品被离液盐裂解。
在本发明的优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品；本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl的缓冲溶液中执行，本发明的方法的步骤(iii)的在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品；本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度。
在本发明另外的优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前将包括核酸的样品裂解；本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的更优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品；本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度和≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的另外的更优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品；本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一更优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品；本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的最优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品；本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一最优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品；本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的极为优选实施例中，在本发明的方法的步骤(i)之前裂解包括核酸的样品；本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有10mM的盐浓度和9的pH值。
根据本发明的一个实施例，紧接着的上述实施例的缓冲溶液中的缓冲剂是Tris-HCl。
根据本发明的另一实施例，在本发明的紧接着的上述实施例中的任一个中，在本发明的方法的步骤(ii)中将结合的核酸洗涤至少两次，优选洗涤两次。
根据本发明的又一实施例，本发明的方法的步骤(i)在存在高盐浓度的条件下执行，其中，如上述实施例所述地对结合的核酸进行洗涤(步骤(ii))和洗脱(步骤(iii))。
如本文中所使用的包括核酸的样品包括生物样品，例如为细菌、酵母、病毒、真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、全血、血清、富含血小板的血浆、血沉棕黄层、来自鼻腔、口腔、阴道或直肠拭子的样品、鼻咽或支气管吸出物和洗液、脑脊髓液、唾液、粪便、尿液、精液和组织。包括核酸的样品也可以是实验室样品，例如为扩增反应混合物和(熔化的)琼脂糖凝胶探针。包括核酸的样品还可以是食物或土壤样品。如果适用，样品可能已经被溶解，部分澄清或纯化，例如通过离心，沉淀和/或过滤。
在本发明的实施例中，包括核酸的样品包括真核细胞，优选为人类细胞，更优选为上皮细胞。
在本发明的优选实施例中，包括核酸的样品包括上皮细胞。
在本发明的另一实施例中，包括核酸的样品还包括细菌和/或病毒。
细菌可以例如包括芽孢杆菌属、巴尔通体属、博德特氏菌属、疏螺旋体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、梭菌属、棒状杆菌属(例如，白喉棒状杆菌)、肠球菌、埃希氏菌属、弗朗西斯菌、嗜血杆菌属、幽门螺杆菌、军团菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、分枝杆菌属、支原体属、奈瑟菌属、假单胞菌属、立克次氏体属、葡萄球菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、链球菌属、密螺旋体属、解脲支原体、弧菌属或耶尔森氏菌属。病毒可以例如包括爱泼斯坦-巴尔病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、丝状病毒、流感病毒或狂犬病病毒。
要通过本发明的方法纯化的核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其杂合物。DNA和RNA可能存在单链和双链。
DNA可以以基因组DNA、cDNA或以环状形式存在，例如，超螺旋、卷曲和松弛的质粒DNA，并且还可以以A-DNA、B-DNA或Z-DNA存在。
术语“RNA”包括细菌RNA、病毒RNA、逆转录病毒RNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、适体、核糖开关、转移RNA(tRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微RNA(miRNA)、Piwi相互作用(piRNA)、CRISPR RNA和免疫刺激RNA。DNA和RNA可以以不同的长度存在，例如从≤0.05kb到≥100kb。
要纯化的核酸还包括在糖部分、磷酸骨架或碱基部分中修饰的核酸。
要纯化的核酸还包括合成的核酸，例如，体外转录的RNA(体外RNA)，任选地进行荧光或放射性标记。
在本发明的优选实施例中，要纯化的核酸是病毒DNA或病毒RNA。
在本发明的方法中使用的核酸结合相包括能够结合核酸的可溶性或固体、多孔或无孔底物。
上述底物可以包括化学官能团，例如，胺基团或胺官能化基团。优选的底物是硅藻土、玻璃、硅氧烷、硅石和用硅烷包覆的底物，其任选地含有官能团，例如，聚乙二醇、胺、环氧化物、异硫氰酸酯以及用聚-L-赖氨酸或诸如硝基纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯的聚合物包覆的底物。官能化硅烷可以是分支的或不分支的。
本发明的一个实施例提供了包括硅石的核酸结合相。
本发明的另外的实施例提供了包括硅烷的核酸结合相。
针对固体核酸结合底物的范例是磁性颗粒，由于它们能够少量使用并且能够容易且定量地回收(US 14/0272999)，因此它们在处理方面尤其有利。磁性颗粒可以包括铁、氧化铁、硅石、包括无定形二氧化硅的二氧化硅、玻璃粉末、石英、硅藻土、烷基硅石、沸石、胶乳颗粒或聚合物，聚合物例如为硝基纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯或用硅烷包覆(任选地含有官能团(例如，聚乙二醇，胺，环氧化物或异硫氰酸酯))或用L-赖氨酸包覆。
在本发明的一个实施例中，磁性颗粒可以包括铁、氧化铁、硅石、包括无定形二氧化硅的二氧化硅、玻璃粉末、石英、硅藻土、烷基硅石、沸石、胶乳颗粒或用硅烷包覆(任选地包括官能团(例如，聚乙二醇、胺、环氧化物或异硫氰酸酯))或用L-赖氨酸包覆。
磁性粒度可以在0.05μm至500μm之间。优选的粒度范围在1μm至200μm之间。
在本发明的优选实施例中，核酸结合相包括磁性颗粒。在本发明的甚至更优选实施例中，这些磁性颗粒被硅石包覆。在本发明的同样优选实施例中，磁性颗粒被硅烷包覆。
在本发明的优选实施例中，核酸结合相包括带负电荷的颗粒，更优选地包括带负电荷的磁性颗粒，其中，颗粒可以包括玻璃、硅石、硅石的衍生物或用硅石包覆，并且在存在高浓度离液盐的条件下核酸结合核酸结合相。
本发明意义上的小型化环境是指亚毫米级的空间。这样的小型化环境的范例是微流体设备，其特征在于在亚毫升空间中对流体进行工程化操纵，从而允许精确控制和操纵这些流体。通常，微流体设备实现小体积，例如，在μl范围内和/或它可以实现小的整体尺寸。此外，根据本发明的微流体设备可以是一次性的或可重复使用的并且消耗少量的能量。在微流体设备中，可以实现诸如层流、比表面张力、电润湿、快速热弛豫、存在电表面电荷和扩散的效果。在某些实施例中，微流体设备可以具有与外部源或外部元件的连接，例如，分离物或储存库或容器以供再次使用。此外，微流体设备可以包括允许控制和操纵设备中的活动和/或检测或确定反应结果或产物的电子接口或计算机接口。微流体设备可以手动或自动操作，例如，作为芯片实验室方法的一部分，所有试剂均已存在于设备中。
微流体设备包括术语“磁性毛细管阀”或“磁性毛细管阀筒”，它们包括相互间隔一定距离的两个平面，使得能够通过毛细作用力将离散单元的液体限制在设备中的固定位置处。设备内部的液体单元可以通过气体或相变材料(例如，石蜡)而被分离，所述相变材料能够基于所施加的温度熔化和固化。例如磁性颗粒可以通过磁力从一个液体单元转移到另一个液体单元(Den Dulk，Lab Chip，2013年)。
本发明的一个实施例设想本发明的方法用微流体设备来执行。
在本发明的另外的实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl的缓冲溶液中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl的缓冲溶液中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中的缓冲溶液中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度。
在本发明的另外的实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中的缓冲溶液中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中的缓冲溶液中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的优选实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度并且pH≥7.5或≥9。
在本发明的另外的优选实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度且pH≥7.5。
在本发明的另一优选实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度且pH≥9。
在本发明的最优选实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度且pH≥7.5。
在本发明的另一最优选实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度且pH≥9。
在本发明的极为优选实施例中，利用微流体设备，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有10mM的盐浓度且pH为9。
根据本发明的一个实施例，紧接着的上述实施例的缓冲溶液中的缓冲剂是Tris-HCl。
根据本发明的一个实施例，本发明的方法包括在上述实施例中的任一个中的本发明的方法的步骤(i)之前的裂解步骤。
根据本发明的一个实施例，在本发明的紧接着的上述实施例中的任一个中，在本发明的方法的步骤(ii)中将结合的核酸洗涤至少两次，优选洗涤两次。
在本发明的优选实施例中，本发明的方法利用磁性毛细管阀来执行。
在本发明的另外的实施例中，利用磁性毛细管阀，本发明的方法的结合核酸的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl的缓冲溶液中执行，并且本发明的方法的步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一实施例中，使用磁性毛细管阀，结合的核酸是本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行的，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度。
在本发明的另外的实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度和≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度和≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的另外的优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的最优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一最优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的极为优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有10mM的盐浓度和9的pH值。
在本发明的优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且本发明的方法的步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的Tris-HCl浓度和≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的另外的优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的Tris-HCl浓度和≥9的pH值。
在本发明的最优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一最优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的Tris-HCl浓度和≥9的pH值。
在本发明的极为优选实施例中，使用磁性毛细管阀，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有10mM的Tris-HCl浓度和9的pH值。
根据本发明的一个实施例，本发明的方法包括在上述实施例中的任一个中在本发明的方法的步骤(i)之前的裂解步骤。
根据本发明的一个实施例，在本发明的紧接着的上述实施例中的任一个中，在本发明的方法的步骤(ii)中将结合的核酸洗涤至少两次，优选洗涤两次。
在本发明的另外的实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl的缓冲溶液中执行，并且本发明的方法的步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl的缓冲溶液中执行。
在本发明的另一实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选≤50mM，更优选≤30mM，最优选≤10mM的盐浓度。
在本发明的另一实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤500μl，≤400μl，≤300μl，≤200μl，≤100μl，≤50μl或≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤50μl，≤40μl，≤30μl，≤20μl，≤15μl，≤10μl或≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液的pH值≥7.5或≥9。
在本发明的优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度和≥7.5或≥9的pH值。
在本发明的另外的优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的最优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一最优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的极为优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有10mM的盐浓度和9的pH值。
在本发明的另外的优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤30mM的Tris-HCl浓度和≥9的pH值。
在本发明的最优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的Tris-HCl浓度和≥7.5的pH值。
在本发明的另一最优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有≤10mM的Tris-HCl浓度和≥9的pH值。
在本发明的极为优选实施例中，使用磁性毛细管阀，将核酸结合到被磁性颗粒包覆的硅石，本发明的方法的步骤(ii)在≤20μl中执行，并且步骤(iii)在≤5μl中执行，其中，步骤(ii)和步骤(iii)中使用的缓冲溶液具有10mM的Tris-HCl浓度和9的pH值。
根据本发明的一个实施例，本发明的方法包括在紧接着的上述实施例中的任一个中在本发明的方法的步骤(i)之前的裂解步骤。
根据本发明的一个实施例，在本发明的紧接着的上述实施例中的任一个中，在本发明的方法的步骤(ii)中将结合的核酸洗涤至少两次，优选洗涤两次。
根据本发明的一个实施例，本发明的方法的步骤(i)至(iii)在室温下执行。
根据本发明的另一实施例，本发明的方法的步骤(i)和步骤(ii)在室温下执行，并且步骤(iii)在≥40℃的温度下执行。
在优选实施例中，本发明的方法的步骤(i)和步骤(ii)在室温下执行，并且步骤(iii)在50℃至70℃的温度下执行。
在更优选实施例中，本发明的方法的步骤(i)和步骤(ii)在室温下执行，并且步骤(iii)在60℃至70℃下执行。
在最优选实施例中，本发明的方法的步骤(i)和步骤(ii)在室温下执行，并且本发明的方法的步骤(iii)在65℃下执行。
本发明的另外的实施例提供用于检测使用本发明的方法纯化的核酸的额外步骤。如本文中所使用的对纯化核酸的检测包括对纯化核酸的酶促限制性分析、扩增(例如经由PCR，例如，定量实时PCR、巢式PCR和本领域技术人员已知的其他扩增变体)、逆转录、杂交(例如，Southern、Northern印迹)、微阵列分析或测序(例如，焦磷酸测序、Illumina测序或Solexa测序)、SOLiD技术(Applied Biosystems)、Heliscope技术(Helicos)或FTIR(Magnotech)。
本发明的另一方面涉及用于纯化核酸的缓冲溶液的用途，其中，包括缓冲剂的缓冲溶液具有≤500mM，≤400mM，≤300mM，≤200mM，≤100mM，≤75mM，≤50mM，≤40mM，≤30mM，≤20mM，≤10mM，≤7.5mM，≤5mM，≤2.5mM的盐浓度以及≥7.5，≥8，≥8.5，≥9，≥9.5或≥10的pH值。
在本发明的一个实施例中，所使用的缓冲溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度以及≥7.5，≥8，≥8.5≥9≥9.5或≥10的pH值。
在本发明的优选实施例中，所使用的缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的更优选实施例中，所使用的缓冲溶液具有10mM的盐浓度和9的pH值。
在本发明的另外的实施例中，上述缓冲溶液用于洗涤和洗脱核酸。
在本发明的另一实施例中，上述缓冲溶液中的缓冲剂是Tris-HCl。
在本发明的优选实施例中，所使用的Tris-HCl缓冲溶液具有≤10mM的盐浓度和≥9的pH值。
在本发明的更优选实施例中，所使用的Tris-HCl缓冲溶液具有10mM的盐浓度和9的pH值。
在本发明的另外的实施例中，用上述缓冲溶液纯化的核酸是DNA或RNA。
在本发明的另一实施例中，核酸是细菌DNA或细菌RNA。
在本发明的优选实施例中，经纯化的核酸是病毒DNA或病毒RNA。
本发明的另外的方面涉及用于纯化核酸的试剂盒，包括：
-核酸结合相，
-用于洗涤和洗脱核酸的缓冲溶液或包括缓冲剂的干燥形式的所述缓冲溶液，
-用于检测经纯化的核酸的器件。
试剂盒的缓冲溶液优选为本发明的前述实施例中所述的本发明的缓冲溶液。
如本文中所使用的对纯化核酸的检测包括对纯化核酸的酶促限制性分析，扩增(例如经由PCR，例如，定量实时PCR、巢式PCR和本领域技术人员已知的其他扩增变体)、逆转录、杂交(例如，Southern、Northern印迹)、微阵列分析或测序(例如，焦磷酸测序、Illumina测序或Solexa测序)、SOLiD技术(Applied Biosystems)、Heliscope技术(Helicos)或FTIR(Magnotech)。
在本发明的另一实施例中，试剂盒还包括如以上所定义的小型化环境。
在本发明的另一实施例中，小型化环境含有核酸结合相，
-用于洗涤和洗脱核酸的缓冲溶液或包括缓冲剂的干燥形式的所述缓冲溶液，
-用于检测经纯化的核酸的器件。
在本发明的另一实施例中，小型化环境被包括在筒中。
在本发明的优选实施例中，试剂盒还包括微流体设备。
在本发明的另一实施例中，试剂盒包括筒。
在本发明的更优选实施例中，试剂盒包括磁性毛细管阀筒。
在本发明的另外的实施例中，试剂盒还可以包括裂解试剂，例如，离液盐或离液序列高的盐、去垢剂(例如，Triton X、NP40、Tween或SDS)，或者酶(例如，溶菌酶、蛋白酶K或枯草杆菌蛋白酶)。
在本发明的另一实施例中，试剂盒还包括不是离液盐或去垢剂的裂解试剂。
在本发明的又一实施例中，试剂盒还包括为硫酸铵或氯化锂的裂解试剂。
在本发明的另外的实施例中，本发明的试剂盒可以包括用于使用试剂盒的部件执行核酸纯化的操作指南。
一个实施例提供了本发明的试剂盒，其中，试剂盒的部件分别被包装或者被储存在提供试剂盒的容器的分开的隔室中。
本发明的另一实施例提供了用作诊断测试的本发明的试剂盒。诊断测试可以包括用于检测由病原体引起的或与病原体相关联的疾病的测试，例如，细菌、酵母或病毒或基因测试，例如，用于遗传病、产前检查或亲子鉴定。
在本发明的优选实施例中，本发明的试剂盒用作用于分子诊断的手持式集成测试。用于分子诊断的手持式测试可以是小型的一次性试剂盒或器械，其是便携式的并且适合于接近患者进行测试。
范例
参考以下范例来支持和说明用于纯化核酸的本发明的方法。必须强调的是，这些范例决不应被解释为限制本发明的范围。
范例1：利用磁性毛细管阀(MCV)通过参考方法或在单一缓冲溶液方法进行纯化之
后的核酸产量的比较结果
为了比较核酸/RNA产量，通过参考方法或通过本发明的单一缓冲溶液方法来纯化体外RNA。以下方案分别用于参考方法或单一缓冲溶液方法(概述参见表1)。
表1
MCV中的参考方法
在2ml Eppendorf管中，将5μl的体外RNA加入到含有3.3M异硫氰酸胍(GITC)、Tris-HCl、Triton-X100和EDTA的995μl的裂解缓冲溶液中。将样品在涡旋中混合10秒以进行裂解。向样品中加入20μl的接着进行混合步骤，向上和向下颠倒Eppendorf管一次，并在室温下温育3至5分钟以将核酸结合到磁珠。
在将样品与裂解缓冲溶液和磁珠温育之后，如den Dulk等在2013年所述并且如图1所示将样品移液至磁性毛细管阀(MCV)筒中。在第一洗涤室和第二洗涤室中，向MCV筒预填充20μl的洗涤缓冲溶液2。向第三室填充20μl的洗涤缓冲溶液3，向洗脱室填充3.5μl的含有10mM的低盐浓度的Tris-HCl且含有9的高pH值的缓冲溶液。
使用磁体收集并移动磁珠，如den Dulk等在2013年所述的。首先，将珠收集在样品所在的浓缩器部分中。然后磁体将磁珠通过阀转移到第一洗涤室。在第一洗涤室中，使用磁体洗涤磁珠。在第二室和第三室中重复执行这个过程。在洗脱室中，通过将温度升高至65℃达2分钟并随后使用磁体进行混合来从珠洗脱核酸。
MCV中的单一缓冲溶液方法
如上所述，该方法类似于上述的“MCV中的参考方法”。唯一的区别是缓冲溶液的组成对于洗涤步骤和最终的洗脱步骤都是相同的(pH＝9的10mM的Tris-HCl)。
从图2中能够得出，由使用MCV的单一缓冲溶液方法获得的RNA产量显著高于通过参考方法获得的产量，其中，平均RNA产量的比较结果为：通过单一缓冲溶液方法获得的、初始结合到磁珠的RNA的64％得到洗脱；而通过参考方法获得的、初始结合到磁珠的RNA的26％得到洗脱。
范例2：通过参考方法或单一缓冲溶液方法用Eppendorf管纯化后的核酸产量的比
较结果
为了比较核酸/RNA产量，通过参考方法或通过本发明的单一缓冲溶液方法纯化体外RNA。以下方案分别用于参考方法或单一缓冲溶液方法(概述参见表2)。
表2
参考方法：
在2ml Eppendorf管中，将5μl体外RNA加入到含有3.3M异硫氰酸胍(GITC)、Tris-HCl、Triton-X100和EDTA的995μl的裂解缓冲溶液中。将样品在涡旋中混合10秒以进行裂解。向样品中加入20μl的珠或8μl的硅石颗粒(相同的最终浓度)，随后进行混合步骤，向上和向下颠倒eppendorf管一次，并且在室温下温育3至5分钟以将核酸分别结合到珠或颗粒中。
在将样品与裂解缓冲溶液和磁珠或磁性颗粒温育之后，将管置于磁架上以将具有结合核酸的珠或颗粒拉到管的侧面。通过使用移液管除去液体，除去诸如碎屑和蛋白质的杂质。
随后，在室温下用50μl含有MES水合盐的pH＝4的洗涤缓冲溶液2洗涤磁性颗粒以稀释/置换一定量的GITC，同时保持核酸与磁珠或磁性颗粒结合。在每一个洗涤步骤中，将洗涤液加入管，随后将磁珠或磁性颗粒与液体混合，将管置于磁架上以将具有结合的核酸的珠或颗粒拉到管的侧面，最后除去液体。
在室温下使用50μl含有pH＝7的Tris-HCl的洗涤缓冲溶液3执行第二洗涤步骤以稀释/置换一定量的MES水合物盐并增大pH值以更好地进行洗脱。
最后，加入含有Tris-HCl的pH＝7的50μl的洗脱缓冲溶液，在65℃下用Eppendorf热加热器对磁珠或磁性颗粒温育5分钟，随后涡旋10秒以从磁珠或磁性颗粒洗脱核酸。
单一缓冲溶液方法：
在2ml Eppendorf管中，将5μl体外RNA加入到含有3.3M异硫氰酸胍(GITC)、Tris-HCl，Triton-X100和EDTA的995μl的裂解缓冲溶液中。将样品在涡旋中混合10秒以进行裂解。向样品中加入20μl的珠或8μl的硅石颗粒(相同的最终浓度)，随后进行混合步骤，向上和向下颠倒eppendorf管一次，并且在室温下温育3至5分钟以将核酸分别结合到珠或颗粒中。
在将样品与裂解缓冲溶液和磁珠或磁性颗粒温育之后，将管置于磁架上以将具有结合的核酸的珠或颗粒拉到管的侧面。通过使用移液管除去液体，除去诸如碎屑和蛋白质的杂质。
随后，在室温下用含有Tris-HCl的pH＝9的50μl的缓冲溶液将磁性颗粒洗涤两次，以稀释/置换一定量的GITC并增大pH以用于随后的洗脱，同时仍然保持核酸与磁珠或磁性颗粒结合。在每一个洗涤步骤中，将洗涤液加入管，随后将磁珠或磁性颗粒与液体混合，将管置于磁架上以将具有结合的核酸的珠或颗粒拉到管的侧面，并且除去液体。
最后，加入含有Tris-HCl的pH＝9的50μl的缓冲溶液，在65℃下在Eppendorf热加热器中与磁珠或磁性颗粒温育5分钟，随后涡旋10秒以从磁珠或磁性颗粒上洗脱核酸。
从图3a和图3c中能够得出，使用50μl的洗涤和洗脱体积，通过参考方法(黑色柱)和单一缓冲溶液方法(灰色柱)得到的RNA产量是相似的。当使用珠时，纯化前样品中存在的约99％的RNA的量以纯化形式获得(图3a)，当使用硅石颗粒时，纯化前样品中存在的约82％的RNA的量以纯化形式获得(图3c)。
在图3b和图3d中，在不同级分(Sup LB级分、第一次洗涤级分、第二次洗涤级分和洗脱级分)中检测到纯化前存在于样品中的RNA的量的百分比。
使用参考方法和单一缓冲溶液方法，使用珠(图3b)和硅石颗粒(图3d)，在裂解并结合到磁珠或磁性颗粒(Sup LB)之后的上清液级分中能够检测到的RNA百分比类似。因此，当使用不同的核酸结合相时，两种方法的未结合的RNA的百分比的量方面几乎相同。
还显示在使用任一方法的第一次洗涤步骤和第二次洗涤步骤期间，几乎没有任何结合的RNA从珠或硅石颗粒中丢失(参见图3b和图3d的中间栏)。
结果，在洗脱级分中发现了大部分最初结合到磁珠或磁性颗粒上的RNA，对于NucliSENS珠约为99％，对于硅石颗粒约为80％(参见图3b和图3d的最右栏)。
总之，上述结果表明：当使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液时，Eppendorf管中的单一缓冲溶液方法在采用相同的小洗涤和洗脱体积时获得与参考方法相似的核酸产量。
参考文献清单：
1.Boom等人的“Rapid and Simple Method for Purification of NucleicAcids”(Journal of Clinical Microbiology，第28卷，第495-503页，1990年)
2.EP 0389063
3.US 14/0272999
4.den Dulk等人的“Magneto-capillary valve for integrated purificationand enrichment of nucleic acids and proteins”(Lab Chip，第13卷，第06-118页，2013年)
Claims (30)
1.一种用于纯化核酸的方法，包括以下步骤：
(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，
(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，
(iii)使用≤50μl的步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(ii)和步骤(iii)的所述缓冲溶液的特征在于盐浓度≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM。
3.根据权利要求1或2中的任一项所述的方法，其中，步骤(ii)和步骤(iii)的所述缓冲溶液的特征在于pH≥7.5，优选为pH≥9。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中，步骤(ii)和步骤(iii)的所述缓冲溶液中的所述缓冲剂是Tris-HCl。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中，步骤(ii)在≤40μl，优选为≤30μl，更优选为≤25μl，并且最优选为≤20μl的所述缓冲溶液中执行。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，步骤(iii)在≤15μl，优选为≤10μl，最优选为≤5μl的所述缓冲溶液中执行。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)中，将结合到所述核酸结合相的所述核酸用所述缓冲溶液洗涤至少一次，优选洗涤两次。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中，所述核酸是DNA或RNA，优选是病毒DNA或病毒RNA。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的方法，其中，所述样品包括真核细胞，优选为人类细胞，更优选为上皮细胞。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中，所述样品包括在步骤(i)之前裂解的细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述样品还包括细菌和/或病毒。
12.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中，所述核酸结合相包括硅石。
13.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法，其中，所述核酸结合相包括磁性颗粒。
14.根据权利要求1至13中的任一项所述的方法，其中，所述方法利用微流体设备来执行。
15.根据权利要求1至14中的任一项所述的方法，其中，所述方法利用磁性毛细管阀来执行。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(i)和步骤(ii)在室温下执行并且步骤(iii)在≥40℃，优选为50℃至70℃，更优选为60℃至70℃，最优选为65℃的温度下执行。
17.一种包括用于纯化核酸的缓冲剂的缓冲溶液的用途，所述溶液具有≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM的盐浓度，并且pH≥7.5，优选为pH≥9。
18.根据权利要求17所述的缓冲溶液的用途，其中，所述缓冲溶液用于洗涤和洗脱核酸。
19.根据权利要求17或18中的任一项所述的缓冲溶液的用途，其中，所述缓冲剂是Tris-HCl。
20.根据权利要求19所述的缓冲溶液的用途，其中，Tris-HCl的浓度为10mM。
21.根据权利要求17至20中的任一项所述的缓冲溶液的用途，其中，所述核酸是DNA或RNA，优选为病毒DNA或病毒RNA。
22.一种用于纯化核酸至≤50μl的洗脱体积的试剂盒，包括：
-核酸结合相，
-缓冲溶液，其包括用于洗涤和洗脱所述核酸的缓冲剂或干燥形式的所述缓冲溶液，
-用于检测经纯化的核酸的器件。
23.根据权利要求22所述的用于纯化核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括芯片格式环境的小型化实验室。
24.根据权利要求22或23中的任一项所述的用于纯化核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括裂解试剂。
25.根据权利要求22至24中的任一项所述的试剂盒，其用作诊断测试，优选用作用于分子诊断的手持式集成测试。
26.一种用于执行根据权利要求1至16所述的方法的筒，包括：
-包括核酸结合相的第一室，
-连接到所述第一室的第二室，所述第二室包括缓冲溶液，所述缓冲溶液包括用于洗涤和洗脱所述核酸的缓冲剂或干燥形式的所述缓冲溶液，
-连接到所述第二室的第三室，所述第三室包括含有所述第二室的所述缓冲溶液的缓冲溶液或干燥形式的所述缓冲溶液。
27.根据权利要求26所述的筒，其中，所述核酸结合相包括磁性颗粒。
28.根据权利要求26和27所述的筒，其中，所述筒适于用在微流体设备中。
29.根据权利要求26至28所述的筒，其中，所述筒包括磁性毛细管阀。
30.根据权利要求26至29所述的筒，其中，所述筒包括连接到所述第三室的第四室，所述第四室包括含有所述第二室的所述缓冲溶液的缓冲溶液或干燥形式的所述缓冲溶液。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15202803.1 | 2015-12-28 | ||
| EP15202803 | 2015-12-28 | ||
| PCT/EP2016/082733 WO2017114844A1 (en) | 2015-12-28 | 2016-12-27 | Nucleic acid purification system using a single wash and elution buffer solution |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108473983A true CN108473983A (zh) | 2018-08-31 |
| CN108473983B CN108473983B (zh) | 2022-09-13 |
Family
ID=55229486
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201680076992.3A Active CN108473983B (zh) | 2015-12-28 | 2016-12-27 | 使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液的核酸纯化系统 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11427815B2 (zh) |
| EP (1) | EP3397763B1 (zh) |
| JP (1) | JP7068183B2 (zh) |
| CN (1) | CN108473983B (zh) |
| BR (1) | BR112018013153A2 (zh) |
| RU (1) | RU2766005C2 (zh) |
| WO (1) | WO2017114844A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110546259A (zh) * | 2017-04-11 | 2019-12-06 | 罗伯特·博世有限公司 | 核酸的解吸 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112239775A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-01-19 | 苏州创澜生物科技有限公司 | 一种用于核酸提取的洗涤缓冲液 |
| CN114350652A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-04-15 | 力因精准医疗产品（上海）有限公司 | 血液游离dna提取试剂盒及核酸提取方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6111096A (en) * | 1997-10-31 | 2000-08-29 | Bbi Bioseq, Inc. | Nucleic acid isolation and purification |
| WO2008000343A1 (en) * | 2006-06-30 | 2008-01-03 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid extraction method |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4843155A (en) * | 1987-11-19 | 1989-06-27 | Piotr Chomczynski | Product and process for isolating RNA |
| NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
| US5346994A (en) * | 1992-01-28 | 1994-09-13 | Piotr Chomczynski | Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins |
| US5945515A (en) * | 1995-07-31 | 1999-08-31 | Chomczynski; Piotr | Product and process for isolating DNA, RNA and proteins |
| RU2119954C1 (ru) * | 1996-12-27 | 1998-10-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных | Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот |
| US6120985A (en) * | 1997-10-31 | 2000-09-19 | Bbi Bioseq, Inc. | Pressure-enhanced extraction and purification |
| EP0967218A1 (en) | 1998-05-26 | 1999-12-29 | Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam | Silica-guanidiniumthiocyanate DNA isolation using casein |
| AU2005241080B2 (en) * | 2004-05-03 | 2011-08-11 | Handylab, Inc. | Processing polynucleotide-containing samples |
| WO2005121336A1 (ja) * | 2004-06-08 | 2005-12-22 | Toagosei Co., Ltd. | 環境dnaの精製方法及び環境dnaからのタンパク質をコードする遺伝子の効率的なスクリーニング方法 |
| GB0814570D0 (en) * | 2008-08-08 | 2008-09-17 | Diagnostics For The Real World | Isolation of nucleic acid |
| DE102008063003A1 (de) * | 2008-12-23 | 2010-06-24 | Qiagen Gmbh | Nukleinsäureaufreinigungsverfahren |
| ES2735514T3 (es) * | 2009-02-03 | 2019-12-19 | Ande Corp | Purificación de ácido nucleico |
| WO2011081869A2 (en) * | 2009-12-14 | 2011-07-07 | Betty Wu | Method and materials for separating nucleic acid materials |
| EP2678429B1 (en) * | 2011-02-21 | 2018-04-18 | Rheonix, Inc. | Microfluidic device-based nucleic acid purification method |
| US20130122496A1 (en) | 2011-09-30 | 2013-05-16 | Blood Cell Storage, Inc. | Storage of nucleic acid |
| US9340828B2 (en) * | 2011-10-27 | 2016-05-17 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Purification of nucleic acid |
| JP5954532B2 (ja) * | 2012-04-05 | 2016-07-20 | セイコーエプソン株式会社 | 核酸抽出用デバイス、核酸抽出用キット、核酸抽出用装置及び核酸抽出方法 |
| US20140120544A1 (en) | 2012-10-25 | 2014-05-01 | Neumodx Molecular, Inc. | Method and materials for isolation of nucleic acid materials |
| US9455053B2 (en) | 2013-09-16 | 2016-09-27 | Westinghouse Electric Company Llc | SiC matrix fuel cladding tube with spark plasma sintered end plugs |
| CN103834637A (zh) | 2014-03-20 | 2014-06-04 | 陆欣华 | 一种磁性纳米颗粒对核酸的提取方法和应用 |
| US9510347B2 (en) | 2014-05-08 | 2016-11-29 | Cisco Technology, Inc. | Timeslot distribution in a distributed routing protocol for deterministic wireless networks |
-
2016
- 2016-12-27 WO PCT/EP2016/082733 patent/WO2017114844A1/en active Application Filing
- 2016-12-27 US US16/065,843 patent/US11427815B2/en active Active
- 2016-12-27 CN CN201680076992.3A patent/CN108473983B/zh active Active
- 2016-12-27 JP JP2018552915A patent/JP7068183B2/ja active Active
- 2016-12-27 EP EP16822692.6A patent/EP3397763B1/en active Active
- 2016-12-27 RU RU2018127652A patent/RU2766005C2/ru active
- 2016-12-27 BR BR112018013153-9A patent/BR112018013153A2/pt unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6111096A (en) * | 1997-10-31 | 2000-08-29 | Bbi Bioseq, Inc. | Nucleic acid isolation and purification |
| WO2008000343A1 (en) * | 2006-06-30 | 2008-01-03 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid extraction method |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| REMCO C. DEN DULK等: "Magneto-capillary valve for integrated purification and enrichment of nucleic acids and proteins", 《LAB ON A CHIP》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110546259A (zh) * | 2017-04-11 | 2019-12-06 | 罗伯特·博世有限公司 | 核酸的解吸 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20190300873A1 (en) | 2019-10-03 |
| EP3397763B1 (en) | 2020-10-28 |
| BR112018013153A2 (pt) | 2018-12-11 |
| EP3397763A1 (en) | 2018-11-07 |
| US11427815B2 (en) | 2022-08-30 |
| CN108473983B (zh) | 2022-09-13 |
| WO2017114844A1 (en) | 2017-07-06 |
| RU2018127652A3 (zh) | 2020-05-13 |
| JP7068183B2 (ja) | 2022-05-16 |
| RU2018127652A (ru) | 2020-01-30 |
| RU2766005C2 (ru) | 2022-02-07 |
| JP2019504640A (ja) | 2019-02-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2217703B1 (en) | Method for isolation of genomic dna, rna and proteins from a single sample | |
| US9624252B2 (en) | Selective nucleic acid fragment recovery | |
| US8110351B2 (en) | Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample | |
| JP6204664B2 (ja) | Ｒｎａおよびｄｎａの並行単離および／または並行精製のためのプロセス | |
| CN107043766A (zh) | 一种即用型的核酸磁珠提取试剂 | |
| US8202693B2 (en) | Method of isolation of nucleic acids | |
| CN108138365B (zh) | 一种高通量的单细胞转录组建库方法 | |
| JP2007275059A (ja) | 核酸の精製方法及び精製装置 | |
| JP2009508496A (ja) | 核酸の単離方法 | |
| JP2012502632A (ja) | スモールｒｎａの単離法 | |
| CN101268189A (zh) | 分离核酸的方法 | |
| JP2016535994A (ja) | 階層的シリカナノ膜の作製及びその核酸の固相抽出への使用 | |
| JP6886965B2 (ja) | 携帯型核酸抽出器具及びその使用方法 | |
| CN108473983A (zh) | 使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液的核酸纯化系统 | |
| EP2798327B1 (en) | Compositions and methods for sample preparation | |
| CN103695419B (zh) | 一种病毒核酸提取试剂 | |
| Dash et al. | Isolation of DNA by using column-based extraction system | |
| Legler et al. | Fetal DNA: strategies for optimal recovery | |
| Atamian et al. | Construction of RNA-Seq libraries from large and microscopic tissues for the Illumina sequencing platform | |
| CN106867994A (zh) | 应用于质粒dna提取的快速沉淀缓冲液及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |