JP6886965B2 - 携帯型核酸抽出器具及びその使用方法 - Google Patents
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Description
図3.a.は、抽出したゲノムDNAの濃度及び純度決定について示す。方法200を使用して生物試料由来のゲノムDNAを抽出した。生物試料は、100マイクロリットル分量のウシ血液6種であった。溶解緩衝液としてpH6.8の0.01mMトリスHClを用いて溶解201を実施した。この例では特定の溶解緩衝液を使用したが、その他の溶解緩衝液を使用してもよい。結合202は、結合緩衝液として、pH3.0の、6M次亜塩素酸ナトリウムの200mMグリシン塩酸塩を添加することを含んでいた。この例では特定の結合緩衝液を使用したが、その他の結合緩衝液を使用してもよい。インキュベーション203は、エタノールを添加して、処理した生物試料を10分間撹拌することを含んでいた。洗浄204は、洗浄緩衝液として200mMグリシン塩酸塩200マイクロリットル及び70%(体積/体積)エタノール250μLを用いて実施され、処理した生物試料を2分間から5分間撹拌することを含んでいた。この例では特定の洗浄緩衝液を使用したが、その他の洗浄緩衝液を使用してもよい。溶出205は、溶出緩衝液としてpH8.8の10mMトリスHCl緩衝液を用いて実施され、90セルシウス度で10分間のインキュベーションを含んでいた。この例では特定の溶出緩衝液を使用したが、その他の溶出緩衝液を使用してもよい。分析206は、DNA濃度及び純度の測定を含んでいた。DNA濃度は、分光光度計を用いて紫外可視光線のDNA吸光度により測定し、純度は、260ナノメートル(nm)及び280nmでの吸光度測定値の比率(ration)を算出することにより測定した。図3.a.は、携帯型核酸抽出器具及び方法200での抽出により、良好と許容され(例えば吸光度比(ration)1.3から1.8を有する)、さらなる活用及び定量分析に適した質のDNAが生じることを実証している。
図3.b.は、方法200で抽出したゲノムDNAを鋳型として使用した、ウシグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子のPCR増幅及びゲル電気泳動を示す。100マイクロリットル分量のウシ血液6種を出発材料として使用した。実施例1の方法200を使用して、これらの生物試料のゲノムDNAを抽出した。分析206は、PCR反応物15マイクロリットル中の、試料6種それぞれから得られた溶出液1マイクロリットルを使用した、GAPDH遺伝子のPCR増幅を含んでいた。PCR反応産物6種を1%アガロースゲルで泳動し、サイバーグリーンで染色して、抽出したDNAを可視化した。レーン1から6は、得られたPCR産物6種それぞれに対応する。レーンNは陰性コントロールである。レーンPは、GAPDH遺伝子をPCR増幅するための鋳型としてウシゲノムDNA40ナノグラムを使用した陽性コントロールである。図3.b.は、レーン1から6のそれぞれにおける約650塩基対の明確なPCR産物を示しており、携帯型核酸抽出器具及び方法200によって、例えば所与のDNA配列が存在するか存在しないかを定性的に決定するためのその後のPCR増幅に適した抽出ゲノムDNAが生じることを示している。
図3.c.は、方法200で抽出したゲノムDNAを鋳型として使用した、ウシベータカゼイン遺伝子領域のRCA及びゲル電気泳動を示す。100マイクロリットル分量のウシ血液6種を出発材料として使用した。実施例1の方法200を使用して、これらの生物試料からゲノムDNAを抽出した。分析206は、生物試料から抽出したゲノムDNA中のウシ(bone)ベータカゼイン遺伝子に特異的なパッドロックプローブをライゲーションし、Bst DNAポリメラーゼを使用して、ライゲーションしたパッドロックプローブに特異的なプライマーを増幅することを含んでいた。増幅産物6種を1%アガロースゲルで泳動し、サイバーグリーンで染色して、増幅されたDNAを可視化した。MWSと記したレーンは、100塩基対分子量ラダーを含むサイズ標準コントロールレーンである。図3.c.は、ウシベータカゼイン遺伝子に特異的なパッドロックプローブの増幅を示す、レーン1から6のバンド形成パターンの可視化を示しており、携帯型核酸抽出器具及び方法200によって、例えば所与のDNA配列が存在するか存在しないかを定性的に決定するためのその後のローリングサークル増幅に適した抽出ゲノムDNAが生じることを示している。
Claims (40)
- 柄、
柄に取り付けられた棒、並びに
棒に取り付けられた先端部
を含む携帯型核酸抽出器具であって、
柄、棒、及び先端部が一体として形成されており、
柄、棒、及び先端部を形成する材料が、核酸と結合するように構成されており、且つポリスチレン、官能化ポリスチレン及びシリカ由来材料からなる群のうち少なくとも1つから選択される、核酸抽出用の携帯型核酸抽出器具、
第1のボトルに入った溶解緩衝液、
第2のボトルに入った結合緩衝液、
第3のボトルに入った洗浄緩衝液、
第4のボトルに入った溶出緩衝液、並びに
少なくとも3本のキット試料チューブ
を含む容器
を含む携帯型核酸抽出キット。 - 容器が、第5のボトルに入ったエタノールをさらに含む、請求項1に記載の携帯型核酸抽出キット。
- 携帯型核酸抽出器具が、核酸と結合するように構成されている核酸結合性媒体をさらに含む、請求項1に記載の携帯型核酸抽出キット。
- 柄、
柄に取り付けられた棒、並びに
棒に取り付けられた先端部
を含む、核酸抽出用の携帯型核酸抽出器具であって、
柄、棒、及び先端部が一体として形成されており、
柄、棒、及び先端部を形成する材料が、核酸と結合するように構成されており、且つポリスチレン、官能化ポリスチレン及びシリカ由来材料からなる群のうち少なくとも1つから選択される、核酸抽出用の携帯型核酸抽出器具。 - 核酸と結合するように構成されている、先端部に取り付けられた核酸結合性媒体
をさらに含む、請求項4に記載の携帯型核酸抽出器具。 - 先端部が、核酸と結合するように構成されており、ポリスチレン、官能化ポリスチレン、及びシリカ由来材料からなる群のうち少なくとも1つから選択される、請求項4に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 核酸結合性媒体が繊維の形態である、請求項5に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 繊維がシリカ繊維である、請求項7に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 繊維がポリスチレン繊維である、請求項7に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 核酸結合性媒体がビーズの形態である、請求項5に記載の携帯型核酸抽出器具。
- ビーズが、シリカマイクロビーズ、シリカナノ粒子、ポリスチレンマイクロビーズ、ポリスチレンナノ粒子、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項10に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 核酸結合性媒体がタンパク質である、請求項5に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 携帯型核酸抽出器具を使用する核酸抽出方法であって、
核酸を有する生物試料を溶解緩衝液で処理して、生物試料中の細胞を溶解させること、
処理した生物試料中の核酸を、結合緩衝液で携帯型核酸抽出器具の先端部に結合させること、
核酸と結合した携帯型核酸抽出器具の先端部をインキュベートすること、
核酸と結合した携帯型核酸抽出器具の先端部を洗浄緩衝液で洗浄すること、
携帯型核酸抽出器具の先端部に結合した核酸を溶出緩衝液で溶出させること、
を含み、
携帯型核酸抽出器具は、
柄、
柄に取り付けられた棒、並びに
棒に取り付けられた先端部
を含む、携帯型核酸抽出器具であって、
柄、棒、及び先端部が一体として形成されており、
柄、棒、及び先端部を形成する材料が、核酸と結合するように構成されており、且つポリスチレン、官能化ポリスチレン及びシリカ由来材料からなる群のうち少なくとも1つから選択される、核酸抽出方法。 - インキュベートすることが、携帯型核酸抽出器具の先端部をエタノールと接触させることをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 溶解緩衝液が10mMトリス塩酸塩水溶液であり、
結合緩衝液が、pH2.0から4.0を有する、6M水性次亜塩素酸ナトリウム及び200mM水性グリシン塩酸塩の組合せであり、
洗浄緩衝液が、水性グリシン塩酸塩及び水性エタノール(エタノール体積/水体積)の組合せであり、
溶出緩衝液が、pH7.0から10.0を有する水性トリス塩酸塩である、
請求項13に記載の方法。 - 溶解緩衝液が、リゾチーム、プロテイナーゼk、及び水酸化ナトリウムからなる群から選択される物質をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 溶解緩衝液が、0.2から5パーセントtriton x−100(triton x−100体積/水体積)、2から50mM水性トリス塩酸塩、及びpH5.5から7.5を有する1mM水性エチレンジアミン四酢酸、及びこれらの組合せからなる群から選択され、
結合緩衝液が、pH2.0から4.0を有する、水性次亜塩素酸ナトリウム及びグリシン塩酸塩の混合物、pH3.6から5.6を有する、水性トリス塩酸塩及び水性酢酸ナトリウム/酢酸の混合物、pH3.0から6.2を有する水性クエン酸ナトリウム/クエン酸、5から7M水性過塩素酸ナトリウム、6M水性硝酸ナトリウム、4から5M水性塩化ナトリウム、4から5M水性塩化カリウム、4から6M水性グアニジン塩酸塩、4から6M水性グアニジンチオシアン酸塩、4から6M水性ヨウ化物、及び4から6M水性尿素、及びこれらの組合せからなる群から選択され、
洗浄緩衝液が、5から7M水性過塩素酸ナトリウム、5から7M水性硝酸ナトリウム、4から5M水性塩化ナトリウム、4から5M水性塩化カリウム、4から6M水性グアニジン塩酸塩、4から6M水性グアニジンチオシアン酸塩、4から6M水性ヨウ化物、4から6M水性尿素、及び100から300mM水性グリシン塩酸塩、及びこれらの組合せからなる群から選択され、
溶出緩衝液が、超純水、pH7.4から9を有する水性トリス塩酸塩、及び0.05から0.2mM水性エチレンジアミン四酢酸、及びこれらの組合せからなる群から選択される、
請求項13に記載の方法。 - 先端部が、核酸と結合することができる材料製であり、かつ/又は先端部が、核酸と結合するように構成されている少なくとも1種の構造体を含む、請求項4に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 核酸と結合することができる材料が、ポリスチレン、官能化ポリスチレン、及びシリカ由来材料からなる群のうち少なくとも1つから選択される、請求項18に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 核酸と結合するように構成されている少なくとも1種の構造体が、少なくとも1種の繊維、少なくとも1種のビーズ、少なくとも1種のタンパク質及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項18又は19に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 少なくとも1種の繊維が、シリカ繊維、ポリスチレン繊維及びこれらの組合せから選択される、請求項20に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 少なくとも1種のビーズが、シリカマイクロビーズ、シリカナノ粒子、ポリスチレンマイクロビーズ、ポリスチレンナノ粒子、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項20に記載の携帯型核酸抽出器具。
- 核酸を含む細胞を含む生物試料から核酸を抽出する方法であって、以下の工程:
(a)生物試料に溶解緩衝液を添加すること、
(b)工程(a)で得られた混合物に結合緩衝液を添加すること、
(c)工程(b)で得られた混合物に、請求項4から12及び18から22の何れか一項に記載の携帯型核酸抽出器具の先端部を浸漬すること、
(d)工程(b)で得られた混合物中で携帯型核酸抽出器具の先端部をインキュベートすること、
(e)携帯型核酸抽出器具の先端部を洗浄緩衝液で洗浄すること、
(f)携帯型核酸抽出器具の先端部に結合した核酸を溶出緩衝液で溶出させること
を含む、方法。 - 方法が、工程(a)前若しくは工程(a)中において生物試料に、かつ/又は工程(b)前若しくは工程(b)中において、工程(a)で得られた混合物に、かつ/又は工程(c)前若しくは工程(c)中、又は工程(d)前若しくは工程(d)中において、工程(b)で得られた混合物に、エタノールを添加する工程をさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 溶解緩衝液が、トリス塩酸塩を含む水性緩衝液であり、
結合緩衝液が、次亜塩素酸ナトリウム及びグリシン塩酸塩を含み、pH2.0から4.0であり、
洗浄緩衝液が、グリシン塩酸塩及びエタノールを含む水性緩衝液であり、
溶出緩衝液が、トリス塩酸塩を含み、pH7.0から10.0を有する水性緩衝液である、
請求項23又は24に記載の方法。 - 結合緩衝液が、次亜塩素酸ナトリウム及びグリシン塩酸塩を含み、pH3.0を有する水性緩衝液である、請求項25に記載の方法。
- 溶出緩衝液が、トリス塩酸塩を含み、pH8.8を有する水性緩衝液である、
請求項25又は26に記載の方法。 - 溶解緩衝液が、0.2から5パーセント(v/v)triton x−100を含む水性緩衝液、2から50mMトリス塩酸塩を含む水性緩衝液、エチレンジアミン四酢酸を含み、pH5.5から7.5を有する水性緩衝液、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択され、
結合緩衝液が、次亜塩素酸ナトリウム及びグリシン塩酸塩を含み、pH2.0から4.0を有する水性緩衝液、トリス塩酸塩及び酢酸ナトリウム/酢酸を含み、pH3.6から5.6を有する水性緩衝液、クエン酸ナトリウム/クエン酸を含み、pH3.0から6.2を有する水性緩衝液、過塩素酸ナトリウムを含む水性緩衝液、硝酸ナトリウムを含む水性緩衝液、4から5M塩化ナトリウムを含む水性緩衝液、4から5M塩化カリウムを含む水性緩衝液、4から6Mグアニジン塩酸塩を含む水性緩衝液、4から6Mグアニジンチオシアン酸塩を含む水性緩衝液、4から6Mヨウ化物を含む水性緩衝液、4から6M尿素を含む水性緩衝液、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択され、
洗浄緩衝液が、5から7M過塩素酸ナトリウムを含む水性緩衝液、5から7M硝酸ナトリウムを含む水性緩衝液、4から5M塩化ナトリウムを含む水性緩衝液、4から5M塩化カリウムを含む水性緩衝液、4から6Mグアニジン塩酸塩を含む水性緩衝液、4から6Mグアニジンチオシアン酸塩を含む水性緩衝液、4から6Mヨウ化物を含む水性緩衝液、4から6M尿素を含む水性緩衝液、100から300mMグリシン塩酸塩を含む水性緩衝液、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択され、かつ/又は
溶出緩衝液が、超純水、トリス塩酸塩を含みpH7.4から9を有する水性緩衝液、0.05から0.2mMエチレンジアミン四酢酸を含む水性緩衝液、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、
請求項23又は24に記載の方法。 - 溶解緩衝液が、1パーセント(v/v)triton x−100を含む水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 溶解緩衝液が、10mMトリス塩酸塩を含む水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 溶解緩衝液が、エチレンジアミン四酢酸を含み、pH6.5を有する水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 洗浄緩衝液が、6M過塩素酸ナトリウムを含む水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 結合緩衝液が、次亜塩素酸ナトリウム及びグリシン塩酸塩を含み、pH3.0を有する水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 洗浄緩衝液が、6M過塩素酸ナトリウムを含む水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 洗浄緩衝液が、6M硝酸ナトリウムを含む水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 洗浄緩衝液が、200mMグリシン塩酸塩を含む水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 溶出緩衝液が、0.1mMエチレンジアミン四酢酸を含む水性緩衝液である、請求項28に記載の方法。
- 溶解緩衝液が、リゾチーム、プロテイナーゼK、水酸化ナトリウム及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1種の物質を含む、
請求項23から37の何れか一項に記載の方法。 - 請求項4から12及び18から22の何れか一項に記載の携帯型核酸抽出器具、
少なくとも1種の溶解緩衝液、
少なくとも1種の結合緩衝液、
少なくとも1種の洗浄緩衝液、
少なくとも1種の溶出緩衝液、及び
少なくとも3本の試料チューブ
を含む携帯型核酸抽出キット。 - エタノールをさらに含む、請求項39に記載の携帯型核酸抽出キット。
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