TW201710500A - 選擇性分離核酸之方法及套組 - Google Patents

選擇性分離核酸之方法及套組 Download PDF

Info

Publication number
TW201710500A
TW201710500A TW104129133A TW104129133A TW201710500A TW 201710500 A TW201710500 A TW 201710500A TW 104129133 A TW104129133 A TW 104129133A TW 104129133 A TW104129133 A TW 104129133A TW 201710500 A TW201710500 A TW 201710500A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
solid phase
acid fragment
concentration
phase carrier
Prior art date
Application number
TW104129133A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI691595B (zh
Inventor
yuan-ting Luo
Original Assignee
Imagen Bioscience
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Imagen Bioscience filed Critical Imagen Bioscience
Priority to TW104129133A priority Critical patent/TWI691595B/zh
Priority to CN201610768933.4A priority patent/CN106480014B/zh
Priority to EP16186708.0A priority patent/EP3138913B1/en
Publication of TW201710500A publication Critical patent/TW201710500A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI691595B publication Critical patent/TWI691595B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明揭露一種選擇性分離核酸的方法與套組，其係透過不同種類及濃度的離液鹽、單價離子鹽和擁擠試劑的相互搭配，使得固相載體能夠與不同大小的核酸片段結合，來達到篩選的效果。

Description

選擇性分離核酸之方法及套組
本發明係關於一種核酸分離之技術，特別是指一種選擇性分離核酸之方法及其套組。
隨著人類以及其他物種的基因體逐漸被解碼，以核酸(包括DNA和RNA)作為檢測標的的分子診斷技術成為近年來臨床檢測上的一大重點。無論是DNA或者是RNA，都是由四個核苷酸分子所組成，因此相較於複雜的臨床病理判讀，核酸的分子組成相對簡單，也較為容易進行檢測。
以核酸為標的進行分子診斷的過程中，核酸片段大小的篩選扮演了相當重要的角色。
例如血液系統當中的游離核酸(cell-free nucleic acids)，常被運用作為胎兒產前檢測與癌症檢測的主要核酸來源。但是，游離核酸多為短序列的片段，並且在樣本當中的含量相對於其他大片段核酸較為微量。因此，如何取得足夠含量的短片段核酸，並且去除其他大片段核酸，是決定檢測結果是否準確的重要因素。
另一方面，次世代定序(next generation sequencing；NGS)技術由於其無需利用細菌進行質體的複製、高通量以及時間短等優點，近年來被廣泛的使用在各種以核酸為標的的分子診斷技術當中，作為核酸定序的主要工具。以Illumina系統的NGS為例，其進行主要是先將待測核酸片段化之後，對這些不同大小片段的核酸進行篩選，再依照需求將特定的短序列片段進行純化、回收濃縮或以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)來增幅並建構核 酸庫。再將核酸庫的核酸片段與接合序列連接，將連接後的片段注入到表面帶有接合片段互補序列的晶片上進行橋式PCR以及螢光的標記與偵測。核酸片段的篩選可以應用在核酸庫建構的前處理、去除為未接妥接合序列的核酸片段以及PCR增幅之後除去非目標核酸片段等步驟，以提昇定序過程中核酸的品質與含量。
以往核酸片段的篩選，大多利用膠體電泳將核酸片段分離之後，再將所需片段大小的核酸所在的膠體區域切下進行回收，但是這樣的方法沒有效率且花費許多時間。另有利用具有官能基(例如帶有羧基)的磁珠配合聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)和鹽類的濃度條件，吸附並結合待分離的小片段核酸，但是這樣的方法並不適用於片段大小大於約400個鹼基對以上的核酸序列。而其他非上述的純化方法中，通常則是利用pH值來控制片段的大小，因此在篩選的過程中需要嚴格的控制pH值，造成許多實驗時的困擾。
本發明之主要目的在於提供一種選擇性分離核酸的方法。
為達成前述目的，本發明揭露一種選擇性分離核酸之方法，其步驟如下：混合一樣本核酸與一結合緩衝液以產生一混合溶液，其中該樣本核酸具有一特定大小之核酸片段，該混合溶液具有一離液鹽，以及一單價離子鹽或一擁擠試劑兩者之一種或兩種；使該混合溶液流過一固相載體，而將該特定大小之核酸片段可分離地結合於該固相載體；使一沖洗緩衝液流過該固相載體以清除未與該固相載體結合之物質；以及使一水溶液流過該固相載體以回收該特定片段大小之核酸片段。
本發明另揭露一種選擇性分離核酸之方法，其步驟如下：混合一樣本核酸與一第一結合緩衝液以產生一第 一混合溶液，其中該樣本核酸具有一特定大小之核酸片段，該第一混合溶液具有一離液鹽，使該第一混合溶液流過一第一固相載體，以取得一一次篩選液，其中該一次篩選液含有該特定大小之核酸片段；混合該一次篩選液與一第二結合緩衝液以產生一第二混合溶液，其中該第二混合溶液具有一離液鹽以及一單價離子鹽或一擁擠試劑兩者任意組合；使該第二混合溶液流過一第二固相載體，而將該特定大小之核酸片段可分離地結合於該第二固相載體；使一沖洗緩衝液流過該第二固相載體以清除未與該第二固相載體結合之物質；以及使一水溶液流過該第二固相載體以回收該特定片段大小之核酸片段。
本發明之另一目的在於提供一種選擇性分離核酸的篩選套組。
為達成前述目的，本發明另一種選擇性分離核酸之套組，包含有至少一結合緩衝液以及至少一固相載體。 其中該結合緩衝液具有一離液鹽，以及一單價離子鹽或一擁擠試劑兩者之一種或兩種。
有關本發明之詳細特點，將於後續之詳細說明中予以描述。然而，在本發明領域中具有通常知識者應能瞭解，該等詳細說明以及實施本發明所列舉之特定實施例，僅用於說明本發明，並非用以限制本發明之專利申請範圍。
第1圖(a)至(c)為以不同濃度與種類的離液鹽處理DNA標準溶液後，核酸片段的分離情形。其中，圖(a)第1欄至第7欄分別為以表1-1中條件1至7處理的結果；第(b)圖第8欄至第14欄分別為以表1-2條件8至14處理的結果；第(c)圖第15欄至第17欄分別為以表1-3條件15至17處理的結果，第18欄至第20欄分別為以表1-4條件18至20處理的結果；圖(a)至(c)中的M欄為未處理的DNA標準溶液。
第2圖(a)至(e)為離液鹽在相同濃度下加入不同濃度與種類的單價離子鹽處理DNA標準溶液後，核酸片段的分離情形。其中，(a)圖中的第1欄至第7欄分別為以表2-1條件1至7處理的結果；(b)至(e)圖中的第1欄至第7欄分別為以表2-3條件1至7處理的結果；(f)圖中的第1欄至第7欄分別為以表2-8條件1至7處理的結果；圖(a)至(e)中的M欄為未處理的DNA標準溶液。
第3圖(a)至(c)為相同離液鹽濃度下加入不同濃度的擁擠試劑處理DNA標準溶液後，核酸片段的分離情形。其中，(a)圖中的第1欄至第5欄分別為以表3-1條件1至5處理的結果；(b)圖中的第1欄至第5欄分別為以表3-2條件6至10處理的結果；(c)圖中的第1欄至第3欄分別為以表3-3條件1至3處理的結果，第4欄至第6欄分別為以表3-4條件4至6處理的結果；圖(a)至(c)中的M欄為未處理的DNA標準溶液。
第4圖為混合搭配離液鹽、單價離子鹽與擁擠試劑，以矽質濾柱作為固相載體，在利用不同混合溶液的條件下，篩選一至三次，以觀察核酸片段的分離情形。其中，第AE1欄至第CE3欄分別為以表4-1中的混合溶液條件AM1至CM3處理的結果，M欄為未處理的DNA標準溶液。
第5圖為為混合搭配離液鹽、單價離子鹽與擁擠試劑，以矽質磁珠作為固相載體，在利用不同混合溶液的條件下，篩選一至三次，以觀察核酸片段的分離情形。其中，第DE1欄至第EE3欄分別為以表4-2中的混合溶液條件DM1至EM3處理的結果，M欄為未處理的DNA標準溶液。
本發明所揭露的選擇性分離核酸之方法及套組，係讓操作者可依照預定之核酸序列長度需求，輕易地從含有序列長度不一之核酸樣本中，分離出特定序列長度之核 酸。亦即，本發明提供之方法及套組可讓使用者選擇性分離出特定序列長度之核酸並直接應用至後續工序，能提高後續應用之效能。
此外，由於本發明提供之方法及套組所使用的溶液環境簡單且穩定，無需調控溶液環境中的酸鹼值(pH值)，亦無須倚賴特定改質官能基之載體(例如表面羧基化、胺基化)，適合應用於現有之自動化系統進行高通量之操作。
本發明所揭露的方法與套組僅利用離液鹽(chaotropic salt)、單價離子鹽與擁擠試劑(crowding agent)在不同濃度的環境下，直接影響核酸滯留性之特性，以分階段篩除或滯留的概念，發展出一種簡易、好操作、應用性廣泛且可輕易調整溶液條件的低成本選擇性核酸分離方法及套組。
本發明所述之「核酸」包含但不限於人工合成、天然來源或人工合成與天然來源混摻之核酸。序列片段之大小、長度或尺寸係指任何單股、雙股、互補序列之天然或人工合成核酸，包含DNA、RNA之單元體所組成之核酸序列，其核酸單元體之數量。核酸單元體係指組成核酸序列之計數單元，常用的計數單元包含鹼基、核苷酸等分子。
本發明所稱之離液鹽係指一類可影響水溶液水分子排列的物質，可使如蛋白質與核酸等大分子之分子間氫鍵強度改變。本發明所適用之離液鹽種類包含但不限於：硫氰酸胍(Guanidine thiocyanate；GuSCN)、鹽酸胍(Guanidine hydrochloride；GuHCl)、碘化鈉(Sodium iodide；NaI)、過氯酸鈉(Sodium perchlorate；NaClO4)。本發明所適用之離液鹽在不同濃度下對於核酸片段尺寸之選擇性不同，具體而言，上述離液鹽濃度較低時，僅能保留較大片段的核酸在固相載體中，而濾除較小片段的核酸至濾液(flow-through)當中，隨著濃度的增加，本發明所適用之離液鹽可以逐漸將較小片 段的核酸保留在固相載體上。
本發明所稱之單價離子鹽係指由單價陽離子與單價陰離子以離子鍵結合而成的化合物，而本發明所適用之單價離子鹽種類包含：單價陽離子氯化鹽、單價陽離子醋酸鹽。其中，單價陽離子氯化鹽包含但不限於：氯化鋰(LiCl)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化銨(NH4Cl)，本實施例中係以氯化鋰為一個較佳的實驗例。而單價陽離子醋酸鹽包含但不限於：醋酸鋰(LiOAc)、醋酸鈉(NaOAc)、醋酸鉀(KOAc)、醋酸銨(NH4OAc)。根據本發明之實驗例，利用醋酸鋰、醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨測試單價離子鹽搭配離液鹽所達成核酸片段尺寸之選擇性。由實驗例可得知單價陽離子鹽類在不同濃度對於核酸片段尺寸之選擇性，具體而言，單價陽離子鹽類濃度較低時，能保留片段尺寸較小的核酸在固相載體中；隨著單價陽離子鹽類濃度的增加，逐漸喪失對較小片段核酸的保留能力，僅能將較大片段的核酸保留於固相載體中，濾除較大範圍(指核酸尺寸分布的範圍)的小片段核酸至濾液中。
本發明所指稱之擁擠試劑係指可佔有溶液的大部分體積而造成使得其溶質聚集或濃縮於較少水溶液中，包含單元醇類、多元醇類及大分子聚合物等。本發明所適用之擁擠試劑種類包含但不限於：乙醇(Ethanol)、異丙醇(Isopropanol)、聚乙二醇(Polyethylene glycol；PEG)。本發明之實驗例中，分別以乙醇、異丙醇、聚乙二醇測試擁擠試劑搭配離液鹽所達成核酸片段尺寸之選擇性。當擁擠試劑溶液濃度較低時，僅能保留較大片段的核酸在固相載體中，而濾除較小片段的核酸至濾液中；隨著濃度的增加，上述擁擠試劑可以逐漸將較小片段的核酸保留在固相載體中。
以下將藉由所列舉之實驗例，配合隨附之圖式，詳細說明本發明之技術內容及特徵。
實驗一：不同種類和濃度的離液鹽對於選擇核酸片段大小的影響
將20μL 1kb DNA標準品(Sharp DNA Ladder Markers 1kb，ELPIS Biotech，韓國)與20μL 100bp DNA標準品(Sharp DNA Ladder Markers 100bp，ELPIS Biotech，韓國)混合作為測試用之DNA標準溶液。如以下表1-1至表1-4所示，將前述40μL DNA標準溶液與結合緩衝液混合之後，在混合溶液的最終體積200μL、濃度介於0.6M至4M之間的鹽酸胍(guanidine hydrochloride；GuHCl)、最終體積200μL、濃度介於0.6M至4M之間的異硫氰酸胍(guanidine thiocyanate；GuSCN)、最終體積200μL、濃度介於2.5M至3.5M之間的碘化鈉(sodium iodide；NaI)以及最終體積200μL、濃度介於2.5M至3.5M之間的過氯酸鈉(sodium perchlorate；NaClO4)等條件下，測得各條件下最終混合溶液內的pH值分別介於5.44至5.84、5.59至5.73、6.25至6.40以及6.66至6.57，加入矽質濾柱(MinElute® Spin Columns,Qiagen)中以13000rpm離心1分鐘，使DNA與矽質濾柱中的固相載體結合。離心之後，在矽質濾柱內加入60%酒精500μL作為清洗緩衝液，再次以13000rpm離心1分鐘，以清除掉未與矽質濾柱結合的DNA片段。在矽質濾柱內加入40μL的水，以13000rpm離心1分鐘，使DNA與矽質濾柱分離，取得最終產物。將在前述條件的濃度下進行核酸篩選的產物進行膠體電泳，實驗結果如第1圖與表1-1至表1-4所示。
第1圖中的圖(a)顯示不同濃度的鹽酸胍下，核酸片段的分離情形，可以看到，在鹽酸胍濃度為0.6M時，會篩選出大於4000bp的核酸片段，亦即小於4000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在鹽酸胍濃度為0.7M時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在鹽酸胍濃度為 0.8M時，會篩選出大於300bp的核酸片段，亦即小於300bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在鹽酸胍濃度為0.9M時，會篩選出大於200bp的核酸片段，亦即小於200bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在鹽酸胍濃度為1M時，會篩選出大於200bp的核酸片段，亦即小於200bp的核酸片段都被篩選掉了；在鹽酸胍濃度為2M與4M時，會篩選出大於100bp的核酸片段，亦即小於100bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。上述鹽酸胍濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表1-1所示。
第1圖中圖(b)另顯示出不同濃度的異硫氰酸胍下，核酸片段的分離情形。在異硫氰酸胍濃度為0.6M時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在異硫氰酸胍濃度為0.7M時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在異硫氰酸胍濃度為0.8M、0.9M和1M時，會篩選出大於200bp的核酸片段，亦即小於200bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔 除掉；在異硫氰酸胍濃度為1.5M和3M時，會篩選出大於100bp的核酸片段，亦即小於100bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。上述異硫氰酸胍濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表1-2所示。
第1圖中圖(c)顯示出不同濃度的碘化鈉下，核酸片段的分離情形。在碘化鈉濃度為2.5M時，並未明顯看到有核酸片段固相載體結合而被保留下來；在碘化鈉濃度為3M時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在碘化鈉濃度為3.5M時，會篩選出大於200bp的核酸片段，亦即小於200bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。上述碘化鈉濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表1-3所示。
第1圖中的圖(c)另顯示出不同濃度的過氯酸鈉下，核酸片段的分離情形。在過氯酸鈉濃度為2.5M時，並未明顯看到有核酸片段與固相載體結合而被保留下來；在過氯酸鈉濃度為3M時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在過氯酸鈉濃度為3.5M時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。上述過氯酸鈉濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表1-4所示。
透過實驗一的結果可以得知，不論是異硫氰酸胍、鹽酸胍、碘化鈉或是過氯酸鈉，隨著離液鹽濃度的增加，可以抓取到更小片段的核酸，反之亦然。再者，透過實際量測混合溶液內的酸鹼值，可以發現混合溶液內的pH值變動範圍非常小，顯示透過不同濃度的離液鹽能夠選擇性地分離不同片段大小的核酸，此一特性與混合溶液內的pH值並無相關性。
實驗二：相同離液鹽濃度下不同濃度、種類的單價離子鹽類對於篩選核酸片段大小的影響
1. 異硫氰酸胍加上不同濃度的氯化鋰
測試用之DNA標準溶液依照實驗一的方式加以配製。將40μL DNA標準溶液分別與不同條件的200μL結合緩衝液混合均勻之後，依照實驗一的方式進行核酸的篩選。其中，最終混合溶液的組成條件如以下表2-1所示，異硫氰酸胍最終濃度固定為0.833M，加上最終濃度分別為0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M的氯化鋰(LiCl)。
將加入前述組合條件1到7的結合緩衝溶液進行核酸篩選的產物進行膠體電泳，實驗結果如第2圖中的圖(a)與表2-2所示。
第2圖中的圖(a)顯示異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度氯化鋰作為結合緩衝液，測得各條件下最終混合溶液內的pH值介於5.82至5.88，篩選後產物的核酸片段分離情形。在氯化鋰濃度為0.104M、0.208M、0.3125M時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在氯化鋰濃度為0.416M和0.52M時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在氯化鋰濃度為0.625M時，會篩選出大於2000bp的核酸片段，亦即小於2000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。混合溶液中氯化鋰濃度與核酸片段篩選的關連性，整理 如以下表2-2。
2. 以醋酸根為陰離子測試四種不同的一價陽離子
測試用之DNA標準溶液依照實驗一的方式加以配製。將40μL DNA標準溶液分別與不同條件的200μL結合緩衝液混合均勻之後，依照實驗一的方式進行核酸的篩選。其中，最終混合溶液的組成條件如表2-3所示，異硫氰酸胍最終濃度固定為0.833M，加上陰離子為醋酸根(OAc-)、陽離子各為鋰(Li+)、鈉(Na+)、鉀(K+)和銨根(NH4 +)的鹽類，最終濃度分別為0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M。
將前述組合條件1到6的最終混合溶液進行核酸篩選後的產物進行膠體電泳，實驗結果如第2圖中圖(b)至圖(e)與表2-4至表2-7所示。
第2圖中的圖(b)顯示異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度醋酸鋰(LiOAc)作為結合緩衝液，測得各條件下最終混合溶液內的pH值介於7.77至7.90之間，篩選後產物的核酸片段分離情形。在醋酸鋰濃度為0.104M時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸鋰濃度為0.208M時，會篩選出大於5000bp的核酸片段，亦即小於5000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸鋰濃度為0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M時，沒有留下任何核酸片段，亦即沒有任何核酸片段與載體結合了。最終混合溶液中醋酸鋰濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表2-4。
第2圖中的圖(c)顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度醋酸鈉(NaOAc)，且測得各條件下最終混合溶液內的pH值介於7.76至8.03，篩選後產物的核酸片段分離情形。在醋酸鈉濃度為0.104M時，會篩 選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸鈉濃度為0.208M時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸鈉濃度為0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M時，沒有留下任何核酸片段，亦即所有核酸片段都與載體結合。結合緩衝液中醋酸鈉濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表2-5。
第2圖中的圖(d)顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度醋酸鉀(KOAc)的條件下，測得各條件下混合溶液之pH值介於7.88至8.03之間，篩選後產物的核酸片段分離情形。在醋酸鉀濃度為0.104M時，會篩選出大於200bp的核酸片段，亦即小於200bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸鉀濃度為0.208M時，會篩選出大於300bp的核酸片段，亦即小於300bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸鉀濃度為0.3125M時，會篩選出大於400bp的核酸片段，亦即小於400bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸鉀濃度為0.416M和0.52M時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除 掉；在醋酸鉀濃度為0.625M時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。最終混合溶液中醋酸鉀濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表2-6。
第2圖中的圖(e)顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度醋酸銨(NH4OAc)的條件下，測得最終混合溶液內的pH值介於6.58至6.68之間，篩選後產物的核酸片段分離情形。在醋酸銨濃度為0.104M時，會篩選出大於200bp的核酸片段，亦即小於200bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.208M時，會篩選出大於300bp的核酸片段，亦即小於300bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.3125M時，會篩選出大於400bp的核酸片段，亦即小於400bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.416M時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.52M時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.625M時，會篩選出大於2000bp的核 酸片段，亦即小於2000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。最終混合溶液中醋酸銨濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表2-7。
第2圖中圖(b)至(e)與表2-4至表2-7所顯示的實驗結果看來，在以醋酸根為陰離子的條件之下，不同濃度的四種鹽類醋酸鋰、醋酸鈉、醋酸鉀和醋酸銨對於核酸片段大小的篩選上均有所不同。也能夠很明顯的看出，四種不同的一價陽離子對於不同大小的核酸片段具有顯著的篩選差異。
3. 以碘化鈉作為單離子鹽測試醋酸銨濃度對於選擇核酸片段大小的影響
測試用之DNA標準溶液依照實驗一的方式加以配製。將40μL DNA標準溶液分別與不同條件的200μL結合緩衝液混合均勻之後，依照實驗一的方式進行核酸的篩選。其中，最終混合溶液的組成條件如表2-8所示，碘化鈉最終濃度固定為3M，加上醋酸銨最終濃度分別為0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M。
第2圖中的圖(f)顯示最終混合溶液含有碘化鈉濃度3M加上不同濃度醋酸銨作為結合緩衝液，測得各條件下 最終混合溶液內的pH值介於6.70至6.88，篩選後產物的核酸片段分離情形。在醋酸鈉濃度為0.104M、0.208M時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；醋酸鈉濃度為0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。最終混合溶液中加入碘化鈉作為離液鹽時，醋酸鈉濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表2-8。
第2圖中的圖(f)與表2-8所顯示的實驗結果看來，在最終混合溶液中含有碘化鈉作為離液鹽的條件下，不同濃度的醋酸銨對於核酸片段大小的選擇上均有所不同。
透過實驗二的結果可以得知，在相同的離液鹽濃度下，隨著單價離子鹽的濃度增加，小片段核酸越不易被抓取，反之亦然。不管是以氯化鋰，或是醋酸根離子為固定的陰離子種類，搭配四種不同的一價陽離子(鋰、鈉、鉀、銨)，都有類似的現象，其中又以醋酸根離子為陰離子的鹽類最為顯著，並且不同的單價陽離子對於核酸大小篩選具有差異性。再者，透過實際量測混合溶液內的酸鹼值，可以發現 混合溶液內的pH值變動範圍非常小，顯示透過離液鹽與單價離子鹽的搭配，能夠選擇性地分離不同片段大小的核酸，此一特性與混合溶液內的pH值並無相關性。
實驗三：相同離液鹽濃度搭配不同濃度、種類的擁擠試劑對於篩選核酸片段大小的影響
1. 不同濃度、種類的擁擠試劑對於篩選核酸片段大小的影響
測試用DNA標準溶液依照實驗一的方式加以配製。將40μL DNA標準溶液分別與不同條件的200μL結合緩衝液混合均勻之後，依照實驗一的方式進行核酸的篩選。其中，最終混合溶液的組成條件如以下表3-1、表3-2所示，異硫氰酸胍最終濃度固定為0.52M，加上最終濃度分別為2.5%、5%、10%、15%、20%的乙醇(ethanol)，或是最終濃度分別為2.5%、5%、10%、15%、20%的異丙醇(isopropanol)。將條件1到11的最終混合溶液進行核酸篩選的產物進行膠體電泳，實驗結果如第3圖中的圖(a)、(b)與表3-1、表3-2所示。
第3圖中的圖(a)顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.52M加上不同濃度乙醇，測得最終混合溶液內的pH值介於6.04至6.22之間，篩選後產物的核酸片段分離情形。在乙醇濃度為2.5%時，會篩選出大於3000bp的核酸片段，亦即小於3000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在乙醇濃度為5%時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在乙醇濃度為10%時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在乙醇濃度為15%時，會篩選出大於300bp的核酸片段，亦即小於300bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在乙醇濃度為20%時，會篩選出大於200bp的核酸片 段，亦即小於200bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。最終混合溶液中乙醇濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表3-1。
第3圖中的圖(b)顯示最終混合溶液含有異硫氰酸胍濃度0.52M加上不同濃度異丙醇的條件下，測得最終混合溶液內的pH值介於5.79至6.01之間，篩選後產物的核酸片段分離情形。在異丙醇濃度為2.5%時，會篩選出大於2000bp的核酸片段，亦即小於2000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在異丙醇濃度為5%時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在異丙醇濃度為10%時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在異丙醇濃度為15%時，會篩選出大於300bp的核酸片段，亦即小於300bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在異丙醇濃度為20%時，會篩選出大於200bp的核酸片段，亦即小於200bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。最終混合溶液中異丙醇濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表3-2。
表3-2、異丙醇類濃度與所篩選的核酸片段大
第3圖圖(a)、(b)與表3-1、表3-2所顯示的實驗結果看來，不同濃度的乙醇和異丙醇對於核酸片段大小的篩選上均有所不同，隨著醇類的濃度增加，小片段的核酸越能夠被抓取，反之亦然。
2. 不同濃度、分子量的聚二乙醇對於篩選核酸片段大小的影響
測試用DNA標準溶液依照實驗一的方式加以配製。將40μL DNA標準溶液分別與不同條件的200μL結合緩衝液混合均勻之後，依照實驗一的方式進行核酸的篩選。其中，最終混合溶液內的組成條件如以下表3-3、表3-4所示，異硫氰酸胍最終濃度固定為0.6M，加上最終濃度分別為10%、15%、20%的聚乙二醇(PEG4000)，或是最終濃度分別為10%、15%、20%的聚乙二醇(PEG8000)。將條件12到17的最終混合溶液進行核酸篩選的產物進行膠體電泳，實驗結果如第3圖中的圖(c)與表3-3、表3-4所示。
第3圖中的圖(c)顯示最終混合溶液含有異硫氰酸胍濃度0.6M加上不同濃度聚乙二醇(PEG4000)作為結合緩衝液，測得各條件下最終混合溶液內的pH值介於7.76至8.03，篩選後產物的核酸片段分離情形。在聚乙二醇(PEG4000)濃度為10%時，會篩選出大於1000bp的核酸片段，亦即小於 1000bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在聚乙二醇(PEG4000)濃度為15%、20%時，會篩選出大於100bp的核酸片段，亦即小於100bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。最終混合溶液中聚乙二醇(PEG4000)濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表3-3。
第3圖中的圖(c)另顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.6M加上不同濃度聚乙二醇(PEG8000)作為結合緩衝液，測得各條件下最終混合溶液內的pH值介於7.76至8.03，篩選後產物的核酸片段分離情形。在聚乙二醇(PEG8000)濃度為10%時，會篩選出大於500bp的核酸片段，亦即小於500bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉；在聚乙二醇(PEG8000)濃度為15%、20%時，會篩選出大於100bp的核酸片段，亦即小於100bp的核酸片段不會與固相載體結合而被剔除掉。最終混合溶液中聚乙二醇(PEG8000)濃度與核酸片段篩選的關連性，整理如以下表3-4。
第3圖中的圖(c)與表3-3、表3-4所顯示的實驗結果看來，不同濃度與分子量大小的聚二乙醇對於核酸片段大小的選擇上還是稍有不同，隨著聚二乙醇的濃度增加，小片段的核酸越能夠被抓取，反之亦然。而分子量較大的聚二乙醇，越能夠抓取小片段的核酸。
從實驗三所顯示的實驗結果看來，不同濃度的乙醇和異丙醇，或是不同濃度與分子量的聚乙二醇對於核酸片段大小的篩選上均有所不同，隨著擁擠試劑的濃度增加，或是分子量的增加，小片段的核酸越能夠被抓取，反之亦然。再者，透過實際量測混合溶液內的酸鹼值，可以發現混合溶液內的pH值變動範圍非常小，顯示透過不同濃度的離液鹽與擁擠試劑的搭配，能夠選擇性地分離不同片段大小的核酸，此一特性與混合溶液內的pH值並無相關性。
實驗四：混合搭配離液鹽、單價離子鹽與擁擠試劑以分離特定核酸片段
1. 以矽質濾柱作為固相載體
測試用之DNA標準溶液依照實驗一的方式加以配製。將40μL DNA標準溶液分別與60μL結合緩衝液A1、B1、C1混合均勻，形成混合溶液AM1、BM1、CM1，混合均勻後測得AM1、BM1、CM1的pH值分別為6.66、6.63、6.62。將AM1、BM1、CM1分別加入第一矽質濾柱，以13000rpm離心1分鐘，取得第一次篩選後的濾液AF1、BF1、CF1。將AF1、BF1、CF1加入100μL、0.9M的異硫氰酸胍，形成混合溶液AM2、BM2、CM2，混合均勻後測得AM2、BM2、CM2的pH值分別為6.54、6.61、6.53。將AM2、BM2、CM2分別加入第二矽質濾柱，以13000rpm離心1分鐘，取得第二次篩 選後的濾液AF2、BF2、CF2。在AF2、BF2、CF2分別加入40μL、20μL、10μL、100%異丙醇，形成混合溶液AM3、BM3、CM3，混合均勻後測得AM3、BM3、CM3的pH值分別為6.60、6.56、6.55。將AM3、BM3、CM3分別加入第三矽質濾柱，以13000rpm離心1分鐘後，丟棄第三次篩選後的濾液。各混合溶液內各成分的最終濃度及其pH值整理如以下表4-1所示。
分別在第一、二、三矽質濾柱中加入60%的乙醇沖洗，以13000rpm離心1分鐘後，加入40μL純水再次以13000rpm離心1分鐘，分別取得第一次篩選的產物AE1、BE1、CE1，第二次篩選的產物AE2、BE2、CE2，和第三次篩選的產物AE3、BE3、CE3，將這些產物進行膠體電泳，實驗結果如第4圖與表4-2所示。
2. 以矽質磁珠作為固相載體
測試用之DNA標準溶液依照實驗一的方式加以配製。將40μL DNA標準溶液分別與60μL結合緩衝液D1(1.5M異硫氰酸胍、0.8M醋酸銨)與E1(2.5M異硫氰酸胍、2.5M醋酸銨)混合均勻，形成混合溶液DM1、EM1，混合均勻後測得DM1、EM1的pH值分別為6.53、6.60。將DM1、EM1分別與第一矽質磁珠(Magnetic beads MF-SIL-5024，磁量生技，新北市)混合，以震盪器震盪5分鐘後，放置於磁座上吸附磁珠1分鐘，取得第一次篩選後的上清液DS1、ES1。將DS1加入20μL、100%的異丙醇、ES1加入100μL、2.5M的異硫氰酸胍，形成混合溶液DM2、EM2，混合均勻後測得DM2、EM2的pH值分別為6.60、6.54。將DM2、EM2分別與第二矽質磁珠混合，以震盪器震盪5分鐘後，放置於磁座上吸附磁珠1分鐘，取得第二次篩選後的上清液DS2、ES2。將DS2加入120μL、2.5M的異硫氰酸胍，ES2加入200μL、100%的異丙醇，形成混合溶液DM3、EM3，混合均勻後測得DM3、EM3的pH值分別為6.51、6.61。各混合溶液內各成分 的最終濃度及其pH值整理如以下表4-3所示。
分別在第一、二、三矽質磁珠中加入60%的乙醇沖洗，震盪30秒後置放在磁座上1分鐘，移除上清液，室溫風乾5分鐘後，再加入40μL純水，再次震盪1分鐘後置放在磁座上1分鐘，分別抽出上清液，取得第一次篩選的產物DE1、EE1，第二次篩選的產物DE2、EE2，和第三次篩選的產物DE3、EE3，將這些產物進行膠體電泳，實驗結果如第5圖與表4-4所示。
由第4圖與第5圖的結果可知，經由上述篩選步驟，不論是使用矽質濾柱或是矽質磁珠，只要配合最適的溶液條件，便可分別取得特定大小的核酸片段，更可成功分離小片段核酸，並且相同的片段大小的區間，也可透過不同濃度的離液鹽、單價離子鹽及擁擠試劑組合達成篩選的目的，因此可按照操作環境的需求進行多種組合的調整。依照各個電泳圖中篩選後的核酸片段與標準溶液中的核酸片段所顯示的亮度比較顯示，本發明的回收率理想，而適合應用於各片段核酸的分離、純化及回收。再者，透過實際量測混合溶液內的酸鹼值，可以發現混合溶液內的pH值變動範圍非常小，顯示透過不同濃度的離液鹽、單價離子鹽及擁擠試劑的組合，能夠選擇性地分離不同片段大小的核酸，此一特性與混合溶液內的pH值並無相關性。
換言之，透過上述三種不同因素的調控，經過一次、二次或是三次的篩選，便可以將所需要的小片段或是特定片段大小的核酸從樣本當中篩選出來，而能夠快速且有效率的進行核酸大小的純化和篩選。另一方面，本發明所提供的篩選方法，完全不需要改質化的固相載體，而且可以針對100至5000個片段大小間的鹼基對進行篩選，大幅增加了核酸篩選時候的選擇性和可運用性。
在此必須說明者為，以上配合圖式所為之詳細描述，僅係為了說明本發明之技術內容及特徵而提供之一實施方式，凡在本發明領域中具有一般通常知識之人，在瞭解本發明之技術內容及特徵之後，於不違背本發明之精神下，所為之種種簡單之修飾、替換或構件之減省，皆應屬於以下所揭示之申請專利範圍之內。

Claims (23)

  1. 一種選擇性分離核酸之方法，其包含有下列步驟：(a)混合一樣本核酸與一結合緩衝液以產生一混合溶液，其中該樣本核酸具有一特定大小之核酸片段，該混合溶液具有一離液鹽，以及一單價離子鹽或一擁擠試劑兩者之一種或兩種；(b)使該混合溶液流過一固相載體，而將該特定大小之核酸片段可分離地結合於該固相載體；(c)使一沖洗緩衝液流過該固相載體以清除未與該固相載體結合之物質；以及(d)使一水溶液流過該固相載體以回收該特定片段大小之核酸片段。
  2. 如請求項第1項所述之方法，其中步驟(a)之該離液鹽係為鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉或過氯酸鈉。
  3. 如請求項第1項所述之方法，其中步驟(a)之該單價離子鹽係為氯化鋰、醋酸鋰、醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。
  4. 如請求項第1項所述之方法，其中步驟(a)之該擁擠試劑係為乙醇、異丙醇或聚乙二醇。
  5. 如請求項第1項所述之方法，其中該固相載體為矽質濾柱或矽質磁珠。
  6. 如請求項第1項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間時，該特定大小之核酸片段約介於大於100至大於5000個鹼基對之間。
  7. 如請求項第1項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於3.5至0.6之間時，該特定大小之核酸片段約介於大於200至大於2000個鹼基對之間。
  8. 如請求項第1項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於3至0.7之間時，該特定大小之核酸片 段約介於大於300至大於1000個鹼基對之間。
  9. 如請求項第1項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間且該擁擠試劑約介於2.5%至60%時，該特定大小之核酸片段約介於大於50至大於5000個鹼基對之間。
  10. 如請求項第1項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間且該單價離子鹽之莫耳濃度約介於0.1至5時，該特定大小之核酸片段約介於大於300至大於5000個鹼基對之間。
  11. 一種選擇性分離核酸之方法，其包含有下列步驟：(a)混合一樣本核酸與一第一結合緩衝液以產生一第一混合溶液，其中該樣本核酸具有一特定大小之核酸片段，該第一結合緩衝液具有一離液鹽；(b)使該第一混合液流過一第一固相載體，以取得一一次篩選液，其中該一次篩選液含有該特定大小之核酸片段；(c)混合該一次篩選液與一第二結合緩衝液以產生一第二混合溶液，其中該第二混合溶液具有該離液鹽，以及一單價離子鹽或一擁擠試劑兩者之一種或兩種；(d)使該第二混合溶液流過一第二固相載體，而將該特定大小之核酸片段可分離地結合於該第二固相載體；(e)使一沖洗緩衝液流過該第二固相載體以清除未與該第二固相載體結合之物質；以及(f)使一水溶液流過該第二固相載體以回收該特定片段大小之核酸片段。
  12. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(a)之該離液鹽係為鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉或過氯酸鈉。
  13. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(c)之該單價離子鹽係為氯化鋰、醋酸鋰、醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。
  14. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(c)之該擁擠試劑係為乙醇、異丙醇或聚乙二醇。
  15. 如請求項第11項所述之方法，其中該固相載體為矽質濾柱或矽質磁珠。
  16. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間時，該特定大小之核酸片段約介於大於100至大於5000個鹼基對之間。
  17. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間且該擁擠試劑約介於2.5%至60%時，該特定大小之核酸片段約介於大於50至大於5000個鹼基對之間。
  18. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間且該擁擠試劑約介於2.5%至40%時，該特定大小之核酸片段約介於大於100至大於5000個鹼基對之間。
  19. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間且該擁擠試劑約介於2.5%至20%時，該特定大小之核酸片段約介於大於200至大於5000個鹼基對之間。
  20. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間且該單價離子鹽之莫耳濃度約介於0.1至5時，該特定大小之核酸片段約介於大於300至大於5000個鹼基對之間。
  21. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間且該單價離子鹽之莫耳濃度約介於0.1至2.5時，該特定大小之核酸片段約介於大於200至大於5000個鹼基對之間。
  22. 如請求項第11項所述之方法，其中步驟(a)中該離液鹽之莫耳濃度約介於4至0.5之間且該單價離子鹽之莫耳濃度約介於0.1至1.5時，該特定大小之核酸片段約介於大於150至大於5000個鹼基對之間。
  23. 一種選擇性分離核酸之套組，包含有：至少一結合緩衝液，具有一離液鹽，以及一單價離子鹽或一擁擠試劑兩者之一種或兩種；以及至少一固相載體。
TW104129133A 2015-09-02 2015-09-02 選擇性分離核酸之方法及套組 TWI691595B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104129133A TWI691595B (zh) 2015-09-02 2015-09-02 選擇性分離核酸之方法及套組
CN201610768933.4A CN106480014B (zh) 2015-09-02 2016-08-30 选择性分离核酸的方法及其套组
EP16186708.0A EP3138913B1 (en) 2015-09-02 2016-08-31 Method and kit for selective isolation of nucleic acid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104129133A TWI691595B (zh) 2015-09-02 2015-09-02 選擇性分離核酸之方法及套組

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201710500A true TW201710500A (zh) 2017-03-16
TWI691595B TWI691595B (zh) 2020-04-21

Family

ID=56893734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104129133A TWI691595B (zh) 2015-09-02 2015-09-02 選擇性分離核酸之方法及套組

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3138913B1 (zh)
CN (1) CN106480014B (zh)
TW (1) TWI691595B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112625857A (zh) * 2019-10-08 2021-04-09 恺硕生物科技(厦门)有限公司 一种游离核酸提取自动化机台及游离核酸提取试剂盒
CN111534511A (zh) * 2020-06-03 2020-08-14 沈阳德宇生物科技有限公司 用于核酸纯化回收的反应液及其核酸回收试剂盒和应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5990302A (en) * 1996-07-12 1999-11-23 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for isolating ribonucleic acid
WO1999058664A1 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
EP1349951A4 (en) 2001-01-09 2005-08-24 Whitehead Biomedical Inst METHOD AND REAGENTS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS
JP4241183B2 (ja) * 2003-05-19 2009-03-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収方法及び核酸回収キット
WO2004108925A1 (en) * 2003-06-04 2004-12-16 Qiagen As Method for sequentially isolating dna and rna from the same nucleic acid-containing sample
CA2482097C (en) * 2003-10-13 2012-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for isolating nucleic acids
US8426126B2 (en) * 2004-03-18 2013-04-23 Applied Biosystems, Llc Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification
EP2029777B1 (en) * 2006-05-31 2017-03-08 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the extraction of nucleic acid from a sample
WO2009070465A1 (en) 2007-11-29 2009-06-04 New England Biolabs, Inc. Selective purification of small rnas from mixtures
EP2414545B1 (en) * 2009-04-03 2017-01-11 Sequenom, Inc. Nucleic acid preparation compositions and methods
CN103097532B (zh) * 2010-09-02 2018-04-27 恰根有限公司 高产量分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法
CN113388606A (zh) * 2011-09-26 2021-09-14 凯杰有限公司 用于分离细胞外核酸的快速方法
WO2013045434A1 (en) * 2011-09-26 2013-04-04 Qiagen Gmbh Methods for separating nucleic acids by size
CN102618532A (zh) * 2012-05-02 2012-08-01 易春 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法
WO2013181651A1 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Omega Bio-Tek, Inc. Selective nucleic acid fragment recovery

Also Published As

Publication number Publication date
EP3138913B1 (en) 2019-05-22
TWI691595B (zh) 2020-04-21
CN106480014B (zh) 2020-05-15
EP3138913A1 (en) 2017-03-08
CN106480014A (zh) 2017-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7481376B2 (ja) 核酸を抽出する装置および方法
CN104350152B (zh) 选择性核酸片段回收
CN106893721A (zh) 一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒及其使用方法
DE102008023297B4 (de) Verfahren zur Anreicherung und Isolierung von Nukleinsäuren oder Viren
JP2013520187A (ja) Ｒｎａおよびｄｎａの並行単離および／または並行精製のためのプロセス
US20220145283A1 (en) Purification Process for Biological Molecules Such as Plasmid DNA Using Anionic Exchange Chromatography
JP6886965B2 (ja) 携帯型核酸抽出器具及びその使用方法
Olgun et al. High-grade purification of third-generation HIV-based lentiviral vectors by anion exchange chromatography for experimental gene and stem cell therapy applications
WO2010140598A1 (en) Method for preparing protein, dna, and rna from cell
TW201710500A (zh) 選擇性分離核酸之方法及套組
KR20170035980A (ko) 항체의 정제 방법
US8067580B2 (en) Isolation of DNA, RNA and protein from a single sample
US20230151351A1 (en) A method of single-stranded rna purification
WO2015197692A1 (de) Verfahren zur anreicherung von mikrovesikeln
JP5931363B2 (ja) タンパク質の精製方法
US20230142167A1 (en) A method of single strand rna purification employing an anion exchanger
US20230142600A1 (en) A method of single-stranded rna purification
CN107532165A (zh) 按大小分级来选择性分开和分离核酸混合物的方法