CN106480014B - 选择性分离核酸的方法及其套组 - Google Patents

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Abstract

本发明揭露一种选择性分离核酸的方法与套组，其透过不同种类及浓度的离液盐、单价离子盐和拥挤试剂的相互搭配，使得固相载体能够与不同大小的核酸片段结合，利用当单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当单价离子盐浓度愈低则保留愈小的核酸片段，来达到特定片段大小的核酸的筛选的效果。

Description

选择性分离核酸的方法及其套组
技术领域
本发明关于一种核酸分离的技术，特别是指一种选择性分离核酸的方法及其套组。
背景技术
随着人类以及其他物种的基因体逐渐被解碼，以核酸(包括DNA和RNA)作为检测标的的分子诊断技术成为近年来临床检测上的一大重点。无论是DNA或者是RNA，都是由四个核苷酸分子所组成，因此相较于复杂的临床病理判读，核酸的分子组成相对简单，也较为容易进行检测。
以核酸为标的进行分子诊断的过程中，核酸片段大小的筛选扮演了相当重要的角色。
例如血液系统当中的游离核酸(cell-free nucleic acids)，常被运用作为胎儿产前检测与癌症检测的主要核酸来源。但是，游离核酸多为短序列的片段，并且在样本当中的含量相对于其他大片段核酸较为微量。因此，如何取得足够含量的短片段核酸，并且去除其他大片段核酸，是决定检测结果是否准确的重要因素。
另一方面，次世代定序(next generation sequencing；NGS)技术由于其无需利用细菌进行质体的复制、高通量以及时间短等优点，近年来被广泛的使用在各种以核酸为标的的分子诊断技术当中，作为核酸定序的主要工具。以Illumina系统的NGS为例，其进行主要是先将待测核酸片段化之后，对这些不同大小片段的核酸进行筛选，再依照需求将特定的短序列片段进行纯化、回收浓缩或以聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction；PCR)来增幅并建构核酸库。再将核酸库的核酸片段与接合序列连接，将连接后的片段注入到表面带有接合片段互补序列的芯片上进行桥式PCR以及荧光的标记与侦测。核酸片段的筛选可以应用在核酸库建构的前处理、去除为未接妥接合序列的核酸片段以及PCR增幅之后除去非目标核酸片段等步骤，以提升定序过程中核酸的质量与含量。
针对前述核酸片段的筛选，实质上回收的目标核酸序列通常不长，且在本领域中常惯称做「小片段核酸」(small fragments)，因此，如何提升小片段核酸回收效果，以维护、强化定序质量，目前已发展出数种方法因应，其中常见的主要包括三种：(1)以洋菜胶(agarose gel)电泳区分出不同序列尺寸之核酸，再以切胶回收的方式，针对目标片段(通常是小片段核酸)进行分离回收，这种方式可精确回收特定片段的核酸，却存有耗时费力的缺点。此外，因为小片段核酸受限于分子量较小，在洋菜胶上的显像分辨率较差，尤其是在浓度低的时候，更容易妨碍切胶回收的效果；(2)利用披覆(coated)DNA分子与表面官能基改质(例如带有羧基)的磁珠(magnetic beads)，配合聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)和盐类的浓度条件，吸附并结合待分离的小片段核酸，如同美国公告专利第6534262号所揭露。这种方法的优点在于可轻易套用至自动化系统，进行大量的分离、筛选，但除了须选用特殊改质的磁珠造成的额外成本与工序之外，这种方法经证实显然不适用于序列尺寸较长(例如序列长度大于约400bp以上)的核酸，明显限制了此方法在NGS技术上的应用；(3)可利用设计引子(primer)或诱引序列(bait)精确回收核酸，惟此法仅适用于已知待定序的目标序列的状况下，难以广泛应用。
根据上述常用方法未能解决的问题，目前仍持续有技术改良，但仍各有其限制，举例说明如下：
美国发明专利公告第US 6534262 B1号提出一种方法，藉由调整PEG条件配合带有官能基的固态载体，来调整反应溶液中的离子强度(ionic strength)及PEG的浓度，改善回收小片段核酸效果。此外，以美国发明公开专利第US20060024701号及美国公开专利第US20110060135号为例，可见其均采用调整PEG方法达成分离、回收小片段核酸，均须搭配官能基(羧基或胺基)改质的固态载体(膜状、微粒、磁珠)，势必增加制造的成本与复杂度。
世界专利第WO2013181651A1号提出了一种回收小片段核酸的方法，藉由调整胍盐浓度及pH值调整小片段核酸黏附至(solid carrier)的效果，藉以改善回收效果，但根据NGS序列尺寸筛选的应用时机多元，回收核酸时，势必面临多元化且复杂的溶液环境，很可能引发pH值的变化，降低此方法之效果与可靠性；此外，在生产相关溶液试剂时，对于pH值的精准度的要求标准相对提高，甚至需要增加检验工序，额外耗时且增加制造成本。美国公开专利第US20140243216号亦使用调节pH值的策略达成回收小片段核酸的目的，因此，根据其对pH的依赖程度，可预期该方法同样存有不同的环境溶液对其效果可能产生的不利影响。
发明内容
为解决上述先前技术之缺失，本发明的主要目的是利用一种选择性分离核酸的方法来分离特定序列长度的核酸。
本发明的另一目的在于提供一种简单的反应缓冲液，让操作者可依照预定之核酸序列长度需求，轻易地从含有序列长度不一之核酸混合液中，分离出特定序列长度之核酸。
本发明的再一目的可以让使用者选择性分离出特定序列长度之核酸并直接应用至后续工序，不仅快速方便、节省成本，回收率(recovery)亦佳，亦能提高后续应用之效能。
本发明进一步的目的在于提供的核酸分离方法所使用的溶液环境简单且稳定，可排除pH值变化对纯化、分离核酸效果的影响，亦无须倚赖特定聚合物溶质或界面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)溶液系统，更无须使用官能基(例如表面羧基化、胺基化)改质之载体，十分适合应用于现有之自动化系统进行高通量之操作，同时满足了分离核酸之精准度、分离与纯化效能、便利性等需求。
本发明的更一目的是利用成分单纯的盐类溶液和拥挤试剂配合硅基(silica-based)滤材使用，即可达成分离特定序列长度的核酸。
本发明的又一目的在于提出一种配方简易、不需使用聚合物溶剂、不需采用官能基改质之滤材亦无需倚赖pH值的简单方法，尤其适用于分离特定范围的核酸片段。
为达成前述目的，本发明揭露一种选择性分离核酸的方法，其步骤如下：混合样本核酸与结合缓冲液以产生混合溶液，其中样本核酸具有特定大小的核酸片段，混合溶液具有离液盐，以及单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一；使混合溶液流过固相载体，藉由单价离子盐浓度的高低来控制欲保留的特定大小的核酸片段结合于固相载体，其中当单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段,其中大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段；使冲洗缓冲液流过固相载体以清除未与固相载体结合的物质；以及使水溶液流过固相载体以回收欲保留的特定片段大小的核酸片段。
本发明另揭露一种选择性分离核酸的方法，其步骤如下：混合样本核酸与第一结合缓冲液以产生第一混合溶液，其中样本核酸具有特定大小的核酸片段，第一混合溶液具有离液盐，使第一混合溶液流过第一固相载体，以取得一次筛选液，其中，一次筛选液含有特定大小的核酸片段；混合一次筛选液与第二结合缓冲液以产生第二混合溶液，其中，第二混合溶液具有离液盐以及单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一；使第二混合溶液流过第二固相载体，藉由所述单价离子盐浓度的高低来控制将欲保留的特定大小的核酸片段结合于第二固相载体，其中当单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段,其中大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段；使冲洗缓冲液流过第二固相载体以清除未与第二固相载体结合的物质；以及使水溶液流过第二固相载体以回收欲保留的特定片段大小的核酸片段。
为达成前述目的，本发明另一种选择性分离核酸之套组，包含有结合缓冲液以及固相载体。其中，结合缓冲液具有离液盐，以及单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一，其特征在于：其中当单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段,其中大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段。
有关本发明的详细特点，将于后续的详细说明中予以描述。然而，在本发明领域中具有通常知识者应能了解，该等详细说明以及实施本发明所列举的特定实施例，仅用于说明本发明，并非用以限制本发明的专利申请范围。
附图说明
图1(a)至图1(c)是根据本发明所揭露的技术，表示以不同浓度与种类的离液盐处理DNA标准溶液后，核酸片段的分离情形。其中，图1(a)的第1栏至第7栏分别为以表1-1中条件1至7处理的结果；图1(b)的第8栏至第14栏分别为以表1-2条件8至14处理的结果；及图1(c)的第15栏至第17栏分别为以表1-3条件15至17处理的结果，第18栏至第20栏分别为以表1-4条件18至20处理的结果；及图1(a)至图1(c)中的M栏为未处理的DNA标准溶液。
图2(a)至图2(e)是根据本发明所揭露的技术，表示离液盐在相同浓度下加入不同浓度与种类的单价离子盐处理DNA标准溶液后，核酸片段的分离情形。其中，图2(a)中的第1栏至第7栏分别为以表2-1条件1至7处理的结果；图2(b)至图2(e)中的第1栏至第7栏分别为以表2-3条件1至7处理的结果；图2(f)中的第1栏至第7栏分别为以表2-8条件1至7处理的结果；及图2(a)至图2(e)中的M栏为未处理的DNA标准溶液。
图3(a)至图3(c)是根据本发明所揭露的技术，表示相同离液盐浓度下加入不同浓度的拥挤试剂处理DNA标准溶液后，核酸片段的分离情形。其中，图3(a)中的第1栏至第5栏分别为以表3-1条件1至5处理的结果；图3(b)中的第1栏至第5栏分别为以表3-2条件6至10处理的结果；图3(c)中的第1栏至第3栏分别为以表3-3条件1至3处理的结果，第4栏至第6栏分别为以表3-4条件4至6处理的结果；图3(a)至图3(c)中的M栏为未处理的DNA标准溶液。
图4是根据本发明所揭露的技术，表示混合搭配离液盐、单价离子盐与拥挤试剂，以硅质滤柱作为固相载体，在利用不同混合溶液的条件下，筛选一至三次，以观察核酸片段的分离情形。其中，第AE1栏至第CE3栏分别为以表4-1中的混合溶液条件AM1至CM3处理的结果，M栏为未处理的DNA标准溶液。
图5是根据本发明所揭露的技术，表示混合搭配离液盐、单价离子盐与拥挤试剂，以硅质磁珠作为固相载体，在利用不同混合溶液的条件下，筛选一至三次，以观察核酸片段的分离情形。其中，第DE1栏至第EE3栏分别为以表4-2中的混合溶液条件DM1至EM3处理的结果，M栏为未处理的DNA标准溶液。
具体实施方式
本发明所揭露的选择性分离核酸的方法及套组，让操作者可依照预定的酸序列长度需求，轻易地从含有序列长度不一的核酸样本中，分离出特定序列长度的核酸。亦即，本发明提供的方法及套组可让使用者选择性分离出特定序列长度的核酸并直接应用至后续工序，能提高后续应用的效能。
此外，由于本发明提供之方法及套组所使用的溶液环境简单且稳定，无需调控溶液环境中的酸碱值(pH值)，亦无须倚赖特定改质官能基的载体(例如表面羧基化、胺基化)，适合应用于现有的自动化系统进行高通量的操作。
本发明所揭露的方法与套组仅利用离液盐(chaotropic salt)、单价离子盐与拥挤试剂(crowding agent)在不同浓度的环境下，直接影响核酸滞留性的特性，以分阶段筛除或滞留的概念，发展出一种简易、好操作、应用性广泛且可轻易调整溶液条件的低成本选择性核酸分离方法及套组。
本发明所述的「核酸」包含但不限于人工合成、天然来源或人工合成与天然来源混掺的核酸。序列片段的大小、长度或尺寸是指任何单股、双股、互补序列的天然或人工合成核酸，包含DNA、RNA的单元体所组成的核酸序列，及其核酸单元体的数量。核酸单元体是指组成核酸序列的计数单元，常用的计数单元包含碱基、核苷酸等分子。「碱基」表示核酸单元体；此外，为利于说明，下文分别以大片段、小片段之用语仅用于描述在特定实施条件下，依技术常识区分为相对较长或较短之核酸序列，并无意特定限制核酸序列的长度，此为本领域技术人员熟知之惯用描述，不再赘述。此外，此方法中所使用之核酸纯化之材料、技术之原理、特性、设备、基本操作流程，已为相关技术领域具有通常知识者所能明了，故下文不再作完整描述。
本发明所称的离液盐是指可影响水溶液水分子排列的物质，可使如蛋白质与核酸等大分子的分子间氢键强度改变。本发明所适用的离液盐种类包含但不限于：硫氰酸胍(Guanidine thiocyanate；GuSCN)、盐酸胍(Guanidine hydrochloride；GuHCl)、碘化钠(Sodium iodide；NaI)、过氯酸钠(Sodium perchlorate；NaClO4)。本发明所适用的离液盐在不同浓度下对于核酸片段尺寸的选择性不同，具体而言，上述离液盐浓度较低时，仅能保留较大片段的核酸在固相载体中，而滤除较小片段的核酸至滤液(flow-through)当中，随着浓度的增加，本发明所适用的离液盐可以逐渐将较小片段的核酸保留在固相载体上。
本发明所称的单价离子盐是指由单价阳离子与单价阴离子以离子键结合而成的化合物，而本发明所适用的单价离子盐种类包含：单价阳离子氯化盐、单价阳离子醋酸盐。其中，单价阳离子氯化盐包含但不限于：氯化锂(LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化铵(NH4Cl)，本实施例中以氯化锂为一个较佳的实验例。而单价阳离子醋酸盐包含但不限于：醋酸锂(LiOAc)、醋酸钠(NaOAc)、醋酸钾(KOAc)、醋酸铵(NH4OAc)。根据本发明的实验，利用醋酸锂、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵测试单价离子盐搭配离液盐所达成核酸片段尺寸的选择性。由实验可得知单价阳离子盐类在不同浓度对于核酸片段尺寸的选择性，具体而言，单价阳离子盐类浓度较低时，能保留片段尺寸较小的核酸在固相载体中；随着单价阳离子盐类浓度的增加，逐渐丧失对较小片段核酸的保留能力，仅能将较大片段的核酸保留于固相载体中，滤除较大范围(指核酸尺寸分布的范围)的小片段核酸至滤液中。
本发明所指称的拥挤试剂是指可占有溶液的大部分体积而造成使得其溶质聚集或浓缩于较少水溶液中，包含单元醇类、多元醇类及大分子聚合物等。本发明所适用的拥挤试剂种类包含但不限于：乙醇(Ethanol)、异丙醇(Isopropanol)、聚乙二醇(Polyethyleneglycol；PEG)。本发明的实验中，分别以乙醇、异丙醇、聚乙二醇测试拥挤试剂搭配离液盐所达成核酸片段尺寸的选择性。当拥挤试剂溶液浓度较低时，仅能保留较大片段的核酸在固相载体中，而滤除较小片段的核酸至滤液中；随着浓度的增加，上述拥挤试剂可以逐渐将较小片段的核酸保留在固相载体中。
以下将藉由所列举的实验，配合随附的图式，详细说明本发明的技术内容及特征。
实验一：不同种类和不同浓度的离液盐对于选择核酸片段大小的影响
将20μL 1kb DNA标准品(Sharp DNA Ladder Markers 1kb，ELPIS Biotech，韩国)与20μL 100bp DNA标准品(Sharp DNA Ladder Markers 100bp，ELPIS Biotech，韩国)混合作为测试用的DNA标准溶液。如以下表1-1至表1-4所示，将前述40μL DNA标准溶液与结合缓冲液混合之后，在混合溶液的最终体积200μL、浓度介于0.6M至4M之间的盐酸胍(guanidinehydrochloride；GuHCl)、最终体积200μL、浓度介于0.6M至4M之间的异硫氰酸胍(guanidinethiocyanate；GuSCN)、最终体积200μL、浓度介于2.5M至3.5M之间的碘化钠(sodiumiodide；NaI)以及最终体积200μL、浓度介于2.5M至3.5M之间的过氯酸钠(sodiumperchlorate；NaClO4)等条件下，测得各条件下最终混合溶液内的pH值分别介于5.44至5.84、5.59至5.73、6.25至6.40以及6.66至6.57，由此可知，混合溶液的pH值并不会随着离液盐的浓度的高低而有明显的差异。接着，将混合溶液加入硅质滤柱(
Figure BDA0001100134990000121
SpinColumns,Qiagen)中，并以转速为13000rpm进行离心1分钟，使DNA与硅质滤柱中的固相载体结合。于离心之后，在硅质滤柱内加入60％酒精500μL作为清洗缓冲液，再次以转速为13000rpm进行离心1分钟，以清除掉未与硅质滤柱结合的DNA片段。接着，在硅质滤柱内加入40μL的水，以转速为13000rpm离心1分钟，使DNA与硅质滤柱分离，取得最终产物。将在前述条件的浓度下进行核酸筛选的产物进行胶体电泳，实验结果如图1(a)与表1-1至表1-4所示。根据上述实验可以得知，当离液盐浓度较低时，仅能滞留较大片段的核酸在硅质滤柱中，而滤除较小片段的核酸至滤液(flow-through)中；随着浓度的增加，上述离液盐可以逐渐将较小片段的核酸滞留在硅质滤柱中。
图1(a)显示不同浓度的盐酸胍下，核酸片段的分离情形，可以看到，在盐酸胍浓度为0.6M时，会筛选出大于4000bp的核酸片段，亦即小于4000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在盐酸胍浓度为0.7M时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在盐酸胍浓度为0.8M时，会筛选出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在盐酸胍浓度为0.9M时，会筛选出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在盐酸胍浓度为1M时，会筛选出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段都被筛选掉了；在盐酸胍浓度为2M与4M时，会筛选出大于100bp的核酸片段，亦即小于100bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。上述盐酸胍浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表1-1所示。
表1-1:盐酸胍浓度与所筛选的核酸片段大小关连性
Figure BDA0001100134990000131
图1(b)另显示出不同浓度的异硫氰酸胍下，核酸片段的分离情形。在异硫氰酸胍浓度为0.6M时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在异硫氰酸胍浓度为0.7M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在异硫氰酸胍浓度为0.8M、0.9M和1M时，会筛选出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在异硫氰酸胍浓度为1.5M和3M时，会筛选出大于100bp的核酸片段，亦即小于100bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。上述异硫氰酸胍浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表1-2所示。
表1-2:异硫氰酸胍浓度与所筛选的核酸片段大小关连性
Figure BDA0001100134990000141
Figure BDA0001100134990000151
表1-1、表1-2，列举不同的离液盐浓度与核酸片段尺寸大小的选择性，其中所列的数据反映出上述胍在不同的浓度离液盐(盐酸胍、异硫氰酸胍)对于核酸片段尺寸的选择性。
图1(c)显示出不同浓度的碘化钠下，核酸片段的分离情形。在碘化钠浓度为2.5M时，并未明显看到有核酸片段固相载体结合而被保留下来；在碘化钠浓度为3M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在碘化钠浓度为3.5M时，会筛选出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。上述碘化钠浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表1-3所示。
表1-3:碘化鈉濃度與所篩選的核酸片段大小關連性
Figure BDA0001100134990000152
图1(c)另显示出不同浓度的过氯酸钠下，核酸片段的分离情形。在过氯酸钠浓度为2.5M时，并未明显看到有核酸片段与固相载体结合而被保留下来；在过氯酸钠浓度为3M时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在过氯酸钠浓度为3.5M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。上述过氯酸钠浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表1-4所示。
表1-4:过氯酸钠浓度与所筛选的核酸片段大小关连性
Figure BDA0001100134990000161
透过实验一的结果可以得知，不论是异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠或是过氯酸钠，随着离液盐浓度的增加，可以抓取到更小片段的核酸，反之亦然。再者，透过实际量测混合溶液内的酸碱值，可以发现混合溶液内的pH值变动范围非常小，显示透过不同浓度的离液盐能够选择性地分离不同片段大小的核酸，此一特性与混合溶液内的pH值并无相关性。
实验二：相同离液盐浓度下，不同浓度、不同种类的单价离子盐类对于筛选核酸片段大小的影响
1.异硫氰酸胍加上不同浓度的氯化锂
测试用之DNA标准溶液依照实验一的方式加以配制。将40μL DNA标准溶液分别与不同条件的200μL结合缓冲液混合均匀之后，依照实验一的方式进行核酸的筛选。其中，最终混合溶液的组成条件如表2-1所示，异硫氰酸胍最终浓度固定为0.833M，加上最终浓度分别为0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M的氯化锂(LiCl)。
表2-1:最终混合溶液内的组成条件
条件 异硫氰酸胍浓度 氯化锂浓度
1 0.833M 0.104M
2 0.833M 0.208M
3 0.833M 0.3125M
4 0.833M 0.416M
5 0.833M 0.52M
6 0.833M 0.625M
将加入前述组合条件1到6的结合缓冲溶液进行核酸筛选的产物进行胶体电泳，实验结果如图2(a)与表2-2所示。
图2(a)显示异硫氰酸胍浓度0.833M加上不同浓度氯化锂作为结合缓冲液，测得各条件下最终混合溶液内的pH值介于5.82至5.88，筛选后产物的核酸片段分离情形。在氯化锂浓度为0.104M、0.208M、0.3125M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在氯化锂浓度为0.416M和0.52M时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在氯化锂浓度为0.625M时，会筛选出大于2000bp的核酸片段，亦即小于2000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。混合溶液中氯化锂浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表2-2所示。
表2-2:氯化鋰濃度與所篩選的核酸片段大小
Figure BDA0001100134990000181
因此，藉由上述的实验结果可以得知，当离液盐(异硫氰酸胍)的浓度固定时(0.833M)，利用浓度较低单价离子盐(氯化锂)，可以分离出较小的核酸片段；当单价离子盐的浓度愈来愈高时，可以分离出较大的核酸片段，因此，使用者可以依据欲分离的核酸片段的尺寸大小，来取用所需要的单价离子盐的浓度。此外，具有离液盐和单价离子盐的混合溶液中的酸碱值(pH值)并不会因为单价离子盐的浓度的高低而有所影响，因此在本发明所揭露的技术中，混合溶液的pH值不是造成核酸片段分离的因素。
2.以醋酸根为阴离子测试四种不同的一价阳离子
测试用的DNA标准溶液依照实验一的方式加以配制。将40μL DNA标准溶液分别与不同条件的200μL结合缓冲液混合均匀之后，依照实验一的方式进行核酸的筛选。其中，最终混合溶液的组成条件如表2-3所示，异硫氰酸胍最终浓度固定为0.833M，加上阴离子为醋酸根(OAc-)、阳离子各为锂(Li+)、钠(Na+)、钾(K+)和铵根(NH4 +)的盐类，最终浓度分别为0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M。
表2-3:本实验所使用的最终混合溶液的组成条件
条件 异硫氰酸胍浓度 XOAc浓度
1 0.833M 0.104M
2 0.833M 0.208M
3 0.833M 0.3125M
4 0.833M 0.416M
5 0.833M 0.52M
6 0.833M 0.625M
备注：X为Li、Na、K或NH4
将前述组合条件1到6的最终混合溶液进行核酸筛选后的产物进行胶体电泳，实验结果如图2(b)至图2(e)与表2-4至表2-7所示。
图2(b)显示异硫氰酸胍浓度0.833M加上不同浓度醋酸锂(LiOAc)作为结合缓冲液，测得各条件下最终混合溶液内的pH值介于7.77至7.90之间，筛选后产物的核酸片段分离情形。在醋酸锂浓度为0.104M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸锂浓度为0.208M时，会筛选出大于5000bp的核酸片段，亦即小于5000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸锂浓度为0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M时，没有留下任何核酸片段，亦即没有任何核酸片段与载体结合了。最终混合溶液中醋酸锂浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表2-4所示。
表2-4:醋酸锂浓度与所筛选的核酸片段大小
Figure BDA0001100134990000201
Figure BDA0001100134990000211
图2(c)显示最终混合溶液中含有异硫氰酸胍浓度0.833M加上不同浓度醋酸钠(NaOAc)，且测得各条件下最终混合溶液内的pH值介于7.76至8.03，筛选后产物的核酸片段分离情形。在醋酸钠浓度为0.104M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸钠浓度为0.208M时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸钠浓度为0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M时，没有留下任何核酸片段，亦即所有核酸片段都与载体结合。结合缓冲液中醋酸钠浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表2-5所示。
表2-5:醋酸鈉濃度與所篩選的核酸片段大小
Figure BDA0001100134990000212
Figure BDA0001100134990000221
图2(d)显示最终混合溶液中含有异硫氰酸胍浓度0.833M加上不同浓度醋酸钾(KOAc)的条件下，测得各条件下混合溶液之pH值介于7.88至8.03之间，筛选后产物的核酸片段分离情形。在醋酸钾浓度为0.104M时，会筛选出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸钾浓度为0.208M时，会筛选出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸钾浓度为0.3125M时，会筛选出大于400bp的核酸片段，亦即小于400bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸钾浓度为0.416M和0.52M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸钾浓度为0.625M时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。最终混合溶液中醋酸钾浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表2-6所示。
表2-6:醋酸钾浓度与所筛选的核酸片段大小
Figure BDA0001100134990000231
图2(e)显示最终混合溶液中含有异硫氰酸胍浓度0.833M加上不同浓度醋酸铵(NH4OAc)的条件下，测得最终混合溶液内的pH值介于6.58至6.68之间，筛选后产物的核酸片段分离情形。在醋酸铵浓度为0.104M时，会筛选出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸铵浓度为0.208M时，会筛选出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸铵浓度为0.3125M时，会筛选出大于400bp的核酸片段，亦即小于400bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸铵浓度为0.416M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸铵浓度为0.52M时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在醋酸铵浓度为0.625M时，会筛选出大于2000bp的核酸片段，亦即小于2000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。最终混合溶液中醋酸铵浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表2-7所示。
表2-7:醋酸銨濃度與所篩選的核酸片段大小
Figure BDA0001100134990000241
Figure BDA0001100134990000251
图2(b)至图2(e)与表2-4至表2-7所显示的实验结果看来，在以醋酸根为阴离子的条件之下，不同浓度的四种盐类醋酸锂、醋酸钠、醋酸钾和醋酸铵对于核酸片段大小的筛选上均有所不同。也能够很明显的看出，四种不同的一价阳离子对于不同大小的核酸片段具有显著的筛选差异。
3.以碘化钠作为单离子盐测试醋酸铵浓度对于选择核酸片段大小的影响
测试用的DNA标准溶液依照实验一的方式加以配制。将40μL DNA标准溶液分别与不同条件的200μL结合缓冲液混合均匀之后，依照实验一的方式进行核酸的筛选。其中，最终混合溶液的组成条件如表2-8所示，碘化钠最终浓度固定为3M，加上醋酸铵最终浓度分别为0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M。
图2(f)显示最终混合溶液含有碘化钠浓度3M加上不同浓度醋酸铵作为结合缓冲液，测得各条件下最终混合溶液内的pH值介于6.70至6.88，筛选后产物的核酸片段分离情形。在醋酸钠浓度为0.104M、0.208M时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；醋酸钠浓度为0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。最终混合溶液中加入碘化钠作为离液盐时，醋酸钠浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表2-8所示。
表2-8:最终混合溶液中加入碘化钠作为离液盐时醋酸铵浓度与所筛选的核酸片段大小
Figure BDA0001100134990000261
图2(f)与表2-8所显示的实验结果看来，在最终混合溶液中含有碘化钠作为离液盐的条件下，不同浓度的醋酸铵对于核酸片段大小的选择上均有所不同。
透过实验二的结果可以得知，在相同的离液盐浓度下，随着特定单价离子盐的浓度增加，小片段核酸与固相载体之结合能力随之降低，即当特定的单价阳离子盐类浓度较低时，能将片段尺寸较小的核酸滞留于固相载体中，随着浓度的增加，特定单价阳离子盐类逐渐丧失对较小片段核酸的滞留，仅能将较大片段的核酸滞留在固相载体中，并且将较小片段核酸筛除至滤液中。不管是以氯化锂，或是醋酸根离子为固定的阴离子种类，搭配四种不同的一价阳离子(锂、钠、钾、铵)，都相同趋势，其中又以醋酸根离子为阴离子的盐类最为显着，而不同的单价阳离子对于核酸大小筛选亦具有差异性。再者，透过实际量测混合溶液内的酸碱值，可以发现混合溶液内的pH值变动范围非常小，显示透过离液盐与单价离子盐的搭配，能够选择性地分离不同片段大小的核酸，此一特性与混合溶液内的pH值并无相关性。
实验三：相同离液盐浓度搭配不同浓度、种类的拥挤试剂对于筛选核酸片段大小的影响
1.不同浓度、种类的拥挤试剂对于筛选核酸片段大小的影响
测试用DNA标准溶液依照实验一的方式加以配制。将40μL DNA标准溶液分别与不同条件的200μL结合缓冲液混合均匀之后，依照实验一的方式进行核酸的筛选。其中，最终混合溶液的组成条件分别如表3-1、表3-2所示，异硫氰酸胍最终浓度固定为0.52M，加上最终浓度分别为2.5％、5％、10％、15％、20％的乙醇(ethanol)，或是最终浓度分别为2.5％、5％、10％、15％、20％的异丙醇(isopropanol)。将条件1到11的最终混合溶液进行核酸筛选的产物进行胶体电泳，实验结果如图3(a)、图3(b)与表3-1、表3-2所示。
图3(a)显示最终混合溶液中含有异硫氰酸胍浓度0.52M加上不同浓度乙醇，测得最终混合溶液内的pH值介于6.04至6.22之间，筛选后产物的核酸片段分离情形。在乙醇浓度为2.5％时，会筛选出大于3000bp的核酸片段，亦即小于3000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在乙醇浓度为5％时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在乙醇浓度为10％时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在乙醇浓度为15％时，会筛选出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在乙醇浓度为20％时，会筛选出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。最终混合溶液中乙醇浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表3-1所示。
表3-1:乙醇浓度与所筛选的核酸片段大小关连性
Figure BDA0001100134990000281
Figure BDA0001100134990000291
图3(b)显示最终混合溶液含有异硫氰酸胍浓度0.52M加上不同浓度异丙醇的条件下，测得最终混合溶液内的pH值介于5.79至6.01之间，筛选后产物的核酸片段分离情形。在异丙醇浓度为2.5％时，会筛选出大于2000bp的核酸片段，亦即小于2000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在异丙醇浓度为5％时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在异丙醇浓度为10％时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在异丙醇浓度为15％时，会筛选出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在异丙醇浓度为20％时，会筛选出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。最终混合溶液中异丙醇浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表3-2所示。
表3-2:异丙醇类浓度与所筛选的核酸片段大小关连性
Figure BDA0001100134990000301
图3(a)、图3(b)与表3-1、表3-2所显示的实验结果看来，不同浓度的乙醇和异丙醇对于核酸片段大小的筛选上均有所不同，随着醇类的浓度增加，小片段的核酸越能够被抓取，反之亦然。
2.不同浓度、分子量的聚二乙醇对于筛选核酸片段大小的影响
测试用DNA标准溶液依照实验一的方式加以配制。将40μL DNA标准溶液分别与不同条件的200μL结合缓冲液混合均匀之后，依照实验一的方式进行核酸的筛选。其中，最终混合溶液内的组成条件分别如表3-3、表3-4所示，异硫氰酸胍最终浓度固定为0.6M，加上最终浓度分别为10％、15％、20％的聚乙二醇(PEG4000)，或是最终浓度分别为10％、15％、20％的聚乙二醇(PEG8000)。将条件12到17的最终混合溶液进行核酸筛选的产物进行胶体电泳，实验结果如图3(c)与表3-3、表3-4所示。
图3(c)显示最终混合溶液含有异硫氰酸胍浓度0.6M加上不同浓度聚乙二醇(PEG4000)作为结合缓冲液，测得各条件下最终混合溶液内的pH值介于5.83to5.92，筛选后产物的核酸片段分离情形。在聚乙二醇(PEG4000)浓度为10％时，会筛选出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在聚乙二醇(PEG4000)浓度为15％、20％时，会筛选出大于100bp的核酸片段，亦即小于100bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。最终混合溶液中聚乙二醇(PEG4000)浓度与核酸片段筛选的关连性，整理表3-3所示。
表3-3:聚乙二醇(PEG4000)浓度与所筛选的核酸片段大小关连性
Figure BDA0001100134990000311
Figure BDA0001100134990000321
图3(c)另显示最终混合溶液中含有异硫氰酸胍浓度0.6M加上不同浓度聚乙二醇(PEG8000)作为结合缓冲液，测得各条件下最终混合溶液内的pH值介于5.83至5.98，筛选后产物的核酸片段分离情形。在聚乙二醇(PEG8000)浓度为10％时，会筛选出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉；在聚乙二醇(PEG8000)浓度为15％、20％时，会筛选出大于100bp的核酸片段，亦即小于100bp的核酸片段不会与固相载体结合而被剔除掉。最终混合溶液中聚乙二醇(PEG8000)浓度与核酸片段筛选的关连性，整理如表3-4所示。
表3-4:高分子量聚乙二醇浓度与所筛选的核酸片段大小关连性
Figure BDA0001100134990000322
图3(c)与表3-3、表3-4所显示的实验结果看来，不同浓度与分子量大小的聚二乙醇对于核酸片段大小的选择上还是稍有不同，在相同的离液盐(异硫氰酸胍)浓度的条件下，随着聚二乙醇的浓度增加，小片段的核酸越能够被抓取，反之亦然。另外，针对分子量大小的聚乙二醇来说，较大的聚二乙醇，越能够抓取小片段的核酸。
从实验三所显示的实验结果看来，不同浓度的乙醇和异丙醇，或是不同浓度与分子量的聚乙二醇对于核酸片段大小的筛选上均有所不同，随着拥挤试剂的浓度增加，或是分子量的增加，小片段的核酸越能够被抓取，反之亦然。再者，透过实际量测混合溶液内的酸碱值，可以发现混合溶液内的pH值变动范围非常小，显示透过不同浓度的离液盐与拥挤试剂的搭配，能够选择性地分离不同片段大小的核酸，此一特性与混合溶液内的pH值并无相关性。
实验四：混合搭配离液盐、单价离子盐与拥挤试剂以分离特定核酸片段
1.以硅质滤柱作为固相载体
测试用的DNA标准溶液依照实验一的方式加以配制。将40μL DNA标准溶液分别与60μL结合缓冲液A1、B1、C1混合均匀，形成混合溶液AM1、BM1、CM1，混合均匀后测得AM1、BM1、CM1的pH值分别为6.66、6.63、6.62。将AM1、BM1、CM1分别加入第一硅质滤柱，以转速为13000rpm离心1分钟，取得第一次筛选后的滤液AF1、BF1、CF1。将AF1、BF1、CF1加入100μL、0.9M的异硫氰酸胍，形成混合溶液AM2、BM2、CM2，混合均匀后测得AM2、BM2、CM2的pH值分别为6.54、6.61、6.53。将AM2、BM2、CM2分别加入第二硅质滤柱，以转速为13000rpm离心1分钟，取得第二次筛选后的滤液AF2、BF2、CF2。在AF2、BF2、CF2分别加入40μL、20μL、10μL、100％异丙醇，形成混合溶液AM3、BM3、CM3，混合均匀后测得AM3、BM3、CM3的pH值分别为6.60、6.56、6.55。将AM3、BM3、CM3分别加入第三硅质滤柱，以转速为13000rpm离心1分钟后，丢弃第三次筛选后的滤液。各混合溶液内各成分的最终浓度及其pH值整理如表4-1所示。
表4-1:各混合溶液内各成分的最终浓度与pH值
Figure BDA0001100134990000341
Figure BDA0001100134990000351
分别在第一、二、三硅质滤柱中加入60％的乙醇冲洗，以转速为13000rpm离心1分钟后，加入40μL纯水再次以转速为13000rpm离心1分钟，分别取得第一次筛选的产物AE1、BE1、CE1，第二次筛选的产物AE2、BE2、CE2，和第三次筛选的产物AE3、BE3、CE3，将这些产物进行胶体电泳，实验结果如图4与表4-2所示。
表4-2:各混合溶液所筛选的核酸片段大小
Figure BDA0001100134990000352
Figure BDA0001100134990000361
根据表4-1、表4-2以及上述实验结果，AM1、AM2、BM1、BM2、CM1、CM2在相同的离液盐(异硫氰酸胍)的浓度条件下，不同浓度的单价离子盐可保留之核酸片段大小也不同，即如同先前所述，单价离子盐浓度愈高可保留之核酸片段较小，较低的单价离子盐浓度，可保留之核酸片段范围较大，即大范围的核酸片段指的是包含有大尺寸的核酸片段、中尺寸及/或小尺寸的核酸片段。
2.以硅质磁珠作为固相载体
测试用的DNA标准溶液依照实验一的方式加以配制。将40μL DNA标准溶液分别与60μL结合缓冲液D1(1.5M异硫氰酸胍、0.8M醋酸铵)与E1(2.5M异硫氰酸胍、2.5M醋酸铵)混合均匀，形成混合溶液DM1、EM1，混合均匀后测得DM1、EM1的pH值分别为6.53、6.60。将DM1、EM1分别与第一硅质磁珠(Magnetic beads MF-SIL-5024，磁量生技，中國台灣新北市)混合，以震荡器震荡5分钟后，放置于磁座上吸附磁珠1分钟，取得第一次筛选后的上清液DS1、ES1。将DS1加入20μL、100％的异丙醇、ES1加入100μL、2.5M的异硫氰酸胍，形成混合溶液DM2、EM2，混合均匀后测得DM2、EM2的pH值分别为6.60、6.54。将DM2、EM2分别与第二硅质磁珠混合，以震荡器震荡5分钟后，放置于磁座上吸附磁珠1分钟，取得第二次筛选后的上清液DS2、ES2。将DS2加入120μL、2.5M的异硫氰酸胍，ES2加入200μL、100％的异丙醇，形成混合溶液DM3、EM3，混合均匀后测得DM3、EM3的pH值分别为6.51、6.61。各混合溶液内各成分的最终浓度及其pH值整理如表4-3所示。
表4-3:各混合溶液内各成分的最终浓度与pH值
Figure BDA0001100134990000371
Figure BDA0001100134990000381
分别在第一、二、三硅质磁珠中加入60％的乙醇冲洗，震荡30秒后置放在磁座上1分钟，移除上清液，室温风干5分钟后，再加入40μL纯水，再次震荡1分钟后置放在磁座上1分钟，分别抽出上清液，取得第一次筛选的产物DE1、EE1，第二次筛选的产物DE2、EE2，和第三次筛选的产物DE3、EE3，将这些产物进行胶体电泳，实验结果如图5与表4-4所示。
表4-4:各混合溶液所筛选的核酸片段大小
产物代号 所筛选的核酸片段大小
DE1 大於1000bp
DE2 1000至200bp
DE3 100bp
EE1 大於1000bp
EE2 1000至200bp
EE3 100bp
根据表4-3、表4-4以及上述实验结果，DM2与DM3是当离液盐浓度增加、单价离子盐浓度降低而拥挤试剂浓度降低时，所筛选的核酸片段大小愈来愈小；由EM1、EM2可知，当离液盐浓度增加、单价离子盐浓度降低，所筛选的核酸片段大小愈来愈小。
由图4与图5的结果可知，经由上述筛选步骤，不论是使用硅质滤柱或是硅质磁珠，只要配合最适的混合溶液条件，即离液盐浓度、单价离子盐浓度及/或拥剂试剂的浓度便可将不同大小的核酸片段进行分离，更可成功取得所需要的大片段或是小片段核酸，而选取片段大小的区间，也可透过如本发明所揭露的四个不同的实验方式:如实验一所述的不同浓度的离液盐、如实验二所述的相同的离液盐浓度搭配不同浓度的单价离子盐、如实验三所述的相同的离液盐浓度搭配不同浓度的拥剂试剂及如实验四所述的使用离液盐、单价离子盐及拥挤试剂组合而成的混合溶液来达成核酸片段的筛选的目的，因此可按照操作环境的需求根据本发明所揭露的各种实验方式来进行各种组合的调整。依照各个电泳图中筛选后的核酸片段与标准溶液中的核酸片段所显示的亮度比较显示，本发明的回收率理想，而适合应用于各片段核酸的分离、纯化及回收。再者，透过实际量测混合溶液内的酸碱值，可以发现混合溶液内的pH值变动范围非常小，显示透过不同浓度的离液盐、单价离子盐及拥挤试剂的组合，能够选择性地分离不同片段大小的核酸，此一特性与混合溶液内的pH值并无相关性。
换句话说，透过上述三种不同因素的调控，经过一次、二次或是三次的筛选，便可以将所需要的小片段或是特定片段大小的核酸从样本当中筛选出来，而能够快速且有效率的进行核酸大小的纯化和筛选。另一方面，本发明所提供的筛选方法，完全不需要改质化的固相载体，而且可以针对100至5000个片段大小间的碱基对进行筛选，大幅增加了核酸筛选时候的选择性和可运用性。
在此必须说明者为，以上配合图式所做的详细描述，仅是为了说明本发明之技术内容及特征而提供的实施方式，凡在本发明领域中具有一般通常知识的人，在了解本发明的技术内容及特征之后，于不违背本发明之精神下，所做的种种简单的修饰、替换或构件之减省，皆应属于以下所揭示的申请专利范围之内。

Claims (6)

1.一种选择性分离核酸的方法，其包含有下列步骤：
(a)混合样本核酸与结合缓冲液以产生混合溶液，其中所述样本核酸具有核酸片段，所述混合溶液具有浓度为0.6M-4M的离液盐，所述离液盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或过氯酸钠，以及浓度为0.104M-0.625M的单价离子盐，所述单价离子盐为氯化锂、醋酸锂、醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵；
(b)使所述混合溶液流过硅质滤柱或硅质磁珠，藉由所述单价离子盐浓度的高低来控制将欲保留的特定大小的核酸片段结合于所述硅质滤柱或所述硅质磁珠；其中，当所述离液盐浓度固定时，使所述单价离子盐的最终浓度愈高，则保留尺寸愈大的核酸片段，进而控制所述特定大小的所述核酸片段结合于所述硅质滤柱或所述硅质磁珠；
(c)使冲洗缓冲液流过所述硅质滤柱或所述硅质磁珠以清除未与所述硅质滤柱或所述硅质磁珠结合的物质；以及
(d)使水溶液流过所述硅质滤柱或所述硅质磁珠以回收所述特定大小的核酸片段；
其中，所述步骤(a)至步骤(d)不包括调控溶液环境中的酸碱值(pH值)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(a)中所述混合溶液进一步包含拥挤试剂，且所述拥挤试剂为乙醇、异丙醇或聚乙二醇。
3.一种选择性分离核酸的方法，其包含有下列步骤：
(a)混合样本核酸与第一结合缓冲液以产生第一混合溶液，其中所述样本核酸具有核酸片段，所述第一结合缓冲液具有离液盐，使所述第一混合溶液所含离液盐浓度为0.6M-4M，所述离液盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或过氯酸钠；
(b)使所述第一混合液流过第一硅质滤柱或第一硅质磁珠，以取得一次筛选液，其中所述一次筛选液含有特定大小的第一核酸片段；
(c)混合所述一次筛选液与第二结合缓冲液以产生第二混合溶液，其中所述第二混合溶液具有所述离液盐，以及浓度为0.104M-0.625M的单价离子盐，所述单价离子盐为氯化锂、醋酸锂、醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵；
(d)使所述第二混合溶液流过第二硅质滤柱或第二硅质磁珠，藉由所述单价离子盐浓度的高低来控制将欲保留的特定大小的第二核酸片段结合于所述第二硅质滤柱或所述第二硅质磁珠；其中，当所述离液盐浓度固定时，所述单价离子盐浓度愈高则保留尺寸愈大的核酸片段，进而使所述特定大小的所述第二核酸片段结合于所述第二硅质滤柱或所述第二硅质磁珠；
(e)使冲洗缓冲液流过所述第二硅质滤柱或所述第二硅质磁珠以清除未与所述第二硅质滤柱或所述第二硅质磁珠结合的物质；以及
(f)使水溶液流过所述第二硅质滤柱或所述第二硅质磁珠以回收所述特定大小的所述第二核酸片段；其中，所述步骤(a)至步骤(d)不包括调控溶液环境中的酸碱值(pH值)。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(c)中的所述第二混合溶液进一步包含拥挤试剂，且所述拥挤试剂为乙醇、异丙醇或聚乙二醇。
5.一种选择性分离核酸之套组，其特征在于,包含如权利要求1或权利要求2中任一项的方法中的结合缓冲液及硅质滤柱或硅质磁珠，所述结合缓冲液具有离液盐，以及单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一，所述结合缓冲液是配合所述硅质滤柱或硅质磁珠使用，所述选择性分离核酸之套组的使用方法如权利要求1或权利要求2中任一項的方法,當所述离液盐具有相同浓度，所述单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段结合于所述硅质滤柱或所述硅质磁珠,及当所述单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段结合于所述硅质滤柱或所述硅质磁珠,其中所述大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段。
6.一种选择性分离核酸之套组，其特征在于,包含如权利要求3或权利要求4中任一项的方法中的结合缓冲液及硅质滤柱或硅质磁珠，所述结合缓冲液具有离液盐，单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一，所述结合缓冲液是配合所述硅质滤柱或硅质磁珠使用，所述选择性分离核酸之套组的使用方法如权利要求3或权利要求4中任一项的方法,当所述离液盐具有相同浓度，所述单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段结合于所述硅质滤柱或所述硅质磁珠,及当所述单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段结合于所述硅质滤柱或所述硅质磁珠,其中所述大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段。
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