CN110769909A - 质粒的周期逆流色谱分离 - Google Patents

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Abstract

在具有至少三个填充有分离基质颗粒的色谱柱的装置中从过程进料连续分离质粒的方法，其中当一个色谱柱加载过程进料时，用洗脱剂洗脱另一个色谱柱以回收被分离的质粒，并且用另外的洗脱剂洗脱又一个色谱柱以去除污染物。

Description

质粒的周期逆流色谱分离
技术领域
本发明涉及生物药物的制造中的分离方法，并且更具体地涉及用于分离大物类（例如质粒、病毒颗粒等）的分离方法。
发明背景
在生物药物（如疫苗、抗体、重组蛋白、基因治疗载体等）的制造中，通常需要几个色谱分离步骤以从产物中去除各种污染物和杂质。这些分离步骤增加了显著成本和处理时间，因此对强化它们有显著的兴趣。
多柱连续色谱方法是可用的，其中将进料应用于第一柱，然后当第一柱接近饱和时，将进料转向至一个或多个后续柱，并且洗脱第一柱，并使其再生以在所述一个或多个后续柱的洗脱和再生期间再次加载。这样的方法可以称为周期逆流色谱(PCC)或模拟移动床(SMB)，并且对于生物药物的分离来说相当重要，参见例如US7901581、US20130248451、US20130280788和US7220356，其通过引用以其整体并入本文。PCC/SMB方法能显著地提高生产能力，但是所达到的提高可能相当强烈地取决于方法的设计。
质粒在生物药物领域中主要作为用于基因治疗和某些细胞治疗（例如用于制备CAR-T细胞）的载体，并且还在疫苗技术中是令人感兴趣的。质粒是细菌来源的大型环状DNA分子，由于它们的尺寸阻碍它们进入大多数色谱介质的孔，这在色谱方法中呈现出特定的问题。在质粒纯化中常见的第一步是所谓的组分离，其中将质粒制备物应用于凝胶过滤树脂，并且在空隙部分或被轻微保留的部分中回收质粒，而RNA（主要的污染物）进入树脂的孔并被显著地保留。与其它凝胶过滤方法一样，这是一种具有有限的加载容量的缓慢方法，并且通过应用连续处理来加速它将高度引人关注。
因此，对质粒和其它大物类（例如病毒颗粒），需要允许提高方法效率的新的组分离方法。
发明概述
本发明的一个方面是提供用于连续分离质粒或例如病毒颗粒或其它大物类的有效方法。这是通过将含有质粒/病毒颗粒或其它大物类的过程进料应用于具有至少三个填充有分离基质颗粒的色谱柱的装置的方法来实现的，其中当一个色谱柱加载有过程进料时，用洗脱剂洗脱另一个色谱柱以回收被分离的质粒，并且用另外的洗脱剂洗脱又一个色谱柱以去除污染物。
本发明的进一步的合适的实施方案在从属权利要求中描述。
附图
图1显示可以用本发明的方法使用的色谱系统的实例。
图2显示可以用本发明的方法使用的色谱系统的另一实例。
图3显示使用三个柱的本发明的方法的实例。
图4显示使用四个柱的本发明的方法的实例。
图5显示来自实施例1的单柱运行1的结果。
图6显示来自实施例1的单柱运行2的结果。
图7显示来自实施例2的四柱PCC运行1的结果。
图8显示来自实施例2的四柱PCC运行2的结果。
图9显示来自实施例2的四柱PCC运行2的结果（放大）。
图10显示具有1 Mw标记物、2样品和3质粒部分的电泳凝胶。
定义
如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”、“具有”等可具有美国专利法中归属给它们的含义，并且可表示“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由……组成”或“基本上组成”同样地具有美国专利法中所归属的含义，并且所述术语是开放式的，允许存在多于所列举的那些，只要所列举的那些的基本或新颖特征不因多于所列举的那些的存在而改变，但是排除现有技术实施方案。
实施方案详述
在一个方面，本发明公开了在具有至少三个色谱柱的装置中，从包含质粒的过程进料中连续分离质粒的方法。该方法也可用于从较低分子量污染物中大物类，例如病毒、病毒样颗粒、抗原缀合物等的其他分离。用分离基质颗粒填充柱，并且当一个色谱柱加载过程进料时，用洗脱剂洗脱另一个色谱柱以回收被分离的质粒，并且用另外的洗脱剂（其可以是与用于洗脱质粒相同的洗脱剂）洗脱又一个色谱柱以去除污染物，例如RNA。如果在不同步骤中的流速是匹配的，以便在任何步骤中不需要停止来等待另一步骤结束，则可能是有利的。
如图3所示，在一些实施方案中，该方法可以包括以下步骤：
a)将包含质粒的过程进料通过包含分离基质颗粒的填充床的第一色谱柱输送；
b)将洗脱剂通过所述第一色谱柱输送，在通过所述第一色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；并且将所述过程进料通过填充有与所述第一色谱柱相同的分离基质的第二色谱柱输送；和
c)将另外的洗脱剂（其可以是与步骤b中相同的洗脱剂）通过所述第一色谱柱输送；将洗脱剂通过所述第二色谱柱输送，在通过所述第二色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；并且将所述过程进料通过填充有与所述第一和第二色谱柱相同的分离基质的第三色谱柱输送。
在步骤c)之后，可以在连续过程的持续时间内重复步骤a)-c)，例如直到整个过程进料都已被处理。在这些重复中，步骤a)可进一步包括将另外的洗脱剂通过所述第二色谱柱输送，同时将洗脱剂通过所述第三色谱柱输送，并在通过所述第三色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；和步骤b)可进一步包括将另外的洗脱剂通过所述第三色谱柱输送。适当地，在所有步骤a)-c)期间，将过程进料或洗脱剂通过所有三个柱输送，即没有流动停止以等待另一柱/步骤结束。
如图4所示，在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：
a)将包含质粒的过程进料通过包含分离基质颗粒的填充床的第一色谱柱输送，并且将来自所述第一色谱柱的流出物通过填充有与第一柱相同的分离基质的第二色谱柱输送；
b)将洗脱剂通过所述第一色谱柱输送，在通过所述第一色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；并且将所述过程进料通过第二色谱柱输送，并且进一步通过填充有与所述第一和第二柱相同的分离基质的第三色谱柱输送；
c)将另外的洗脱剂通过所述第一色谱柱输送；将洗脱剂通过所述第二色谱柱输送，在通过所述第二色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；并且将所述过程进料通过所述第三色谱柱输送，并且进一步通过填充有与所述第一、第二和第三柱相同的分离基质的第四色谱柱输送；和
d)将包含质粒的过程进料通过所述第四色谱柱输送，并且将来自所述第四色谱柱的流出物通过所述第一色谱柱输送；将另外的洗脱剂通过所述第二色谱柱输送；并且将洗脱剂通过所述第三色谱柱输送，在通过所述第三色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂。
在步骤d)之后，可以在连续过程的持续时间内重复步骤a)-d)，例如直到整个过程进料都已被处理。在这些重复中，步骤a)可进一步包含将另外的洗脱剂通过所述第三色谱柱输送，并且将洗脱剂通过所述第四色谱柱输送，同时在通过所述第四色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；和步骤b)可进一步包含将另外的洗脱剂通过所述第四色谱柱输送。适当地，在所有步骤a)-d)期间，将过程进料或洗脱剂通过所有三个柱输送，即没有流动停止以等待另一柱/步骤结束。
该方法可以例如在如图1所示的色谱系统10中来进行。这样的系统包含多个色谱柱11、12、13（图1中显示了三个柱，但是四个或更多个柱同样是可能的）。该系统可被适当地安排以进行连续色谱。柱可以用相同的分离基质填充，并且用一个或多个连接管线14、15、16连接，使得液体可以从一个柱11、12流动到随后的一个柱12、13，并且从最后的柱13流动到第一柱11，并且两柱之间的每一个连接管线可包含至少一个开/关阀17、18、19，它可以是三通阀或四通阀。这些阀与阀/阀组23、25、29结合，也允许柱的平行操作，例如一个或多柱的洗脱与一个或多个其它柱的加载同时进行。该系统可以进一步包含进料泵20（例如通过第一检测器21与第一阀组22连接），以及一个或多个缓冲泵34、35（例如与阀组22连接）。第一阀组22可通过第一阀23进一步与第一柱11的入口连接。所述第一柱11的出口端可以通过第二检测器24与第二阀17连接。所述第一阀组22可以通过第二阀或阀组25进一步与第二柱12的入口连接。所述第二柱12的出口端可以通过第三检测器26与阀18连接。此外，阀27可以连接到阀17和阀18之间。阀27还可以连接到阀28，阀28还连接到阀23和所述第二阀组25。据此，来自第一柱11的流出物通过连接管线14，阀17、27、28和25可被引导到第二柱12的入口。此外，第一阀组22通过阀29可以与第三柱13的入口连接。所述第三柱13的出口端可以通过第四检测器30与阀19连接。此外，阀31可以连接到阀18和阀19之间。阀31还可以与阀32连接，阀32还可以与所述第二阀组25和阀29连接。据此，来自第二柱12的流出物通过连接管线15可被引导到所述第三柱13的入口。来自第三柱13的流出物通过阀19和23通过连接管线16可被引导到第一柱11的入口（或者它可以被引导到随后的第四柱）。此外，第一、第二、第三和第四检测器21、24、26、30可以全部连接到确定单元37。所述确定单元可以适用于使用来自检测器的检测信号来确定三个不同柱的穿透点和饱和点。所述确定单元37以及所有的阀组、阀和泵可以进一步与控制单元33连接（图1中未显示所有的连接），控制单元33适用于在从/向加载区域去除或添加柱、改变流速、开始新的洗脱步骤等的时间方面来控制色谱系统。所述检测器21、24、26、30可以例如是UV检测器。控制单元33可以配置为根据从确定单元37获得的穿透数据来控制系统。或者，控制单元33可以使用固定的预设步骤时间来转换操作。
图2显示了进行本发明的方法的可替代色谱系统110。该系统包含多个色谱柱（例如3个或4个柱）111、112、113、114，可以用相同的分离基质填充它们。柱可通过多功能的第一阀组122独立地与进样泵120、缓冲泵134、135和/或连接管线115、116、117、118、119连接。它们也可通过多功能的第二阀组125独立地与连接管线和检测器121、124、126连接。阀组122和125允许在阀组内几个不同流动路径的平行连接（参见例如WO2015094095或WO2015094096，通过引用以其整体结合到本文中，用于阀/阀组的有用的设计）。它们也可以用于将一个或多个泵与一个或多个连接管线连接，以便绕过或反冲一个或多个柱。进一步的阀或阀组129允许引导流动从检测器126到一个或多个收集容器、废物或到连接管线119用于例如在另一柱上应用。阀/阀组122、125、129，检测器121、124、126和泵120、134、135通过电连接或电磁连接到组合的确定单元和控制单元133，用于检测和用于控制流动。系统110类似于商业上可获得的ÄKTATM pcc 75系统(GE Healthcare Life Sciences)，具有一些小的修改，例如所述三个泵可直接连接到三个不同的柱。系统10和系统110两者当然可以被进一步修改，例如通过添加进一步的柱、泵、阀和/或检测器。
在上述讨论的实施方案中，分离基质颗粒可以合适地是具有小于5000 kDa（例如500 kDa-5000 kDa或500-3000 kDa）的葡聚糖排阻限的凝胶过滤颗粒。这些颗粒能够从较低分子量的污染物（例如存在于细胞裂解物中的或多或少降解的RNA，通常具有＜1 kb的尺寸）分离质粒（其通常可以在2-20 kb的尺寸范围内（对于疫苗型质粒为2-7 kb，以及对于用于基因治疗的质粒达到20 kb））。该分离基质颗粒可包含交联的多糖，例如交联的琼脂糖或备选地交联的琼脂、纤维素或葡聚糖。交联的琼脂糖颗粒的实例可以例如是具有葡聚糖排阻限为2000 kDa、平均粒径为90 µm和粒径范围为45-165 µm的SepharoseTM 6 Fast Flow珠(GE Healthcare Life Sciences)。或者，可以使用具有葡聚糖排阻限为约1000 kDa的Sepharose CL-6B交联琼脂糖珠(GE Healthcare Life Sciences)，虽然Sepharose 6 FastFlow由于更高的刚性而将允许更高的流速。为了允许甚至更高的流速，可以使用高刚性交联琼脂糖珠，例如在US6602990（通过引用以其整体并入本文）中描述的珠。
在一些实施方案中，洗脱剂（和任选另外的洗脱剂）包含至少1.5 M盐，例如1.5-2.5 M或1.8-2.3 M盐。换句话说，洗脱剂（和任选另外的洗脱剂）的总盐浓度可为至少1.5M，例如1.5-2.5 M或1.8-2.3 M。所述盐可例如是硫酸铵，和所述洗脱剂/另外的洗脱剂可例如包含至少1.5 M硫酸铵，例如1.5-2.5或1.8-2.3 M硫酸铵。盐/硫酸铵的存在改善质粒和RNA污染物之间的分离。
过程进料可以包含澄清的细胞裂解物，例如革兰氏阴性细胞（例如大肠杆菌）的裂解物。在一些实施方案中，该方法包含在分离之前，制备澄清的细胞裂解物作为过程进料的步骤0)。步骤0)可包含使细胞（例如大肠杆菌细胞）与碱和表面活性剂（例如SDS）接触，以诱导裂解并用例如醋酸钾中和。这是众所周知的方法，涉及到添加NaOH和SDS至终浓度为例如0.1 M和0.05%（参见例如L A Ciccolini et al: Biotech Bioeng 87, 293-302 (2004)）。步骤0)也可以连续模式进行，例如通过在静态混合器或类似装置中添加裂解试剂（参见例如US2007/0213289，通过引用以其整体并入本文）。澄清可以通过传统的过滤进行，但是为了避免过滤器的过度阻塞，在最终的过滤之前通过絮凝/漂浮来去除大部分颗粒可能是有利的。这可以通过在pH约5 （例如在pH 4-6或4.5-5.5）下向粗中和裂解物中添加碳酸氢盐（例如碳酸氢铵）来实现。如果pH在这一区间之外，在加入碳酸氢盐后可以调节以便落到该区间内。在这些条件下产生的二氧化碳气泡将引起絮凝的颗粒漂浮到表面，留下几乎完全澄清的裂解物作为主体液体。这样的漂浮过程也可以连续进行，例如通过使裂解物流动通过漂浮容器，在该漂浮容器中表面上的漂浮材料被丢弃或以其它方式转移，同时将澄清的裂解物通过过滤器而没有任何阻塞问题。
除了上述讨论的步骤，该方法可以进一步包含，在分离之后，纯化回收的质粒的步骤e)。这可以例如通过结合-洗脱色谱来进行，并且可以适当地涉及从开环(oc)和其他构象的质粒分离想要的超螺旋(sc)质粒。亲硫和疏水两种相互作用色谱方法均可用于这个目的。对于亲硫色谱，可以使用树脂如PlasmidSelectTM或PlasmidSelect Xtra (GEHealthcare Life Sciences)，而具有例如苯基、丁基或己基的各种色谱树脂已经被建议用于质粒的疏水相互作用色谱（参见例如US2007/0213289，通过引用以其整体并入本文）。步骤e)也可以以连续模式进行，例如通过使用PCC或SMB连续色谱技术。这可以通过将来自上述步骤的洗出液直接应用于第二多柱色谱系统来实现。或者，在具有几个色谱柱的系统中，一些柱可用于初始分离，而一些柱可用于进一步纯化。在这种情况下，该系统可以包含填充有凝胶过滤树脂的柱和填充有例如亲硫或疏水相互作用树脂的柱两者。
实施例
实施例1 - 在单柱上的分批色谱
样品：大肠杆菌澄清裂解物，含有质粒pJV4 (6 kb)、17 mM Tris、3.3 mM EDTA，1 M醋酸钾。
柱：20 mL Sepharose 6 Fast Flow (Sepharose 6FF)凝胶过滤树脂(GEHealthcare Life Sciences)，其填充在HiPrepTM 16/10柱(GE Healthcare LifeSciences)中，具有16 mm的床直径和100 mm的床高。
色谱系统：ÄKTA pcc 75系统(GE Healthcare Life Sciences)
平衡缓冲液：2.1 M硫酸铵、10 mM EDTA、100 mM Tris-HCl pH 7.5。
洗脱缓冲液：2.1 M硫酸铵、10 mM EDTA、100 mM Tris-HCl pH 7.5。
运行1
表1. 运行1的条件
步骤 缓冲液 柱体积 流速(ml/min) 流动速度(cm/h) 停留时间(min)
平衡 平衡缓冲液 5 1.67 50 12
加载 样品 0.3 1.67 50 12
洗脱 洗脱缓冲液1 3 1.67 50 12
这是最初的运行，用于检查分离模式和开始优化。结果如图5所示，并表明质粒（第一峰）和污染物RNA（第二峰）之间的清晰分离。
运行2
表2. 运行2的条件
步骤 缓冲液 柱体积 流速(ml/min) 流动速度(cm/h) 停留时间(min)
平衡 平衡缓冲液 2 3.0 90 6.7
加载 样品 0.3 3.0 90 6.7
洗脱 洗脱缓冲液1 3 3.0 90 6.7
和运行1相比，流速增加。如图6所示，质粒峰的形状仍然和运行1相似。质粒峰的体积为7.7 ml，相当于0.39个柱体积，这表明一定程度的稀释。
实施例2 - 4柱PCC实验
在ÄKTA pcc 75色谱系统中安排了具有与实施例1中所用相同类型的四个柱的周期逆流色谱(PCC)设置。样品和缓冲液与实施例1中的相同，但在PCC循环开始之前对于所有柱仅进行一次平衡步骤。图4显示了在该过程期间不同柱的概述。对于加载步骤，使用两个连续连接的柱，以使来自第一加载柱（加载1）的流出物被引导到第二加载柱（加载2）。加载2步骤的作用主要是用从第一柱流出的缓冲液来洗涤第二柱。在PCC运行1中，洗脱2步骤的持续时间比其它步骤更长，在其它步骤中需要一些等待时间。
PCC运行1
表3. PCC运行1的条件
步骤 缓冲液 柱体积 流速(ml/min) 流动速度(cm/h) 停留时间(min)
平衡 平衡缓冲液 4 5.0 150 4
加载 样品 0.2 1.8 54 11
洗脱1 洗脱缓冲液 0.36 1.8 54 11
洗脱2 洗脱缓冲液 1 5.0 150 4
如图7中显示的结果表明了相当好的性能，尽管在加载期间已经有一些UV穿透，表明一些质粒在流通中被直接洗脱。
PCC运行2
在这个实验中，稍微减少加载的量以避免在流通中的洗脱。进一步地，调节步骤时间以使所有步骤可以连续运行而没有任何等待时间。如上所述，在实际PCC循环之前，平衡步骤仅运行一次。
表4. PCC运行2的条件
步骤 缓冲液 柱体积 流速(ml/min) 流动速度(cm/h) 停留时间(min)
平衡 平衡缓冲液 4 5.0 150 4
加载 样品 0.18 0.9 27 22
洗脱1 洗脱缓冲液 0.36 1.8 54 11
洗脱2 洗脱缓冲液 1 5.0 150 4
结果显示在图8和9中，证明了完全连续的分离。图10中的电泳凝胶显示了从高Mw质粒基本上完全去除低Mw RNA条带。表达生产能力的简单方法是计算每小时加载的柱体积(CV)的数目。对于单柱分批实验，在1.67 ml/min（运行1）下，每25 min加载是可能的，其导致了0.7 CV/h的生产能力。在3.0 ml/min下，可以每12 min将柱进行加载，即生产能力为1.5CV/h。在优化的PCC实施例（PCC运行2）中，每4.2 min可以加载0.18 CV，对应2.6 CV/h的生产能力，即相对运行2提高到170%，相对运行1提高到370%。可以预期连续的三柱设置给出甚至更高的生产能力。
本书面描述使用实例来公开本发明（包括最佳模式），并且还使本领域技术人员能够实践本发明，包括制造和使用任何设备或系统以及进行任何并入的方法。本发明可专利范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这样的其它实例具有与权利要求的字面语言并无不同的结构要素，或如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差异的等同结构要素，则这样的其它实例被认为在权利要求的范围内。本文中提到的任何专利或专利申请通过引用以其整体并入本文，如同它们被单独并入。

Claims (23)

1.在具有至少三个填充有分离基质颗粒的色谱柱的装置中从包含质粒的过程进料中连续分离质粒的方法，其中当一个色谱柱加载所述过程进料时，用洗脱剂洗脱另一个色谱柱以回收所述被分离的质粒，并且用另外的洗脱剂洗脱又一个色谱柱以去除污染物。
2.权利要求1所述的方法，其包含以下步骤：
a)将包含质粒的过程进料通过包含分离基质颗粒的填充床的第一色谱柱输送；
b)将洗脱剂通过所述第一色谱柱输送，在通过所述第一色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；并且将所述过程进料通过填充有与所述第一色谱柱相同的分离基质的第二色谱柱输送；和
c)将另外的洗脱剂通过所述第一色谱柱输送；将洗脱剂通过所述第二色谱柱输送，在通过所述第二色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；并且将所述过程进料通过填充有与所述第一和第二色谱柱相同的分离基质的第三色谱柱输送。
3.权利要求2所述的方法，其中在步骤c)之后，在连续过程的持续时间内重复步骤a)-c)。
4. 权利要求3所述的方法，其中在所述重复中：
步骤a)进一步包含将另外的洗脱剂通过所述第二色谱柱输送，同时将洗脱剂通过所述第三色谱柱输送，并在通过所述第三色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；和
步骤b)进一步包含将另外的洗脱剂通过所述第三色谱柱输送。
5.权利要求2-4中任一项所述的方法，其中在所有步骤a)-c)期间，将过程进料或洗脱剂通过所有三个柱输送。
6.权利要求1所述的方法，其包含以下步骤：
a)将包含质粒的过程进料通过包含分离基质颗粒的填充床的第一色谱柱输送，并且将来自所述第一色谱柱的流出物通过填充有与所述第一柱相同的分离基质的第二色谱柱输送；
b)将洗脱剂通过所述第一色谱柱输送，在通过所述第一色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；并且将所述过程进料通过所述第二色谱柱输送，并且进一步通过填充有与所述第一和第二柱相同的分离基质的第三色谱柱输送；
c)将另外的洗脱剂通过所述第一色谱柱输送；将洗脱剂通过所述第二色谱柱输送，在通过所述第二色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；并且将所述过程进料通过所述第三色谱柱输送，并且进一步通过填充有与所述第一、第二和第三柱相同的分离基质的第四色谱柱输送；和
d)将包含质粒的过程进料通过所述第四色谱柱输送，并且将来自所述第四色谱柱的流出物通过所述第一色谱柱输送；将另外的洗脱剂通过所述第二色谱柱输送；并且将洗脱剂通过所述第三色谱柱输送，在通过所述第三色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂。
7.权利要求6所述的方法，其中在步骤d)之后，在连续过程的持续时间内重复步骤a)-d)。
8. 权利要求7所述的方法，其中在所述重复中：
步骤a)进一步包含将另外的洗脱剂通过所述第三色谱柱输送，并且将洗脱剂通过所述第四色谱柱输送，同时在通过所述第四色谱柱后回收具有所述质粒的所述洗脱剂；和
步骤b)进一步包含将另外的洗脱剂通过所述第四色谱柱输送。
9.权利要求6-8中任一项所述的方法，其中在所有步骤a)-d)期间，将过程进料或洗脱剂通过所有三个柱输送。
10. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离基质颗粒是具有小于5000kDa、例如500 kDa-5000 kDa或500-3000 kDa的葡聚糖排阻限的凝胶过滤颗粒。
11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离基质颗粒包含交联的多糖，例如交联的琼脂糖。
12. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗脱剂包含至少1.5 M的盐，例如1.5-2.5或1.8-2.3 M盐。
13. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗脱剂的总盐浓度为至少1.5 M，例如1.5-2.5或1.8-2.3 M。
14. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗脱剂包含至少1.5 M硫酸铵，例如1.5-2.5或1.8-2.3 M硫酸铵。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过程进料包含澄清的细胞裂解物。
16.前述权利要求中任一项所述的方法，其包含，在分离之前，制备澄清的细胞裂解物作为所述过程进料的步骤0)。
17.权利要求16中所述的方法，其中步骤0)包含使细胞、例如大肠杆菌细胞与碱和表面活性剂、例如SDS接触。
18.权利要求16或17所述的方法，其中步骤0)以连续模式进行。
19.权利要求16-18中任一项所述的方法，其中步骤0)进一步包含添加碳酸氢盐，例如碳酸氢铵，任选地随后将pH调节到4-6。
20.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含，在分离之后，将回收的质粒纯化的步骤e)。
21.权利要求20所述的方法，其中步骤e)包含结合-洗脱色谱。
22.权利要求21所述的方法，其中步骤e)包含亲硫或疏水相互作用色谱。
23.权利要求20-22中任一项所述的方法，其中步骤e)以连续模式进行。
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