CN107532165A - 按大小分级来选择性分开和分离核酸混合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及按大小分级来分离核酸的方法，其特征是有以下步骤：在不存在脂肪族醇的情况下，向一定量的核酸混合物中添加第一结合缓冲剂，所述第一结合缓冲剂包含至少一种离液盐和至少一种提高该结合缓冲剂的pH值的物质；结合至固相，并使通过步骤a)所结合的核酸分开；将来自步骤a)的滤液与pH值小于步骤a)中的结合缓冲剂的第二结合缓冲剂混合，或者与非离子表面活性剂混合，或者与醇混合，或者与非离子表面活性剂和醇的混合物混合；结合至固相并使通过步骤c)所结合的核酸分开；按照已知方法洗涤和洗脱在步骤a)和步骤c)之后所分离的核酸，结果，不仅在步骤a)后所分离的核酸具有比在步骤c)中分离的核酸更多数量的碱基对，而且在步骤a)后和在步骤c)后都分离出具有特定数量的碱基对的、在各其它步骤中未被分离出的独特的特定核酸级分。核酸级分的大小关系可以通过改变pH值来控制。

Description

按大小分级来选择性分开和分离核酸混合物的方法

技术领域

本发明涉及按大小分级来分开和分离核酸的新方法。

本发明尤其针对此类应用，其中预期仅应分离具有所选大小范围的核酸以便能更为高效地执行特定的下游应用。但本发明也适用于使用者意欲分析来自一份样本的不同核酸级分的情况。

背景技术

为了纯化和回收核酸，尤其是DNA或DNA片段，当今存在许多可供商业使用的提取试剂盒。

所有这些方法均基于由Vogelstein和Gillespie(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1979,76,615-619)研发且初次著述的琼脂糖凝胶中DNA片段的预备性分析纯化方法。所述方法组合了：将含有待分离的DNA带的琼脂糖溶解在离液盐饱和溶液(NaJ)中，和使DNA结合至玻璃颗粒。固定到玻璃颗粒上的DNA随后用清洗溶液(20mM的Tris HCl[pH7.2]；200mM的NaCl；2mM的EDTA；50％v/v乙醇)清洗，且最终脱离载体颗粒。

与此同时，核酸结合至矿物载体材料的特定形式的物理化学原理体现在，破坏了核酸借以吸附在矿物材料特别是玻璃颗粒或硅石颗粒表面上的含水环境的母体结构。其中，始终在存在离液离子且其具有高浓度的情况下趋近定量地破坏含水环境的母体结构。从1998年起也已申明，在没有含离液盐的缓冲剂情况下也完全可以将核酸结合至矿物载体。因此，在公开出版物WO2007/036564A2中申明含有所谓抗离液盐的缓冲剂允许核酸特定吸附至矿物载体上，此时所采用的核酸分离过程类似于基于离液化学物质的已知方法。该化合物随后被优选和提纯(WO2007/060248A1)。

在出版物WO01/62976A1中公开了以下方法，其涉及在添加不同的醇的情况下对不同反应混合物中的核酸进行纯化，随后使核酸沉积在特定固相(具有特殊物理特性的薄膜)上，使用醇缓冲剂进行洗涤的步骤，和最终利用水洗脱核酸。

专利文献US5405951A和EP0512767B1同样描述了通过用醇孵育含核酸样本，随后用矿物材料孵育该样本来实现核酸的分离。通过添加60摄氏度热水进行核酸洗脱。

在专利文献DE10253351B4中公开了核酸的纯化和回收过程，即用添加剂调节含核酸的溶液，使它含有单价和多价阳离子以及醇，然后使其接触固相，随后可洗涤载体并将核酸与固相分离。作为单价盐成分，采用氯化铵、氯化钠和/或氯化钾，而作为多价盐成分则采用氯化镁、氯化钙、氯化锌和/或氯化锰。

申明内容如下，正是单价盐和多价盐的组合导致核酸吸附于固相上，而其中为此所需的离子浓度只需很低。这一点的优势在于，或许不再需要迄今始终必要的洗涤步骤，进而可以明显缩短和简化核酸分离方法。

在公开出版物WO2007/065934A1中公开了以下方法，该方法也允许能够纯化长链DNA片段和短链DNA片段，为此通过使用柠檬酸盐来添加缓冲剂，该缓冲剂只含低离子浓度，因此也不再需要洗涤步骤。

所有这些不同的方法呈现出一个共同点。它们始终能够分离样本所含的总核酸。意即，样本中存在长链核酸和短链核酸构成的混合物，因而始终纯化该核酸混合物。未对长链核酸片段和短链核酸片段进行分离或者差别性提取，或者对处于预期大小范围内的核酸进行有目的的纯化。

当前，现代诊断课题限定了必须从含核酸的样本中选择性富集或减少特定的核酸级分，或者差异性具备这些级份。本发明意义上的核酸片段是指核酸的大小级分，即，短链、较长链或长链的核酸。

一份样本中的短链核酸富集和与之相关的较长链和长链核酸减少在现代产前诊断中扮演了重要角色。其中涉及到将孕妇血液中的游离循环母体DNA与游离循环胎儿DNA按预期大小分级来分离。将游离循环胎儿DNA用于产前诊断(例如证明三染色体性)具有以下优点，即无需进行对生长中的胎儿常常造成危险的创伤性检验(羊膜穿刺术或者绒毛膜绒毛活检)。但本领域的专业人员也了解，母血中源自胎儿的游离循环DNA占比通常大幅低于游离循环母体DNA的占比。尤其是在DNA测序中，大量过剩的母体DNA明显增加了对胎儿靶序列的检验难度。

此外，游离循环DNA的占比通常始终很低，由此进一步加重了诊断难度，因为无法始终提供足量的DNA。此时亟需将更多样本量用于单次提取。除了产前诊断外，从体液中分离出游离循环核酸也越来越重要。这涉及到分子肿瘤诊断、植入物排斥反应化验等。在这些研究领域中，可以实现从样本中按大小分级来选择性提取核酸也受到越来越多的关注。另一方面，能够分离出足量核酸并由此简单快速地处理较大体积的样本也至关重要。同样重要的是，整体探究样本中核酸大小如何分布，因为由此可以推断出游离循环DNA的来源。

在WO2009/146776A2中公开了以下方法，其涉及了从含核酸的原材料中分离/纯化短链核酸。

此时采用了两种方法变型。短链核酸的纯化主要通过使原材料接触离液剂、异丙醇以及核酸结合载体材料来实现。此时，醇浓度应该≥5％(v/v)且≤40％(v/v)。由此，短链核酸应该更为高效地结合至载体材料。已结合的核酸可留在载体材料上，但也可以被洗脱。根据该出版物的数据，短链核酸应该在所述结合条件下极其高效地得到纯化(离液剂与异丙醇的组合)，甚至可以实现相对于较长链核酸的短链核酸富集。但是，该方法未涉及有效分离短链核酸与较长链核酸。所有级分均得到纯化。为了执行短链核酸和长链核酸的分离，该文献中描述了另一备选方法。此方法中，使原材料接触到离液剂、支链醇和/或非支链醇以及核酸结合载体材料，其中醇浓度≤30％(v/v)。随后使第一步中得到的渗透物或上清液接触离液剂、支链醇和/或非支链醇以及核酸结合载体材料，其中醇浓度≥5％(v/v)。文献中提到，在核酸结合载体材料与离液剂和浓度大于约25％的醇的组合条件下，导致长链核酸或较长链核酸的优先结合，而短链核酸的结合则相对很弱且因而处于渗透物/上清液中，它们随后可根据所述方法被从中分离出来。这一备选方法只涉及较长链核酸的分离。其并未指明执行短链核酸和较长链/长链核酸的分级分离的可行性。该方法也无法实现总核酸的分离和短链核酸与较长链/长链核酸的后续分离。对于短链核酸富集至关重要的是离液剂与优选异丙醇的组合。

在专利文献DE102006045391B4中也描述了以下方法，该方法适用于从含此核酸的混合物中分离出长链核酸和短链核酸。此时，所述分离未通过改变结合条件来实现，而是通过使与离液剂接触的样本连续经过具有两种不同孔径的两个二氧化硅相。在样本两次流经二氧化硅相1和样本两次流过二氧化硅相2后，核酸片段就形态而言呈现分离状态，此时在第一相上结合至少20000碱基对大小的核酸片段，而在第二相上结合最多10000碱基对的核酸片段。因此，该方法不适用于分离短链核酸和长链核酸，而这恰好是本发明的预设目的。

出版物WO2004/042058A2也属于现有技术。其中申明，所用的结合缓冲剂的pH值不仅对待获取的核酸的产量具有显著影响，也显著影响到对于例如待纯化的PCR产物的片段长度的选择性。此时不需要相互组合在溶液中的单价盐和多价盐。最好采用首选的二价镁盐或二价钙盐。对于不含醇但含有二价阳离子的结合缓冲剂，在100bp至10000bp大小范围内进行大量DNA片段定量回收，优先采用＞8.5的pH值。

发明内容

本发明是基于消除现有技术中所述方案的缺点的目的。

该目的根据权利要求书的特征加以完成。

根据本发明，提供一种方法，其允许从含有短链核酸和较长链/长链核酸(尤其是DNA)的混合物样本中，选择性纯化或分离不同的DNA大小级分，进而可以将这些级分用于进一步应用。

另外，提供一种方法，其允许从含有短链核酸和较长链/长链核酸(DNA)的混合物的样本中选择性分离短链核酸与长链核酸，其中各个级分的大小范围可调(例如将小于500碱基对的DNA与大于500碱基对的DNA分离)。非预期的各个级分随后可以丢弃，同时使用预期的级分继续加工。

此外，提供一种方法，其允许从大体积样本(例如血浆、血清、尿液或者其它无细胞体液)中浓缩短链核酸和较长链/长链核酸，随后按照第1项或第2项中所述对核酸按大小分级进行选择性分离。

本发明基于以下观察，即当所用的扩增缓冲液具有高pH值且将离液缓冲剂用于纯化时，从PCR反应配制物中分离出短链DNA片段(小于500bp的DNA片段)始终存在问题。

原因似乎在于，较高的pH值明显对特别是短链核酸到矿物载体材料的结合产生了不利影响。如果此为原因，则存在以下可能，即通过改变pH值，可调节允许短链或较长链/长链核酸选择性结合的结合条件。

不同于如出版物WO2004/042058A2中所述的方法，二价或多价阳离子以及单价和二价阳离子的组合均不是不同长度核酸的分离所需要的。

这恰可使用本发明的相关方法而极为高效地实现。此外，可以灵活调节结合条件，即实际可以完成任一种核酸大小分级。为此，本发明的相关方法允许从含有短链核酸和较长链/长链核酸(DNA)的混合物样本中选择性纯化或分离不同的DNA大小级分，或者同样也选择性去除某些大小级分。该方法的过程基础是，使短链核酸和较长链/长链核酸的混合物接触含有离液盐的溶液。为实现短链或较长链/长链的核酸的选择性结合，可对该混合物的pH值进行多变调节。结果表明，当pH值为6或7时，短链核酸以及较长链/长链的核酸极为高效地结合至矿物载体材料(例如玻璃纤维过滤材料)。在核酸结合至矿物材料(例如采用玻璃纤维材料的离心柱)后，用洗涤缓冲剂洗涤载体材料，最后在添加水或其它低盐缓冲剂后从载体上洗脱结合的核酸级分。出乎意料的是，样本和离液盐含水溶液的混合物的pH值增大，改变了结合于载体上的核酸的大小范围。pH值的连续增大导致短链核酸首先不再结合载体，接着较长链/长链核酸也不再结合载体，只有长链核酸留在载体上。此时，可以灵活调节上述分级。最后，较长链/长链核酸或者甚至长链核酸和短链或短链/较长链核酸均不结合载体材料。所结合的核酸随后可以被纯化和分离。格外受到关注的恰恰是以下应用，该应用针对的是旨在从含有短链核酸以及较长链/长链的核酸混合物中减少较长链/长链的核酸并分离短链核酸。而这种预设目标可以利用本发明的相关方法来简单高效地实现。在调节样本和离液溶液构成的混合物的pH值之后，较长链/长链核酸结合至第一载体材料。未结合的核酸级分随后始终处于滤液中。

位于滤液内的短链核酸分离利用本发明方法如下进行。滤液现在与含水溶液混合，该溶液的pH值低于第一结合反应溶液的pH值。这例如可以只通过添加缓冲溶液(例如Tris HCl；pH6)进行，但也可以通过添加例如衍生自烷基糖苷类或辛基酚乙氧基化物类的非离子表面活性剂，或者由离液剂和非离子表面活性剂等构成的混合物进行。此时重要的只是改变最终结合条件，即滤液所含的核酸级分高效结合至第二载体材料。这根据本发明通过降低pH值实现。

在改变pH值之后使混合物接触第二核酸结合载体(如具有玻璃纤维材料的离心柱)，接着洗涤，最后通过加水或添加低盐缓冲剂而从载体上洗脱核酸。

事实表明，通过改变(减小)pH值来改变结合条件，以便滤液所含的短链核酸或者短链/较长链核酸高效结合至载体材料，即未结合至第一载体材料的核酸级分。为此，本发明基于针对核酸吸附于第一载体材料和第二载体材料所存在的多变结合条件的可变化的相互作用。针对第一载体材料的结合条件通过灵活可调的pH值来设计，从而使短链或较长链或长链的核酸如预期的结合至载体材料。于是，未结合的核酸级分在进行提取步骤之后位于滤液中。现在，结合条件通过添加其pH值较低的溶液来调节，即该核酸现在结合至第二载体材料。

出乎意料的是，大小分级不是如同在所引用的出版物EP2128169A1中所述的，某些片段大小按照百分比富集/减少20％、50％或60％，而是能几乎定量(达到99％)实现所述分离。

因此，利用本发明的方法，可以单独地选择性灵活分离两种核酸级分，它们可同时存在。如果不想要两个级分而是只想要其中之一，则可以弃用各自的载体材料，而只用预期核酸级分处于其上的载体材料来工作。因此，可以简单高效地调节并实现所预期的所选核酸大小级分的富集/减小。

另外，根据本发明的核酸混合物的选择性大小分级也允许直接加工含有不同核酸级分的生物样本。尤其是无细胞体液(血清、血浆、尿液等)是重要的原始样本，因为人们也想要从中高效地分离出所谓的循环无细胞DNA。如上所述，在此重要的是从样本减小例如长链核酸，并高效地纯化短链核酸(例如为了产前诊断要分离母体DNA和胎儿DNA)。本发明的方法也允许直接加工这样的样本。为此，样本与裂解缓冲剂/结合缓冲剂混合，其由根据本发明的具有灵活调节的特殊pH值的离液溶液的组合物构成。在这种情况下也可以通过改变pH值(在盐浓度恒定情况下pH值越高，短链核酸或随后的较长链和长链核酸越发难以结合)来灵活调节，从而可以限定预期的大小分级。原始样本短暂裂解之后，使样本接触核酸结合载体(例如具有玻璃纤维材料的离心柱)。此时较长链/长链核酸结合该载体，而短链核酸位于滤液中。现在可以抛弃离心柱或者根据所述方法过程来洗涤，结合的较长链/长链的核酸从该载体被洗脱下来，以供进一步应用。随后用其它溶液处理滤液，使最终的pH值现在低于添加该溶液之前滤液的pH值。这可以如上所述通过添加Tris缓冲剂或者通过添加盐溶液或去污剂或醇或这些组分的混合物来进行。该溶液随后允许滤液所含的核酸结合至第二载体材料。

在洗涤步骤之后，短链核酸被洗脱下来且可以用于分析。利用本发明的方法，可以从样本中高效减少较长链/长链核酸并且高效分离短链核酸。如此证明了本发明的方法是很有意义的，因为可以加工大体积的生物样本，通过这样的方式可以实现核酸的大小分级。目前无细胞体液检验越来越引人关注。如前所述，循环核酸对于许多诊断课题是很有意义的。但是，无细胞循环DNA的量很少，因而可以处理大体积样本是很值得期待的，因为可借此显著提高DNA获得量。公开出版物(WO2009/055596)描述了一种用于从大体积样本中富集无细胞DNA的极简单高效的方法。为了富集和随后纯化无细胞DNA，也有可供商用的提取试剂盒(PME游离循环DNA提取试剂盒；Analytik Jena AG)。但是，该方法只允许纯化无细胞总DNA。它不能分离短链核酸和长链核酸。本发明在此提供了解决方案。因此可以将无细胞DNA的富集步骤与短链核酸和较长链/长链核酸的后续大小分级组合。因此，第一次可以加工大体积样本并能也实现大小分级。为了如下执行本发明的方法，此时在第一步骤中进行样本的无细胞总DNA的富集。为此，给样本添加含水藻酸盐溶液和含水溶液，其含有二价或多价阳离子的盐(如氯化钙或氯化铝)。在短暂离心分离之后，除去大量的上清液并用形成的团块继续处理。在此团块中存在无细胞总DNA。

现在，用缓冲剂溶解团块，接着调节条件，以使所富集的无细胞总DNA高效吸附到第一载体材料(例如具有玻璃纤维材料的离心柱)。在洗涤步骤后，通过第一载体材料洗脱无细胞总DNA。因此在最终的洗出液中有短链核酸和较长链/长链核酸。从洗出液中取出少量液体。现在，根据本发明的方法进一步处理剩余体积。在洗出液中加入pH值根据本发明进行调节的离液溶液，使预期核酸级分(较长链/长链核酸)结合到第二载体材料上(通过调节pH值来确定总DNA的哪种片段长度结合至载体材料，或哪种级分不结合至载体材料且因而位于滤液中)。随后使配制物接触核酸结合载体(例如具有玻璃纤维材料的离心柱)。接着载体材料用洗涤缓冲剂洗涤，最后在加水或其它低盐缓冲剂后从载体上洗脱结合的核酸级分。现在，第二洗出液根据本发明包含较长链/长链核酸级分。随后，再通过添加下述溶液分离滤液内的短链核酸，该溶液的pH值低于先前结合至载体材料所呈现的pH值。现在，根据本发明来保证位于滤液内的核酸可以高效结合至第三载体材料且能进行分离。

接着使该混合物接触第三核酸结合载体(例如具有玻璃纤维材料的离心柱)，随后被洗涤，最终通过添加水或者低盐缓冲剂从载体上洗脱核酸。因此在洗出液中得到第三级分即短链核酸。本发明的方法首次容许从一份样本中同时且并行提供三种不同核酸级分。现在可以对这些不同级分进行研究。

具体实施方式

以下，结合实施例来说明本发明。

但这些实施例在此并不限制本发明。

实施例1

从含有不同DNA片段的混合物的样本中，按大小分级来选择性分离DNA。呈现混合样本/离液盐溶液的pH值改变对DNA大小选择性的影响。

各40微升含有DNA梯状条带(大范围的DNA片段)的样本与400微升离液剂(4M异硫氰酸胍)混合。通过加入具有不同pH值(pH6.0、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH9.0)的Tris HCl溶液调节/改变pH值。在结合配制物中，Tris溶液的浓度分别是10mM。样本只与离液盐溶液混合。

所有的反应配制物通过离心柱(具有玻璃纤维材料)被离心分离。随后该离心柱用醇洗涤缓冲剂洗涤，通过离心步骤干燥，加水洗脱结合的核酸。

使用DNA试剂盒7500，利用安捷伦生物分析仪检测分离出的DNA片段(图1～图6)。这能灵敏且定量地检测分离出的DNA片段。在此清楚示出，当加入具有pH值6.0和7.0的TrisHCl时，样本所含的所有DNA片段都高效结合，甚至比在纯离液盐溶液时的结合略强。如果样本随后与具有pH值7.5、8.0和9.0的Tris溶液混合，进一步提高结合配制物的pH值，则清楚表明这些结合条件不再足以结合较小片段或者说所述结合被完全抑制。在加入具有pH值7.5的Tris溶液后，还能高效结合大于200bp的片段。在加入具有pH值8.0的Tris溶液后，还能高效结合约1000bp的片段。在加入具有pH值9.0的Tris溶液后，这些片段都无法再结合。

附图说明

图1示出了安捷伦生物分析仪的分析(样本+离液盐溶液)。

图2示出了安捷伦生物分析仪的分析(样本+离液盐溶液+Tris溶液pH 6.0)。

图3示出了安捷伦生物分析仪的分析(样本+离液盐溶液+Tris溶液pH 7.0)。

图4示出了安捷伦生物分析仪的分析(样本+离液盐溶液+Tris溶液pH7.5)。

图5示出了安捷伦生物分析仪的分析(样本+离液盐溶液+Tris溶液pH8.0)。

图6示出了安捷伦生物分析仪的分析(样本+离液盐溶液+Tris溶液pH9.0)。

实施例2

从含有不同DNA级分的样本中，按大小分级来选择性分离DNA，目的是在第一级分中分离出>300bp的片段，在第二级分中分离出<300bp的片段。

分别将40微升含约100bp的DNA片段、约300bp的DNA片段和约1000bp的DNA片段的样本水溶液与400微升离液剂(4M异硫氰酸胍；5mM的Tris HCl，pH7.5)混合。根据试验的设定目的，给由样本和离液溶液构成的混合物添加9微升0.05N的NaOH以调节pH值，借此获得预期的分级。

所有的反应配制物通过第一离心柱(具有玻璃纤维材料)被离心分离。接着，所述离心柱用醇洗涤缓冲剂洗涤，通过离心步骤干燥，加水洗脱结合的核酸。

该滤液与200微升2M的Tris HCl溶液(pH6.0)混合，将该配制物转送至第二离心柱(具有玻璃纤维材料)并离心分离。接着，所述离心柱用醇洗涤缓冲剂洗涤，通过离心步骤干燥，加水洗脱结合的核酸。

使用DNA试剂盒7500，利用安捷伦生物分析仪检测分级的DNA片段。它能灵敏定量地检测分离出的DNA片段。

下面的图7～图9明确示出如何高效地从最初的混合物中分离出核酸片段。在第一级分(第一离心柱的洗出液)中有300bp以及1000bp的片段，但没有100bp的片段。在第二级分(第二离心柱的洗出液)中有100bp的片段，但没有300bp以及1000bp的片段。该试验证明了本发明的方法如何选择性发挥作用，因为高效分离了大于300bp的片段与小于300bp的片段。

图7示出了安捷伦生物分析仪的分析(具有三种不同DNA片段的样本)。

图8示出了安捷伦生物分析仪的分析(具有较长链DNA片段的第一级分的洗出液)。

图9示出了安捷伦生物分析仪的分析(具有短链DNA片段的第二级分的洗出液)。

实施例3

直接从血浆样本中按大小分级来选择性分离DNA

本例旨在表明也可以从生物样本直接对DNA按大小分级进行分离，即，可以高效地将短链核酸与较长链/长链核酸分离开并且平行处理两种级分，或者当只期望一种级分时，从样本中高效除去另一级分以便它无法干扰到特定应用。

原始样本分别是200微升的血浆样本，其含有短链核酸片段(51bp、77bp、103bp、149bp、199bp、298bp)以及1118bp的较长链片段。应该说明了短链级分可与较长链级分分离。

样本与300微升离液剂(4M异硫氰酸胍，5mM的Tris HCl，pH7.5)混合。还向样本中加入了衍生自烷基糖苷类的非离子表面活性剂和20微升蛋白酶K(20mg/ml)。该样本在70℃被裂解15分钟。为了调节出用于核酸片段的特定选择性分离所需要的pH值，向溶液加入4微升Tris HCl溶液pH 8。接着，配制物通过第一离心柱(具有玻璃纤维材料)离心分离。滤液与400微升的离液剂和衍生自烷基糖苷类的非离子表面活性剂(4M异硫氰酸胍/30％非离子表面活性剂)的混合物混合，以建立用于吸附滤液中的短链核酸片段的特定结合条件。将配制物转移至第二离心柱(具有玻璃纤维材料)并离心分离。

两个离心柱随后用含乙醇的洗涤缓冲剂洗涤，最后用水洗脱所结合的核酸。

再次使用DNA试剂盒7500，利用安捷伦生物分析仪检测分离出的DNA片段。分析表明，可以直接从生物样本中实现对DNA按大小分级进行分离。在此例子中，用于第一离心柱和第二离心柱的结合条件被如此调节，以便片段即短链核酸片段不结合在第一柱上，这些短链片段因此在滤液内并可通过第二离心柱被分离。因此可表明可以从样本中高效除去较长链核酸或者根据设定目的同时处理并可提供两种级分以供使用。安捷伦生物分析仪的分析在以下的图10和图11中示出。

图10示出了安捷伦生物分析仪的分析(具有较长链DNA片段的第一级分洗出液)。

图11示出了安捷伦生物分析仪的分析(具有短链DNA片段的第二级分的洗出液)。

实施例4

从人类血浆样本中富集无细胞DNA并且随后选择性分离短链核酸和较长链/长链核酸，有区分地分离两个级分，并利用实时PCR测量从较长链/长链核酸中减少的短链核酸。说明pH值的连续提高对选择性结合至第一过滤柱和对应滤液的影响。

原材料是1毫升人类血浆样本。DNA片段的富集利用可商用的试剂盒(PME游离循环DNA提取试剂盒；Analytik Jena AG)按照厂家说明书来进行。在富集步骤后，按照厂家的说明书分离无细胞总核酸。

具有分离出的总核酸的洗出液随后用于短链核酸与较长链/长链核酸级分的选择性分离。测试了四组单独的配制物。选择结合条件，以便较长链核酸应该随着pH值的连续提高而越发难以结合至第一离心柱，这样较长链核酸也位于滤液中，最终这些核酸随后结合至第二柱。

将在富集和提取之后获得的含无细胞DNA的总核酸的洗出液(40微升)与400微升离液剂(4M异硫氰酸胍；5mM Tris HCl，pH7.5)混合。为了影响pH值，添加1微升0.1N的NaOH(样本1)、5微升0.1N的NaOH(样本2)、10微升0.1N的NaOH(样本3)、20微升0.1N的NaOH(样本4)。

接着，所述配制物通过第一离心柱(具有玻璃纤维材料)离心分离。该离心柱被保留。为了分离短链DNA，滤液与由离液剂和衍生自烷基糖苷类的非离子表面活性剂构成的400微升混合物(4M异硫氰酸胍/30％非离子表面活性剂，50mM的Tris HCl，pH6.0)混合，将所述配制物转送至第二离心柱(具有玻璃纤维材料)并离心分离。接着，这两个离心柱用醇洗涤缓冲剂洗涤，通过离心步骤干燥，通过加水洗脱结合的核酸。

洗脱的核酸级分随后在实时PCR中进行测试。

为此执行基于SybrGreen的实时PCR，以扩增约1kb大小的细胞色素b的片段。分别采用来自两个样本的两个洗出液级分用于所述PCR。

所用的PCR引物：

CyB S: CCA GCY CCA TCA AAC ATC TCA KCA TGA TG

CyB AS:TTG GCT GAG TGG TCG GAA TAT TAT GCT KCG TTG YTT

反应配制物(扩增/杂交)

每份样本：

PCR将在商用标准的实时PCR循环仪中进行：

扩增处理

步骤1：

变性 95℃120"

步骤2：

扩增 45个循环

95℃4"

55℃40"

接着，进行熔融曲线分析以证明扩增的特异性。PCR结果如图12中的柱形图所示。Ct值越小，各核酸级分在样本中的占比越高。能清楚看到可以如何高效地从短链级分中除去较长链核酸。

在样本1中的较长链核酸的占比仅为1％，即减少了高达约99％。也能清楚看到当连续提高pH值以便结合至第一柱时，在级分2中的较长链核酸的占比如何变化。

图12示出Ct值的图。

定义：

离液物质或离液盐：

通常该物质破坏液态水的基于氢键形成的规则结构，即它们阻止溶剂化所需的H₂O笼型结构的形成。离液成分的示例：硫氰酸盐、碘化物或高铝酸盐。它们造成蛋白质变性、提高非极性物质在水中的可溶性以及破坏疏水性相互作用。

脂肪族醇

本专利说明书和权利要求书意义上的脂肪族醇是在脂肪族碳原子上带有OH基的所有醇，但除了氨基醇如Tris之外。

Claims (9)

1.一种从具有不同数量的碱基对(bp)的核酸混合物中按大小分级来分离核酸的方法，其特征是有以下步骤：

a)在不存在脂肪族醇的情况下，向一定量的核酸混合物中添加第一结合缓冲剂，所述第一结合缓冲剂包含至少一种离液盐和至少一种提高该结合缓冲剂的pH值的物质，

b)结合至固相并使通过步骤a)所结合的核酸分开，

c)将来自步骤a)的滤液与具有pH值小于步骤a)中的结合缓冲剂的第二结合缓冲剂混合，

或者与非离子表面活性剂混合，

或者与醇混合，

或者与非离子表面活性剂和醇的混合物混合，

d)结合至固相并使通过步骤c)所结合的核酸分开，

e)按照已知方法洗涤和洗脱在步骤a)和步骤c)后所分离的核酸，

结果，不仅在步骤a)后所分离的核酸具有比在步骤c)后所分离的核酸更多的碱基对，而且在步骤a)后以及在步骤c)后都分离出具有特定数量的碱基对的、在各其它步骤中未被分离出的独特的特定核酸级分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述第二结合缓冲剂包含至少一种离液物质。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，采用4M异硫氰酸胍作为所含的离液盐，而采用NaOH作为所含的提高结合缓冲剂的pH值的物质。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，采用脂肪族醇作为所述醇，采用衍生自烷基糖苷类或烷基酚乙氧基化物类的物质作为所述非离子表面活性剂。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征是，通过逐步提高步骤la)的结合缓冲剂的pH值，来控制在步骤la)后分离出的核酸的大小(碱基对数量)，其中，随着pH值增大而能分离出更少的短链核酸(较少数量的碱基对)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征是，通过逐步降低来自步骤la)的滤液中的pH值，或者通过将非离子表面活性剂或醇或非离子表面活性剂与醇的混合物添加至根据la)的第一结合缓冲剂，来控制从步骤lc)分离出的核酸的大小(碱基对数量)，其中，随着添加物质的浓度增大而能分离出更多的短链核酸(较少数量的碱基对)。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征是，在任意大体积的样本中进行分级之前，首先按照已知方法浓缩总核酸，接着根据权利要求1至6中任一项将核酸分级。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法用于从具有不同数量的碱基对(bp)的核酸混合物中分离核酸级分的用途，所述核酸级分按照以下大小分级：

a)约小于或等于110bp，或者

b)约小于或等于250bp，或者

c)约大于或等于550bp，或者

d)大于或等于1000bp。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法用于从短链核酸和较长链/长链核酸(DNA)的混合物中对核酸进行任意大小分级的用途。