CN106574265A - 高产量分离rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从样品分离核酸的无酚方法，所述方法包括以下步骤：a)通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品来制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中所述沉淀混合物i)包括金属阳离子沉淀剂；ii)包括15％或以下浓度的有机溶剂；ⅲ)包括缓冲剂；和iv)具有酸性pH值；b)分离上清液与沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和c)从上清液分离核酸。在蛋白质沉淀步骤中以限定的浓度使用主张的有机溶剂提供上清液，除了小RNA，其还包含大RNA。这是有利的，因为本方法为用户提供更多的灵活性。可以使用所描述的方法分离且因此分析不同的靶RNA。

Description

高产量分离RNA的方法

本发明涉及从样本分离核酸如RNA的方法，特别提供通过使用无酚RNA分离方法从各种不同的样本(包括富含蛋白质的样本)以高产量有效分离小RNA和大RNA的方法。

研究各种组织、体液和其它生物学样品中约200个核苷酸或更小量级的小核酸是极其感兴趣的领域，并有望保持于将来。小核酸尤其包括但不限于：小RNA，例如微小RNA(miRNA)和小干扰RNA分子，二者都可以对基因表达产生强有力的影响。此外，参与mRNA和rRNA加工的其它小核与小核仁RNA(如snRNA和snoRNA)也令人感兴趣。此外，长度为500个核苷酸或更小的核酸，如RNA也常常作为降解产物包含在其它样品中，必须有效地从中捕捉。随着对各小RNA的兴趣日益增加，标准分离程序得到改进以促进小核酸的分离和提高小核酸的产量。该种改进是必要的，因为用于分离总RNA标准方法对于分离小RNA通常不理想，使用标准方法小RNA通常不能有效结合。因此，采用标准程序分离的总RNA通常包含的小RNA的量不足以用于后续分析。在核酸分离过程中小RNA或者没有结合或者丢失导致低的产量。因此开发了能够从样本有效分离包含所需小RNA的总RNA的方法或选择性分离小RNA(无较大的RNA)的方法。

设计用于分离小RNA，如特别是小、单链RNA如miRNA的常用方法在结合期间需要≥45％或优选≥50％的高醇浓度以确保小RNA有效结合至核酸结合固相。随醇浓度增加，结合效率增高。但是，确保RNA有效结合固相所需的这些高醇浓度引起妨碍分离过程的问题。特别是当处理富含蛋白质的样品如血浆，血清或组织样品时，RNA结合步骤所需的高醇浓度可导致该蛋白质沉淀。这些沉淀物是妨碍分离过程的污染物，因为它们例如非特异性地结合至固相并由此阻断固相，和/或作为污染物而带入洗脱物。

因此，建立的从富含蛋白质的样品分离小RNA的方法包括在能够结合小RNA的结合条件建立之前的蛋白质去除步骤。蛋白质去除技术包括，例如，酚/氯仿提取或蛋白质沉淀步骤。其它方法采用耗时的酶蛋白质消化步骤，如用蛋白酶K消化。或者，将样品深度稀释或降低结合期间的醇浓度，这具有分离效率降低的缺点。后续更详细描述与这些已知方法相关的问题。

基于酚/氯仿的有机提取方法常按照Chomczynski方法(Chomczynski和Sacchi,1987:通过酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取的RNA分离单步法(Single-stepmethod of RNAisolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction).Anal.Biochem.(162):156-159)实施。根据所述方法，RNA在酚/氯仿萃取期间浓缩于水相，然后从中分离，例如通过将醇加入水相并将RNA结合到核酸结合固相。在所述RNA结合步骤中，同样需要特定的条件如高醇浓度以有效结合并从而捕获分离的总RNA中的小RNA。基于相应的酚/氯仿法的商业试剂盒是mirVana miRNA分离试剂盒(安比昂公司-Ambion)。酚/氯仿萃取后，该方案遵循分馏策略，其中较大的RNA(超过200个核苷酸)在中等醇浓度(通常25％)下，在第一结合步骤中结合至核酸结合固相。流出物(flow-through)包含小RNA。通过第二结合步骤从流出物中捕获所述小RNA，第二结合步骤中醇浓度提高到50％以上(通常为55％)且小RNA结合到它能够从其被洗脱的第二固相。此外，mirVana miRNA分离试剂盒提供的方案，其中包括小RNA的总RNA是从酚/氯仿萃取后获得的水相中分离。在此，结合条件是通过在一步中增加醇浓度到使得小RNA有效结合所需量(通常为55-70％)而产生。WO 2005/012523和WO 2005/054466也描述了类似的方法。然而，在这些方案中，通常预先实施有机酚/氯仿萃取步骤。另一基于酚/氯仿的商业产品是miRNAeasy Mini试剂盒(凯杰公司-QIAGEN)。它提供了来自各种不同生物样品的高品质和高产量的总RNA，包括小RNA。

通常，基于酚的分离方法对样品的组成或蛋白质含量相对不敏感。然而，样品通常与5至10体积的含酚溶液结合。这导致需要处理相对高的样品体积。因此，最初的样本体积通常是相当小的，并在100μl至200μl的范围内，很少达到500μl。这是不利的，特别是如果目标小RNA以低浓度存在于初始样品中。另一个缺点是酚可以带入洗脱物。此外，每个样本需要手动处理。除了这些技术困难和限制，特别是酚的强毒性被认为是不利的。因此，强烈需求能够以高产量和质量从各种不同的样本分离包含小RNA的总RNA的无酚RNA分离方法。

用于分离包含小RNA的RNA的无酚方法在现有技术中也是已知的。为允许包括小RNA的总RNA结合至核酸结合固相，经常使用高浓度的醇和离液盐(离液序列高的盐)。通常，所利用的核酸结合固相包含或由二氧化硅组成。然而，在有醇和离液物质存在下，基于将RNA结合到二氧化硅表面的方法中，小RNA(例如miRNA)的回收需要非常高的醇浓度。结合混合物中通常利用至少约50％的醇，结合混合物中醇的常用范围包括50-80％(v/v)。然而，当采用结合期间使用高醇浓度的各无酚方案时，当处理富含蛋白质的样本(其可能是当将高浓度醇加入至破碎样本时诱发的蛋白质沉淀所致)时，总RNA产量以及所得的小RNA产量常常降低。因此，一些方法限制初始样本体积或减少在RNA结合期间使用的醇浓度(见上文)。两种方法都可以降低由沉淀蛋白质干扰分离的风险。然而，小核酸分离效率降低，因为结合效率较低和/或投样体积减小具有缺点：可被分离的小核酸的总浓度降低。因此，通常，这些方案的效能可惜与基于酚/氯仿分离方法没有可比性。特别是用基于柱的方法观察到问题。

其他无酚方法包括先于实际RNA分离步骤进行的蛋白质沉淀步骤。由金属阳离子引发蛋白质沉淀是为选择性地沉淀蛋白质建立的方法(参见例如Lovrien,R.E.和Matulis,2001“蛋白质的选择性沉淀：蛋白质科学实验室指南(Selective precipitation ofproteins.Current Protocols in Proteins Science.)7:4.5.1-4.5.36)。EP2163622中描述相应的方法。其中，公开了来自不同样品类型的长度≤200nt的小RNA的分离。金属阳离子用来沉淀蛋白质且在蛋白质沉淀步骤之前或期间除去较大的核酸。随后通过向上清液以高浓度添加有机溶剂如非极性，质子性有机溶剂，例如THF从所得的上清液中分离小RNA。该方法选择性地分离小RNA，其中主要量的较大RNA(如mRNA)和基因组DNA损失，因此，不能用于随后的分析。这是主要缺点的，因为有些客户兴趣在于小RNA和较大的RNA如mRNA，因此在也需要较大的RNA的情况下，将需要执行额外的，独立的分离步骤。此外，如果分析小RNA后期望分析较大的RNA，将需要处理新的样品或现有试样的新部分。

本发明的目的是提供一种核酸分离方法，特别是RNA分离方法，其克服现有技术方法的上述缺点中的至少一个。特别地，本发明的目的是提供一种允许分离小RNA以及大RNA的方法，其对于不同样本类型，包括富含蛋白质的样品，避免使用酚并提供良好的RNA产量。

发明内容

本发明人已经发现，如果在蛋白质沉淀步骤中选自非质子极性溶剂(例如DMSO或THF)和质子溶剂(例如异丙醇或乙醇)的有机溶剂以15％或更低的浓度存在，在从蛋白质消除的上清液中分离核酸之前包括金属阳离子诱导蛋白质沉淀步骤的核酸分离方法可以显著改进。除去沉淀后，提供蛋白质消除的上清液，其包括小(小于200nt)以及大RNA(至少1000nt)和当然还有中间大小的RNA，如果包含在样本中。因此所有这些RNA种类可以从蛋白质消除的上清液分离，例如，以总RNA的形式或作为富集所需大小，相应尺寸范围的RNA的一个或多个单独的部分。因此，该方法特别适合于分离RNA。此外，如在实施例中示出，也可以将DNA从所得的上清液中分离。从而提供了一种改进的核酸分离方法，其就待分离的核酸为用户提供灵活性。

根据第一个方面，提供一种从样本分离核酸的无酚方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品以制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中所述沉淀混合物

i)包括金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的有机溶剂；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；

b)分离上清液与沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离核酸。

该方法特别适合于从样品分离作为靶核酸的RNA。实施例表明，本发明提供从各种样品类型分离RNA的高效方法，其中各种样品类型包括使用不含酚基提取步骤的方法特别难以从其以高产量分离RNA的样品。本方法提供相当的结果，即使使用无酚或水不溶性的有机溶剂如氯仿用于提取蛋白质。在金属阳离子诱导沉淀步骤后，该方法提供包括小RNA，大RNA和在实施方案中是基因组DNA的蛋白质消除的上清液。然后从上清液分离一或多种包含的核酸类型。因此，该方法能够，例如，以良好的产量分离小和大RNA，从而有利地提供一种为用户提供更多灵活性的方法。通过提供避免使用酚同时提供相当RNA产量的方法，本发明对现有技术做出重大贡献，显著改进现有无酚基于沉淀的RNA分离方法。此外，本发明的核酸分离方法很容易实施到既有的方案，这些既有的方案旨在从各种不同的样品，包括富含蛋白质的样品，例如血液，血浆或血清中分离小和/或大RNA，或者平行分离该RNA以及DNA。

根据第二方面，提供一种用于从样品提供蛋白质消除的上清液的无酚方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品以制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中所述沉淀混合物

i)包括金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的有机溶剂；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；

b)从上清液分离沉淀物，其中获得的上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA。

根据第三方面，提供了一种沉淀缓冲液，其包含

a)至少一种金属阳离子沉淀剂；

b)选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂；

c)至少一种缓冲剂；且

其中所述沉淀缓冲液的pH值为3-5.5。

所述沉淀缓冲液可以用于，例如，从破碎的生物样品沉淀蛋白质，由此在沉淀分离后提供蛋白质消除的上清液，其包含长度<200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA以及中间大小的RNA，如果包含在样品中。随后可以从上清液分离所包含的RNA，例如以总RNA的形式或以富含某一尺寸，相应尺寸范围(例如，小于200nt或大于200nt)的一或多种单独部分。所述沉淀缓冲液可以包含于试剂盒内用于分离核酸诸如特别是RNA。

本领域技术人员从以下描述和所附权利要求中可以明白本申请的其它主题、特征、优点和方面。然而，应当理解，虽然表明是本申请的优选实施方式，但以下描述、所附的权利要求和具体的实施例仅是通过举例说明的方式给出。本领域技术人员通过阅读下文不难明白落在本发明构思和范围内的各种变化和改进。

附图说明

图1和2：显示的是miScript miRNA的QC PCR阵列的定量RT-PCR的结果。分析了使用不同的miRNA分离方案从血清和血浆获得的洗脱物，采用BioRobot Universal系统使用两种方案“沉淀”(XP)和“miRNeasy”(QIAzol)，后者是在分离期间使用酚的方案。示出从8次重复得到的平均值，包括标准偏差。

图3：显示的是“人miFinder 384HC miRNA PCR阵列”分析的qRT-PCR结果。分析6(miRNeasy)和8(沉淀XP)次重复的分离自相同样本材料的miRNA。这PCR阵列处理372个miRNA。两者的小于35的平均，标准化的Ct值直接绘图。显示的趋势线符合公式y＝1.0051x且判定系数R²＝83.2％。

图4：显示的是miScript miRNA QC PCR阵列的qRT-PCR结果。分析在沉淀过程和随后的结合期间使用不同的DMSO和异丙醇浓度从血清分离RNA后得到的洗脱物中包含的miRNA。示出的是各条件下8个重复的平均值以及相应的标准偏差。

图5：显示使用安捷伦生物分析仪RNA 6000阵列的洗脱物分析。事先采用水以1:4稀释样品“RNeasy”、“QIAzol”和“XP”。

图6和7：示出RT²RNA QC PCR阵列qRT-PCR结果(图6)和NanoDrop结果(图7)。对采用不同的RNA分离方案从细胞裂解物得到的洗脱物进行分析。示出的是各样本获得的Ct值以及相应的核酸浓度。

图8a和8b：显示的是miScript miRNA QC PCR阵列的qRT-PCR结果。对采用方案“沉淀”(XP)和“miRNeasy”在有或无额外的柱上DNA酶消化下从不同组织类型大鼠肝(A)或大鼠脑(B)获得的同样体积的洗脱物进行分析。示出的是来自4个重复的平均值和标准偏差。

图9：示出的是含有核酸的洗脱物的凝胶电泳分离，采用本发明的基于沉淀的方法且使用除了DMSO外的不同的水溶性有机溶剂或水获得该洗脱物。在120V下，非变性琼脂糖凝胶(0.8％)内经1小时分离1.5μl洗脱物。显示的标记是DNA标记。因此，指示kb值不直接转移到所示的rRNA条带，其通常具有较高的分子量。在图9中，数字的含义如下：1(标记)、2(DMSO)、3(丙酮)、4(THF)、5(1,4-二氧六环)、6(DMF)、7(乙腈)、8(NMP)、9(异丙醇)、10(乙醇)、11(H₂O)、12(DMSO)、13(标记)。

图10：显示miScript miRNA QC PCR阵列的qRT-PCR结果。在沉淀缓冲液使用不同的有机溶剂(获得的)源自血清的不同miRNA制剂的洗脱物进行分析。示出的是使用非质子极性有机溶剂或质子溶剂获得的全部结果的平均值。

图11：显示的是含有核酸的洗脱物的凝胶电泳分离，采用本发明的基于沉淀的方法获得该洗脱物，其中在沉淀缓冲液中测试不同的乙酸钠替代物。自细胞裂解物分离核酸。在恒定120V下，在非变性琼脂糖凝胶(0.8％)内经1小时分离1.5μl各洗脱物。作为乙酸钠替代物，对相同浓度相同pH值的下列缓冲剂进行测试：柠檬酸钠，乙酸镁，乙酸铵和乙酸钾。此外，(在以下条件)分离RNA：i)无乙酸钠(H₂O)，ii)采用沉淀后加入乙酸钠的方案(H₂O+NaOAc)，和iii)采用氯化钠NaCl代替乙酸钠的方案。此外，在沉淀缓冲液中采用0.4M PIPPS(pH 4.3)作为乙酸盐缓冲液的缓冲剂替代物分离RNA。在图11中，数字具有以下含义：1(标记)、2(柠檬酸盐)、3(MgOAc)、4(NH₄OAc)、5(KOAc)、6(NaOAc)、7(H₂O)、8(H₂O+NaOAc)、9(NaCl)、10(NaOAc)、11(XP(NaOAc))、12(XP(PIPPS))、13(标记)。

图12：显示miScript miRNA QC PCR阵列的对照的qRT-PCR结果。对在沉淀缓冲液中使用不同的乙酸钠替代物从来自血清的不同的RNA分离物得到的洗脱物进行分析。

图13：显示miScript miRNA QC PCR阵列的对照的qRT-PCR结果。使用不同的pH缓冲沉淀缓冲液对来自血清的不同RNA分离方案的洗脱物进行分析。

图14：显示含有核酸的洗脱物的凝胶电泳分离，采用基于沉淀的方案使用包含不同浓度的DMSO和氯化锌的沉淀缓冲液得到该洗脱物。自细胞裂解物分离RNA。在恒定120V下，在非变性琼脂糖凝胶(0.8％)内经1小时分离1.5μl各洗脱物。在图14中，数字含义如下：1(标记)、2(0％DMSO)、3(3.4％DMSO)、4(6.9％DMSO)、5(10.4％DMSO)、6(13.7％DMSO)、7(17.2％DMSO)、8(25.6％DMSO)、9(标记)、10(50mM ZnCl₂)、11(145mM ZnCl₂)、12(290mMZnCl₂)、13(437mM ZnCl₂)、14(580mM ZnCl₂)、15(730mM ZnCl₂)。

图15和16：显示miScript miRNA QC PCR阵列的qRT-PCR结果。对相同体积的洗脱物进行分析。采用具有不同DMSO和锌浓度的沉淀缓冲液，从不同RNA分离方案获得来自血清的洗脱物。示出的是沉淀混合物中和由此当沉淀发生时的这些组分的终浓度。

图17：显示含有核酸的洗脱物的凝胶电泳分离，采用基于沉淀的方案从包括不同离液剂浓度的破碎样本使用EtOH或DMSO作为有机溶剂获得该洗脱物。M＝标记；为各泳道标记沉淀混合物中离液剂的浓度(M)。

图18：显示含有核酸的洗脱物的凝胶电泳分离，采用基于沉淀的方案使用包括不同浓度的EtOH或DMSO的沉淀缓冲液获得该洗脱物。M＝标记；各泳道的百分比值表示沉淀混合物中EtOH或DMSO百分比。

图19：显示miScript miRNA QC PCR阵列的对照的qRT-PCR结果。对使用不同pH值的沉淀缓冲液获得的来自血清的不同RNA分离物的洗脱物进行分析。miRNA被分离，具有良好的产量；miRTC＝反转录对照；PPC＝阳性PCR对照。

发明详述

本发明提供用于处理含有RNA的样品的改进的蛋白质沉淀为基础的方法，其在沉淀后提供蛋白质消除的上清液，包含小和大RNA，和在实施方案中也含DNA。随后可从上清液分离一或多种包含的核酸类型。该方法是对现有技术方法的改进，因为该蛋白质消除的上清液包含不同种类的RNA，包括小和大RNA，且因此对于待分离的靶核酸为用户提供更多的灵活性。因此，提供一种可用于分离不同核酸的方法。

A.从样品分离核酸的方法

根据第一个方面，提供一种从样本分离核酸的无酚方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品以制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中所述沉淀混合物

i)包括金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的有机溶剂；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；

b)分离上清液与沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离核酸。

随后，我们将详细解释各步骤和其优选实施方式。

步骤a)-蛋白质沉淀

在步骤a)中，制备含有沉淀混合物的样品并沉淀蛋白质。样品优选是生物样品，并且可以是，例如破坏的样品，如果需要样品破坏以释放核酸的话。如随后描述的，可以在蛋白质沉淀步骤期间发生样品破坏。为引发沉淀，某种(即至少一种)金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的某种(即，至少一种)有机溶剂被加入到样品中。在蛋白质沉淀期间以本文所述的浓度合并该有机溶剂具有效果：随后获得的蛋白质消除的上清液不仅包含小于200nt长度的小RNA(现有技术的方法也是这种情况)，而且还包括至少1000nt长度的大RNA。当然，上清液也可以包括中间尺寸的RNA种类，如果包含于样品中。不仅小的，且较大的RNA种类被包括在蛋白质消除的上清液是有利的，因为该方法的适用范围扩大，且用户可分离不同类型的RNA。此外，在实施方式中，上清液还包括DNA，如实施例中例证。

使用金属阳离子沉淀剂用于沉淀蛋白质是现有技术已知的且合适的金属阳离子沉淀剂也被描述(参见例如Lovrien，R.E.和Matulis，2001年“蛋白质的选择性沉淀：蛋白质科学实验室指南(Selective precipitation of proteins.Current Protocols inProteins Science.)7:4.5.1-4.5.36或EP2163622)。任何能够用作蛋白质沉淀剂的金属阳离子可以与本发明结合使用，实例包括但不限于：镉，汞，铅，锌和铝的阳离子。也可使用的金属阳离子沉淀剂的组合。优选地，金属阳离子沉淀剂选自Zn²⁺或Al³⁺。如由实施例证明的，这些金属阳离子沉淀剂有优势，因为Zn²⁺和Al³⁺非常迅速引发蛋白质沉淀且在低浓度也是有效的。使用Zn²⁺是特别优选的。

优选以包括金属阳离子沉淀剂的溶解盐的溶液形式加入金属阳离子沉淀剂。例如，可以使用卤化物盐如氯化物盐。步骤a)提供的沉淀混合物可包括宽浓度范围的金属阳离子沉淀剂。如由实施例示出，沉淀混合物中浓度约50mM的氯化锌已经足以沉淀蛋白质。特别优选的是选自下组的沉淀混合物中的浓度：200mM–675mM、250mM–650mM、300mM–625mM、350mM–600mM或400mM–550mM。如由实施例证明的，这些浓度范围特别适合实现蛋白质沉淀，同时提供包含大量小和大RNA的上清液。如果锌用作金属阳离子沉淀剂，这些浓度范围是特别有用的。根据一实施方式，所提到的浓度是指在沉淀混合物中金属阳离子沉淀剂的总浓度，如果两或更多的金属阳离子沉淀剂加入到沉淀混合物。根据一实施方式，单一金属阳离子沉淀剂，优选Zn²⁺用于制备沉淀混合物。

步骤a)提供的沉淀混合物包括15％或更低浓度的选自非质子极性溶剂和质子溶剂的有机溶剂。使用的有机溶剂是水溶性有机溶剂。如果沉淀混合物中包含两或更多种相应的有机溶剂，该浓度是指在沉淀混合物中所述有机溶剂的总浓度。如实施例证明的，蛋白质沉淀步骤期间包括本文定义浓度的这样的有机溶剂表现出技术效果：不仅小于200nt长度的小RNA，而且至少1000nt长度的RNA被包括在蛋白质消除的上清液中。当然，上清液还包括中间大小的RNA种类，如果包含于样品中。因此，mRNA也大量保留在上清液中，与现有技术的方法(如在例如EP2163622中描述)相比没有与蛋白质一起消除，因此可以随后根据需要从得到的上清液分离。因此，本方法允许从蛋白质消除的上清液分离不同的尺寸，相应尺寸范围的RNA，提供灵活性的方法给用户。然而，如实施例证明的，如本文所定义的有机溶剂以正确的浓度包括在沉淀混合内是重要的。少量主张的有机溶剂是对实现本文所述的有利技术效果是有效的，因此提供包含小和大RNA的上清液。然而，沉淀混合物中较高浓度，例如17％或25％的主张的有机溶剂有负面影响，因为在这些条件下大RNA从上清液再次消除。

步骤a)提供的沉淀混合物可包括选自下组浓度的有机溶剂2％-15％、3％-15％、5％-14.5％、6％-14％、7％-13.5％、8％-13％、9％-12.5％或9.5％-12％。如实施例所示，这些浓度范围适合提供蛋白质消除的上清液，其包含大量的小以及大RNA。当然，上清液还包括中间大小的RNA种类，如果包含于样品中。如上所述，所主张的两种或更多种不同的有机溶剂也可以在步骤a)中使用。在这种情况下，上面所指出的浓度范围是指沉淀混合物中所述有机溶剂的总浓度。根据一实施方式，使用如本文所定义的单一有机溶剂制备沉淀混合物。

根据一优选的实施方式，有机溶剂是非质子极性溶剂。这种有机溶剂的实例包括但不限于：亚砜如二甲基亚砜(DMSO)、酮如丙酮、腈如乙腈、环醚如四氢呋喃(THF)和1,4-二恶烷、内酰胺如1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和叔羧酸酰胺如二甲基甲酰胺(DMF)。这种非质子极性溶剂是水可混溶的。因此，非质子极性溶剂可选自亚砜、酮、腈、环醚、内酰胺和叔羧酸酰胺，且优选选自二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、乙腈、四氢呋喃(THF)、1,4-二恶烷、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲基甲酰胺(DMF)。如由实施例证明的，这些非质子极性有机溶剂都适用于本方法的目的，并提供蛋白质消除的上清液，其包含小RNA，大RNA，还包含高分子量核酸例如尤其是基因组DNA。因此，使用极性非质子有机溶剂提供蛋白质消除的上清液，其可用于范围广泛的下游应用，因为小RNA，大的RNA，中间尺寸的RNA种类，以及基因组DNA可以从中分离，如果这些类型的核酸包含在初始样本中。这提供了大量的灵活性的方法给用户。特别好的结果是采用DMSO、DMF、THF和NMP获得的，因此它们是优选的非质子极性有机溶剂。特别优选的是DMSO，NMP也是，其也具有降低毒性的优点。

此外，如由实施例证明的，有机溶剂也可以是质子溶剂。可以使用的极性质子溶剂包括直链或支链的C1-C5醇。水混溶的醇，如异丙醇和乙醇是优选的，并可以用作有机溶剂。甲醇也是水混溶醇。如果以本文中所描述的浓度范围使用，这些有机溶剂也提供蛋白质消除的上清液，其包括大量小RNA和大RNA，当然也有中间尺寸的RNA，如果在样品中含有。如上所述，也可能使用两种或多种这些有机溶剂，其中沉淀混合物中这些有机溶剂的总浓度在上述一个或多个范围内。

步骤a)提供的沉淀混合物具有酸性的pH值。酸性pH值具有如在实施例中示出的有益的效果。沉淀混合物的pH值可以是≤6、≤5.75、≤5.5、≤5.25，优选≤5、≤4.75、≤4.5或≤4.4。合适的范围包括3至5.5、3至5.25、3.25至5，优选3.25至4.75、3.5至4.5或3.75至4.4。

为实现和/或保持酸性pH值，沉淀混合物包含至少一种缓冲剂。如由实施例证明的，不同的缓冲剂是合适的并且可以使用。也可以使用缓冲剂的组合。根据一实施方式，缓冲剂是羧酸或从羧酸衍生。羧酸包括单，二或三羧酸。优选地，缓冲剂是乙酸或柠檬酸，特别是乙酸盐或柠檬酸盐。如由实施例证明的，可以不同的盐形式加入乙酸盐和柠檬酸盐。例如，可以使用碱金属盐如钠或钾盐。根据一实施方式，乙酸钠作为缓冲剂。此外，也可以使用磷酸盐缓冲剂如PIPPS。以上述范围内能够维持沉淀混合物pH值的浓度使用缓冲剂。根据一实施方式，沉淀混合物包括浓度选自下组的缓冲剂：60mM-400mM、75mM-375mM、100mM-350mM、125mM-300mM和150mM-275mM。如实施例证明的，这些浓度范围特别适用于羧酸，特别地羧酸盐如乙酸钠。125mM-300mM或 150mM-275mM范围内的浓度达到特别好的效果。

根据一优选的实施方式，步骤a)包括将沉淀缓冲液加到样品，其中所述沉淀缓冲液包含至少一种金属阳离子沉淀剂，如上定义的至少一种有机溶剂和至少一种缓冲剂。有关金属阳离子沉淀剂、有机溶剂和缓冲剂的详细信息如上所述。这实施方式是便利的，因为实现蛋白质沉淀以及由此的蛋白质消除同时小和大RNA维持在上清液中所需的试剂包含在加入样本的缓冲液中。在一实施方式中样品是破坏的样品。

沉淀缓冲液的组成应是这样的，当加入预期体积的沉淀缓冲液到一定体积的样本，其可能是破坏的样品时，提供包括金属阳离子沉淀剂和浓度如上所述的有机溶剂的沉淀混合物。在某些实施方式中，样品(可以是破坏的样品)与沉淀缓冲液以1:1-1:20(沉淀缓冲液:样品)的比例进行混合。具体地，比例可能为1:1.5至1:12，优选1:2至1:8，更优选1:2.5至1:5，最优选1:3至1:4(沉淀缓冲液:样品)。在具体的实施方式中，以约1:3.37的比例(沉淀缓冲液：样品)将沉淀缓冲液加入到样品，其可以是破坏的样品。

为确立沉淀混合物的条件，被加入到样品，根据一实施方式是破坏的样品的沉淀缓冲液优选包括溶解的盐的形式的金属阳离子沉淀剂。例如，可以使用卤化物盐如氯化物盐。沉淀缓冲液中可以包括金属阳离子沉淀剂，浓度选自：0.75M-3M、1M-2.8M、1.25M-2.7M、1.5M-2.6M或1.7M-2.5M。如实施例表明，使用包括相应浓度的金属阳离子沉淀剂的沉淀缓冲液提供了良好结果。合适的金属阳离子沉淀剂如上所述，优选使用选自Zn²⁺和Al³⁺的金属阳离子沉淀剂。最优选的是Zn²⁺，其可以如氯化锌加入。

沉淀缓冲液可以包含浓度为13％-65％、20％-63％、25％-62.5％、30％-60％、33％-57.5％、37.5％-55％或40％-52.5％的有机溶剂。上面描述了有机溶剂的合适例子，且从实施例也是显而易见的。有机溶剂为水混溶性。优选地，有机溶剂是非质子极性溶剂，例如DMSO。质子有机溶剂中，水混溶性的醇例如乙醇和异丙醇是优选的。

沉淀缓冲液的pH选自：3至5.5、3至5.25、3.25至5、3.25至4.75、3.5至4.5和3.75至4.4。特别合适的是pH为3-5、3.25-4.75、3.5-4.5或3.75-4.4。沉淀缓冲液优选适于建立和/或维持沉淀混合物相应的pH值。如由实施例表明，使用具有和保持相应的酸性pH值的沉淀缓冲液提供有利的结果，特别是当处理富含蛋白质的样品，如血浆或血清时。上面描述了可用于在沉淀混合物中维持相应的pH值的合适的缓冲剂实例，且从实施例也显而易见的。根据一实施方式，沉淀缓冲液包含浓度为300mM-2M、400mM-1.75M、450mM-1.5M、500mM-1.4M、550mM-1.3M和600mM-1.25M的缓冲剂。特别优选的是羧酸盐，如乙酸盐或柠檬酸盐，例如，可以以之前提到的浓度范围使用的碱金属盐。特别优选的是550mM-1.3M、600mM-1.25M或650mM-1.2M的浓度。

当提供沉淀混合物时，沉淀包含在样品中的蛋白质。可以例如通过搅拌协助沉淀。搅拌包括但不限于涡流，振荡，倒置和上下抽吸。此外，样品可以被冷却，例如在冰上储存，在实施例中也有描述。

如上所述，通过将金属阳离子沉淀剂和如上定义的有机溶剂加到含有核酸的样品制备沉淀混合物。合适的RNA的非限制性实例也在下面描述。本方法特别适用于从富含蛋白质的样品中分离RNA。必要时，将样品破碎。因此，根据一实施方式，方法包括破坏样品的步骤。从而，核酸例如特别是RNA被释放并用于随后的核酸分离步骤。

不同的方法可以用于破坏样本。在本文中以广义使用术语“破坏”或“破裂”，且特别涵盖样品的裂解。在各自的裂解步骤，生物分子，如特别是RNA是从细胞中释放出来，或者可以从其它样品组分如蛋白质分离，从而使RNA用于分离。因此，它被称为相应的破坏步骤，也作为裂解步骤，不管生物分子如尤其是核酸是否从细胞释放或者是否为从蛋白或包含在样本中的其他物质释放生物分子如核酸实施裂解。因此，样品可以包括细胞或者可以不含或仅含少量细胞，如在用血浆的情况下。

为裂解样本可以使用不同的方法且合适的裂解方法是现有技术中已知的。优选地，为破坏，相应地裂解，样品与一种或多种裂解剂接触。这些可以在破坏试剂如裂解缓冲液中获得。裂解过程中RNA应得到保护免于被核酸降解。所选择的裂解条件也可以根据待处理的样本类型改变。通常，裂解过程可包括但不限于对样品进行机械，化学，物理和/或酶处理。实例包括但不限于在球磨机或在玻璃珠存在下研磨样品，均质样本，应用超声，加热，添加一种或多种表面活性剂和/或添加蛋白质降解化合物，例如蛋白质降解酶或盐。此外，为裂解也可加入还原剂如β-巯基乙醇或DTT以协助例如核酸酶变性。根据一实施方式，至少一种离液剂，如优选至少一种离液盐，用于裂解，且因此破坏样本。合适的离液剂，特别是合适的离液盐是本领域技术人员公知的且在本文中也有描述。如本文所述，使用离液盐裂解的优点是它允许引入离液盐，而离液盐还可在步骤c)支持建立合适核酸结合条件。

如由实施例表明，在制备沉淀混合物时，加入金属阳离子沉淀剂和有机溶剂之前可能发生样本破坏，但也可能同时，相应地同一阶段发生。取决于待处理的样本，也可以在制备沉淀混合物之后加入裂解/结合组合物。然而这个实施例是亚优选的，因为处理复杂样品，例如血液或血清时它可能降低RNA产量。

因此，根据一实施方式，当在步骤a)加入金属阳离子沉淀剂和有机溶剂时，同时，相应地在同一阶段样本被破坏。根据该实施方式，提供用于从样本分离核酸的无酚方法，其包括以下步骤：

a)制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，通过加入至少一种破坏试剂、至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品以破坏样本和制备沉淀混合物，其

i)包括金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的有机溶剂；

iii)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；和

v)包括破坏试剂；

b)从上清液分离沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离核酸。

可以使用的合适的破坏试剂例如裂解缓冲液是本领域技术人员公知的且在本文中也有描述。这种破坏试剂可例如与沉淀缓冲液分别单独加入或者可以事先与沉淀缓冲液混合，使得沉淀缓冲液和破坏试剂的混合物随后在步骤a)加入至样本。根据一实施方式，破坏试剂包含离液盐。合适的实例是已知的，且在本文中也有描述。

根据一优选的实施方式，在步骤a)加入金属阳离子沉淀剂和有机溶剂之前破坏样本。根据该实施方式，提供一种从样本分离核酸的无酚方法，其包括以下步骤：

x)破坏样品；

a)制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到破坏的样品从而制备沉淀混合物，其

i)包括金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的有机溶剂；

iii)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；

b)从上清液分离沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离核酸。

根据一实施方式，为破坏样品，提供一种破坏组合物，其包括待破坏的样本和添加至其的离液剂，优选离液盐，浓度选自下组：0.5M至饱和、0.75M-5M、1M-4.5M和1.25M-4.25M。离液盐包括但不限于：胍盐如盐酸胍，硫氰酸胍(或异硫氰酸胍(GITC))或包括硫氰酸盐，碘化物，高氯酸盐，三氯乙酸盐或三氟乙酸盐等的离液盐。这种离液盐可以提供为例如钠或钾盐。优选地，离液盐是GTC(GITC)或同样强的离液盐。各强离液盐是有利的，因为它们也可以有效地保护包含在组合物中的RNA以免被酶降解。尿素也可用于支持样品的破坏。根据一实施方式，在步骤x)提供破坏组合物，且因此先于在步骤a)加入金属阳离子沉淀剂和有机溶剂至所述破坏组合物。

此外，裂解期间，还可以加入其它的添加剂，如螯合剂，核酸酶抑制剂，特别是RNA酶抑制剂或DNA酶抑制剂(如果打算平行分离RNA和DNA)等等。可以用于支持样品裂解且保护释放的核酸，特别是释放的RNA的各添加剂是现有技术已知的，且因此不需要在本文中详细说明。

在步骤a)制备沉淀混合物之前，还可以任选地进一步处理在步骤x)从样品获得的破坏样品。例如，可以均质裂解物，均质还可能在破坏/裂解过程本身发生。此外，裂解物可以被清除以除去细胞碎片。裂解物清除方法可以包括过滤和/或结合细胞碎片和其它污染物到适当的表面，例如载有离子基团，特别是阴离子基团如羧基基团的表面。

本发明的方法可以与蛋白质水解消化进行组合。即使进行蛋白质水解消化，本发明的基于沉淀的方法仍然可以通过消除残余的蛋白质改善结果。如本文所用的术语“蛋白质”还包括肽。然而，本发明的优点是它并不需要耗时的蛋白质水解酶消化步骤。因此，根据一实施方式，样品的破坏不涉及使用蛋白质水解酶。蛋白质水解酶是指催化例如蛋白质，多肽，寡肽和肽类内肽边界的切割的酶。示例性蛋白质水解酶包括但不限于蛋白水解酶和蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶，枯草杆菌酶，碱性丝氨酸蛋白酶等。枯草杆菌酶是丝氨酸蛋白酶家族，即在活性侧具有丝氨酸残基的酶。枯草杆菌蛋白酶是细菌丝氨酸蛋白酶，具有广泛的底物特异性。枯草杆菌蛋白酶对离液剂诸如尿素和盐酸胍以及阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)引起的变性相对有抗性。示例性枯草杆菌蛋白酶包括但不限于：蛋白酶K，蛋白酶R，蛋白酶T，枯草杆菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶A，QIAGEN蛋白酶等。

步骤b)-沉淀的去除

在步骤b)中，形成的沉淀物从剩余的样品中分离，在此被称为“上清液”。可以通过各种手段，例如沉降，离心或过滤协助分离。术语“上清液”具体在本文中用于描述从其中除去形成的沉淀的沉淀混合物。因此，术语“上清液”不限于通过特定模式沉淀分离获得的特定沉淀消除的沉淀混合物。因此，术语“上清液”，例如包含其中在容器的底部收集沉淀和其中剩余的样品作为上清液被除去的实施方式，以及其中沉淀混合物通过过滤器除去所形成的沉淀物并以流过物形式回收剩余的样品的实施方式。

如由实施例证明，由于根据本发明的方法中所用的沉淀条件，所获得的上清液含有长度小于200nt的小RNA，除此之外还有至少1000nt长度的大RNA。当然，中间尺寸的RNA也包含在所述上清液内，如果包括在原始样品中。根据一实施方式，所获得的上清液包含至少60％，至少65％，至少70％，至少75％或至少80％的包含在原始样本中的至少1000nt长度的RNA分子。还发现，大RNA回收率高。因此，与现有技术的沉淀为基础的方法相比，本方法允许以良好的产量回收和分离大RNA分子。此外，根据所使用的沉淀条件，高分子量核酸如基因组DNA可以包括在所述上清液中。

步骤c)-从上清液分离核酸

在步骤c)，从所得的上清液中分离核酸。核酸可以是RNA，DNA或两者。对于从得到的上清液分离一或多种所需目标核酸(例如RNA和/或DNA)，可以使用现有技术中已知的方法。合适的分离方法的实例包括但不限于硅基纯化方法，基于磁性颗粒的纯化方法，基于色谱纯化过程，阴离子交换层析(使用阴离子交换表面，如柱或磁性颗粒)，沉淀和它们的组合。优选地，通过使用合适的结合条件将核酸结合到固相从上清液中分离一或多种目标核酸如RNA和/或DNA。固相例如可以提供二氧化硅结合表面或可以带有可结合所需核酸的阴离子交换官能团。对于后面的实施方式，例如可以使用基于电荷开关原理的分离方法。

优选地，至少RNA从上清液分离。为从得到的上清液分离RNA，可以使用现有技术中已知的方法。本发明的方法具有上清液包含小和大RNA的优点。因此，用户可以根据所关注的靶RNA，从上清液分离小RNA、或大RNA或两者。小和大RNA可以从上清液以单独的部分被分离或以总RNA或总核酸的形式被分离。当然，中间大小的RNA也包含在上清液中，如果包含在样品中，也能被分离，例如与大RNA和/或小RNA一起。

优选地，在有机溶剂如醇存在下通过将其结合至核酸结合固相分离RNA。与固相的结合可以在结合混合物中有离液盐存在而得到增强。随后描述非限制性实施方式。

根据一实施方式，从上清液分离总RNA，其中所述的总RNA包括小和大RNA和中间尺寸的RNA。在本实施例中，步骤c)优选包括：

aa)加入至少一种醇至上清液从而提供结合混合物，其包含浓度≥35％，优选≥40％，更优选≥45％的醇；

bb)包含在结合混合物中的总RNA结合至核酸结合固相，其中在步骤bb)后，大和小RNA结合至固相；

cc)任选地洗涤结合的RNA；和

dd)从固相洗脱RNA。

在高浓度醇存在下大RNA和小RNA当然以及中间尺寸RNA可以结合至核酸结合固相是已经确定的原则。因此，在该实施例中本方法允许分离总RNA，其包括小RNA，大RNA和中间尺寸的RNA。相应的方法在本发明的背景也有描述。

在结合步骤期间，在结合混合物中使用至少35％，优选至少40％，更优选至少45％或至少50％的醇浓度具有效果：建立的RNA结合条件允许小RNA结合至核酸结合固相。这里，令人吃惊地发现，较低醇浓度也可与在现有技术中通常用于获得小RNA与固相结合的现有方法相结合。不希望理论上被束缚，但据信，这是因为沉淀混合物使用的有机溶剂有助于建立合适的结合条件。当然，更长的RNA分子也可在这些条件下结合，因此被捕获入总RNA。

醇可以是具有1至5个碳原子的有支链或无支链的脂族醇，并且可以选自：甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇和丁醇以及它们的混合物。还可以使用醇的混合物。优选地，异丙醇和/或乙醇用作醇从而建立结合条件。这些醇通常用于从破坏样品分离小和大RNA。特别优选的是异丙醇。由于预先进行蛋白质沉淀步，在结合混合物中可使用高醇浓度，因为结合步骤中蛋白质沉淀，且例如阻碍核酸结合相或另外干扰RNA结合的风险被降低。对于产量这是有利的。结合混合物中的醇浓度可以≥50％(v/v)、≥55％(v/v)或≥60％(v/v)。结合混合物中醇浓度的合适范围包括但不限于≥40％(v/v)-≤80％(v/v),≥45％(v/v)-≤75％(v/v),≥50％(v/v)-≤70％(v/v)和≥55％(v/v)-≤65％(v/v)。在步骤aa)可以使用各浓度。如所讨论的，乙醇和异丙醇是优选的。

根据一实施方式，通过在结合混合物掺入离液盐增强RNA与核酸结合固相的结合。离液盐的合适的浓度是技术人员已知的且在本文中描述。

根据一实施方式，步骤aa)的结合混合物包括离液盐，浓度在0.1M至饱和极度的范围内。浓度可以选自：0.2M-5M,0.25M-4.5M,0.3M-4.25M,0.35-4M和0.4M-3.75M。较高浓度的离液盐能有利于提高RNA的产量。离液盐包括但不限于：胍盐如盐酸胍，硫氰酸胍(或异硫氰酸胍(GITC))或包括硫氰酸盐，碘化物，高氯酸盐，三氯乙酸或三氟乙酸盐等的离液盐。还可以使用离液盐的混合物。这种离液盐可以例如以钠或钾盐提供。优选地，离液盐是GTC或GITC或同样强的离液盐。结合混合物中存在的离液盐可以在裂解过程中引入，因为使用离液剂，特别是离液盐用于裂解对于破坏样本是优选的。细节如上所述。这个过程也被用于实施例中。也可以在步骤c)加入离液盐从而将离液盐引入至结合混合物或在RNA结合步骤期间增加离液盐的浓度。因此，通过在RNA分离步骤c)中加入额外量的离液盐增加用于结合的离液盐的浓度也在本发明的范围之内。此外，可加入额外的添加剂，例如去污剂以改善RNA结合。

在步骤bb)，步骤aa)获得的结合混合物中包含的小和大RNA以及中间尺寸的RNA结合至核酸结合固相。适合RNA结合的固相是本领域技术人员公知的，示例性的合适的核酸结合固相也在下文描述。根据一个实施方式，步骤aa)获得的结合混合物与步骤bb)的固相接触。如果利用包含在柱内的核酸结合相，该实施方式是特别合适的。如果使用基于柱的方案，可以在步骤bb)中使用核酸结合固相以将总RNA包括小RNA结合至固相。在使用粒子的情况下，它们也可以已经存在于步骤aa)或可以在步骤bb)引入。

在步骤bb)，RNA包括小RNA结合至核酸结合固相后，任选可以在步骤cc)洗涤结合的RNA。为该目的，可以使用常规洗涤溶液。根据一实施方式，用于洗涤的溶液包括至少一种离液剂和/或至少一种醇。可用于洗涤溶液中的离液剂包括但不限于：离液盐，盐酸胍，硫氰酸胍，异硫氰酸胍和碘化钠。其它离液盐也如上所述。具有优选1至5个碳原子的短链支链或无支链醇可用于洗涤，具体用于洗涤溶液中。实例是甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇和丁醇。优选地，使用异丙醇和/或乙醇。但是也使用不含离液剂的洗涤溶液。

能够选择使用或加入到上述洗涤溶液中使用的合适的洗涤溶液的实例包括醇和缓冲液。合适的醇如上所述。优选地，异丙醇或乙醇，最优选乙醇用于洗涤步骤。优选地，以至少60％(v/v)，至少70％(v/v)，优选至少80％(v/v)的浓度使用乙醇。根据一实施方式，用于洗涤的溶液包括至少一种离液剂，至少一种醇，至少一种表面活性剂和/或至少一种缓冲剂。可以使用合适的缓冲剂如Tris或柠檬酸盐；合适的缓冲剂也是本领域技术人员已知的。

在上述任选一或多个洗涤步骤之前或随后，可以实施DNA酶消化。例如当RNA结合至核酸结合固相时，实施该DNA酶消化。从而，如果仅RNA是关注的核酸，分离的RNA中的基因组DNA污染物的量降低。本文描述用于实施相应DNA酶消化的合适的实施方式，且在现有技术中也是已知的。相应的DNA酶消化步骤是可选的。用于在RNA结合至核酸结合固相时实施DNA酶消化的条件能够实现RNA，特别是小RNA从核酸结合固相部分释放。因此，优选确保可能释放的小RNA再结合至核酸结合固相从而确保小RNA高回收率。根据使用的核酸结合固相的类型，如，是否使用基于柱或基于粒子的方案，不同的方法是可行的。如果颗粒如磁性颗粒用作核酸结合固相，在实施任选的DNA酶消化后，可以添加离液剂和乙醇，由此建立允许小RNA重新结合至颗粒的结合条件。为了这个目的，可以使用包括例如离液盐和/或醇的方案。相应的溶液也可以用作洗涤液。其他的醇也可单独加入，以增加醇的浓度为重新结合。结合步骤c)上文描述合适的醇，醇浓度，离液盐和离液浓度。相同的条件可用于重新结合。如果使用基于柱的核酸结合固相，优选在RNA被结合于固相时实施任选的DNA酶消化(通常也被称为柱上DNA酶消化)后执行以下步骤：

-收集可能已经在DNA酶消化期间从核酸结合固相释放的小RNA作为流过物；

-混有回收溶液的包含小RNA的所述流过物与核酸结合固相接触用于将包含的小RNA重新结合至所述核酸结合固相。

为确保柱上DNA酶消化期间可能已经部分释放的RNA结合至核酸结合固相并收集释放的小RNA作为流过物，优选在DNA酶消化完成后将回收溶液过柱。能够在由回收溶液确定的条件下重新结合的RNA重新结合至核酸结合固相，“逃逸的”小RNA可以作为流过物收集，且因此能再次应用，且因此能重新结合至核酸固相。这阻止小RNA丢失，尽管实施了柱上DNA消化。柱上DNA消化后相应的重新结合步骤的细节在WO 2012/028737中描述，通过引用并入本文。在可能逃逸的小RNA重接结合至核酸结合固相后，再次实施一或多个洗涤步骤。合适的条件如上所述。

在期望执行洗脱步骤从固相洗脱RNA的情况下，可以例如采用经典洗脱溶液，例如水，洗脱缓冲液，特别是低盐洗脱缓冲液来实现洗脱。洗脱缓冲液可包括生物缓冲剂如Tris、MOPS、HEPES、MES、BIS-TRIS丙烷等。可以在步骤dd)进行相应的洗脱步骤。优选地，洗脱溶液的使用不干扰预期的下游应用。洗脱后，洗脱液可热变性。然而，通过其他或协助洗脱手段如加热从固相释放并因此洗脱核酸也在本发明的范围内。

随后，描述合适的实施方式，其能够从包括RNA和DNA的样品分离包括小RNA的总RNA。这里描述的实施方式能够分离包括小RNA的总RNA或者小RNA能够与较大的RNA分离作为单独的部分和/或与DNA平行分离。因此，可以从根据本发明的方法所提供的蛋白质耗尽的上清液分离RNA以及DNA。然而，如果需要，在纯化过程可以选择性消除DNA从而提供分离的RNA，其基本上不含DNA，特别是无基因组DNA。这里，存在不同的选择以除去DNA。非限制性的实施方式将在下面说明。

根据一实施方式，步骤b)中得到的上清液包含RNA以及DNA，且通过将两种类型的核酸结合到核酸结合固相在步骤c)分离RNA和DNA。以总核酸的形式洗脱RNA和DNA。根据一实施方式，如下方式是可行的，如果RNA和DNA都结合到核酸结合固相，然后可以进行差分洗脱过程从而分别分离DNA与包括大和小RNA的总RNA。例如，在洗脱结合的RNA之前选择性洗脱DNA，或反之亦然。相应的差分洗脱条件在，如WO 95/21849或EP 1693453中描述。

根据一实施方式，通过在适当的条件下选择性地将DNA结合至核酸固相，然后将结合至核酸结合固相的DNA与仍包含小和大RNA的剩余的上清液分离以去除DNA。这可以例如通过在将主要的DNA，而不是RNA结合于固相的条件下将上清液与合适的核酸结合固相接触实现。能够结合DNA的合适的核酸结合固相是在现有技术中公知的，也是本文所需的。通常，本文描述用于RNA结合步骤的核酸结合固相，特别是含有硅的固相，也可用于DNA结合。选择性结合并由此除去DNA的合适方法例如在EP0880537和WO95/21849中描述，通过引用并入本文。例如，如果使用离液剂如离液盐裂解样品，可在对DNA具有选择性的短链醇诸如乙醇或异丙醇不存在下建立结合条件。如果需要，可进一步使用结合的DNA，例如进一步处理，并且可以例如任选地被洗涤和从核酸结合固相洗脱从而提供DNA部分，其基本上不含RNA。各个DNA部分随后可用于分析。因此，本发明还提供了一种方法，其中RNA和DNA可以从相同的样品中分离，因为与现有技术的方法比较，可以提供蛋白质消除的上清液，其除了包含小和大RNA也含DNA，例如基因组DNA。然而，如果DNA不是所关注的，也可以简单地丢弃结合的DNA，如果打算(仅)分离RNA，例如小和大RNA，以单独的组分或以总RNA形式，是优选的。此外，在这种情况下，该DNA结合和除去步骤是有利的，因为它减少了纯化的RNA中DNA污染的量。

当DNA结合到核酸结合固相，例如含有二氧化硅的固相，且从剩余的样品中分离结合的DNA，提供一种DNA消除的含RNA的上清液，小RNA以及大RNA和中间尺寸的RNA可从其分离。

为了进一步减少分离的RNA中的DNA的量，通过将DNA结合至上述核酸固相从蛋白质消除上清液去除DNA后，可以进行使用合适的酶降解DNA的中间步骤。进行DNA酶消化能够去除剩余痕量的DNA。在RNA结合到核酸结合固相后进行DNA酶处理，例如作为柱上DNA酶消化。细节如上所述。此外，也可以在含有RNA的洗脱液上进行DNA酶消化。

此外，以单独的部分分离小RNA和大RNA在本发明范围之内。这可以例如通过使用对较大RNA种类具有选择性的条件在第一步骤将长度>200nt的RNA结合至第一核酸结合固相实现。从而，大部分这种较大的RNA结合至固相，而剩余的上清液包含小RNA。接着在第二结合步骤，具有200nt或更小长度的小RNA从去除大RNA的剩余的上清液分离。各选择性结合条件在现有技术中公知的，因此，不需要详细地描述。它们在背景中也有描述。通常，为在第一结合步骤选择性地结合大RNA，在结合混合物中使用小于40％的醇浓度。例如浓度处在10％-37％、15％-35％或20％-30％的范围内，优选在离液盐存在下。在将结合至固相的大RNA分离后，上清液残留仍包含小RNA。接着可以在第二结合步骤分离小RNA，例如通过提高醇浓度至≥40％，优选≥45％，更优选≥50％，并将小RNA结合至核酸结合固相。结合的RNA可以被洗涤或洗脱。此外，总RNA可以结合到相同的固相，小RNA可作为富集的组分与较大RNA分离获得，例如使用差分洗脱方案。然而，优选的是分离总RNA，其包括小于200nt长度的小RNA以及较大的RNA种类，因为这样的过程对于用户非常方便，对于分离的RNA的下游应用是灵活的，因为所有尺寸(小，中和大)的RNA被回收。

为从使用本发明特定沉淀条件提供的蛋白质消除上清液分离RNA，也可以使用其他RNA分离方法。RNA分离方法如还在EP2163622和WO2009/070558中描述，为从上清液分离RNA可以使用描述的结合条件。通常，在适合结合小RNA中核酸结合固相的条件下，较大RNA也将结合。

此外，DNA可能从上清液分离。合适的方式是技术人员已知的，且从本披露内容也将是明显的。根据一实施方式，从上清液分离总核酸。这里，分离的核酸包含小RNA，大RNA，中间大小的RNA以及DNA。合适的结合条件是本领域技术人员已知的，并且从本公开内容也很明显。

然后可以使用合适的测定和/或分析方法分析和/或进一步处理分离的核酸。例如，RNA如小，大和/或中间尺寸，以及DNA，如果从上清液分离，可以被识别、修饰、与至少一种酶接触、扩增、反转录、测序、与探针接触，被检测(它们存在与否)和/或可以被定量。各方法是现有技术中公知的，且通常用于医疗，诊断和/或预后领域以分析RNA。因此，可以分析回收的核酸，例如从而识别疾病状态的存在与否或严重程度，包括但不限于许多肿瘤性疾病，特别是初癌和恶性肿瘤，如不同形式的肿瘤或癌症。例如，为在许多应用领域检测诊断和/或预后标记物(如胎儿或肿瘤衍生的细胞外核酸)可以分析分离的核酸，包括但不限于无创产前遗传检测，相应地，筛选，疾病筛查，病原体筛查，肿瘤学，癌症筛查，早期癌症筛查，肿瘤治疗监测，遗传检测(分型)，感染性疾病检测，损伤诊断，创伤诊断，移植医学或许多其他疾病，因此，是诊断和/或预后相关的。因此，如上讨论的，本方法可以包括核酸分析和/或处理的另外步骤。

因此，根据一实施方式，分析分离的核酸，如特别是分离的RNA从而识别，检测，筛查、监控或排除疾病和/或至少一种胎儿特性。分析方法将取决于所关注的核酸种类。可以使用任何核酸分析/处理方法包括，但不限于扩增技术，聚合酶链反应(PCR)，等温扩增，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)，数字PCR，凝胶电泳，毛细管电泳，质谱，荧光检测，紫外光谱，杂交分析，RNA或DNA测序，下一代测序，限制性分析，反转录，NASBA，等位基因特异性聚合酶链反应，聚合酶循环装配(PCA)，不对称聚合酶链反应，线性指数聚合酶链反应(LATE-PCR)，解旋酶依赖性扩增(HDA)，热启动聚合酶链式反应，序列间特异性后聚合酶链式反应(ISSR)，逆聚合酶链式反应，连接介导聚合酶链式反应，甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)，多重聚合酶链式反应，巢式聚合酶链式反应，固相聚合酶链式反应，或它们的任意组合进行分析/进一步处理分离的核酸。

特别地，本发明的方法可以为通常需要分离RNA的任何目的而用于RNA分离。非限制性实例包括，但不限于分离RNA为随后的cDNA合成、cDNA文库构建、基于扩增的方法如逆转录PCR、消减杂交、体外翻译、SAGE技术、表达分析、表达测试和表达芯片分析，微阵列分析，RNA酶和S1核酸酶保护，RNA印迹、点和狭线印迹、微注射以及用于测序应用。各技术是本领域技术人员公知的，且因此本文不需进一步的描述。本发明的方法是有效的，灵活的，并且不要求使用酚类化合物。

具体的实施方式

将在下面说明本发明方法的非限制性具体的实施方式。

根据一实施方式，本方法包括以下步骤：

a)通过加入溶解盐形式的至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品来制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中使用质子溶剂的情况下，优选质子溶剂是水溶性醇，更优选选自乙醇和异丙醇，且其中所述沉淀混合物

i)包括金属阳离子沉淀剂盐，浓度选自300mM-625mM、350mM-600mM或400mM-550mM；

ii)包括选自下组浓度的有机溶剂：6.5％-14.5％、7％-14％、8％-13.5％、9％-13％或9.5％-12％；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值，处于以下范围：3-5.25、3.25-5.0、3.25-4.75、3.5-4.5或3.75-4.4；

b)分离上清液与沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离至少小和大RNA，其中步骤c)包括：

aa)加入至少一种醇至上清液从而提供结合混合物，其包含浓度≥40％，优选≥45％，更优选≥50％的醇；

bb)包含在结合混合物中的总RNA结合至含硅的核酸结合固相，其中在步骤bb)后，至少大和小RNA结合至固相；

cc)任选地洗涤结合的RNA；和

dd)从固相洗脱RNA。

如上所述，根据一实施方式，步骤a)之前，执行步骤x)，其中破坏样品。然而，如从实施例中所述和也很明显，也可能在制备沉淀混合物的同时发生样品的破坏(如果需要的话)。优选地，在步骤a)加入沉淀缓冲液，它包括溶解盐形式的金属阳离子沉淀剂，本文所定义的有机溶剂和缓冲剂，以合适的浓度和适合的pH值从而提供所定义的沉淀混合物。

根据一实施方式，所述方法是用于分离RNA并包括以下步骤

x)破坏样品；

a)通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到破坏的样品以制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中使用质子溶剂的情况下，优选质子溶剂是水可混溶性醇，且其中所述沉淀混合物

i)包括金属阳离子沉淀剂，浓度选自300mM-625mM、350mM-600mM或400mM-550mM；

ii)包括选自下组浓度的有机溶剂：6.5％-14.5％、7％-14％、8％-13.5％、9％-13％或9.5％-12％；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值，处于以下范围：3-5.25、3–5、3.25-4.75、3.5-4.5或3.75-4.4；

b)分离上清液与沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离至少小和大RNA，其中步骤c)包括：

aa)加入至少一种醇至上清液从而提供结合混合物，其包含浓度≥40％、≥45％或≥50％的醇；

bb)包含在结合混合物中的总RNA结合至含硅的核酸结合固相，其中在步骤bb)后，至少大和小RNA结合至固相；

cc)任选地洗涤结合的RNA；和

dd)从固相洗脱RNA。

根据一实施方式，所述方法包括以下步骤

x)破坏样品；

a)通过加入溶解盐形式的选自Zn²⁺和Al³⁺的至少一种金属阳离子沉淀剂，优选氯化锌和为非质子极性溶剂的至少一种有机溶剂到破坏的样品以制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中所述沉淀混合物

i)包括金属阳离子沉淀剂盐，浓度选自300mM-625mM、350mM-600mM或400mM-550mM；

ii)包括选自下组浓度的有机溶剂：8％-13.5％,9％-13％或9.5％-12％；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值，处于以下范围：3.5-4.5或3.75-4.4；

b)分离上清液与沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离至少小和大RNA，其中步骤c)包括：

aa)加入至少一种醇至上清液从而提供结合混合物，其包含浓度≥40％、≥45％或≥50％的醇且其中所述结合混合物还包含离液盐；

bb)包含在结合混合物中的总RNA结合至含硅的核酸结合固相，其中在步骤bb)后，至少大和小RNA结合至固相；

cc)洗涤结合的RNA；和

dd)从固相洗脱RNA。

如上所述，优选地，在步骤a)加入沉淀缓冲液，它包括溶解盐形式的金属阳离子沉淀剂，有机溶剂和缓冲剂，具有合适的浓度和合适的pH，以提供所定义的沉淀混合物。

如所描述的，根据一实施方式，当在具体阶段在步骤a)加入金属阳离子沉淀剂和有机溶剂同时破坏样本。根据一实施方式，所述方法是用于分离RNA，其中所述方法包括以下步骤

a)制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，沉淀混合物的制备是通过加入至少一种破坏试剂、至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品从而破坏样品，其中使用质子溶剂的情况下，优选质子溶剂是水可混溶性醇，且其中所述沉淀混合物

i)包括金属阳离子沉淀剂，浓度选自300mM-625mM、350mM-600mM或400mM-550mM；

ii)包括选自下组浓度的有机溶剂：6.5％-14.5％、7％-14％、8％-13.5％、9％-13％或9.5％-12％；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值，处于以下范围：3-5.25、3-5、3.25-4.75、3.5-4.5或3.75-4.4；和

v)包括破坏试剂；

b)分离上清液与沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离至少小和大RNA，其中步骤c)包括：

aa)加入至少一种醇至上清液从而提供结合混合物，其包含浓度≥40％、≥45％或≥50％的醇；

bb)包含在结合混合物中的总RNA结合至含硅的核酸结合固相，其中在步骤bb)后，至少大和小RNA结合至固相；

cc)任选地洗涤结合的RNA；和

dd)从固相洗脱RNA。

根据一实施方式，所述方法包括以下步骤

a)制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，通过加入至少一种破坏试剂、溶解盐形式的选自Zn²⁺和Al³⁺的至少一种金属阳离子沉淀剂，优选氯化锌和为非质子极性溶剂的至少一种有机溶剂从而破坏样品并制备沉淀混合物，其

i)包括金属阳离子沉淀剂盐，浓度选自300mM-625mM、350mM-600mM或400mM-550mM；

ii)包括选自下组浓度的有机溶剂：8％-13.5％,9％-13％或9.5％-12％；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值，处于以下范围：3.5-4.5或3.75-4.4；和

v)包括破坏试剂；

b)分离上清液与沉淀物，其中该上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离至少小和大RNA，其中步骤c)包括：

aa)加入至少一种醇至上清液从而提供结合混合物，其包含浓度≥40％、≥45％或≥50％的醇且其中所述结合混合物还包含离液盐；

bb)包含在结合混合物中的总RNA结合至含硅的核酸结合固相，其中在步骤bb)后，至少大和小RNA结合至固相；

cc)洗涤结合的RNA；和

dd)从固相洗脱RNA。

如上所述，优选地，在步骤a)中加入沉淀缓冲液，它包括溶解的盐形式的金属阳离子沉淀剂，有机溶剂和缓冲剂，以合适的浓度并具有合适的pH，以提供所定义的沉淀混合物。

术语“样品”在本文中以广义使用，旨在包括含有核酸的各种来源。样品可以是生物学样品，但该术语还包括其它，例如包含核酸的人工样品。示范性的样品包括但不限于：组织，通常包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、脂肪、胰腺、细胞培养物、体液；全血；血清；血浆；红细胞；白细胞；血沉棕黄层，肿瘤细胞，胎儿细胞，宿主和移植物细胞；拭子，包括但不限于口腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子、尿道拭子、子宫颈拭子、咽喉拭子、直肠拭子、病灶拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等；尿；痰；唾液；精液；淋巴液；液体；羊水；脑脊液；腹腔积液；胸腔积液；囊肿液体；滑液；玻璃体液；房水；囊液；眼洗出物；眼抽吸物；肺灌洗物；肺抽吸物；骨髓抽吸物，细胞悬液，以及从可能存在于样品中的任何细胞或微生物和病毒获得的裂解物、提取物或材料，等等。从包含核酸的临床或法医机构获得的材料也包括在术语样品的含义内。此外，本领域技术人员将了解，从任何上述示范性样品获得的裂解物、提取物或材料或它们的各部分也在术语样品的范围内。样品优选来自人、动物、植物、细菌或真菌的生物学样品。样品宜选自下组：细胞、组织、体液，例如血液、血液制品，如血沉棕黄层、血浆和血清，尿、液体、痰、粪便、脑脊液和精液、上皮拭子、活检样品、骨髓样品和各种组织样品。如上所述，优选在制备沉淀混合物之前破坏样品。本发明方法特别适用于从富含蛋白的样品，例如血浆或血清分离RNA。如实施例所示，本发明方法能够从相应的样品有效分离总RNA，包括小RNA，即使纯化过程中不使用苯酚。

本发明方法也适用于处理血液样品，特别是利用，例如抗凝剂稳定化的血液样品和源自血液样本的样本如血浆或血清。用于稳定血液样品的典型抗凝剂包括但不限于EDTA和柠檬酸盐。本发明方法也适用于从源自各稳定的样本如从血浆或血清样本的样本分离RNA。此外，可从包括含有活化剂的血清样品在内的血清样品中分离RNA。

本文所用的术语“核酸”尤其指包含核糖核苷和/或脱氧核糖核苷的聚合物，它们通过共价键合，通常通过亚单位间的磷酸二酯键，但是在一些情况下通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。DNA包括，但不限于所有类型的DNA，如gDNA；环状DNA、质粒DNA和循环DNA。RNA包括，但不限于hnRNA；mRNA；胞外RNA、非编码RNA(ncRNA)，包括但不限于rRNA、tRNA、lncRNA(长非编码RNA)、lincRNA(长基因间非编码RNA)、miRNA(微小RNA)、siRNA(小干扰RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、snRNA(小核RNA)和stRNA(小瞬时RNA)、piRNA(piwi互动RNA)、tiRNA(转录起始RNA)、PASR(启动子相关RNA)、CUT(隐形不稳定转录物)。小RNA或术语小RNA种类尤其是指链长为200nt或更少，175nt或更少，150nt或更少，125nt或更少，100nt或更少，或75nt或更少的RNA，包括但不限于miRNA、siRNA、其它短干扰核酸，snoRNA等。大RNA和类似的表述用于本文是指具有至少1000nt长度的RNA种类，如至少1250nt、至少1500nt或甚至更大。大RNA特别包括mRNA。在RNA是双链分子的情况下，以“nt”表示的链长是指“bp”。可以采用本发明方法分离的RNA当然也可能是中间尺寸的RNA，例如当从样本分离总RNA时被分离。

对于可用于结合核酸如RNA的核酸结合固相，可以使用能够结合感兴趣的核酸的任何材料。这包括能够结合核酸的各种材料。可结合本发明使用的示例性的固相包括，但不限于包括硅的化合物，包括但不限于，二氧化硅材料，如二氧化硅颗粒，二氧化硅纤维，玻璃纤维，二氧化硅，硅藻土，玻璃，烷基硅，硅酸铝，和硼硅酸盐；硝化纤维；重氮化纸；羟基磷灰石(也称为羟基磷灰石)；尼龙；金属氧化物；矿物质，氧化锆；氧化铝；聚合物载体，有机聚合物，二乙氨基乙基和三乙氨基乙基衍生的载体，疏水层析树脂等。术语固相不旨在暗示对其形式或设计的任何限制。因此，术语固相包括适当的材料，其是多孔的或无孔的，可渗透的或不可渗透的，包括但不限于膜，滤纸，片，颗粒，磁性颗粒，珠，凝胶，粉末，纤维等。根据一实施方式，使用阴离子交换配体官能化的固相，从而从蛋白质耗尽上清结合所关注的核酸。例如可以使用阴离子交换配体官能化的颗粒如磁性颗粒或柱。根据另一实施方式，固相例如二氧化硅固相的表面不会被修饰，且例如未用官能团改性。

特别优选的是使用含有硅的材料如二氧化硅和聚硅酸材料，硼硅酸盐，硅酸盐和无机玻璃作为固相。这里，固相最好提供与RNA相互作用的二氧化硅表面，其可以通过沉淀和或吸附被结合。本文所用的术语“二氧化硅表面”包括包含或由二氧化硅和/或其它氧化硅、硅藻土，玻璃，沸石，膨润土，烷基硅，硅酸铝和硼硅酸盐组成的表面。二氧化硅表面优选是未被修饰的。因此表面未被核酸结合派替或其他核酸结合基团修饰。例如，固相在其包含离子交换基团结合表面不载有任何配体，特别地，固相表面未被官能配体修饰。尤其是，它未被包含阴离子或阳离子交换基团，如氨基或羧基的配体修饰。根据一实施方式，二氧化硅表面不包含除了其硅烷醇基或其它氧化形式的硅如氧化物外的任何官能团。可结合本发明使用的示例性固相包括，但不限于包括二氧化硅表面的固相，包括但不限于，二氧化硅粒子，二氧化硅纤维，玻璃材料如玻璃粉末，玻璃纤维，玻璃颗粒或可控孔径玻璃，二氧化硅，颗粒形式例如粉末，珠粒或熔块状的玻璃或二氧化硅。根据本发明，优选使用基于柱的固相或使用颗粒，特别是磁性颗粒。

二氧化硅基核酸分离方法在现有技术中广泛使用，并且当使用高醇浓度用于结合分离RNA包括小RNA，优选与至少一种离液盐结合时特别有效。

根据一实施方式，所使用的二氧化硅粒子可以具有珠粒形式。优选地，所述颗粒的尺寸为约0.02至30μm，更优选0.05至15μm，且最优选0.1至10μm。为容易处理核酸结合固相，优选使用磁性二氧化硅粒子。磁性颗粒响应磁场。磁性二氧化硅粒子可以例如是亚铁磁的，铁磁的，顺磁的或超顺磁的。合适的磁性二氧化硅粒子例如在WO 01/71732、WO 2004/003231和WO 2003/004150中描述。其他磁性二氧化硅粒子也是现有技术已知的，且如WO98/31840、WO 98/31461、EP 1 260 595、WO 96/41811和EP 0 343 934中描述，且也包括例如磁性二氧化硅玻璃颗粒。因为通过磁场的帮助，例如通过使用永久磁铁可以容易处理包括结合的RNA的磁性颗粒，因此使用磁性颗粒是方便的。本实施方式与能够处理磁性颗粒的已建立的机器人系统兼容。这里，在现有技术中存在的不同的机器人系统可以与本发明结合使用来处理核酸结合的磁性颗粒。根据一实施方式，在反应容器的底部或侧面收集磁性颗粒并从反应容器中除去剩余的液体样品，留下收集的核酸结合的磁性颗粒。可以通过倾析或抽吸除去剩余的样品。这样的系统在现有技术中是公知的，因此这里无需详细描述。在被用于处理磁性颗粒的已知的替代系统中，通常由封皮或包膜覆盖的磁体投入反应容器以收集磁性颗粒。因系统在现有技术中是众所周知的，并且也可商购(例如QIAGEN公司)，在这里它们并不需要任何详细描述。在被用于处理磁性颗粒的已知的另一种替代系统中，包含磁性颗粒的样本可被吸入移液管尖端且通过在例如移液管一侧应用磁体可以将磁性颗粒收集到移液管尖端。然后从移液管尖端释放剩余的样品，同时由于移液管尖端内的磁体保留载有结合的核酸的收集的磁性颗粒。然后可以进一步处理收集的磁性颗粒。这样的系统在现有技术中也是众所周知的，并且也可商购(例如BioRobot EZ1，QIAGEN)，因此，这里不需要任何详细说明。

根据一优选的实施方式，进行基于柱的核酸分离方法，其中固相被包含在柱内。本文使用的术语“柱”特别描述具有至少两个开口的容器。由此，溶液和/或样品可以穿过所述柱。特别地，术语“柱”对容器的形状没有任何限制，其可以是例如圆的或有角的，优选是圆柱形的。但是，也可以使用其他的形状，特别是当使用多柱时。柱包括用于RNA结合的固相。包含在柱内的所述固相应允许溶液通过，具体地结合混合物，当施加到柱时。这意味着如果例如施加离心力到柱，溶液和/或结合混合物能够在离心力的方向通过柱。如上所讨论的，结合混合物通常例如通过离心或真空辅助通过柱，且在通过期间RNA分子结合到包含的固相。哪种RNA(小和/或大RNA)结合取决于所用的结合条件。可以单个或多个方式使用柱。具有相似试样的多柱如多孔板，其包含固相，如二氧化硅膜或玻璃纤维，是现有技术中已知的，且也可商购。优选地，该柱是离心柱。优选地，RNA结合膜或RNA结合纤维用作固相。实例包括但不限于二氧化硅膜，玻璃纤维膜或滤纸，提供用于结合RNA的含硅表面。优选地，膜是多孔的、如实施例所示，使用包含在柱内的固相具有优势。柱如离心柱的使用被广泛用于RNA纯化，因此使用柱对于用户来说非常方便。基于柱的方法也是快速的，此外，存在自动化系统允许自动处理样品(参见例如QIAcube工作站，QIAGEN)。由此，能够避免繁琐的手工处理过程。此外，使用基于离心柱的方法用于分离RNA具有优点：不存在来自洗涤溶液(如醇)或小珠夹带潜在的抑制性组分的风险。优选在柱内使用含有或由二氧化硅组成的膜或纤维作为固相。上文也描述提供适合RNA结合的二氧化硅表面的合适和优选的基于二氧化硅的材料。包含在柱内的其他常规固相是二氧化硅粒子填充，或二氧化硅材料(例如硅胶)层。例如，二氧化硅颗粒可以层的形式布置在惰性滤纸或膜上，从而形成RNA结合固相。为了缓解结合混合物通过包括在柱中的固相，可以使用合适的装置，如离心机或使用压力差发生装置，例如其压样品通过柱，具体地通过固相或通过应用真空吸它通过固相。各装置在现有技术中是公知的，因此这里不需要进一步的描述。

上述核酸结合固相通常也适合用于结合DNA，如本领域技术人员已知的。

B.提供蛋白质消除上清液的方法

根据第二方面，提供一种从样品提供蛋白质消除上清液的无酚方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品以制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中沉淀混合物

i)包括金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的有机溶剂；

iii)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；

b)从上清液分离沉淀物，其中获得的上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA。

有关单独步骤a)和b)的细节，金属阳离子沉淀剂和有机溶剂的合适的类型和浓度以及可以从其制备蛋白质消除上清液的不同样品类型在上文结合第一方面的方法并在权利要求中描述了，且参考也适用于本文的各披露。如所描述的，步骤a)样品是根据一实施方式的破坏的样本。可以在制备沉淀混合物之前或同时发生样本破坏。根据一实施方式，第二方面的方法包括步骤x)，其中样本在步骤a)之前破坏。该破坏步骤的细节如上所述，并参开以上公开内容。优选地，在步骤a)中加入沉淀缓冲液，它包括金属阳离子沉淀剂，有机溶剂和缓冲剂从而建立沉淀混合物的沉淀条件。所述沉淀缓冲液的细节在上面描述。例如，根据第三方面的沉淀缓冲液，它也在权利要求限定可以用于该目的。优选将沉淀缓冲液添加到破坏样品。

该方法提供蛋白质消除上清液，其与现有技术的方法相比包括小以及大RNA(和中间大小的RNA)，且在实施方式中还包含高分子量核酸如基因组DNA。上文描述细节，参考以上公开内容。然后可以使用各种核酸分离方法从蛋白质消除上清液中分离出感兴趣的核酸种类。所使用的方法也将取决于所感兴趣的靶核酸。适合于分离RNA以及DNA的示例性，非限制性实施例在上文描述，参考以上公开内容。

C.沉淀缓冲液

根据第三方面，提供一种沉淀缓冲液，包含：

a)至少一种金属阳离子沉淀剂；

b)选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂；和

c)至少一种缓冲剂；

其中所述沉淀缓冲液的pH值为3-5.5。

可以有利地使用各沉淀缓冲液从而从各种生物样品特别是破坏的生物样品沉淀蛋白质。因此，它可以特别用于本发明第一和第二方面的方法中。所述沉淀缓冲液的细节已经在上文结合第一方面的方法被描述，参开还适用于此的各公开内容。非限制性实施方式在下文再次简单说明。

金属阳离子沉淀剂可以以溶解盐形式包含在沉淀缓冲液中，浓度选自0.75M-3M、1M-2.8M、1.25M-2.7M、1.5M-2.6M或1.7M-2.5M。例如，可以使用诸如卤化物盐如氯化物盐。在包含两种或更多种金属阳离子沉淀剂情况下，根据一实施方式，这些浓度是指包含的金属阳离子沉淀剂的总浓度。如由实施例表明，使用包括相应浓度的金属阳离子沉淀剂的沉淀缓冲液提供好的结果。合适的在上文描述，优选地金属阳离子沉淀剂选自Zn²⁺和Al³⁺。Zn²⁺是特别优选的。它可以氯化锌包括在沉淀缓冲液中。

沉淀缓冲液可以包括选自非质子极性溶剂和质子溶剂的有机溶剂，浓度选自13％-65％、20％-63％、25％-62.5％、30％-60％、33％-57.5％、37.5％-55％或40％-52.5％。在包含两种或更多种相应有机溶剂情况下，根据一实施方式，这些浓度是指包含的有机溶剂的总浓度。选自非质子极性溶剂和质子溶剂的合适有机溶剂的合适实例在上文结合第一方面的方法描述，且从实施例中也是明显的。有机溶剂是与水混溶。优选地，有机溶剂是非质子极性溶剂，例如DMSO。此外，可以使用质子有机溶剂，如与水混溶的醇。优选地，质子有机溶剂是低级脂族醇，诸如甲醇，乙醇和异丙醇。

沉淀缓冲液的pH值选自3至5.5、3至5.25、3.25至5、3.25至4.75、3.5至4.5和3.75至4.4。特别优选的是pH值在3-5范围内，优选3.25至4.75，更优选3.5至4.5或3.75至4.4。如由实施例表明，使用具有相应酸性pH值的沉淀缓冲液提供有利的结果，特别是当处理富含蛋白质的样品，如血浆或血清时。

为维持酸性pH值，沉淀缓冲液包含至少一种缓冲剂。如由实施例表明，可使用不同的缓冲剂。也可以使用缓冲剂的组合。根据一实施方式，缓冲剂是或从羧酸衍生。羧酸包括单，二或三羧酸。优选地，缓冲剂是乙酸或柠檬酸，具体是乙酸盐或柠檬酸盐。如由实施例表明，乙酸盐和柠檬酸盐可采用不同盐的形式加入。此外，可以使用诸如PIPPS的磷酸盐缓冲剂。根据一实施方式，沉淀缓冲液包含缓冲剂，浓度选自下组：300mM-2M、400mM-1.75M、450mM-1.5M、500mM-1.4M、550mM-1.3M和600mM-1.25M。特别优选的是羧酸盐，如乙酸盐或柠檬酸盐，例如可以前述浓度范围使用碱金属盐。特别优选的是处于以下范围的浓度：550mM-1.3M、600mM-1.25M或650mM-1.2M。在使用两种或多种缓冲剂的情况下，根据一实施方式相应的浓度是指沉淀缓冲液中缓冲剂的总浓度。

根据一实施方式，沉淀缓冲液

aa)包括Zn²⁺或Al³⁺，优选Zn²⁺，作为金属阳离子沉淀剂，以溶解盐的形式，浓度选自：1.25M-2.8M、1.5M-2.6M或1.7M-2.5M；

bb)包括有机溶剂，其优选为非质子极性有机溶剂，浓度选自：13％-65％、20％-63％、25％-62.5％、30％-60％、33％-57.5％、37.5％-55％或40％-52.5％；和

cc)具有的pH值处于3.25至4.75或3.4至4.5范围内。

如上所述，Zn²⁺是优选的，可以例如以氯化锌被包含。

根据第三方面的沉淀缓冲液也可以包含在试剂盒内。因此，本发明披露还提供试剂盒。试剂盒用于从样本分离核酸，优选至少RNA。根据一实施方式，试剂盒包括分离核酸，优选至少RNA所需的全部试剂。根据一实施方式，这种试剂盒包含根据第三方面的沉淀缓冲液，以及一或多种以下组分：

-至少一种破坏试剂；

-至少一种核酸结合固相；

-至少一种结合溶液；

-至少一种洗涤液；和/或

-至少一种洗脱溶液。

根据一实施方式，试剂盒包括沉淀缓冲液，含有离液盐的破坏试剂和核酸结合固相。各破坏试剂和核酸结合固相合适的实施方式在上文结合第一方面的方法被描述，参考还适用于此的上述公开内容。试剂盒可进一步包括结合溶液。结合溶液可以包括或由适合促进核酸如优选RNA结合至核酸结合固相的醇构成。合适的醇如上所述，优选的是乙醇和异丙醇。例如如果含硅材料用作核酸结合固相，该实施方式是合适的。结合溶液可包含离液剂，如优选离液盐。在破坏缓冲液不含离液盐的情况下这是特别有利的。

本发明不受在此公开的示例性的方法和材料的限制，类似或等同于本文描述那些的任何方法和材料可以在实践或本发明实施例的测试中使用。数字范围包括限定该范围的数字。本文所提供的标题不是对本发明各个方面或实施方式的限制，其参考说明书整体被阅读。

如在本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数方面，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种金属阳离子沉淀剂”包括单一类型的金属阳离子沉淀剂，以及两种或多种金属阳离子沉淀剂。同样地，提及一种“醇”，“有机溶剂”，一“离液盐”，一“缓冲剂”等包括单一实体和两个或更多个这样的实体的组合。参照“本公开”和“本发明”等包括本文教导的单个或多个方面等等。本文所教导的方面通过术语“发明”涵盖。

如本文使用的术语“溶液”特别是指一种液体组合物，优选水性组合物。它可以是仅一相的均匀混合物，但它也在本发明的范围内，其中溶液包括固体成分，例如沉淀。

根据一个实施方式，本文描述的主题，在方法的情况下包含一些步骤或在组合物中包括一些组分，溶液和/或缓冲液是指包含各独立步骤或组分的主题。优选选择和结合本文所述的优选的实施方式且从优选实施方式的相应组合产生的特定主题也属于本发明。

实施例

I.材料和方法

除非另有说明，根据以下标准方法从血清、血浆或组织中分离总RNA：

1.材料

沉淀缓冲液XP(45％(体积/体积)DMSO；ZnCl₂(1.909M)；醋酸钠；pH为4-4.5)

-二氧化硅柱(离心柱)

-收集管(1.5ml和2ml)

-洗涤缓冲液RWT(QIAGEN；包含GTC，使用前2倍体积乙醇(96％-100％)加入到浓缩缓冲液RWT)

-洗涤缓冲液RPE(QIAGEN；使用前4倍体积乙醇(96％-100％)加入到浓缩缓冲液RPE)

-裂解缓冲液RLT+(QIAGEN；含有离液盐和表面活性剂)

-无RNA酶的水

-Ce_miR-39_1引物分析

2.总RNA分离

2.1.手动过程

样品制备

120μl裂解缓冲液(RLT+，QIAGEN)加入到200μl样品如血清或血浆。裂解混合物涡旋振荡并在室温下温育3分钟以破坏样品。

蛋白质沉淀

95μl沉淀缓冲液XP加到破碎样品并涡旋振荡3秒。任选地加入3.5μl miRNeasy血清外加对照(1.6x 10⁸拷贝/μl)，并再次涡旋振荡3秒。然后将样品在冰上孵育3分钟。任选地，样品也可以在4℃存储数小时。通过在>11.000rpm离心3分钟除去得到的沉淀物。将含核酸上清液转移至新的收集管。

RNA结合

1体积(360μl)醇(例如异丙醇)加入到上清液并将结合混合物涡旋振荡5秒。然后将结合混合物加到二氧化硅离心柱上，并在室温下温育2分钟。此后，在>11.000rpm离心柱30秒。

洗涤步骤

为进一步纯化结合的RNA，进行数个洗涤步骤：700μl RWT，>8000xg离心15秒，弃去流过物；800μl RPE，>8000xg离心15秒，弃去流过物；700μl RPE，>8000xg离心15秒，弃去流过物。最后，300μl 100％乙醇加至柱中，>8000xg离心2分钟，弃去流过物。然后将含有洗涤的RNA的柱转移到新的2mL收集管。然后将打开盖子的柱以最大转速离心5分钟除去残留痕量乙醇。

洗脱

将柱转移到新的1.5毫升反应容器中。将20μl无RNA酶的水加到柱的中间。封闭柱并以最大的转速离心1分钟。任选地，可以进行第二洗脱步骤，例如使用已经获得的洗脱液。

2.2.多孔(96)方法

也可以采取手动方法同时处理多个样品，在BioRobot(仿生自动机)通用机器人系统或例如QIAcube HT系统上使用96孔板。在CMTR(收集微管架)模块内进行样本制备。

样本制备

200μl血清或血浆加入到CMTR模块。加入120μl裂解缓冲液(RLT+，QIAGEN公司)并混合。为裂解，裂解混合物在室温下孵育3分钟。

蛋白质沉淀

95μl沉淀缓冲液XP加入到裂解混合物并混合样品。任选地，加入3.5μl miRNeasy血清外加对照(1.6x 10⁸拷贝/μl)并混合。如上所述，在这一阶段在4℃存储样品几个小时也是可能的。在4℃、>5.000rpm离心5分钟除去沉淀物。然后在BioRobot通用系统内进一步处理CMTR模块。进一步的BioRobot方案对应于用于血清/血浆样品现有miRNeasy BioRobot方案。唯一的调整是从样本获得的上清液的体积。使用RNeasy 96孔板进行RNA分离。洗涤步骤对应于为手工制备中描述的那些。洗脱体积2×55μl。

II.实验

实施例1：使用BioRobot通用方法从血清和血浆分离包括miRNA的总RNA

使用不同的样品类型证实本发明方法的功效。作为样品材料，使用不同的人血清和血浆样品(合并的)(见表1)：

使用1)已建立的QIAzol制备方法(用于血浆/血清的miRNeasy；涉及使用苯酚)或2)本发明无酚的方法从相同的合并的样本分离RNA。因为是从相同的合并的样本获得RNA，可以直接比较方法的RNA分离效率。

在BioRobot通用系统上使用两种方法处理来自各合并的样品的8次重复品。随后使用miScript miRNA PCR阵列miRNA QC(MIHS-989Z)分析6μl的各洗脱液。图1(血清)和图2(血浆)显示三种量化的miRNA(miR-16，miR-21和miR-191)和外加对照Cel-miR-39的Ct值。大多数情况下，本发明的方法比已建立的现有技术的分离方法(miRNeasy)获得更好的结果(即，较低的Ct值)。因此，本发明的无酚方法与已建立的基于酚的RNA分离方法相比，提供相当或更好的结果。

实施例2：分离的miRNA的谱图

分析本发明的方法是否能够像已建立的miRNeasy分离方法那样从相同样本分离到具有相当的谱图的miRNA。使用miRNeasy血清/血浆试剂盒(6个重复品)或本发明的方法(8个重复品)从合并的血清样品手动分离RNA。使用“人miFinder 384HC miRNA PCR阵列”分析获得的洗脱液。量化的372个miRNA的平均Ct值和两种方法的平均值在一图中队彼此直接作图。结果示于图3。所获得的相关系数大于83％表明本发明的方法能够分离大多数的分析的miRNA，丰富以及罕见的目标，具有相当的效率。

实施例3：非质子性极性溶剂对miRNA分离的影响

为了分析非质子极性有机溶剂如何影响RNA分离，使用上述手动方法从合并的血清样品(6个献血者，收集管不含凝块活化剂)分离RNA。除了使用标准的沉淀缓冲液XP外，为比较还使用无DMSO且因此无非质子性极性有机溶剂的改性沉淀缓冲液。在结合混合物中使用不同的异丙醇(醇)浓度以及不同的DMSO浓度分析miRNA分离效率。使用miScript miRNAPCR阵列miRNA QC(MIHS-989Z)进行量化。

表2显示了不同的沉淀缓冲液的设定(W/O＝无)，示出沉淀混合物中DMSO浓度，也示出结合混合物中最终醇(异丙醇)和DMSO浓度：

图4示出结果。可以看到，为结合包括小RNA的RNA至固相，结合混合物中DMSO的存在没有发挥至关重要的作用，因为使用XP(w/o DMSO)和50％-55％异丙醇提供与使用结合混合物中XP(w/o DMSO)和45％异丙醇+10％DMSO(蛋白质沉淀步骤之后此处添加DMSO)本质相同的结果。这里，结合期间整体溶剂浓度显然是有关的。然而，出人意料的是，所得到的结果表明在沉淀步骤中已经存在非质子极性溶剂(这里：DMSO)是重要的，且显然这里对小RNA有稳定作用。从较低CT值可以看出，本发明的标准沉淀缓冲液XP(包括DMSO)比其他沉淀缓冲液(不含DMSO)提供显著更好的结果。此外，如采用缓冲液XP(w/o DMSO)45％异丙醇+10％DMSO所证实的，在沉淀步骤之后但在RNA结合之前DMSO的随后加入没有改善结果。不希望被理论束缚，除了沉淀过程中对miRNA施加稳定效果，在沉淀步骤中通过DMSO溶解包含miRNA的蛋白质复合物也是可能的，且因此，支持小RNA的释放，然后在后续结合步骤将其更有效地回收。这与以下观察一致：当使用本发明的方法时与在沉淀期间使用不含DMSO的方法相比，miR-191的Ct值显著降低(参照图4)。

实施例4：非质子性极性有机溶剂中对总RNA分离的影响

本发明的方法的旨在允许从一样品中分离小以及大RNA，例如以总RNA的形式。为分析较大RNA分子的分离效率，从细胞培养物分离总RNA。作为样品材料，使用在8毫升裂解缓冲液(RLT,QIAGEN)内裂解的4x10⁷Jurkat细胞(白血病细胞)的合并裂解物。从200μl裂解物(6个重复品)分离RNA。为了比较，还采用实施例3的不同的沉淀为基础的方法分离RNA。在所有情况下，使用含有二氧化硅柱(RNeasy小型柱)并采用50μl无RNA酶的水洗脱RNA。使用RNeasy型试剂盒(按手册)和miRNeasy血清/血浆试剂盒分离(QIAzol；根据手册)分离RNA作为对照。

使用分光光度测量(NanoDrop)分析获得的洗脱物的RNA含量。此外，用安捷伦生物分析仪和RNA 6000芯片分析单独的样本。安捷伦分析之前，以1:4稀释样本“RNeasy”、“QIAzol”和“XP”。沉淀缓冲液(“XP 50”、XP 55”和“XP 45+10”)中不含DMSO分离的样本的洗脱液不进行稀释被分析。

结果示于图5。从RNeasy分离获得的洗脱液表现出预期的18S和28S RNA之间的很好的比例。然而，≤200nt的小RNA在本质上从获得的洗脱液中缺失。使用基于QIAzol的miRNeasy分离方法获得的洗脱液显示出较低浓度的RNA，但是洗脱液除了含有大RNA也含有小RNA。采用本发明基于沉淀的方法获得的洗脱液，其中沉淀缓冲液(XP)中包含DMSO，包含类似于RNeasy方法显著量的18S和28S RNA(和因此大RNA)，此外还包含小RNA。宽28S峰的结构可能是归因于洗脱液DNA或可能是安捷伦芯片的测量假象。沉淀缓冲液中无DMSO制备的洗脱液包含显著少量的RNA，另外，缺乏大多数的大18S和28S RNA。这强调沉淀混合物包括非质子性极性有机溶剂的优点。

此外，使用RT²RNA QC PCR阵列分析每个设定的四个洗脱液。这个阵列尤其定量两种持家基因的mRNA以及可能存在的gDNA。为了更好地比较，图6和图7还示出使用Nanodrop测定的样品的RNA含量。

RNeasy方法和本发明沉淀为基础的方法(XP)的洗脱液中的mRNA含量(基于两个持家基因测定)是基本相同的，这清楚地表明，当使用本发明方法时与现有技术的方法相比mRNA在蛋白质沉淀步骤没有去除，但是能够被回收。与RNeasy制剂相比，使用本发明方法获得的洗脱液中的较高总含量的核酸归因于较高DNA含量，如“无RT对照”值所示。基于QIAzol的方法示出最低浓度的持家基因1。总核酸含量也是较低的。这通过安捷伦生物分析仪数据证实。如预期的，基于QIAzol的制剂中的基因组DNA的量最低。相比之下，采用无DMSO的沉淀缓冲液获得的三种RNA制剂示出更坏的结果(较高Ct值，低的总核酸浓度)。采用无DMSO的沉淀缓冲液，获得的Ct值如基于包含的核酸浓度预期的高2至3个Ct单位。根据核酸产量(200ng相比600ng)，预期最大差别将是约1.5Ct。这与安捷伦分析一起证明蛋白质沉淀步骤使用非质子极性有机溶剂如DMSO的优点。在沉淀步骤中使用非质子极性有机溶剂能从蛋白质消除上清液有效纯化大RNA。

实施例5：从组织样品分离miRNA

还使用本发明的方法从不同的组织样品分离RNA。为了这个目的，破坏大鼠脑和大鼠肝以提供分批裂解物。直接添加秀丽线虫(C.elegans)外加对照到批裂解物。使用miRNeasy小型试剂盒(根据手册)或本发明的沉淀为基础的方法从裂解物平行分离RNA。在QIAzol直接或在裂解缓冲液RLT+(包括β-巯基乙醇)采用TissueRuptor均质获得的裂解物。总体而言，每次制备处理约10mg的组织样品。因为预期高RNA含量，使用RNeasy小型离心柱代替RNeasy MinElute柱作为固相。使用50μl无RNA酶的水进行洗脱。各方法和组织类型制备6个重复品。此外，每种条件制备4个额外的重复品，其中进行额外的柱上DNA酶消化。随后使用qRT-PCR分析对每个条件的洗脱液进行分析。然而，从肝脏得到的洗脱液，由于高RNA含量事先用水稀释(1:10)。

结果示于图8。可以看到，使用已建立的基于QIAzol的方法或本发明的方法，在qRT-PCR分析用于分析的miRNA(miR-16、miR-21和miR-191)以及分析三种分析的snoRNA(SNORD61、SNORD95、SNORD96a)期间获得基本相同的Ct值。这表明两种方法获得相似的小RNA分离效率，即便处理不同的样本类型。观察到的外加对照线虫miR-39的分离效率的差异可能是归因于裂解物加入的外加对照的不同的稳定性。所执行的DNA酶消化仅在较小程度上助于执行的定量RT-PCR分析的质量。这可能是当实施DNA酶消化(2x350μl RWT缓冲液替代1X700μl RWT)时使用的改变的洗涤方案的结果，可能归因于柱上DNA酶消化步骤期间较长的柱停留时间。然而，通常可能执行DNA酶消化，但是，当使用miScript miRNA PCR系统实施qRT-PCR分析时，不是特别需要的。

实施例6：沉淀过程中使用的有机溶剂的作用

如上所述，例如DMSO的非质子性极性有机溶剂有助于本发明的分离方法中小和大RNA的稳定，其中分离RNA前沉淀出蛋白质。在实施例6中，证实当使用其他非质子性极性有机溶剂或质子有机溶剂如乙醇和异丙醇时同样也获得相应的结果。水用于比较测试。测试以下溶剂。

使用包含提及的不同的有机溶剂的不同沉淀缓冲液变体从细胞裂解物(1x10⁶Jurkat细胞/样本，在200μl RLT缓冲液中裂解)制备总核酸。在0.8％琼脂糖凝胶上分离所得洗脱液的1.5μl等份试样。结果示于图9。

可以看出，采用测试的非质子、极性有机溶剂，不仅小RNA而且大RNA可以从蛋白质消除的上清液成功分离。此外，高分子量的DNA可以分离。因此，测试的非质子极性有机溶剂能够从蛋白质消除的上清液分离小RNA，大RNA和如果希望，还分离基因组DNA。使用质子性有机溶剂，异丙醇和乙醇，同样地可以分离小以及大RNA(如从分离的rRNA可见)。因此，使用本发明的沉淀条件在蛋白质沉淀步骤中不导致大RNA丢失，但是采用现有技术的方法RNA丢失。然而，蛋白质沉淀步骤或随后的分离过程中，沉淀步骤中使用乙醇或异丙醇作为有机溶剂时高分子量的核酸如基因组DNA明显丢失。此外，使用水代替不会导致可接受的结果，因为28S和18S rRNA的产量显著降低。

由几个重复实验确认结果。另外，在洗脱液中检测不同的miRNA来分析小RNA产量。下表显示结果和两个重复品的标准偏差(std)：

STD

如上述结果和图10明显可见，实施例6证实上述观察，认为小RNA的分离不会受所主张的有机溶剂的存在负面影响。小RNA可以良好的产量成功回收。此外，使用非质子性极性有机溶剂时，miRNA产量甚至会提高。

然而，除了小RNA外，为分离大RNA，在蛋白质沉淀步骤强制存在主张的有机溶剂以防止蛋白质沉淀步骤中这些大RNA损失，从而确保它们能在随后RNA分离步骤从蛋白质消除的上清液被回收。另外，如研究结果表明，使用非质子性极性有机溶剂提供更好的结果，特别是对于较大的RNA的分离，以及高分子量的DNA。

实施例7：缓冲剂和pH值

沉淀缓冲液XP包括乙酸钠。乙酸钠可以起到两个重要功能。首先，乙酸盐化合物可提供pH缓冲效果。此外，一价的钠离子能够支持核酸的电荷的中和，因此，可以支持核酸结合到固相。第二个效果对于实际蛋白质沉淀步骤是不相关的。因此，测试乙酸钠是否可以由其他乙酸盐特别是二价乙酸镁进行替换。结果证明省略乙酸盐且因此的沉淀缓冲液的缓冲剂导致分离的核酸的谱图的显著差异。此外，沉淀步骤完成后随后加入乙酸钠也无法恢复原来的谱图。这支持这样的结论，即乙酸钠的主要效果是pH值的缓冲且这个缓冲是有利的从而提供良好的RNA分离结果。这通过附加实验进一步证实，其中表明代替乙酸钠其他缓冲剂已也可以作为替代方案，如柠檬酸盐缓冲液或哌嗪-1,4-双(丙烷磺酸)缓冲液(PIPPS)。这些替代缓冲剂同样允许分离高分子核酸，如图11所示。

无pH缓冲剂制备的样品示出蛋白质沉淀步骤后较高pH值(pH5.5)，如采用含缓冲剂的沉淀缓冲液(pH 4.3)制备的那些。此外，当从血清样本代替细胞裂解物分离RNA，在RNA结合步骤加入异丙醇后涡混样本。因此发现为了防止固相污染和/或堵塞，缓冲沉淀混合物的pH值以及因此的在沉淀步骤中是有利的，特别是如果复杂样本如血清被处理且如果使用柱时。此外，在随后实施的miScript miRNA分析中采用不含缓冲剂(参见“水”)的沉淀溶液制备的样本明显示出对反转录反应的更多抑制。结果示于图12(miRTC＝反转录对照；PPC＝阳性PCR对照)。

另外，在XP沉淀缓冲液中使用不同的pH值制备的miRNA的分析证实了上述观测。当处理富含蛋白质的复杂样品(此处为血清样本)，沉淀缓冲液的较低pH值防止在RNA结合步骤中加入醇后发生沉淀，从而支持防止所使用的柱的污染或堵塞。结果示于图13。

此外，对不同浓度的缓冲剂进行了测试。结果证实，可在很宽的浓度范围内使用该缓冲剂。使用标准沉淀缓冲XP(见上文)，其中，然而，醋酸钠浓度是变化的。对沉淀缓冲液XP中以下浓度的乙酸钠进行了测试：227mM、455mM、682mM、909mM、1136mM和1591mM(对应沉淀混合物中52mM、104mM、156mM、208mM、260mM和364mM乙酸钠)。下面两表显示来自两个重复品的不同miRNA的检测结果和标准偏差(std):

	52mM	104mM	156mM	208mM	260mM	364mM
							秀丽线虫miR-39	25.43	24.10	23.89	23.96	24.29	25.57
miR-16	29.28	23.11	23.07	23.38	23.69	24.75
							miR-21	30.42	25.98	25.50	25.95	26.14	27.18
miR-191	32.40	27.82	27.49	27.37	28.09	29.22
							miRTC	26.18	21.78	21.72	21.64	21.55	21.32
PPC	19.41	19.35	19.30	19.36	19.29	19.29

STD

	52mM	104mM	156mM	208mM	260mM	364mM
							秀丽线虫miR-39	0.694	0.298	0.181	0.527	0.501	0.635
miR-16	3.009	0.409	0.512	0.507	0.314	0.034
							miR-21	4.026	0.493	0.246	0.472	0.326	0.109
miR-191	0.808	0.384	0.810	0.522	0.169	0.647
							miRTC	2.094	0.091	0.050	0.060	0.201	0.139
PPC	0.107	0.099	0.080	0.089	0.126	0.041

特别优选的是在沉淀混合物中125mM-300mM或150mM-275mM的浓度。

实施例8：沉淀缓冲液中所用的金属阳离子

如上所述，在沉淀缓冲液中，锌用作沉淀蛋白质的功能。在人工设定中，在PBS中使用BSA(40克/升)作为血清替代品，使用三价铝离子代替锌可同样地沉淀蛋白质。二价钙或镁离子也沉淀出蛋白质，但是，只能在测试条件(pH值，浓度，溶剂)下慢慢沉淀，因此，与Zn²⁺和Al³⁺相比不合适。因此，根据一实施方式，不使用这种缓慢金属阳离子沉淀剂。锌是优选的。

实施例9：有机溶剂和金属阳离子沉淀剂的浓度范围

此外，对不同浓度的有机溶剂和金属阳离子(锌)进行分析。从细胞裂解物和血清样品中分离核酸。图14示出沉淀混合物中的各成分(包含样品，裂解缓冲液和沉淀缓冲XP)的浓度。

有机溶剂的浓度结果

如由图14证明的，为了有效分离大RNA，沉淀缓冲液中已有15％的DMSO(沉淀缓和物中终浓度是3.4％)是合适的。此外当沉淀缓冲液XP中使用30％DMSO(沉淀缓和物中终浓度是6.9％)时，高分子核酸如基因组DNA可以分离。因此，有机溶剂浓度的选择影响存在于上清液中且因此，可以被分离的核酸的类型。然而，沉淀缓冲液中使用较高浓度75％的DMSO(沉淀缓和物中终浓度是17.2％)降低大RNA的产量，而高分子DNA仍然可以从上清液中分离出来。甚至更高浓度的DMSO导致只有小RNA可以分离。然而，在这里，根据凝胶分析，小RNA的总产量也似乎减小(参见图14，25.6％的DMSO)。因此，根据本发明在沉淀混合物中使用的有机溶剂的浓度是很重要的，在沉淀混合物中优选的浓度范围位于3.4-15％之间。例如根据本发明使用包括15％-60％有机溶剂的沉淀缓冲液可以实现这些浓度。各自的浓度范围特别适合在去除沉淀后提供蛋白质消除的上清液，其包含小以及大RNA，然后可以从所述上清液将其分离。分离的miRNA的分析表明，DMSO是否存在或不存在，只要浓度不太高，同样良好分离小核酸。对于几种miRNA，如果有机溶剂存在，结果甚至被改进，如图4和14所证实。例如，如果存在DMSO(在沉淀混合物中至少3.4％的最终浓度)，可以更有效分离miR-191。为了能够分离大RNA，有机溶剂是非常重要的，如本文所证实。如果不存在有机溶剂，或如果浓度太高且因此在主张的范围之外，大RNA不存在，或仅以低量存在于上清液中。

沉淀剂氯化锌的结果

结果示于图14和图16。在沉淀剂氯化锌的情况下，最小测试量的氯化锌(沉淀缓冲液中0.212M，对应于沉淀混合物中48mM的终浓度)足以沉淀蛋白质。沉淀缓冲液中至多2.55M氯化锌浓度(在沉淀混合物中终浓度582mM)同样适用于从细胞裂解物提供总核酸制剂。当使用高得多的浓度(沉淀缓冲液XP中3.18M，其对应于沉淀混合物中728mM的最终浓度)，高分子酸的分离被干扰，如从图14明显可见。关于从血清分离miRNA，表明沉淀缓冲液中0.212M和0.63M氯化锌浓度(最终浓度分别为48mM，145mM)作为测试的较高浓度未能助于有效分离miRNA。因此优选的金属盐粒子沉淀剂的范围是例如，沉淀混合物中290-580mM。这可以通过使用包含例如1.27-2.55M氯化锌的沉淀缓冲液获得。

实施例10：破坏试剂的添加

在实施例10中，测试对于复杂样品如血清样品在制备沉淀混合物之前且因此在添加沉淀缓冲液之前破碎样品是否是关键的。作为参考，采用上述标准程序。首先，加入120μl破坏试剂(裂解缓冲液RLT+)至血清样品，孵育然后加入95μl XP缓冲液。在该标准方法的变化方法中，95μl XP-缓冲液与120μl RLT+混合，然后各混合物加入至血清样本。因此，在本实施方式中，在同一时间发生沉淀混合物的制备和样品的破坏。结果示于随后的表中：

STD

可以看到，裂解缓冲液在制备沉淀混合物之前或期间加入基本上没有影响。因此，在加入沉淀缓冲液之前首先破坏样本不是强制性的。然而，发现在沉淀过程中存在破坏试剂，优选离液盐是有利的。

实施例11：采用破坏试剂裂解的样品的沉淀

为了在不同更高离液剂浓度的存在下测试沉淀，通过在1％β-巯基乙醇存在下，在包含5.8M GTC、30mM柠檬酸钠的pH5.0的5毫升裂解缓冲液中裂解800mg的组织，从大鼠肝组织制备一批裂解物。均质裂解物并通过QIAshredder过滤以去除残留的固体颗粒。为在沉淀期间改变离液盐(GTC)的浓度，接着将获得的裂解物用不同量的稀释缓冲液(30mM柠檬酸钠,pH 5.0)和用裂解缓冲液稀释，稀释缓冲液具有与裂解缓冲液相同组成但缺乏离液剂。使用的裂解物、稀释缓冲液和裂解缓冲液的量示于下表。该表还显示获得的稀释裂解物中离液剂浓度和沉淀混合物中存在的最终离液盐的浓度。

体积一批裂解物(μl)	67.2	67.2	67.2	67.2
					体积稀释缓冲液(μl)	31.0	64.7	98.3	131.9
体积裂解缓冲液(μl)	201.7	168.1	134.5	100.9
					稀释物中GTC浓度(M)	5.20	4.55	3.90	3.25
沉淀混合物中GTC浓度(M)	4.0	3.5	3.0	2.5

然后将沉淀缓冲液XP或具有相同组成但含有质子性溶剂乙醇代替DMSO的沉淀缓冲液与稀释裂解物(300μl)混合。沉淀后，将样品离心并从所得上清液中分离核酸。为此，将上清液与等体积(340μl)异丙醇混合。将该混合物施加在RNeasy柱上。核酸被结合后，用700μl缓冲液RW1洗涤柱，随后用700μl RPE洗涤两次并用50μl水洗脱。接着将核酸在凝胶上分离。

结果

图17示出得到的结果。使用质子(乙醇，左凝胶)和非质子(DMSO，右凝胶)有机溶剂。M＝标记；为各泳道示出沉淀混合物中离液盐的浓度(范围从4.0至2.5M)。结果证明包括大RNA的大核酸可在一定范围的离液剂浓度上和在质子和非质子有机溶剂的存在下进行分离。测试的示例性范围4.0-2.5M取得了良好的效果。

实施例12：非质子和质子性有机溶剂的浓度范围

此外，进一步分析有机溶剂的浓度。DMSO和EtOH分别用作示例性非质子和质子溶剂。分离核酸并跑胶以分离包含在洗脱液中的核酸，其中采用基于沉淀的方法使用包含不同浓度DMSO或乙醇的沉淀缓冲液获得洗脱液。

结果

结果示于图18。图中显示DMSO(上图)和EtOH(下图)的结果。M＝标记；各泳道的百分值示出沉淀混合物中DMSO或EtOH百分比。如由图18证明，沉淀混合物中2％的非质子或质子性有机溶剂的最终浓度已经适合有效地分离大RNA。使用稍高浓度3％DMSO或乙醇也证实该发现。高分子核酸如基因组DNA也可以在进一步测试浓度分离，从而确认实施例9的发现，基因组DNA可在6.9％的最终有机溶剂浓度下分离。当使用14％的相对较高的有机溶剂浓度时，大RNA仍然可以从洗脱液回收。

因此，如2％这么低的非质子或质子性有机溶剂的浓度适合在去除沉淀后提供蛋白质消除的上清液，其仍包含大核酸，其除了小RNA还包括大RNA。因此小和大RNA可以从上清液分离。本实施例证实大RNA也可以在本文所定义范围内的较高有机溶剂浓度下进行分离，例如14％，只要浓度不太高(参见以上实施例9)。此外，实施例证实质子和非质子有机溶剂适合用于在蛋白质沉淀期间稳定大核酸。

实施例13：使用不同酸性pH值的沉淀缓冲液分离大核酸

在1％β-巯基乙醇存在下，通过在包含2.78M GTC、20mM柠檬酸钠的pH5.0的6ml裂解缓冲液中裂解400mg组织从大鼠肝组织制备一批裂解物。均质裂解物并通过QIAshredder过滤以去除残留的固体颗粒。通过用乙酸调节pH制备具有不同pH值的XP-缓冲液。

对于每个要测试的pH值，300μl裂解物与90μl各XP-缓冲液组合。通过离心除去沉淀物，上层清液(约360μl)与440μl异丙醇合并从而得到55％的最终异丙醇浓度。将混合物施加到RNeasy柱。离心后，采用700μl缓冲液RW1洗涤柱一次，接着采用700μl RPE洗涤两次并用50μl H₂O洗脱。检测分离的核酸的浓度和纯度。

结果

不同的测试pH值3.30-4.75的结果示于下表：

	浓度[ng/μl]	260/280	260/230
				pH 4.75	1197.0	1.97	2.12
pH 4.50	1143.0	1.93	2.17
				pH 4.30	1198.5	2.01	1.82
pH 3.30	1296.5	2.00	2.14

这些结果再次表明，在使用不同的酸性pH值的沉淀缓冲液进行蛋白质沉淀之后可以以良好的产量从上清液分离大RNA。

实施例14：使用不同pH值的沉淀缓冲液分离小RNA

在进一步的实验中，使用如标准方案中描述的沉淀缓冲液XP从血清样品中分离RNA。采用乙酸调节沉淀缓冲液的pH值以得到不同酸性pH值的缓冲液。

结果

为额外的pH值确认实施例7的结果。pH值范围为3.3至4.75，即便在复杂的富含蛋白质的血清样品中，在RNA结合步骤中加入异丙醇后还能避免浑浊是可能的。柱的污染和堵塞被避免。以良好产量分离miRNA；使用miScript测试的miRNA的分析结果示于图19(miRTC＝反转录对照；PPC＝PCR阳性对照)。

Claims (20)

1.一种从样本分离核酸的无酚方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到所述样品以制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中所述沉淀混合物

i)包括所述金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的所述有机溶剂；

ⅲ)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；

b)分离上清液与沉淀物，其中所述上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从所述上清液分离核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀混合物包括2％-15％浓度的有机溶剂，且其中所述有机溶剂是水混溶性的。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，待分离的所述核酸是RNA，且其中步骤c)包括从所述上清液分离至少小和/或大RNA。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤c)包括：

aa)加入至少一种醇至所述上清液从而提供结合混合物，其包含浓度≥35％，或≥40％的醇；

bb)将包含在结合混合物中的总RNA结合至含硅核酸结合固相，其中在步骤bb)后，至少大和小RNA结合至所述固相；

cc)任选地洗涤结合的RNA；和

dd)从所述固相洗脱RNA。

5.如权利要求1-4中一或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有一个或多个以下特征：

i)所述金属阳离子沉淀剂为Zn²⁺或Al³⁺，优选为Zn²⁺；和/或

ii)以溶液形式添加所述金属阳离子沉淀剂，且其中步骤a)提供的所述沉淀混合物包括所述金属阳离子沉淀剂，浓度选自：200mM-675mM、250mM-650mM、300mM-625mM、350mM-600mM或400mM-550mM；和/或

iii)以溶液形式添加所述金属阳离子沉淀剂，其包含所述金属阳离子沉淀剂的溶解盐。

6.如权利要求1-5中一或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有一个或多个以下特征：

i)步骤a)提供的所述沉淀混合物包括所述有机溶剂，浓度选自3％-15％、5％-14.5％、6％-14％、7％-13.5％、8％-13％、9％-12.5％或9.5％-12％；

ii)所述有机溶剂是非质子极性溶剂；

iii)所述有机溶剂是选自下组的非质子极性溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、乙腈、四氢呋喃(THF)、二氧六环、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲基甲酰胺(DMF)；

iv)所述有机溶剂是质子溶剂，其是醇；和/或

v)所述有机溶剂是质子溶剂，其是水混溶性的醇，优选选自乙醇和异丙醇。

7.如权利要求1-6中一或多项所述的方法，其特征在于，沉淀期间所述pH值≤5.5、≤5.25、≤5、≤4.75、≤4.5或≤4.4。

8.如权利要求1-7中一或多项所述的方法，其特征在于，步骤a)包括加入沉淀缓冲液至所述样本，其中所述沉淀缓冲液包括所述金属阳离子沉淀剂、所述有机溶剂和所述缓冲剂。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述沉淀缓冲液具有一个或多个以下特征：

i)它包括浓度选自下组的所述金属阳离子沉淀剂：0.75M-3M、1M-2.8M、1.25M-2.7M、1.5M-2.6M或1.7M-2.5M；

ii)它包括浓度选自下组的所述有机溶剂：13％-65％、20％-63％、25％-62.5％、30％-60％、33％-57.5％、37.5％-55％或40％-52.5％；和/或

iii)它具有选自下组的pH值：3-5、3.25-4.75、3.5-4.5或3.75-4.4。

10.如权利要求1-9中一或多项所述的方法，其特征在于，待分离的所述核酸是RNA，且其中在步骤c)，使用核酸结合固相分离RNA，且其中使用至少一种醇和/或至少一种离液盐从而建立RNA结合条件。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤c)包括加入至少一种醇至所述上清液从而建立RNA结合条件，且其中在步骤c)加入的所述醇具有一个或多个以下特征：

i)它是具有1-5个碳原子的支链或直链脂肪醇；

ii)它选自：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇以及它们的混合物；

iii)它选自：异丙醇和乙醇；和/或

iv)它是异丙醇。

12.如权利要求1-11中一或多项所述的方法，其特征在于，所述样本被破坏，且其中当制备所述沉淀混合物时，在加入所述金属阳离子沉淀剂和所述有机溶剂之前和/或在同时/阶段发生样本破坏。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

x)破坏所述样品；

a)制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到破坏的样品从而制备沉淀混合物，其

i)包括所述金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的所述有机溶剂；

iii)包括缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；

b)分离上清液与沉淀物，其中所述上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离核酸；

或其中所述方法包括：

a)制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，通过加入至少一种破坏试剂、至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到样品以破坏该样品并制备沉淀混合物，其

i)包括所述金属阳离子沉淀剂；

ii)包括15％或以下浓度的所述有机溶剂；

iii)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值；和

v)包括所述破坏试剂；

b)分离上清液与沉淀物，其中所述上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离核酸。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述沉淀混合物包括浓度为2％-15％的所述有机溶剂，且其中所述有机溶剂是水混溶性的。

15.如权利要求1-14中一或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有一个或多个以下特征：

i)从所述上清液分离总RNA；

ii)以浓缩组分的形式分离小RNA；

iii)包含小RNA和大RNA的上清液还包括基因组DNA；

iv)从所述上清液分离总核酸；

v)从所述上清液分别分离基因组DNA与RNA；和/或

vi)在步骤c)，RNA结合至核酸结合固相，其是含硅材料如二氧化硅、聚硅酸材料、硼硅酸盐、硅酸盐或玻璃。

16.如权利要求1-15中一或多项所述的方法，其特征在于，为分离RNA，所述方法包括以下步骤：

x)破坏所述样品；

a)通过加入至少一种金属阳离子沉淀剂和选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂到破坏的样品来制备沉淀混合物并沉淀蛋白质，其中在使用质子溶剂的情况下，所述质子溶剂是水混溶性的醇，且其中所述沉淀混合物

i)包括浓度选自下组的所述金属阳离子沉淀剂：300mM-625mM、350mM-600mM或400mM-550mM；

ii)包括浓度选自下组的所述有机溶剂：6.5％-14.5％、7％-14％、8％-13.5％、9％-13％或9.5％-12％；

iii)包括至少一种缓冲剂；和

iv)具有酸性pH值，范围为3-5.25、3-5、3.25-4.75、3.5-4.5或3.75-4.4；

b)分离上清液与沉淀物，其中所述上清液包括长度小于200nt的小RNA和至少1000nt长度的大RNA，和

c)从上清液分离至少小和大RNA，其中步骤c)包括：

aa)加入至少一种醇至所述上清液从而提供结合混合物，其包含浓度≥40％，≥45％或≥50％的醇；

bb)将包含在结合混合物中的总RNA结合至含硅核酸结合固相，其中在步骤bb)后，至少大和小RNA结合至所述固相；

cc)任选地洗涤结合的RNA；和

dd)从所述固相洗脱RNA。

17.一种用于沉淀蛋白质的沉淀缓冲液，包括：

a)至少一种金属阳离子沉淀剂；

b)选自非质子极性溶剂和质子溶剂的至少一种有机溶剂；和

c)至少一种缓冲剂；

其中所述沉淀缓冲液的pH值为3-5.5。

18.如权利要求17所述的沉淀缓冲液，其特征在于，所述有机溶剂是水混溶性的，且其中所述沉淀缓冲液适合在权利要求1所述的方法中用作沉淀缓冲液。

19.如权利要求17或18所述的沉淀缓冲液，其特征在于，所述沉淀缓冲液具有一个或多个以下特征：

i)所述金属阳离子沉淀剂选自Zn²⁺和Al³⁺，且优选是Zn²⁺；

ii)所述有机溶剂是选自下组的非质子极性溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、乙腈、四氢呋喃(THF)、1,4二氧六环、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲基甲酰胺(DMF)；

iii)所述有机溶剂为质子溶剂，其是醇，优选是水混溶性的醇，如乙醇或异丙醇；

iv)所述缓冲剂为或衍生自羧酸或磷酸盐。

20.如权利要求17-19中一或多项所述的沉淀缓冲液，其特征在于，所述沉淀缓冲液具有一个或多个以下特征：

i)它包括浓度选自下组的所述金属阳离子沉淀剂：0.75M-3M、1M-2.8M、1.25M-2.7M、1.5M-2.6M或1.7M-2.5M；

ii)它包括浓度选自下组的所述有机溶剂：13％-65％、20％-63％、25％-62.5％、30％-60％、33％-57.5％、37.5％-55％或40％-52.5％；

iii)它的pH值选自3-5、3.25-4.75或3.4-4.5；

iv)它包括浓度选自下组的所述缓冲剂：300mM-2M、400mM-1.75M、450mM-1.5M、500mM-1.4M、550mM-1.3M和600mM-1.25M

和/或

v)它

aa)包括浓度选自下组的溶解盐形式的Zn²⁺或Al³⁺，优选Zn²⁺作为金属阳离子沉淀剂：1.25M-2.8M、1.5M-2.6M或1.7M-2.5M；

bb)包括浓度选自下组的非质子极性有机溶剂或质子溶剂：13％-65％、20％-63％、25％-62.5％、30％-60％、33％-57.5％、37.5％-55％或40％-52.5％；和

cc)具有的pH值为3.25-4.75或3.4-4.5。