CN111004798A - 一种高效提取MicroRNA的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效提取MicroRNA的方法，包括如下步骤：（1）向经裂解后的样本中加入含有金属阳离子的第一杂质去除液以及第二杂质去除液，所述第二杂质去除液为水混溶性醇；（2）沉淀杂质，离心分离后取含有MicroRNA的上清液；（3）从含有MicroRNA的上清液中分离MicroRNA。本发明耗时短，步骤简单，提取效率高。

Description

一种高效提取MicroRNA的方法
技术领域
本发明涉及RNA提取技术领域，特别涉及一种高效提取MicroRNA的方法。
背景技术
微小核糖核酸（MicroRNA）是一种大小为22nt左右的非编码单链RNA，其主要功能是参与基因表达与调控。它在组织和血液中都存在，并且MicroRNA有着高度的稳定性。MicroRNA已被证明跟疾病的发生有相关性，特别是在肿瘤发生过程中起到至关重要的作用，是一种潜在的疾病监测标志物。但MicroRNA大小为22nt左右，提取一直是一个较大的难题，步骤越多，提取效率一般越低下，在吸附时，往往会优先吸附长链RNA，导致MicroRNA等短链RNA流失，所以目前MicroRNA提取效率不高。因此，提供一种高效简便提取MicroRNA的方法就显得非常重要。
目前市场上专门用于提取MicroRNA的方法主要是通过Trizol溶液裂解细胞，再通过氯仿对溶液进行分层去除蛋白质，往核酸溶液中加醇进行长链核酸的沉淀，过柱吸附长链核酸，再添加醇提高醇浓度，沉淀MicroRNA，再过柱吸附，洗涤后分离。如以提取总RNA的方式提取MicroRNA，则提取效率不高，因为不管啥分离方式，MicroRNA往往会先损失。另外专门提取MicroRNA的方式则过程过于繁琐，耗时较长，容易造成MicroRNA降解。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效提取MicroRNA的方法，耗时短，步骤简单，提取效率高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种高效提取MicroRNA的方法，包括如下步骤：
（1）向经裂解后的样本中加入含有金属阳离子的第一杂质去除液以及第二杂质去除液，所述第二杂质去除液为水混溶性醇；
（2）沉淀杂质，离心分离后取含有MicroRNA的上清液；
（3）从含有MicroRNA的上清液中分离MicroRNA。
样本裂解具体操作为：取100-400μL样本，加入60-240μL的裂解液，涡旋震荡3-10S后，室温静置2-5min。
加第一杂质去除液和第二杂质去除液是同时进行的，而无需在其中进行离心或洗涤。
所述金属阳离子包括Zn2+、Al3+中的一种或几种。金属阳离子的提供源为氯化锌、硫酸锌、氯化铝等。
所述第一杂质去除液的中各组分配比如下：0.7-1.2M金属阳离子，30%-60% 二甲基亚砜，0.4-1M乙酸钠，2%-5%醋酸。
所述第二杂质去除液的用量为经裂解后的样本和第一杂质去除液总体积的15%-35%，所述水混溶性醇选自乙醇、异丙醇中的一种或几种。
所述第一杂质去除液的用量为样本体积的0.5-2倍。
用于样本裂解的裂解液种各组分配比如下：3-8M盐酸胍，3%-12%表面活性剂；所述表面活性剂选自SDS、辛苯昔醇、NP-40、Tween 20中的一种或几种。裂解液的作用不止是裂解细胞，MicroRNA是和蛋白结合在一起的，裂解液也能裂解，释放出MicroRNA，比如裂解血清。
从含有MicroRNA的上清液中分离MicroRNA 具体步骤如下：将异丙醇与含有MicroRNA的上清液等体积混合，加入无RNA酶的吸附柱中，离心，弃去液体，然后漂洗，最后，离心后换收集管，加入RNase-free水，离心并收集液体以获得MicroRNA。
所述漂洗过程如下：
一次漂洗：加入第一漂洗液，离心，倒掉液体；
二次漂洗：加入第二漂洗液，离心，倒掉液体；
三次漂洗：加入第二漂洗液，离心，倒掉液体；
所述第一漂洗液为浓度2-5M的盐酸胍水溶液，所述第二漂洗液为质量浓度70%-90%乙醇。
漂洗的作用是除掉胍盐残留等。
所述样本包括血清样本、血浆样本、尿液样本、唾液样本。
具体操作步骤如下：
A、样本的裂解：取100-400μL样本，加入60-240μL的裂解液，涡旋震荡3-10S后，室温静置2-5min；
B、杂质的去除：向步骤A处理后的样本中加50-200μL 第一杂质去除液，接着加入第二杂质去除液，涡旋震荡10-30S，冰上静置2-5min；将样本离心，取上清液转移至新的离心管；
C、MicroRNA分离：向步骤B所得上清液中加入等体积的异丙醇，涡旋震荡3-10S后，加入到RNase-free吸附柱中，离心，倒掉液体，然后进行漂洗，所述漂洗过程如下：
一次漂洗：加入500-1000μL第一漂洗液，离心，倒掉液体；
二次漂洗：加入300-700μL第二漂洗液，离心，倒掉液体；
三次漂洗：加入300-700μL 第二漂洗液，离心，倒掉液体；
最后，离心后换收集管，加入25-50μL RNase-free水，离心，收集液体即得MicroRNA。
本发明通过胍盐裂解，利用金属阳离子和水混溶性醇同时沉淀蛋白和长链核酸，用硅基质膜吸附柱吸附MicroRNA，同时利用低浓度胍盐和高浓度乙醇洗去杂质。常规的MicroRNA提取方法均分多步完成对蛋白和长链核酸的去除，步骤多，耗时长，MicroRNA又较小，每个步骤均会有不同程度的损耗，MicroRNA也会随时间的延长发生降解，本方法步骤简单，主要分为三步，而且耗时短，仅需30min左右即可完成对样本的提取，可以大幅度提高MicroRNA的提取效率。
本发明的有益效果是：能同时沉淀蛋白质和长链核酸，达到快速高效提取MicroRNA的目的，本方法仅需30min左右即可完成MicroRNA的提取。
附图说明
图1显示的是沉淀体系中添加不同浓度异丙醇提取血清样本后，样本检测MicroRNA的荧光定量RT-PCR的结果，检测基因为人血清中3个管家基因，分别是miR-484、let-7a、miR-16。
图2显示的是使用本发明方法提取血清样本和使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（QIAGEN）提取血清样本后，按荧光定量RT-PCR法检测12种MicroRNA的结果比较。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：血清样本的MicroRNA提取
（1）样本的裂解：取200ul血清样本，加入120ul的裂解液（Buffer A），涡旋震荡5S后，室温静置3min。
（2）蛋白质以及长链核酸等杂质的去除：向样本中加100ul第一杂质去除液（Buffer B），100ul的第二杂质去除液（Buffer C），涡旋震荡20S，冰上静置3min。将样本12000g离心3min，取上清液400ul转移至新的1.5ml离心管。
（3）MicroRNA分离：向上清液中加入400ul的异丙醇，涡旋震荡5S，将样本加入到RNase-free吸附柱中，12000g离心15S，倒掉液体，加入700ul第一漂洗液（Buffer D），12000g离心15S，倒掉液体，加入500ul 80%乙醇（第二漂洗液），12000g离心15S，倒掉液体，加入500ul 80%乙醇，12000g离心15S，倒掉液体，18000g离心5min后换收集管，加入25ulRNase-free水，18000g离心1min，收集液体。
实施例2：尿液样本的MicroRNA提取
（1）样本的裂解：取200ul尿液样本，加入120ul的裂解液（Buffer A），涡旋震荡5S后，室温静置3min。
（2）蛋白质以及长链核酸等杂质的去除：向样本中加100ul第一杂质去除液（Buffer B），100ul的第二杂质去除液（Buffer C），涡旋震荡20S，冰上静置3min。将样本12000g离心3min，取上清液400ul转移至新的1.5ml离心管。
（3）MicroRNA分离：向上清液中加入400ul的异丙醇，涡旋震荡5S，将样本加入到RNase-free吸附柱中，12000g离心15S，倒掉液体，加入700ul第一漂洗液（Buffer D），12000g离心15S，倒掉液体，加入500ul 80%乙醇，12000g离心15S，倒掉液体，加入500ul 80%乙醇，12000g离心15S，倒掉液体，18000g离心5min后换收集管，加入25ul RNase-free水，18000g离心1min，收集液体。
实施例1-2中Buffer A- Buffer D的配比为：
Buffer A：3.5M盐酸胍，9.5%辛苯昔醇，水余量；
Buffer B：0.9M氯化锌，45% 二甲基亚砜（DMSO），0.6M乙酸钠，3%醋酸，水余量；
Buffer C：异丙醇；
RNase-free吸附柱为硅基质膜吸附柱；
Buffer D：3.3M盐酸胍，水余量。
下表为样本实施例1-2提取的MicroRNA的OD（260:280）值：
混合人血清 人尿液样本
OD（260:280） 1.91 1.92
从上表可知，利用本方法提取样本MicroRNA耗时仅30min，能较快完成MicroRNA的提取，从OD（260:280）比值看，说明本方法提取的MicroRNA具有较高的纯度。
试验一：配制沉淀体系时，体系中Buffer C不同浓度对提取MicroRNA的影响，具体步骤如下：
（1）样本的裂解：取200ul血清样本，加入120ul的Buffer A，涡旋震荡5S后，室温静置3min。
（2）蛋白质以及长链核酸等杂质的去除：向样本中加100ul Buffer B，分别加总体系体积0%（0ul）、15%（63 ul）、25%（105 ul）、35%（147 ul）、45%（189 ul）的Buffer C ，涡旋震荡20S，冰上静置3min。将样本12000g离心3min，将上清液转移至新的1.5ml离心管。
（3）MicroRNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，涡旋震荡5S，将样本加入到RNase-free吸附柱中，12000g离心15S，倒掉液体，加入700ul Buffer D，12000g离心15S，倒掉液体，加入500ul 80%乙醇，12000g离心15S，倒掉液体，加入500ul 80%乙醇，12000g离心15S，倒掉液体，18000g离心5min后换收集管，加入25ul RNase-free水，18000g离心1min，收集液体。
图1显示的是添加不同量Buffer C提取血清样本MicroRNA的荧光定量RT-PCR的结果，检测MicroRNA为在人血清中稳定存在的管家基因，分别是miR-484、let-7a、miR-16。
Buffer A- Buffer D的配比为：
Buffer A：3.5M盐酸胍，9.5%辛苯昔醇，水余量；
Buffer B：0.9M氯化锌，45% 二甲基亚砜（DMSO），0.6M乙酸钠，3%醋酸，水余量；
Buffer C：异丙醇；
RNase-free吸附柱为硅基质膜吸附柱；
Buffer D：3.3M盐酸胍，水余量。
从结果看出，随着体系中异丙醇浓度的增加，提取效率会变好，浓度为25%时提取效率最优，继续增加浓度后提取效率会变差。
本发明与miRNeasy Serum/Plasma Kit（QIAGEN）提取效果比较
按实施例1提取血清样本200ul作为实验组，使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（QIAGEN）提取血清样本200ul作为对照组，提取方法参照说明书。分别使用荧光定量RT-PCR法检测12种MicroRNA的CT值，检测结果为图2，从结果看出，部分MicroRNA提取效率等效，但实验组中某些基因提取效率会更高；耗时对比，实验组与对照组相比，提取一个样本能快约15min左右，随着样本量的增加，时差会变大，能快15-20min。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）向经裂解后的样本中加入含有金属阳离子的第一杂质去除液以及第二杂质去除液，所述第二杂质去除液为水混溶性醇；
（2）沉淀杂质，离心分离后取含有MicroRNA的上清液；
（3）从含有MicroRNA的上清液中分离MicroRNA。
2.根据权利要求1所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于：所述金属阳离子包括Zn2+、Al3+中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于：所述第一杂质去除液的中各组分配比如下：0.7-1.2M金属阳离子，30%-60% 二甲基亚砜，0.4-1M乙酸钠，2%-5%醋酸。
4.根据权利要求1所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于：所述第二杂质去除液的用量为经裂解后的样本和第一杂质去除液总体积的15%-35%，所述水混溶性醇选自乙醇、异丙醇中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于：所述第一杂质去除液的用量为样本体积的0.5-2倍。
6.根据权利要求1所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于：用于样本裂解的裂解液种各组分配比如下：3-8M盐酸胍，3%-12%表面活性剂；所述表面活性剂选自SDS、辛苯昔醇、NP-40、Tween 20中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于：从含有MicroRNA的上清液中分离MicroRNA 具体步骤如下：将异丙醇与含有MicroRNA的上清液等体积混合，加入无RNA酶的吸附柱中，离心，弃去液体，然后漂洗，最后，离心后换收集管，加入RNase-free水，离心并收集液体以获得MicroRNA。
8.根据权利要求7所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于：
所述漂洗过程如下：
一次漂洗：加入第一漂洗液，离心，倒掉液体；
二次漂洗：加入第二漂洗液，离心，倒掉液体；
三次漂洗：加入第二漂洗液，离心，倒掉液体；
所述第一漂洗液为浓度2-5M的盐酸胍水溶液，所述第二漂洗液为质量浓度70%-90%乙醇。
9.根据权利要求1所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于：所述样本包括血清样本、血浆样本、尿液样本、唾液样本。
10.根据权利要求1所述的一种高效提取MicroRNA的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
A、样本的裂解：取100-400μL样本，加入60-240μL的裂解液，涡旋震荡3-10S后，室温静置2-5min；
B、杂质的去除：向步骤A处理后的样本中加50-200μL 第一杂质去除液，接着加入第二杂质去除液，涡旋震荡10-30S，冰上静置2-5min；将样本离心，取上清液转移至新的离心管；
C、MicroRNA分离：向步骤B所得上清液中加入等体积的异丙醇，涡旋震荡3-10S后，加入到RNase-free吸附柱中，离心，倒掉液体，然后进行漂洗，所述漂洗过程如下：
一次漂洗：加入500-1000μL第一漂洗液，离心，倒掉液体；
二次漂洗：加入300-700μL第二漂洗液，离心，倒掉液体；
三次漂洗：加入300-700μL 第二漂洗液，离心，倒掉液体；
最后，离心后换收集管，加入25-50μL RNase-free水，离心，收集液体即得MicroRNA。
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