CN116135975A - 一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法。本发明提供了一种用于核酸提取纯化的试剂，包括细胞裂解液、消化酶、结合液、漂洗液和洗脱液；其中，所述结合液中含有醇溶液(如无水乙醇)和钾盐(如乙酸钾)。与市场上现有同类试剂盒相比本发明试剂盒中的结合液除了无水乙醇外还加入了乙酸钾试剂，该试剂的加入可使DNA提取物高效率选择性吸附于离心柱硅基质膜，所得核酸的得率和纯度显著提高。本发明的试剂/试剂盒组成简单，成本低廉，且操作方法简便，便于进行大规模核酸提取操作，另外，本发明试剂盒中不含甲苯、二甲苯、酚、氯仿等有毒有害试剂，对环境和操作人员的危害较小，更符合现代化环保理念。

Description

一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法。
背景技术
核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本。目前已知的酚氯仿法、吸附柱法、磁珠法等现有DNA提取方法中可用于血液DNA提取。其中，酚氯仿法由于在提取过程中使用了有毒有害的有机溶剂，具有核酸质量不佳、操作步骤繁琐、耗时较长的缺陷。目前主要的核酸提取方法包括硅胶膜吸附柱法和磁珠法。柱法提取能获得高纯度核酸，但是提取步骤繁琐，需多次离心，整个流程耗时长。磁珠法提取结合自动化提取仪器，相较于柱法提取，能大幅缩短提取时间，但是多样本同时操作存在交叉污染的风险，提取仪器及试剂的成本也比较高。
现在医学实验室中广泛采用分子诊断学的主要瓶颈是要求从样品中纯化核酸，尤其是疾病(癌症)治疗手术中的检测，因此，急需研发安全、简便、快速、质量高的核酸提取方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法。
第一方面，本发明要求保护一种用于核酸提取纯化的试剂。
本发明所要求保护的用于核酸提取纯化的试剂，包括细胞裂解液、消化酶、结合液、漂洗液和洗脱液；其中，所述结合液中含有醇溶液和钾盐。
进一步地，所述醇溶液为无水乙醇或异丙醇。
进一步地，所述钾盐为乙酸钾、硫酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。
在本发明的具体实施方式中，所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.1-0.5％；所述结合液的pH为6.0-8.0。
具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.1％；所述结合液的pH为6.0。在本发明的第二个实施案例中，所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.3％；所述结合液的pH为7.0。在本发明的第三个实施案例中，所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.5％；所述结合液的pH为8.0。
进一步地，所述裂解液中可含有Tris-HCl、胍盐、EDTA、非离子表面活性剂和NaCl，pH值为5.0-8.0。
进一步地，所述漂洗液由漂洗液A1和漂洗液A2组成；所述漂洗液A1中可含有盐酸胍和无水乙醇，pH值为6.0-8.0；所述漂洗液A2中可含有KAC、Tris-HCl和无水乙醇，pH值为7.0-9.0。
进一步地，所述洗脱液中可含有Tris-HCl，pH值为7.0-9.0。
在本发明的具体实施方式中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.5-3.0mol/L胍盐、0.05-0.3mol/L EDTA、体积百分比为3-10％(如3.2-10％)的非离子表面活性剂、0.5-3mol/L NaCl，0.05-0.3mol/L Tris-HCl。各浓度为在所述裂解液中的终浓度。
具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.5mol/L胍盐(盐酸胍)、0.05mol/L EDTA、体积百分比为3.2％的非离子表面活性剂(0.1％曲拉通100、3％吐温20、0.1％ NP40)、0.5mol/L NaCl、0.05mol/L Tris-HCl；所述裂解液的pH为5.0。在本发明的第二个实施案例中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：1.5mol/L胍盐(盐酸胍)、0.15mol/L EDTA、体积百分比为7％的非离子表面活性剂(0.5％曲拉通100、6％吐温20、0.5％ NP40)、1.5mol/L NaCl、0.15mol/L Tris-HCl；所述裂解液的pH为6.5。在本发明的第三个实施案例中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：3.0mol/L胍盐(盐酸胍)、0.3mol/L EDTA、体积百分比为10％的非离子表面活性剂(1％曲拉通100、8％吐温20、1％ NP40)、3mol/LNaCl、0.3mol/L Tris-HCl；所述裂解液的pH为8.0。上述各浓度为在所述裂解液中的终浓度。
在本发明的具体实施方式中，所述漂洗液A1的溶剂为水，溶质及浓度如下：
1-8mol/L盐酸胍，体积百分比为60％-80％的无水乙醇。各浓度为在所述漂洗液A1中的终浓度。
具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述漂洗液A1的溶剂为水，溶质及浓度如下：1mol/L盐酸胍，体积百分比为60％的无水乙醇；所述漂洗液A1的pH为6.0。在本发明的第二个实施案例中，所述漂洗液A1的溶剂为水，溶质及浓度如下：4mol/L盐酸胍，体积百分比为70％的无水乙醇；所述漂洗液A1的pH为7.0。在本发明的第三个实施案例中，所述漂洗液A1的溶剂为水，溶质及浓度如下：8mol/L盐酸胍，体积百分比为80％的无水乙醇；所述漂洗液A1的pH为8.0。上述各浓度为在所述漂洗液A1中的终浓度。
在本发明的具体实施方式中，所述漂洗液A2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.01-1.0mol/L KAC、体积百分比为70-80％无水乙醇，1-10mol/L Tris-HCl。上述各浓度为在所述漂洗液A2中的终浓度。
具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述漂洗液A2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.01mol/L KAC、体积百分比为70％无水乙醇、1mol/L Tris-HCl；所述漂洗液A2的pH为7.0。在本发明的第二个实施案例中，所述漂洗液A2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.05mol/L KAC、体积百分比为75％无水乙醇、5mol/L Tris-HCl；所述漂洗液A2的pH为8.0。在本发明的第三个实施案例中，所述漂洗液A2的溶剂为水，溶质及浓度如下：1mol/L KAC、体积百分比为80％无水乙醇、10mol/L Tris-HCl；所述漂洗液A2的pH为9.0。上述各浓度为在所述漂洗液A2中的终浓度。
在本发明的具体实施方式中，所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：2-10mol/L Tris-HCl。浓度为在所述洗脱液中的终浓度。
具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：2mol/L Tris-HCl；所述洗脱液的pH为7.0。在本发明的第二个实施案例中，所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：6mol/L Tris-HCl；所述洗脱液的pH为8.0。在本发明的第三个实施案例中，所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：10mol/LTris-HCl；所述洗脱液的pH为9.0。上述各浓度为在所述洗脱液中的终浓度。
进一步地，在所述裂解液中，所述胍盐可为异硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸胍的至少一种。
在本发明的具体实施方式中，所述胍盐为盐酸胍。
进一步地，在所述裂解液中，所述非离子表面活性剂可为曲拉通100、吐温20、SDS和NP40中的至少一种；
在本发明的具体实施方式中，所述非离子表面活性剂具体由曲拉通100、吐温20、和NP40组成。在所述裂解液中，曲拉通100的浓度可为0.1-1％、吐温20的浓度可为3-8％、NP40的浓度可为0.1-1％。上述各％均表示体积百分比。
具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述裂解液中，曲拉通100的浓度为0.1％、吐温20的浓度为3％、NP40的浓度为0.1％。在本发明的第二个实施案例中，所述裂解液中，曲拉通100的浓度为0.5％、吐温20的浓度为6％、NP40的浓度为0.5％。在本发明的第三个实施案例中，所述裂解液中，曲拉通100的浓度为1％、吐温20 的浓度为8％、NP40的浓度为1％。上述各％均表示体积百分比。
进一步地，所述消化酶可为蛋白酶K(生产商：天根生化科技(北京)有限公司，货号：RT403-02)。
更进一步地，所述蛋白酶K的浓度可为10-20mg/mL。
具体地，在本发明的第一个实施案例中，所述蛋白酶K的浓度为10mg/mL。在本发明的第二个实施案例中，所述蛋白酶K的浓度为15mg/mL。在本发明的第三个实施案例中，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
第二方面，本发明要求保护一种用于核酸提取纯化的试剂盒。
本发明要求保护的用于核酸提取纯化的试剂盒，包括前文第一方面中所述的试剂。
进一步地，所述试剂盒中还可包含有吸附物。
在本发明中，所述吸附物是指能够将核酸特异性地吸附在其表面，并在特定的条件下能够特异性地与核酸相分离的物质。
更进一步地，所述吸附物可为吸附柱。
在本发明的具体实施方式中，所述吸附柱具体为吸附柱TC1。
第三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的试剂或前文第二方面中所述的试剂盒在进行核酸提取纯化中的应用。
第四方面，本发明要求保护一种核酸提取纯化方法。
本发明要求保护的核酸提取纯化方法，可包括如下操作步骤：
S1.将待提取样本加入无RNA酶的离心管中，依次加入前文第一方面中所述的裂解液和前文第一方面中所述的消化酶，盖上管盖，瞬时离心；
S2.将S1处理后的样品金属浴或水浴孵育10-20分钟(如20分钟)后，加入结合液盖上管盖，瞬时离心；
其中，所述金属浴或水浴孵育温度可设置为50℃。
S3.将S2处理后样品转移到前文第二方面中所述的吸附物中，13400g离心30s至3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
S4.向所述吸附物中加入前文第一方面中所述的漂洗液A1，13400g离心30s至3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
S5.向所述吸附物中加入前文第一方面中所述的漂洗液A2，13400g离心30s至3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
S6.向所述吸附物中加入前文第一方面中所述的漂洗液A2，13400g离心2-4min(如1.5min)，弃滤液，将所述吸附物放入1-2ml(如2ml)EP管中，开盖室温放置2-5min；
S7.向吸附物中央悬空加入前文第一方面中所述的洗脱液，室温静置2-5min，13400g离心1min，弃所述吸附物，得到核酸产物。
更加具体地，所述S1具体操作如下：吸取150-300μL(如200μL)所述待提取样本加入RNase-Free的离心管中，依次加入150-300μL(如200μL)裂解液和10-50μL(如20μL)消化酶至相应的离心管中，盖上管盖，涡旋10-35秒(如20秒)，瞬时离心；
更加具体地，所述S2具体操作如下：金属浴或水浴(温度50℃)孵育10-20分钟(如20分钟)后，加入150-300μL(如200μL)结合液相应的离心管中，盖上管盖，涡旋10-15秒(如15秒)，瞬时离心；
更加具体地，所述S3具体操作如下：将上述混合液转移到所述吸附物中，10000rpm(相当于13400g)离心30sec-3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
更加具体地，所述S4具体操作如下：向所述吸附物中加入300-500μl(如300μL)所述漂洗液A1，10000rpm(相当于13400g)离心30sec-3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
更加具体地，所述S5具体操作如下：向所述吸附物中加入400-800μl(如600μl)所述漂洗液A2，10000rpm(相当于13400g)离心30sec-3min(如2min)，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
更加具体地，所述S6具体操作如下：向所述吸附物中加入150-400μl(如200μl)所述漂洗液A2，10000rpm(相当于13400g)离心2-4min(如1.5min)，弃滤液，将所述吸附物放入1-2ml(如2ml)EP管中，开盖室温放置2-5min；
更加具体地，所述S7具体操作如下：向所述吸附物的中央悬空加入50-100μl(如70μl)洗脱液，室温静置2-5min，10000rpm(相当于13400g)离心1min，弃所述吸附物，得到核酸产物。
其中，所述待提取样本可来自于动物样本。所述待提取样本可为细胞、细菌、血液、唾液、尿液或胸腹水。优选的，所述待检测样本为血液。
在本发明的具体实施方式中，所述待提取样本具体为人全血样本。
本发明提取纯化试剂可适用于新鲜或冻存的抗凝全血样本。
在本发明的一些实施例中所述分离的核酸优选地是脱氧核糖核酸(DNA)。
本发明的有益效果是：
(1)与市场上现有同类试剂盒相比本发明的结合液中除了无水乙醇外还加入了乙酸钾试剂，该试剂的加入可使DNA提取物高效率选择性吸附于离心柱硅基质膜，所得核酸的得率和纯度显著提高；
(2)本发明采用了独家的硅胶模纯化技术，可有效降低生产成本；
(3)本发明采用碱裂解法快速提取DNA，提取流程中不涉及酚、氯仿等有毒试剂，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少，完全符合现代环保理念，能更好地满足临床使用条件，也不需耗费大量时间进行醇类沉淀，安全高效，省时省力；
(4)本发明能够将RNA、杂蛋白、脂类及其他抑制性杂质最大限制的除去，提取得到的基因组DNA纯度高，质量稳定，可以用于甲基化、PCR、酶切、Southern杂交等多种场景的下游实验，适用于大批量样本的高效处理，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1和对比例1所提取的核酸样本等量上样后的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为实施例2和对比例2所提取的核酸样本等量上样后的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图3为实施例3和对比例3所提取的核酸样本等量上样后的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图4为实施例4中不同试剂盒所提取的核酸样本等量上样后的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、利用本发明的核酸提取纯化试剂盒及方法提取血液中DNA
本实施例中的核酸提取纯化试剂由裂解液、消化酶、结合液、漂洗液A1、漂洗液A2和洗脱液组成。
所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.5mol/L胍盐(盐酸胍)、0.05mol/LEDTA、体积百分比为3.2％的非离子表面活性剂(0.1％曲拉通100、3％吐温20、0.1％NP40)、0.5mol/L NaCl、0.05mol/L Tris-HCl(生厂商：北京索莱宝科技有限公司，货号：T1140，下同)；所述裂解液的pH为5.0。
所述消化酶为浓度为10mg/mL的蛋白酶K(生产商：天根生化科技(北京)有限公司，货号：RT403-02；5mL/包，20mg/mL，下同。用水稀释)。
所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.1％；所述结合液的pH为6.0。
所述漂洗液A1的溶剂为水，溶质及浓度如下：1mol/L盐酸胍，体积百分比为60％的无水乙醇；所述漂洗液A1的pH为6.0。
所述漂洗液A2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.01mol/L KAC、体积百分比为70％无水乙醇、1mol/L Tris-HCl；所述漂洗液A2的pH为7.0。
所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：2mol/L Tris-HCl；所述洗脱液的pH为7.0。
本实施例中的核酸提取纯化试剂盒除了含有上述试剂外还含有吸附柱TC1(生产商：北京艾比根生物科技有限公司，货号D5-50，下同)。
采用上述核酸提取纯化试剂盒对人全血样本(样本来源：河南省医药科学研究院)进行核酸提取纯化，提取操作步骤如下：
S1、吸取200μL样本加入RNase-Free的离心管中，再加入200μL上述裂解液和20μL上述消化酶至相应的离心管中，盖上管盖，涡旋20秒，瞬时离心；
S2、50℃金属浴或水浴孵育20分钟，加入200μL上述结合液至相应的离心管中，盖上管盖，涡旋15秒，瞬时离心；
S3、将S2中混合液转移到上述吸附柱TC1中，10000rpm(相当于13400g)离心2min，弃滤液，将吸附柱TC1放回收集管中；
S4、向吸附柱TC1中加入300μl上述漂洗液A1，10000rpm(相当于13400g)离心2min，弃滤液，将吸附柱TC1放回收集管中；
S5、向吸附柱TC1中加入600μl上述漂洗液A2，10000rpm(相当于13400g)离心2min，弃滤液，将吸附柱TC1放回收集管中；
S6、向吸附柱TC1中加入200μl上述漂洗液A2，10000rpm(相当于13400g)离心1.5min，弃滤液，将吸附柱TC1放入2ml EP管中，开盖室温放置2-5min，以确保彻底去除残留的乙醇；
S7、向吸附柱TC1中央悬空加入70μl上述洗脱液，室温静置2-5min，10000rpm(相当于13400g)离心1min，弃吸附物，将DNA产物保存于-20℃。
实施例2、利用本发明的核酸提取纯化试剂盒及方法提取血液中DNA
本实施例中的核酸提取纯化试剂由裂解液、消化酶、结合液、漂洗液A1、漂洗液A2和洗脱液组成。
所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：1.5mol/L胍盐(盐酸胍)、0.15mol/LEDTA、体积百分比为7％的非离子表面活性剂(0.5％曲拉通100、6％吐温20、0.5％NP40)、1.5mol/L NaCl、0.15mol/L Tris-HCl；所述裂解液的pH为6.5。
所述消化酶为浓度为15mg/mL的蛋白酶K(生产商：天根生化科技(北京)有限公司，货号：RT403-02，5mL/包，20mg/mL)。
所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.3％；所述结合液的pH为7.0。
所述漂洗液A1的溶剂为水，溶质及浓度如下：4mol/L盐酸胍，体积百分比为70％的无水乙醇；所述漂洗液A1的pH为7.0。
所述漂洗液A2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.05mol/L KAC、体积百分比为75％无水乙醇、5mol/L Tris-HCl；所述漂洗液A2的pH为8.0。
所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：6mol/L Tris-HCl；所述洗脱液的pH为8.0。
本实施例中的核酸提取纯化试剂盒除了含有上述试剂外还含有吸附柱TC1(生产商：北京艾比根生物科技有限公司，货号D5-50)。
本实施例所采用的样本及DNA提取操作步骤同实施例1。
实施例3、利用本发明的核酸提取纯化试剂盒及方法提取血液中DNA
本实施例中的提取纯化试剂由细胞裂解液、消化酶、结合液、漂洗液A1、漂洗液A2和洗脱液组成。
所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：3.0mol/L胍盐(盐酸胍)、0.3mol/LEDTA、体积百分比为10％的非离子表面活性剂(1％曲拉通100、8％吐温20、1％NP40)、3mol/L NaCl、0.3mol/L Tris-HCl；所述裂解液的pH为8.0。上述各浓度为在所述裂解液中的终浓度。
所述消化酶为浓度为20mg/mL蛋白酶K(生产商：天根生化科技(北京)有限公司，货号：RT403-02 5mL/包，20mg/mL)。
所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.5％；所述结合液的pH为8.0。
所述漂洗液A1的溶剂为水，溶质及浓度如下：8mol/L盐酸胍，体积百分比为80％的无水乙醇；所述漂洗液A1的pH为8.0。
所述漂洗液A2的溶剂为水，溶质及浓度如下：1mol/L KAC、体积百分比为80％无水乙醇、10mol/L Tris-HCl；所述漂洗液A2的pH为9.0。
所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：10mol/L Tris-HCl；所述洗脱液的pH为9.0。
本实施例中的核酸提取纯化试剂盒除了含有上述试剂外还含有吸附柱TC1(生产商：北京艾比根生物科技有限公司，货号D5-50)。
本实施例采用的样本及DNA提取操作步骤同实施例1。
对比例1
提取试剂配方及DNA提取流程同实施例1，区别在于，提取试剂的配方溶液的结合液中没有加入乙酸钾试剂(即所述结合液为无水乙醇)。
对比例2
提取试剂配方及DNA提取流程同实施例2，区别在于，提取试剂的配方溶液的结合液中没有加入乙酸钾试剂(即所述结合液为无水乙醇)。
对比例3
提取试剂配方及DNA提取流程同实施例3，区别在于，提取试剂的配方溶液的结合液中没有加入乙酸钾试剂(即所述结合液为无水乙醇)。
采用超微量紫外分光光度计对上述实施例1-3和对比例1-3中所提取核酸的ODA260/280和A260/230进行检测；采用Qubit对上述实施例1-3和对比例1-3中所提取核酸的浓度进行检测。结果如表1所示。
表1、实施例1-3和对比例1-3中所提取核酸的结果对比
Figure BDA0004134155920000091
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Figure BDA0004134155920000101
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Figure BDA0004134155920000121
分别取1μl实施例1-3和对比例1-3中提取的核酸样本上样，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1、图2和图3所示。
由表1可以看出，实施例1-3提取DNA的含量要高于对应对比例1-3的提取结果，而CV值低于对应对比例1-3的CV值。
从图1至图3可以明显看出，相比于对比例1，实施例1所得核酸样本的条带亮度更高；相比于对比例2，实施例2所得核酸样本的条带更加明显；相比于对比例3，实施例3所得核酸样本的条带亮度更明显一些。
综上可知，与对比例相比，本发明试剂盒所提取的DNA浓度的得率和纯度得到了显著提高，且所得核酸样本的条带亮度更高，说明在结合液中加入乙酸钾可有效提升DNA的提取效果。
实施例4、本发明核酸提取纯化试剂盒及提取方法与市场上试剂盒提取DNA效果的对比
采用市面上常见的试剂盒Q、试剂盒T、试剂盒V、试剂盒Z(其中试剂盒Q为QIAGENQIAamp DNABlood Mini Kit、试剂盒T为天根生化科技(北京)有限公司血液基因组DNA提取试剂盒、试剂盒V为南京诺唯赞生物科技股份有限公司FastPure Blood DNA IsolationMini Kit、试剂盒Z为北京天漠科技开发有限公司通用DNA提取试剂盒)，实验操作分别按照相对应的试剂盒说明进行和本发明的DNA提取试剂盒进行对比，提取试剂配方及实验操作流程同实施例2。提取相同体积的同一血液样本，每个试剂盒提取4个样本。结果如表2所示。
表2、本发明核酸提取纯化试剂盒及提取方法与市场上试剂盒提取DNA结果对比
Figure BDA0004134155920000122
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Figure BDA0004134155920000131
从上表2可以看出，试剂盒Q、T、V和Z的DNA提取含量值均在70ng/μl以下，本发明试剂盒的DNA提取含量均值在75ng/μl以上。相比于试剂盒Q、T、V和Z，本发明试剂盒提取DNA后得到的OD检测值更加稳定。
分别取1μl不同试剂盒提取的核酸样本进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。由图4可以看出，在取等体积核酸样本的情况下本发明试剂盒组的条带更亮。
综上，利用本发明试剂盒及操作方法提取的DNA纯度更高，DNA提取效果更好，且试剂盒组成简单，成本低廉，便于进行大规模核酸提取操作。另外，试剂盒中不含甲苯、二甲苯、酚、氯仿等有毒有害试剂，对环境和操作人员的危害较小，符合现代化环保理念，能够更好的满足市场发展的需求。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种用于核酸提取纯化的试剂，包括细胞裂解液、消化酶、结合液、漂洗液和洗脱液，其特征在于：所述结合液中含有醇溶液和钾盐。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述醇溶液为无水乙醇或异丙醇；和/或
所述钾盐为乙酸钾、硫酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：所述结合液由无水乙醇和乙酸钾混合而成，其中所述乙酸钾的质量百分比为0.1-0.5％；所述结合液的pH为6.0-8.0。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂，其特征在于：所述裂解液中含有Tris-HCl、胍盐、EDTA、非离子表面活性剂和NaCl，pH值为5.0-8.0；
和/或
所述漂洗液由漂洗液A1和漂洗液A2组成；所述漂洗液A1含有盐酸胍和无水乙醇，pH值为6.0-8.0；所述漂洗液A2含有KAC、Tris-HCl和无水乙醇，pH值为7.0-9.0；
和/或
所述洗脱液中含有Tris-HCl，pH值为7.0-9.0。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于：所述裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.5-3.0mol/L胍盐、0.05-0.3mol/L EDTA、体积百分比为3-10％的非离子表面活性剂、0.5-3mol/L NaCl、0.05-0.3mol/L Tris-HCl；
和/或
所述漂洗液A1的溶剂为水，溶质及浓度如下：1-8mol/L盐酸胍，体积百分比为60％-80％的无水乙醇；
和/或
所述漂洗液A2的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.01-1.0mol/L KAC、体积百分比为70-80％的无水乙醇、1-10mol/L Tris-HCl；
和/或
所述洗脱液的溶剂为水，溶质及浓度如下：2-10mol/L Tris-HCl。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：在所述裂解液中，所述胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸胍的至少一种；
和/或
在所述裂解液中，所述非离子表面活性剂为曲拉通100、吐温20、SDS和NP40中的至少一种；
和/或
所述消化酶为蛋白酶K。
7.一种用于核酸提取纯化的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-6中任一所述的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含有吸附物；
进一步地，所述吸附物为吸附柱。
9.权利要求1-6中任一所述的试剂或权利要求7或8所述的试剂盒在进行核酸提取纯化中的应用。
10.一种核酸提取纯化方法，包括如下操作步骤：
S1.将待提取样本加入无RNA酶的离心管中，依次加入权利要求1-6任一中所述的裂解液和权利要求1-6任一中所述的消化酶，盖上管盖，瞬时离心；
S2.将S1处理后的样品金属浴或水浴孵育10-20分钟后，加入结合液盖上管盖，瞬时离心；
S3.将S2处理后样品转移到权利要求8中所述的吸附物中，13400g离心30s至3min，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
S4.向所述吸附物中加入权利要求1-6任一中所述的漂洗液A1，13400g离心30s至3min，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
S5.向所述吸附物中加入权利要求1-6任一中所述的漂洗液A2，13400g离心30s至3min，弃滤液，将所述吸附物放回收集管中；
S6.向所述吸附物中加入权利要求1-6任一中所述的漂洗液A2，13400g离心2-4min，弃滤液，将所述吸附物放入1-2ml EP管中，开盖室温放置2-5min；
S7.向吸附物中央悬空加入权利要求1-6任一中所述的洗脱液，室温静置2-5min，13400g离心1min，弃所述吸附物，得到核酸产物。
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