CN104603267B - 高产量地分离包括小rna的rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从样品分离RNA，包括尺寸为200nt或更少的小RNA的方法，包括以下步骤：a)提供包含RNA和离液剂的组合物；b)加入醇；c)温育该混合物至少2分钟；d)将额外的醇加入该混合物以将混合物中的总醇浓度调节至≥50％；e)将该混合物中所含的RNA结合至核酸结合固相；f)任选地洗涤该结合的RNA；g)任选从地固相洗脱RNA。由于分步加入醇，总RNA产量和小RNA的产量得到提高。

Description

高产量地分离包括小RNA的RNA的方法

本发明涉及从样品中分离RNA，包括小RNA的方法，特别是提供高产量地从各种样品中有效分离总RNA，包括小RNA的手段。

研究各种组织、体液和其它生物学样品中约500个核苷酸或更小量级的小核酸是极其感兴趣的领域，并有望保持于将来。小核酸尤其包括但不限于：小RNA，例如微小RNA(miRNA)和小干扰RNA分子，二者都可以对基因表达产生强有力的影响。此外，参与mRNA和rRNA加工的其它小核与小核仁RNA(如snRNA和snoRNA)也令人感兴趣。此外，长度为500个核苷酸或更小的核酸，如RNA也常常作为降解产物包含在其它样品中，必须有效地从中捕捉。随着对各小RNA的兴趣日益增加，标准分离程序得到改进以促进小核酸的分离，特别是提高小核酸的产量。用作分离总RNA标准的这种已知方案对于分离小RNA通常不理想，因为小RNA往往不能在分离期间采用标准方法被有效地捕获和洗脱。因此，采用标准程序分离的总RNA通常不包含足够量的小RNA，因而无法提供可接受的产量，因为在核酸分离过程小RNA或未结合或丢失。因此，需要改进的技术来有效分离总RNA，包括所需的小RNA。

为分离小RNA而作优化的方法往往依赖于酚/氯仿抽提和随后的醇分馏。基于酚/氯仿的有机提取方法常按照Chomczynski方法实施(Chomczynski和Sacchi,1987:通过酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取的RNA分离单步法(Single-step method of RNA isolation byacid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction).Anal.Biochem.(162):156-159)。根据所述方法，RNA在苯酚/氯仿萃取期间浓缩于水相，然后从中分离，例如通过加入醇并将RNA结合到核酸结合固相。在所述结合步骤中，再次需要特定的条件以有效捕获分离的总RNA中的小RNA。基于相应的苯酚/氯仿法的商业试剂盒是MirVana miRNA分离试剂盒(安比昂公司-Ambion)。苯酚/氯仿萃取后，该方案遵循分馏策略，其中较大的RNA(超过200个核苷酸)在中等醇浓度(通常30-40％)下，在第一结合步骤中结合于核酸结合固相。流出物(flow-through)包含小RNA。通过第二结合步骤，将醇浓度提高到50％以上(通常为55-70％)并使小RNA结合到第二固相以便自流出物中捕获所述小RNA。该方案不方便，因为需要两种不同的结合条件和两种不同的核酸结合固相。此外，MirVana miRNA分离试剂盒提供一方案，其中包括小RNA的总RNA是从苯酚/氯仿萃取后获得的水相中分离。在此，结合条件是通过在一步中增加醇浓度到所需量(通常为55-70％)而产生的。WO 2005/012523和WO 2005/054466也描述了相应的方法。然而，在这些方案中，也要预先实施有机苯酚/氯仿萃取步骤。另一基于苯酚/氯仿的商业产品是miRNAeasy Mini试剂盒(凯杰公司-QIAGEN)。它提供了来自各种不同生物学样品的高品质和高产量的总RNA，包括小RNA。

然而，需要有机提取步骤(例如特别是苯酚/氯仿提取)的此类方法有缺点，因为苯酚是有毒的试剂。本领域急需无苯酚的RNA分离方法，以便高产量和高质量地从各种样品分离包含小RNA的总RNA。

现有技术已知分离包含小RNA的RNA的无苯酚方法。离液剂和高浓度的醇被利用于将包含小RNA的总RNA结合于核酸结合固相。通常，所利用的核酸结合固相包含或由二氧化硅组成。然而，在有醇和离液物质存在下，基于将RNA结合到二氧化硅表面的方法中，小RNA(例如miRNA)的回收需要非常高的醇浓度。结合混合物中通常利用至少约50％的醇，结合混合物中醇的常用范围包括50-80％(v/v)。然而，当采用涉及高浓度醇以便结合小RNA的各方案时(不涉及基于酚的有机提取步骤)，总RNA产量以及所得的小RNA产量常常降低。对于某些生物学样品，例如纤维组织样品(如心脏或肌肉样品)，RNA分离特别具有挑战性。因此，这些方案的性能通常遗憾地无法与基于苯酚/氯仿的分离方法相媲美。不论利用何种类型的核酸结合固相，均会遇到这些问题。基于柱的方法以及涉及利用磁性颗粒的方法也观察到这些问题。

本发明的目的是提供分离总RNA，包括小RNA的方法，其克服了至少一种上述现有技术方法的缺点。具体地说，本发明的目的是提供分离总RNA，包括小RNA的方法，该方法避免使用苯酚，并提供良好的RNA产量，特别是良好的小RNA产量，适用于不同类型的样品，包括纤维组织。

发明概述

本发明人发现，如果以分步方式加入调节小RNA与核酸结合相结合的条件所需的醇，可以显著改善总RNA制品中小RNA的回收以及总RNA产量。如实施例所示，当以分步方式加入醇时，观察到总RNA产量增加高达4倍。此外，小RNA产量也得到显著改善。这是出乎意料的发现，因为迄今为止，人们认为对于有效的结合以及由此分离小RNA，只有结合混合物中的整体酒精浓度是决定性的。然而，发明人发现，如果采用与现有技术中已知相同的醇浓度和结合条件，但以分步方式而非在一步中加入醇，小RNA产量以及总RNA的整体产量可以得到显著改善。

这些显著改善的潜在分子机制尚不清楚。不希望受理论的束缚，但这可能是仅在一步中将酒精浓度调节到≥50％导致RNA立即沉淀，并且就与固相的生产性相互作用和结合而言，RNA的各凝聚物增长得过大过快。此外，如果预未先进行基于酚的有机提取步骤(例如无苯酚/氯仿提取)，仅在一步中调节高醇浓度可以显著降低污染物，尤其是蛋白质的溶解度。由此，降低了核酸结合相的RNA结合容量，从而降低了分离RNA的总产量。根据本发明的教导，可以避免这些问题。然而，作为本发明基础的分子理论基础不是决定性的。不同核酸结合固相和各种组织证明了所实现的改进。

根据第一方面，提供了从样品分离RNA，包括长度为300nt或更少，优选200nt或更少的小RNA的方法，包括以下步骤：

a)提供包含RNA和离液剂的组合物；

b)加入醇；

c)温育该混合物至少2分钟；

d)将额外的醇加入该混合物，将该混合物中的总醇浓度调节至≥50％；

e)将该混合物中所含的RNA结合至核酸结合固相，其中在步骤e)之后，RNA，包括小RNA结合于固相；

f)任选地洗涤该结合的RNA；

g)任选地从固相洗脱RNA。

实施例表明，本发明提供了从各种样品高效分离总RNA，包括小RNA，例如miRNA的方法，所述样品包括采用不含有基于苯酚的提取步骤就特别难高产量地自样品中分离RNA的样品。无需使用苯酚或其它有机提取剂的本发明方法提供的结果和RNA产量类似于利用苯酚分离RNA的现有技术方法。通过提供一种能提供相当的RNA产量，同时避免使用苯酚的方法，本发明对现有技术作出重大贡献，并显著改善现有的无苯酚RNA分离方法。此外，本发明的RNA分离方法不难在现有方案中实施，这些方案旨在从不同样品中分离总RNA，包括小RNA或旨在平行分离总RNA，包括小RNA和DNA。

本领域技术人员从以下描述和所附权利要求中可以明白本申请的其它主题、特征、优点和方面。然而，应当理解，虽然表明是本申请的优选实施方式，但以下描述、所附的权利要求和具体的实施例仅是通过举例说明的方式给出。本领域技术人员通过阅读下文不难明白落在本发明构思和范围内的各种变化和改进。

附图简述

图1：显示了按照现有技术方法或根据本发明原理分步加入醇，从肾脏组织获得的RNA产量(见实施例1)。

图2：显示了按照现有技术方法或根据本发明原理分步加入醇，从肌肉组织获得的RNA产量(见实施例2)。

图3和4：显示了按照现有技术方法或根据本发明原理分步加入醇，从肌肉组织获得的RNA产量(见实施例2)的图表(图3)，和对分离RNA作凝胶电泳后获得的图像(图4)。

图5：实施例2的miRNA测定结果。

图6-8：显示了按照不同分离方案，从不同组织获得的RNA分离结果(图6-脑；图7-心脏；图8-肝)(见实施例3)。显示了分离RNA的等分试样在凝胶电泳后获得的图像。

图9：显示了按照不同分离方案，从不同组织获得的RNA分离结果(见实施例4)。显示了分离RNA的等分试样在凝胶电泳后获得的图像。

图10：温度对DNA分离步骤中进行的柱上蛋白水解消化和DNA产量的影响(见实施例4)。

图11：温育时间对DNA分离步骤中进行的柱上蛋白水解消化和DNA产量的影响(见实施例4)。

图12-14：显示了按照不同分离方案从肌肉组织获得的RNA分离结果(见实施例5)。显示了总产量的图表(图12)和miRNA测定结果(图14)以及分离RNA的等分试样在凝胶电泳后获得的图像(图13)。

图15-17：显示了按照不同分离方案从肌肉组织获得的RNA分离结果(见实施例5)。显示了总产量的图表(图15)和miRNA测定结果(图17)以及分离RNA的等分试样在凝胶电泳后获得的图像(图16)。

图18和19：显示了按照不同分离方案从肌肉组织获得的RNA分离结果(见实施例5)。显示了总产量的图表(图15)和miRNA测定结果(图17)以及分离RNA的等分试样在凝胶电泳后获得的图像(图16)。

图20-22：显示了DNA酶消化和再结合步骤对于从不同样品类型分离RNA中回收miRNA的作用(参见实施例6)。显示了miRNA测定结果。

图23：在步骤c)温育中采用或不采用蛋白酶K消化从细胞中分离RNA和DNA(参见实施例7)。

图24：采用或不采用蛋白酶K和/或DNA酶消化从全血样品中分离RNA(参见实施例8)。显示了分离RNA的等分试样在凝胶电泳后获得的图像。

图25：显示了实施例9分离的RNA得到的miRNA测定结果。

发明详述

本发明提供了从样品分离RNA，包括长度为200nt或更少的小RNA的改进方法。该方法包括以下步骤：

a)提供包含RNA和离液剂的组合物；

b)加入醇，从而获得包含RNA、离液盐和醇的混合物；

c)温育该混合物至少2分钟，其中，在所述温育步骤期间，优选进行蛋白水解消化；

d)将额外的醇加入该混合物，将该混合物中的整体醇浓度调节至≥50％，优选≥55％，更优选≥60％；

e)将该混合物中所含的小RNA结合至核酸结合固，其中在步骤e)之后，RNA，包括小RNA结合于固相；

f)任选地洗涤该结合的RNA；

g)任选地从固相洗脱RNA。

如实施例所示，分步加入构建结合条件所需的醇，以有效捕获RNA，包括小RNA，出乎意料地显著改善总RNA产量，包括改善的小RNA产量。从各种生物学样品，包括从复杂样品，例如纤维组织样品和血液分离RNA时，观察到显著的效果。与不进行分步方法的相同方案相比，按照本文教导的分步方法使得总RNA产量提高到高达4倍以上。此外，实施例还表明，如果为小RNA结合调整高醇浓度时采取分步方法，小RNA产量也提高。此外，如实施例所示，本发明方法对许多类型的样品实现了这些结果，包括各种组织样品，包括纤维组织样品。该方法的广泛适用性是有利的，因为它允许用户方便地采用一种RNA分离方案从各种不同的样品分离总RNA，包括小RNA。从上文显而易见的是，本发明对现有技术作出了显著的贡献。

随后，我们将详细解释各步骤和优选的实施方式。

RNA分离程序始于步骤a)，其中提供了包含RNA和离液剂的组合物。为提供所述组合物，存在几个选择，随后也将详细解释。通常，所述组合物是裂解生物学样品获得的裂解物，例如细胞或组织样品。合适的裂解方法是现有技术中已知的，裂解程序也描述如下。所述裂解物可在步骤a)之前作进一步处理。适当的处理步骤包括但不限于净化裂解物或从裂解物中除去DNA。在任何情况下，在步骤a)中提供包含RNA和离液剂的组合物，然后实施本文所述的步骤以将RNA从所述组合物中分离。

离液剂通过(例如但不限于)改变蛋白质或核酸的二级、三级或四级结构、但使得一级结构保持完整，从而引起蛋白质或核酸的紊乱。优选地，步骤a)中提供的组合物所包含的离液剂是离液盐(chaotropic salt)，如胍盐。优选的离液剂包括但不限于：盐酸胍、硫氰酸胍(GTC)、异硫氰酸胍(GITC)、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠，尿素等。优选地，离液剂是GTC或GITC或同样强效的离液剂。相应的强离液试剂是有利的，因为它们可有效地保护组合物中所含的RNA免遭酶降解。此外，离液剂有助于构建RNA结合条件(尤其参见以下步骤e))。离液剂可以在裂解过程中引入，因为优选利用离液剂进行裂解。根据一实施方式，步骤a)中提供的组合物包含离液剂，优选离液盐，其浓度选自0.5M至饱和、0.75M至5M、1M至4.5M、1.25M至4.25M、1.5M至4M、1.75至3.75M和2M至3.5M。如果使用离液盐，如GTC或GITC，最优选的浓度是2.75至3.75。

在步骤b)中加入醇。在步骤b)中加入的醇有助于为结合步骤e)准备结合条件。优选使用脂族、短链支链或非支链醇，优选1至5个碳原子。例子有甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。还可以在步骤b)中加入醇的混合物。所述醇优选异丙醇或乙醇，特别适宜的是乙醇。现有技术中也添加相应的醇来调整RNA结合条件，从而也能捕获小RNA。然而，与现有技术方法相反，并不在步骤b)中加入全部所需量的、用来调节RNA，包括小RNA与核酸结合固相结合之结合条件的醇(大约至少50％(v/v)；优选至少60％(v/v))。相反，在步骤b)中仅加入所需的醇总量的一部分。步骤b)中加入的醇部分通常对应于为在步骤e)中结合小RNA的总醇浓度的大约40％至80％。因此，如果步骤e)中用于结合的最终乙醇浓度为60％(v/v)，步骤b)中醇的加入量应使得其在所得混合物中的浓度约为25％(v/v)(对应于最终醇浓度的约41％)到47％(v/v)(对应于最终醇浓度的约78％)。优选地，在步骤b)中加入的醇部分对应于为在步骤e)中结合小RNA构建的总量，即最终醇浓度的约45％至75％、50％至70％、55％至65％、57％至64％、58％至63％，最优选59％-62％。

根据一实施方式，步骤b)中醇的加入量应使得其在所得混合物中的浓度至少约为25％(v/v)，优选至少30％(v/v)，更优选至少为35％(v/v)。然而，如果步骤d)中构建的总醇浓度至少为60％(v/v)，混合物中醇的浓度优选不超过48％(v/v)醇。步骤b)中醇的加入量优选使得使所得混合物包含的醇浓度范围在25％(v/v)至45％(v/v)，优选27.5％(v/v)至42.5％(v/v)，更优选30％至40％(v/v)，最优选32.5％至38％(v/v)。如果为在步骤e)中进行结合的最终醇浓度为60％(v/v)，这些量是特别合适的。

在步骤c)中，将得到的混合物温育至少2分钟、优选至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少7分钟和更优选至少10分钟。相应的温育步骤是很重要的，以便确保醇确实分步加入，以及由此确保总RNA，特别是小RNA回收产量高。该混合物可以在温育期间进行搅拌(也参见下文)。

根据优选的实施方式，在温育步骤c)中利用了蛋白水解酶进行蛋白水解消化。在步骤c)进行蛋白水解消化改善了RNA分离的产量和纯度，特别是如果处理困难或复杂的样品，如纤维组织或血液。据推测，当与采用蛋白水解酶(如蛋白酶K)的蛋白水解消化联用时，本文教导的分步加入醇具有独特的优势。与高离液浓度和无醇(例如乙醇)以及较低离液浓度和高醇浓度相比，在适度高浓度离液盐(包含在步骤a)所提供的含RNA组合物中)和中等浓度醇(步骤b)提供)下用蛋白酶K进行消化显著更有效率。蛋白水解酶消化蛋白质。这是有利之处，因为蛋白质可在经步骤d)调整的较高醇浓度下沉淀，从而可以减少与固相结合的RNA。此外，蛋白水解消化支持困难样品，如纤维组织样品的消化。

蛋白水解酶是指催化，例如蛋白质、多肽、寡肽和肽之中的肽键切割的酶。示例性的蛋白水解酶包括但不限于：蛋白质酶和蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)、枯草杆菌酶(subtilases)、碱性丝氨酸蛋白酶等。枯草杆菌酶是丝氨酸蛋白酶家族，即为在活性侧具有丝氨酸残基的酶。枯草杆菌蛋白酶是具有广泛底物特异性的细菌丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶相对耐受离液剂，例如尿素和盐酸胍和阴离子洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)所致的变性作用。示例性枯草杆菌蛋白酶包括但不限于：蛋白酶K、蛋白酶R、蛋白酶T、枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A、QIAGEN蛋白酶等。枯草杆菌酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K和其它蛋白酶的讨论参见Genov等.,Int.J.Peptide Protein Res.45:391-400,1995。优选地，蛋白水解酶是蛋白酶K。

蛋白水解酶可以在步骤b)之前，期间或之后加入。这些实施方式对于许多生物样品是可行的。优选在步骤b)中加入醇之前加入蛋白水解酶。本发明人发现，对于特定的样品，例如肌肉组织，在步骤b)中加入醇之前加入蛋白水解酶是决定性的，否则，不能有效纯化RNA。对于其他样品类型，先加入醇还是蛋白水解酶没有区别。但是，为了确保该方法的普遍适用性，优选在步骤b)之前添加蛋白水解酶，由此在根据步骤b)加入醇之前加入蛋白水解酶。在任一情况下，蛋白水解消化在有醇和离液剂存在的温育步骤c)中发生。人们发现，如果蛋白水解消化在有离液盐和醇的存在下进行，使用蛋白水解酶作消化最有效。

如实施例所示，在步骤c)中，不同的温育时间适合于根据本发明的教导处理的各种样品。平均来说，3和15分钟之间的温育时间足以实现高RNA产量。因此，优选温育至少2.5分钟、至少3分钟、优选至少5分钟、更优选至少为7.5分钟、或最优选至少10分钟。如实施例所示，较长的温育时间没必要，因为这不会进一步增加RNA产量。考虑到实施该方案的所需时间，这是有利的。然而，如果需要，也可以采用更长的温育时间。如以上所讨论的，优选在步骤b)之前添加蛋白水解酶，以便在步骤c)中进行蛋白水解消化。在温育步骤c)期间，蛋白水解酶是具有活性的，因此可以消化包含在混合物中的蛋白质。人们发现，掺入相应的蛋白水解消化步骤导致RNA产量显著增加。加热或搅拌有助于消化。在现有技术中，用蛋白水解酶，如蛋白酶K进行的消化经常在高温下进行，例如至少50℃，或甚至至少55℃。然而，这样的加热步骤常不方便，因为需要特殊的实验设备。此外，许多自动化系统并不包括加热单元。在此，发明人出乎意料地发现采用本文规定的条件，其中蛋白水解消化在离液盐和醇的存在下进行，能够在较低温度，甚至室温下进行蛋白水解消化。因此，优选在45℃或更低、40℃或更低、37℃或更低、或30℃或更低的温度下进行温育步骤c)。优选不进行加热步骤，温育步骤c)在15℃-30℃的温度下，相应地在室温下进行。在室温下进行温育步骤c)非常方便，此外，与在蛋白水解消化期间采用常规加热步骤的方法相比，出乎意料地发现具有RNA甚至降解更少的优点。

可在搅拌该混合物的同时进行温育步骤c)。然而，搅拌并非必须。搅拌的非限制性例子包括振荡、搅动、混合、振动或通过垂直移动(例如可用于处理磁珠的机器人系统的)柱塞。在某些方面，搅拌包括振荡。振荡可以是一维、两维或三维振荡。可以在，例如混合器中以至少50rpm、至少100rpm、至少200rpm、至少500rpm或至少1,400rpm进行搅拌。当使用至少一种蛋白水解酶时，采用的温育条件确保所述酶有效运作并具有催化活性。优选地，温育在有促进和/或维持蛋白水解酶活性的盐和/或离子的存在下进行。由于离液剂，如离液盐包含在混合物中，而所述酶在这些条件下非常活跃，通常不需要添加另外的盐。然而，如果需要，可以添加进一步的盐或其它添加剂。合适的盐包括但不限于：NaCl、KCl、MgCl₂或CaCl₂或离液剂，如离液盐。当使用蛋白水解酶，如蛋白酶K时，上述条件是特别有利的，所述条件促进消化并增加RNA总产量。

因此，根据一实施方式，在步骤b)中加入醇后得到的混合物包含：

-RNA；

-至少一种离液盐；

-醇，优选异丙醇或乙醇，浓度为25％-42.5％(v/v)，优选30％-40％(v/v)，更优选32.5％-38％(v/v)。

根据一优选的实施方式，在步骤b)中加入醇后得到的以及由此在后续步骤c)中温育的混合物包含：

-RNA；

-离液盐，浓度选自0.5M-5M、0.75-4M、1-3.5M、1.25M-3.25M、1.5M-3M、1.75-2.75M和1.75M-2.5M；

-蛋白水解酶，优选蛋白酶K；

-醇，优选异丙醇或乙醇，浓度为25％-42.5％(v/v)，优选30％-40％(v/v)，更优选32.5％-38％(v/v)。

如上所述，优选在步骤b)之前加入蛋白水解酶。但是，也可在步骤b)中加入醇之后加入。在非限制性的方面，蛋白水解酶包含于在步骤c)中温育的所述混合物中，其浓度为至少12mAU、至少20mAU、至少25mAU或至少30mAU。合适的范围包括但不限于10mAU-100mAU、15mAU-75mAU和25-50mAU。

如上所述，可以通过各种方式获得步骤a)中提供的包含RNA和离液剂的组合物。合适的、非限制性的实施例描述于下。

根据一实施方式，通过实施至少以下步骤获得在步骤a)中提供的组合物：

-获得含有RNA的生物学样品。优选地，所述样品是含有细胞的样品，例如特别是组织样品或体液。优选地，所述样品也包含DNA。在这种情况下，也可能从同一样品平行分离RNA和DNA，这将在随后更详细地描述。

-裂解所述生物学样品，其中所述裂解优选涉及使用至少一种离液剂。

可采用不同的方法以实现样品的裂解，合适的裂解方法是现有技术中熟知的。本文所用的术语“裂解”是指样品或其部分或组分的破坏、降解和/或消化。在相应的裂解步骤中，生物分子，例如尤其是核酸可以从细胞释放，或不含其它样品添加剂，例如蛋白质。在此，通常将破坏、降解和/或消化样品的相应步骤称为裂解步骤，而与生物分子(例如尤其是核酸)是否从细胞释放或者是否进行裂解以便使生物分子(例如核酸，与蛋白质或包含在样品中的其它物质)释放无关。所以，样品可以包含细胞或者可以不含或仅含少量细胞，例如血浆的情况。优选将样品与一种或多种裂解剂接触以便裂解。RNA应在裂解过程中进行保护以免受核酸酶的降解。根据待处理的样品种类，所选择的裂解条件也有所不同。裂解过程通常可包括但不限于：对样品作机械、化学、物理和/或酶作用。实例包括但不限于：在珠磨机中或在玻璃珠存在下研磨样品，均质化样品，应用超声、加热，添加一种或多种洗涤剂和/或加入蛋白降解化合物，例如蛋白质降解酶或盐。此外，为裂解，可加入还原剂，如β-巯基乙醇或DTT以协助如核酸的变性。如上所讨论的，根据本发明的教导，在样品的裂解过程中使用优选至少一种离液剂，优选至少一种离液盐。以上描述了合适的离液剂，尤其是离液盐。此外，裂解期间，还可加入其它添加剂，例如螯合剂，核酸酶抑制剂，尤其是RNA酶抑制剂或DNA酶抑制剂(特别是如果意欲平行分离RNA和DNA的话)等。可用于支持样品裂解，并保护所释放核酸，特别是释放的RNA的相应添加剂是现有技术中熟知的，因此，无需在本文中详细说明。

在步骤d)中，额外的醇加入混合物以将混合物中的总醇浓度调节至≥50％(v/v)，优选≥55％(v/v)，更优选≥60％(v/v)。通过将醇浓度增加至≥50％(v/v)，构建RNA结合条件，以便将小RNA结合到核酸结合固相。当然，较长的RNA分子也可在这些条件下结合。步骤d)的所述混合物中醇浓度的合适范围包括≥50％(v/v)至≤80％(v/v)，≥55％(v/v)至≤75％(v/v)，优选≥60％(v/v)至≤70％(v/v)。上文结合步骤b)描述了可用于构建RNA结合条件的合适的醇。可参考同样适用于此的相应内容。与步骤b)中所用相同或不同的醇可在步骤d)中使用。优选在步骤b)和d)利用相同类型的醇。优选在步骤d)中加入乙醇或异丙醇。通过如本文所述以分步方式增加醇浓度和优选在步骤c)中进行蛋白水解消化，提供的RNA结合条件尤其适合于高效率地结合总RNA，包括小RNA，即便是处理有挑战性的样品，例如纤维组织时。如本文所教导的，分步加入醇以构建结合条件，其中在醇加入步骤之间实施温育步骤，对于增加RNA总产量，特别是增加小RNA产量是很重要的。如实施例所证实的，所述分步过程，特别是当在步骤c)中额外实施蛋白水解消化时，相比于传统的现有技术方法具有显著的优点，在所述传统的现有技术方法中，为了总RNA，包括小RNA的结合，醇浓度在一步(或同时)中调节，相应地，温育步骤c)缺失。本发明相对于以下方法也是优选的，在该方法中大RNA在第一步骤中结合到核酸结合固相，小RNA在第二RNA结合步骤中结合于另一固相。当采用本发明方法时，无需进行两个单独的RNA结合步骤。相反，较大的RNA和小RNA一起结合于同一核酸结合固相。因此，同一固相可用于结合小RNA和较长的RNA。此外，与在结合RNA结合之前涉及用酚作有机提取，例如基于苯酚/氯仿的方法相比，本发明具有的优点在于，本发明方法取得了相当、有时甚至改进的RNA分离结果，其中，然而，本发明方法无需使用有毒的苯酚或其它有机提取步骤。

在步骤d)中加入醇来调节结合条件，以便将RNA，包括小RNA在步骤e)中结合于核酸结合固相。在所述结合混合物中，所含有的上述离液剂(优选是离液盐)的浓度范围在0.1M至饱和极限。根据所用的离液剂，优选的浓度范围在0.3M到5M、0.5M到4M、0.75M到3.75M和1M到3M。上文描述了合适的离液剂，特别是合适的离液盐，包括但不限于：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠，高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠、尿素等，特别优选盐酸胍、硫氰酸胍和异硫氰酸胍。结合过程中存在的离液剂可源自裂解过程，或者可以单独加入以构建结合条件。较高浓度的离液剂可有利于增加RNA产量。因此，为了结合而通过加入额外量的离液剂来增加离液剂的浓度也在本发明的范围内。此外，可以加入额外的添加剂，例如洗涤剂以改善RNA结合。

在步骤e)中，由于醇浓度足够高以保证步骤e)中小RNA的有效捕获，步骤d)所得混合物中含有的小RNA结合于核酸结合固相。根据一实施方式，步骤d)所得的结合混合物在步骤e)中与为所述目的的固相接触。如果使用包含在柱中的核酸结合相，该实施方式特别合适。如果采用基于柱的过程，可以在步骤e)中使用核酸结合固相，以将总RNA，包括小RNA结合于固相。在此实施方式中，优选在步骤e)之前没有RNA结合到固相，总RNA，包括小RNA在步骤e)中首次结合于固相。然而，也有可能在步骤e)之前加入核酸结合固相，例如在步骤a)、b)、c)或d)期间。例如，如实施例所示，如果使用颗粒，例如磁性颗粒作为核酸结合固相，所述颗粒可以直接接触步骤a)中所提供的组合物(优选为了易于处理)。因此，该颗粒也可以在步骤a)、b)、c)和/或d)期间存在，并且相应地可以在步骤e)之前存在。在这种情况下，RNA，尤其是较长的RNA分子，也可以在步骤e)之前，例如在步骤c)和或d)中结合于颗粒。在此实施方式中，特别是小RNA在步骤e)中结合到固相，因为在此，结合混合物中的醇浓度足够高(由于步骤d)中加入额外量的醇)，从而将小RNA有效结合于核酸结合固相。无论采用的各实施方式，RNA，包括小RNA在步骤e)之后均结合于固相。合适的核酸结合固相将在下文更详细地说明。

作为在步骤e)中可用于结合的核酸结合固相，可利用能够结合RNA的任何材料。这包括能够在本文所述的结合条件下结合核酸的各种材料。可与本发明联用的示范性固相包括但不限于：含二氧化硅的化合物，包括但不限于，二氧化硅颗粒(silica particles)、二氧化硅纤维(silica fibres)、玻璃纤维、二氧化硅(silicon dioxide)、硅藻土、玻璃、烷基二氧化硅、铝硅酸盐和硼硅酸盐；硝酸纤维素；重氮化纸；羟磷灰石(也称为羟基磷灰石)；尼龙；金属氧化物；矿物质，氧化锆；氧化铝；聚合物支持物，有机聚合物，二乙基氨基乙基-和三乙基氨基乙基衍生支持物，疏水层析树脂等。术语固相不旨在暗示关于其形式或设计的任何限制。因此，术语的固相包括合适的多孔或无孔材料；渗透或不渗透的；包括但不限于膜、过滤器、薄片、颗粒、磁性颗粒、珠、凝胶、粉末、纤维等。根据一实施方式，固相，例如二氧化硅固相的表面未经修饰，例如未用官能团修饰。

特别优选的是使用含硅材料，如二氧化硅和聚硅酸材料、硼硅酸盐、硅酸盐和无机玻璃作为固相。基于二氧化硅的核酸分离方法广泛用于现有技术中，在利用离液剂和高醇浓度以供结合来分离RNA，包括小RNA时，该方法特别好。包含二氧化硅的固相可以，例如具有过滤器、纤维、膜或颗粒的形式。根据本发明，优选使用基于柱的固相或使用颗粒，特别是磁性颗粒。

因此，根据一实施方式，利用可以具有珠形式的二氧化硅颗粒。优选地，所述颗粒的尺寸为约0.02至30μm，更优选0.05至15μm，最优选0.1至10μm。为便于处理核酸结合固相，优选利用磁性二氧化硅颗粒。磁性颗粒对磁场作出响应。磁性二氧化硅颗粒可以是，例如亚铁磁性、铁磁性、顺磁性或超顺磁性的。合适的磁性二氧化硅颗粒描述于，例如WO01/71732、WO2004/003231和WO2003/004150。其它磁性二氧化硅颗粒在现有技术中也是已知的，描述在，例如WO 98/31840、WO 98/31461、EP 1 260 595、WO 96/41811和EP 0343 934，也包括，例如磁性二氧化硅玻璃颗粒。优选使用磁性颗粒，因为可以借助磁场，例如通过使用永磁体方便地处理包含结合了RNA的磁性颗粒。该实施方式是优选的，因为它与能够处理磁性颗粒的已有机器人系统兼容。在此，现有技术中存在可与本发明联用来处理结合有核酸的磁性颗粒的不同机器人系统。根据一实施方式，磁性颗粒收集在反应容器的底部或侧面，而其余的液体样品从反应容器中除去，留下结合有核酸的所收集磁性颗粒。可通过倾析或抽吸去除剩余的样品。此类系统是现有技术中熟知的，因此无需在此详细描述。在已知用于处理磁性颗粒的替代系统中，将磁体投入反应容器来收集磁性颗粒，所述磁体通常覆有盖子或外壳。由于相应的系统是现有技术中熟知的，也可以商品化购得(例如凯杰公司-QIAGEN)，它们无需在此详细描述。在已知用于处理磁性颗粒的进一步的替代系统中，可将包含磁性颗粒的样品吸入移液管尖端，可通过应用磁体将磁性颗粒收集在，例如移液管尖一侧。然后，剩余的样品可从移液管尖端释放，而携带所结合核酸的收集的磁性颗粒因磁体而保留在移液管尖端。然后可以进一步处理所收集的磁性颗粒。此类系统也是现有技术中熟知的，并且也可商品化购得(例如BioRobot EZ1，凯杰公司)，因此，在此无需任何详细的描述。

根据一优选的实施方式，进行基于柱的核酸分离方法，其中，所述固相包括在柱中。优选利用核酸结合膜或核酸结合纤维作为核酸结合固相。实例包括但不限于：二氧化硅膜、玻璃纤维膜、尼龙膜、纤维素膜，例如硝酸纤维素膜、改性纤维素膜(例如乙酰基或羟基)、纸膜、特别是改性的纸张。优选地，该膜是多孔的。此外，优选使用包含或由二氧化硅构成的膜或纤维。上文还描述了合适的和优选的基于二氧化硅的材料。另一常见的包含在柱中的核酸结合固相是核酸结合颗粒(例如二氧化硅颗粒)填充物，或者核酸结合材料(例如硅胶)层。例如可以将二氧化硅颗粒在惰性过滤器或膜上布置为一层，由此形成核酸结合固相。为减轻结合混合物通过包含在柱中的核酸结合固相的压力，可采用合适的手段，例如离心或使用压差产生设备，例如将样品压过柱和相应的核酸结合固相，或通过施加真空将其吸过核酸结合固相。各装置是现有技术中熟知的，因此无需在此进一步描述。当使用基于柱的方法时，优选将步骤d)中得到的混合物在步骤e)中与核酸结合固相接触，以将总RNA，包括小RNA结合于核酸结合固相。在本实施方式中，步骤e)是旨在结合RNA的唯一结合步骤。

本发明的方法优选不涉及使用苯酚、苯酚/氯仿和/或氯仿。

RNA，包括小RNA在步骤e)中结合于核酸结合固相后，所结合的RNA可任选在步骤f)中洗涤。为此目的可利用常规洗涤溶液。根据一实施方式，用于洗涤的溶液包含至少一种离液剂和/或至少一种醇。可用于洗涤溶液中的离液剂包括但不限于：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍和碘化钠。作为醇，短链的支链或非支链醇(优选1至5个碳原子)可相应用于洗涤溶液中以供洗涤。例子是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。优选利用异丙醇和/或乙醇。然而，不含离液剂的洗涤溶液也可以使用。

可替换地或者除上述洗涤溶液外也可使用的其它合适洗涤的溶液包含醇和缓冲液。合适的醇和缓冲液，例如生物学缓冲液如上所述。优选异丙醇或乙醇，最优选乙醇用于该第二洗涤步骤。优选的乙醇使用浓度为至少60％(v/v)，至少70％(v/v)，优选至少80％(v/v)。缓冲液优选pH约为7-8的Tris。根据一实施方式，用于洗涤的溶液包含至少一种离液剂、至少一种醇、至少一种洗涤剂和/或至少一种缓冲组分。

在上述任选的一个或多个洗涤步骤之前或之后，可以在RNA结合到核酸结合固相的同时进行DNA酶消化。由此，可以进一步减少在分离的RNA中的基因组DNA污染量。实施相应的DNA酶消化的适当实施方式在本文中描述，也是在现有技术中已知的。相应的DNA酶消化步骤是任选的。

用于在RNA结合到核酸结合固相的同时实施DNA酶消化的条件可导致RNA，特别是小RNA从核酸结合固相部分地释放。因此，优选要确保可能释放的小RNA重新结合于核酸结合固相，以确保小RNA的高回收产量。取决于所用核酸结合固相的类型，例如使用基于柱的还是基于颗粒的方案，可采用不同的程序。

如果颗粒，如磁性颗粒用作核酸结合固相，进行任选的DNA酶消化后，可以加入离液剂和醇，从而建立结合条件以允许小RNA再结合于颗粒。为此目的，可利用包含，例如离液盐和/或醇的溶液。相应的溶液也可用作洗涤液。还可单独加入额外的醇，以增加醇的浓度进行再结合。上文结合步骤e)描述了合适的醇、醇浓度、离液盐和离液剂浓度。相同的条件可以用于再结合。

如果利用基于柱的核酸结合固相，优选在RNA结合到固相的同时进行任选的DNA酶消化(通常也称为柱上DNA酶消化)，然后进行以下步骤：

-收集在DNA酶消化过程中可能作为流出物从核酸结合固相释放的小RNA；

-使包含小RNA的所述流出物与含核酸结合固相的回收溶液混合，以便将所含的小RNA再结合于所述核酸结合固相。

为了确保在柱上DNA酶消化期间可能部分释放的RNA再结合核酸结合固相，并将释放的小RNA作为流出物收集，优选在DNA酶消化完成后将回收溶液流过柱。将在回收溶液建立的条件下可再结合的RNA牢固地再结合于核酸结合固相并可将“逃脱的”小RNA作为流出物收集，因此可以再结合于步骤e)所用的核酸结合固相。这样即使进行柱上DNA酶消化，小RNA的丢失也得到了防止。因此，利用回收溶液收集可能的“逃脱”小RNA并构建适合将小RNA再结合于步骤e)所用核酸结合固相的条件。回收溶液也可以通过混合一种或多种溶液和/或成分来获得。回收溶液提供的结合条件可以与步骤e)中所用的、将RNA包括小RNA结合于包含在柱中的核酸结合固相的条件相同或相似。然而，回收溶液优选也可构建比步骤e)中使用的结合条件更强的结合条件。还可通过混合一种或多种溶液或化学试剂获得的回收溶液，优选包含至少一种离液剂和/或至少一种醇。合适的离液剂和醇如上所述。优选地，离液剂选自下组：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠和尿素。优选利用离液盐。具体地说，盐酸胍和/或硫氰酸胍可用作离液剂。回收液中至少一种离液剂的浓度范围可以是0.5M至最高饱和极限。根据所用的离液剂，优选的浓度范围在约1M至7M、约1.5M至6M、约2M至5.5M，优选在约2.5至5.5M的范围内。

此外，用于将收集的小靶核酸结合于核酸结合固相的回收溶液可任选包含至少一种醇。作为醇，优选使用短链支链或非支链的醇，优选1至5个碳原子。例子是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。还可以使用醇的混合物。所述醇优选异丙醇或乙醇，分离RNA作为靶核酸时特别适宜的是异丙醇。醇的使用浓度≥50％v/v是有利的，优选≥60％v/v，≥70％。优选地，醇的浓度范围为约50％v/v-90％v/v/或约55％v/v至85％，更优选约60％v/v至80％v/v。WO2012/028737也描述了柱上DNA酶消化后相应的再结合步骤的细节，其通过引用并入本文。将可能逃脱的小RNA再结合于核酸结合固相后，再次进行一个或多个洗涤步骤。合适的条件如上所述。

如果需要进行洗脱步骤将RNA从固相洗脱，可利用，例如经典洗脱溶液，如水、洗脱缓冲液，尤其是生物学缓冲液，如Tris、MOPS、HEPES、MES、BIS-TRIS丙烷等实现洗脱。优选利用不干扰预期下游应用的洗脱溶液。洗脱后，可将洗脱液作热变性。然而，释放和由此通过其它洗脱手段(例如加热)从固相洗脱核酸也属于本发明的范围。

随后描述了合适的实施方式，其允许从包含RNA和DNA的样品分离总RNA，包括小RNA。在此，描述的实施方式能够与DNA平行地选择性分离总RNA，包括小RNA。因此，可按照本发明方法从同一样品分离RNA以及DNA。然而，如果需要，在纯化过程中，DNA也能仅被选择性消除，从而提供分离的总RNA，包括小RNA，不含DNA，特别是基因组DNA。在此，存在不同的选择以除去DNA。随后会描述非限制性的和优选的实施方式。此外，描述的实施方式对于消除样品中的DNA特别有效，藉此增加所分离RNA的纯度并避免纯化的RNA中有DNA污染。

根据一实施方式，步骤a)中提供的组合物包含RNA以及DNA，RNA和DNA在步骤e)后结合于核酸结合固相。根据一可行的实施方式，如果RNA和DNA均在步骤e)中结合于核酸结合固相，然后可进行差别洗脱过程，从而能够从总RNA，包括小RNA中单独分离DNA。例如，可在洗脱结合的RNA之前选择性地洗脱DNA，反之亦然。相应的差别洗脱条件是，例如WO 95/21849或EP 1693453所述。

根据进一步的实施方式，RNA分离过程中包括除去裂解物中所含DNA的中间步骤。根据一实施方式，通过加入特异性破坏DNA的适当酶，如DNA酶来破坏DNA。所述酶可以加入裂解物或步骤a)中提供的组合物中。用于实施相应的DNA酶消化步骤的合适实施方式是现有技术中已知的(参见WO 2011/104032)，因此，无需在此作任何进一步的描述。

从样品获得的裂解物也可任选地在步骤a)之前作进一步处理。例如，可以在裂解过程本身中将裂解物均质化。此外，可以净化裂解物以除去细胞碎片。裂解物净化方法可以涉及过滤和/或将细胞碎片和其它污染物结合到适当的表面，例如携带离子基团，特别是阴离子基团，如羧基的表面。

根据一实施方式，通过实施至少以下步骤获得步骤a)中提供的组合物：

-获得含有RNA和DNA的生物样品；

-裂解该样品，其中裂解优选涉及使用至少一种离液盐；

-任选地均质化裂解物；

-任选地净化裂解物；

-除去裂解物中的DNA。

根据本实施方式，优选通过在适当条件下将DNA选择性结合于核酸固相，然后将结合于核酸结合固相的DNA与仍包含RNA，包括小RNA的剩余样品分离从而除去DNA。这可以通过，例如在其中主要是DNA而非RNA结合于固相的条件下、将裂解物接触合适的核酸结合固相来实现。允许DNA结合的合适核酸结合固相是现有技术中熟知的。此外，上述用于RNA结合步骤的核酸结合固相，特别是含有硅的固相也可用于DNA结合。用于选择性地结合并由此除去DNA的合适方法描述于，例如EP 0 880 537和WO 95/21849，它们通过引用并入本文。例如，如果使用离液剂，例如离液盐，在没有短链醇，如乙醇或异丙醇存在下裂解样品，可以构建对DNA具有选择性的结合条件。如果需要，则结合的DNA被进一步使用，例如进一步处理，可以例如任选被洗涤，并从核酸结合固相洗脱，从而提供基本上不含RNA的DNA部分。因此，本发明还提供了可以从同一样品分离RNA和DNA的方法。然而，如果该DNA是不感兴趣的，且(仅)打算分离总RNA，包括小RNA的话，可以简单地弃去结合的DNA，。在这种情况下，此类DNA结合和除去步骤也是有利的，因为它降低了纯化的RNA中DNA污染的量。

当将DNA结合于核酸结合固相，例如含有二氧化硅的固相，并且将结合的DNA与剩余样品分离时，为本发明方法的步骤a)提供了DNA消除的含RNA组合物。

其中本发明方法用于平行分离DNA和RNA的优选实施方式包括以下步骤：

-获得含有RNA和DNA的生物学样品；

-裂解所述样品，其中裂解涉及使用至少一种离液盐；

-任选地均质化裂解物；

-任选地净化裂解物；

其中，所述DNA的分离包括以下步骤：

a)通过将DNA选择性结合于核酸结合固相并将结合的DNA与剩余样品分离以除去裂解物中的DNA，藉此提供包含离液盐的DNA消除的含RNA组合物，从而提供可用于步骤a)中作RNA分离的组合物；

b)任选地洗涤结合的DNA；

c)任选地在DNA结合到核酸结合固相的同时进行蛋白水解消化；

d)任选地洗涤结合的DNA；

e)任选地洗脱结合的DNA；

并且，其中RNA的分离包括以下步骤：

a)在DNA分离方法的步骤a)后获得DNA消除的含RNA组合物，其中所述组合物包含离液盐；

b)加入醇；

c)温育混合物至少2分钟，优选至少5分钟，其中，在所述温育步骤中，优选进行蛋白水解消化，其中优选为此目的在步骤b)之前加入蛋白水解酶；

d)将额外的醇加入混合物，以将该混合物中的总醇浓度调节至≥50％；

e)将该混合物中所含的RNA结合至核酸结合固相；

f)任选地洗涤结合的RNA；

g)任选地从固相洗脱RNA。

上文已解释了各步骤，可参见相应的内容。优选利用包含硅，例如二氧化硅的核酸结合固相，或玻璃核酸结合固相以便结合DNA和结合RNA。固相可以包含在柱中。

以下描述了DNA分离步骤的具体改进之处。根据一实施方式，蛋白水解消化在DNA分离的步骤c)中进行，同时DNA结合到核酸结合固相。在DNA结合到固相支持物的同时进行蛋白水解消化的一般优点和合适的消化条件描述于WO2009/016110中，其通过引用并入本文。人们发现，如果在有醇和离液盐的存在下进行蛋白水解消化，可实质性改善柱上的蛋白水解消化。因此，采用类似的消化条件在RNA分离过程的温育步骤c)中进行的蛋白水解消化。蛋白水解酶在有离液盐和醇的存在下显示出活性的增加。为进行蛋白水解消化，将包含醇与离液盐的组合物接触蛋白水解酶，优选蛋白酶K，然后将所得混合物与DNA所结合的核酸结合固相接触。优选地，包含蛋白水解酶的所得混合物包含的醇浓度范围选自：25％(v/v)至60％(v/v)，30％(v/v)至55％(v/v)，35％(v/v)至50％(v/v)和40％(v/v)至45％(v/v)；其包含的离液剂，优选离液盐，例如胍盐，浓度范围选自：0.75M至5M，1M至4M，1.25M至3.5M和1.5M至3.25M，1.5M至3M，1.75M至2.75M和2M至2.5M。

利用涉及离液剂和实质量醇的这些改进的消化条件，即便在低温下，例如15℃至35℃或15℃至30℃，以及由此的室温下，可以进行蛋白水解消化，同时将DNA结合到固相。无需加热步骤。这是很大的优势，因为用于加热的特定设备是过时的，藉此可将该方法集成于利用机器人系统的自动化工作流程中。此外，采用新颖的消化条件使得彻底消化所需的温育期缩短。例如，无论是5分钟还或是30分钟，蛋白水解消化达到基本相同的结果。因此，可采用非常短的温育时间。相比于现有技术中已知的柱上蛋白水解消化，这些是显著优势。

为进一步减少分离RNA中的DNA量，可以在如上所述将DNA结合于核酸固相从而自裂解物中除去DNA后，利用合适的酶进行降解DNA的中间步骤。进行DNA酶消化的优点在于可以有效除去残留的痕量DNA。根据一实施方式，对DNA消除的裂解物进行DNA酶消化。合适的条件描述于WO 2011/104032，其通过引用并入本文。在RNA结合前对裂解物进行DNA酶消化的优点在于在DNA酶消化过程中不会有小RNA丧失的风险。此外，与柱上DNA酶消化相比，可省去处理步骤。根据进一步的实施方式，RNA结合到核酸结合固相后，进行DNA酶处理。细节如上所述。如果进行柱上DNA酶消化，优选利用上述回收溶液收集可能逃脱的小RNA。可参考相应的内容。

术语“样品”在本文中以广义使用，旨在包括含有核酸的各种来源。样品可以是生物学样品，但该术语还包括其它，例如包含核酸的人工样品。示范性的样品包括但不限于：组织，通常包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、脂肪、胰腺、细胞培养物、体液；全血；血清；血浆；红细胞；白细胞；血沉棕黄层，肿瘤细胞，胎儿细胞，宿主和移植物细胞；拭子，包括但不限于口腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子、尿道拭子、子宫颈拭子、咽喉拭子、直肠拭子、病灶拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等；尿；痰；唾液；精液；淋巴液；液体；羊水；脑脊液；腹腔积液；胸腔积液；囊肿液体；滑液；玻璃体液；房水；囊液；眼洗出物；眼抽吸物；肺灌洗物；肺抽吸物；骨髓抽吸物，细胞悬液，以及从可能存在于样品中的任何细胞或微生物和病毒获得的裂解物、提取物或材料，等等。从包含核酸的临床或法医机构获得的材料也包括在术语样品的含义内。此外，本领域技术人员将了解，从任何上述示范性样品获得的裂解物、提取物或材料或它们的各部分也在术语样品的范围内。样品优选来自人、动物、植物、细菌或真菌的生物学样品。具体地说，术语“样品”是指含核酸的样品，也包括细胞。样品宜选自下组：细胞、组织、体液，例如血液、血液制品，如血沉棕黄层、血浆和血清，尿、液体、痰、粪便、脑脊液和精液、上皮拭子、活检样品、骨髓样品和各种组织样品。示范性组织样品如上所述。本发明方法特别适用于从纤维组织分离RNA。纤维组织包括但不限于：骨骼肌、心脏和主动脉。这些富含纤维的组织因富含收缩蛋白、结缔组织以及胶原蛋白而难以加工。因此，采用许多现有技术方案不能从相应的组织分离RNA。然而，如实施例所示，本发明方法能够从相应的样品有效分离总RNA，包括小RNA，即使纯化过程中不使用苯酚。

本发明方法也适用于处理血液样品，特别是利用，例如抗凝血剂稳定化的血液样品。用于稳定的血液样品的典型抗凝血剂包括但不限于EDTA和柠檬酸盐。为采用本发明方法分离RNA，或平行分离RNA和DNA，首先在红细胞裂解溶液中处理血液样品以裂解红细胞。裂解红血细胞的合适方案是现有技术中已知的。例如可以通过使用裂解红血球(即红细胞)的红细胞裂解组合物选择性裂解红细胞，但该组合物基本上不裂解白细胞。现有技术中已知的任何红细胞裂解缓冲液可用于此目的，相应的红细胞裂解缓冲液也可商品化购得。标准红细胞裂解缓冲液的合适实例包括但不限于：红血球裂解缓冲ELB1(320mM蔗糖，50mMTris/Cl pH 7.5，5mM MgCl₂，1％Triton X-100)或ELB2(155mM NH₄Cl,10mM KHCO₃)。然后通过，例如离心或将白细胞结合于适合结合白细胞的固相来收集白细胞。如果对RNA或RNA和DNA这两种类型的核酸均感兴趣的话，随后就按照上述的本发明方法从细胞沉淀物中将它们分离，。在此，优选在RNA分离方案的温育步骤c)期间还包括蛋白水解消化，因为结果显著改善。此外，如果打算额外分离DNA，还优选如上所述在将DNA结合到核酸固相的同时进行蛋白水解消化。

本文所用的术语“核酸”尤其指包含核糖核苷和/或脱氧核糖核苷的聚合物，它们通过共价键合，通常通过亚单位间的磷酸二酯键，但是在一些情况下通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。DNA包括，但不限于所有类型的DNA，如gDNA；环状DNA、质粒DNA和循环DNA。RNA包括，但不限于hnRNA；mRNA；胞外RNA、非编码RNA(ncRNA)，包括但不限于rRNA、tRNA、lncRNA(长非编码RNA)、lincRNA(长基因间非编码RNA)、miRNA(微小RNA)、siRNA(小干扰RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、snRNA(小核RNA)和stRNA(小瞬时RNA)、piRNA(piwi互动RNA)、tiRNA(转录起始RNA)、PASR(启动子相关RNA)、CUT(隐形不稳定转录物)。小RNA或术语小RNA种类尤其是指链长为500nt或更少，400nt或更少，300nt或更少，200nt或更少，100nt或更少，或50nt或更少的RNA，包括但不限于miRNA、siRNA、其它短干扰核酸，snoRNA等。在RNA是双链分子的情况下，以“nt”表示的链长是指“bp”。

本发明不限于本文公开的示范性方法和材料。数值范围包括定义该范围的数字。本文所提供的标题不是对本发明的各方面或实施方式的限制，本发明的各方面或实施方式可通过参考本说明书作为整体来理解。本文所用的术语“溶液”尤其是指液体组合物，优选水性组合物。它可以是仅有一个相的均质混合物，但是包含固体组分(例如沉淀物)的本发明所用的溶液也属于本发明的范围。根据一实施方式，本文所述的主题是指由相应步骤或成分构成的主题，在方法的情况下包括某些步骤，在组合物、溶液和/或缓冲液的情况下包括某些成分。优选选择和结合本文所述的优选实施方式，从相应的优选实施方式的组合所产生的特定主题也属于本发明。

实施例

实施例1：利用磁性二氧化硅颗粒分离RNA

采用本发明方法从不同组织样品中分离RNA。每个制品中，将10mg大鼠肾脏或20mg鼠肌肉处理作为组织样品。本发明的方案如下进行：

将组织样品在胍盐和非离子型洗涤剂(小于5％)的3,5M浓度裂解缓冲液中裂解和匀浆。

然后将匀浆和裂解的样品转移到能够处理磁性珠的机器人系统(QIAsymphony(凯杰公司))。加入20μl蛋白酶K和50μl磁性二氧化硅珠(MagAttract G，凯杰公司)。加入步骤可以以任何顺序进行。

此后，加入第一用量的乙醇，从而提供包含不同浓度乙醇(29％(v/v)，37％(v/v)或47％(v/v))的混合物。将得到的混合物在室温下温育并混合5分钟。在所述温育步骤中，因蛋白酶K的存在而进行蛋白水解消化。

在所述温育步骤后，在第二步骤中加入额外的乙醇以在结合混合物中建立60％(v/v)的最终浓度。进行进一步的混合步骤以确保与RNA接触，由此结合于磁性颗粒。

将结合的核酸洗涤两次，并进行DNA酶消化。对于将可能洗脱的RNA再结合于颗粒，加入含有离液剂和醇的再结合缓冲液并混合以再结合RNA。然后，用含醇的洗涤缓冲液再进行2个洗涤步骤。磁性颗粒与结合的RNA进行风干以蒸发醇，用不含RNA酶的水洗脱RNA。

为作比较，进行以下方案：

在第一方案中，进行相同的过程，然而，其中乙醇的最终浓度为37％(一步加入)。这对应于标准的RNA分离过程，它不旨在专门捕捉分离的总RNA中的小RNA，例如miRNA。

在第二方案中，乙醇的浓度在第一步骤中调节为60％(因此是有效结合小RNA所需要的最终乙醇浓度)调整。因此，在该变型方式中，没有本发明教导的分步方法。

结果示于图1和图2。图1示出肾脏组织样品获得的结果。采用在结合混合物中使用37％乙醇的标准RNA分离方案，回收了约12μg RNA。在一步中将乙醇浓度调节为60％，显著降低RNA产量。如果在一步中将醇浓度调节至60％乙醇来捕获小RNA，仅回收了约3.5μgRNA。相反，与利用37％乙醇的标准方案相比，按照本发明教导的分步方案导致类似或甚至更高的产量。如果在第一步中将醇浓度调节为37％，在第二步中调节为60％乙醇，RNA产量实现特别改善的结果。在此，与标准方案相比，总RNA产量甚至显著改善，可以回收约16μgRNA。因此，图1表明本发明法实现的具体优点。它能以良好的产量分离总RNA，此外还能捕获小RNA，如miRNA，而这采用仅使用37％乙醇的标准方案则无法捕获。通过测试也证实了小RNA的回收(使用miScript系统检测RNA miR-16)。标准方案(37％，1步)和所有其他方案(由于结合混合物中较高醇浓度也能分离小RNA)之间的差异在3.5至5个PCR循环，这对应于与在结合混合物中采用60％的方案相比，在较低乙醇浓度下，miRNA回收低10倍以上(数据未显示)。这证实了超过50％，优选约60％(v/v)的高醇浓度是有效捕获小RNA所需。然而，如果醇浓度在一步中调整为60％，总RNA产量显著降低。按照本发明的教导并且以分步方式加入醇克服了该缺点，由此能够以良好的产量分离总RNA，还包括小RNA。

图2显示了肌肉样品的结果。再次表明，与其中醇浓度在一步中调节至60％的方案相比，如本发明教导的分步加入醇提供更高的总RNA产量。

实施例2：采用基于柱的方案的RNA分离

采用本发明方法纯化10mg RNALater稳定化的大鼠肌肉组织中的RNA，包括小RNA。分离过程如下：

制备裂解物

使用转子定子，POLYTRON或珠磨机将10mg组织在350μl含离液剂的缓冲液(RLTplus，QIAGEN plusβ-巯基乙醇)中均质化。

除去DNA

将350μl裂解物施加到Allprep-DNA-离心柱并以14.000rpm离心1分钟。从而将基因组DNA(而非RNA)结合到离心柱，流出物可用于制备RNA。如果需要，也可对结合的DNA作进一步加工，以提供DNA作为单独的组分。因此，该方案还能从一样品中平行分离DNA和RNA。在该实验中，DNA不进一步处理，而是弃去。

分离RNA

从除去裂解物中DNA后获得的DNA消除流出物中分离RNA。该DNA消除的含RNA流出物与50μl蛋白酶K混合。向所述混合物中加入乙醇到混合物中36％的最终浓度。在一改变形式中，加入异丙醇。为作比较，混合物中不加入乙醇。然后将样品在室温下温育15分钟来进行蛋白水解消化，之后加入更多的醇(乙醇或异丙醇)将RNA结合条件调节至最终醇浓度为63％(v/v)或60％(v/v)。将所得混合物施加到RNeasy迷你柱并以14.000rpm离心1分钟。弃去流出物。

此后，洗涤柱结合的RNA并洗脱RNA。不进行柱上DNA酶消化。不进行柱上DNA酶消化。

作为对照和比较，进行miRNeasy方案。所述miRNeasy方案是基于苯酚/氯仿的方法，它能分离高量的纯RNA，包括小RNA。本发明的一个目的是提供能够产生类似结果的不含苯酚/氯仿的方法。

RNA产量通过NanoDrop测量来确定。相同体积的洗脱液用作miScript miRNA测定miR-25中的模板，并用于凝胶电泳分析。结果示于图3-5。

图3显示通过采用不同方法获得的总RNA产量。可以看出，以分步方式加入醇的本发明方法提供的产量类似于miRNeasy对照。乙醇和异丙醇获得相同的结果，从而确认不同的醇可用于该目的。

然而，如果不按照分步方法，而是在一步中直接加入乙醇将结合混合物中的醇浓度调节至60％，则获得的产量显著较低。电泳后的凝胶图片也证实了这些结果(见图4)。此外，miRNA测定的结果(见图5)也确认了本发明方法实现的改进之处。采用分步方式加入醇的本发明方法所分离的RNA在RT-PCR分析中达到的Ct值与基于苯酚/氯仿的miRNeasy试剂盒对照分离的RNA的相当。这证实了本发明方法的高性能。此外，图5显示，如果不按照相应的分步方法，而是将醇在一步中直接加入，也导致了显著较低的miRNA回收产量，这点可以从Ct值较高得出。

总而言之，本实施例表明，分步加入醇可以将总产量提高约1.5倍，miRNA回收产量也可以显著提高。在使用乙醇或异丙醇调节RNA结合条件的反复实验中证实了这一发现。

实施例3：采用基于柱的方法从不同组织中分离RNA

将本发明的方法(见实施例2)与不同方法进行比较，(分别)处理脑、心脏和肝脏样品。

采用以蛋白酶K消化含RNA的流出物和分步加入醇的本发明方法(参见实施例2)或不同的改变形式从心脏、脑、肝组织分离RNA。裂解缓冲液的使用浓度是3.5M GTC和3M GTC以供纯化。测定了以下改变形式：

改变形式(A)(本发明)：在用0.66体积的乙醇稀释之前加入50μl蛋白酶K。所示的乙醇体积是加入蛋白酶K之前存在的裂解物/流出物的体积。

改变形式(B)：在用0.166体积的H₂O稀释之前加入50μl蛋白酶K。所示的乙醇体积是加入蛋白酶K之前存在的裂解物/流出物的体积。

改变形式(C)：将50μl蛋白酶K加入含RNA的流出物，但维持未稀释以供蛋白酶K消化。

将样品在室温下温育15分钟并轻轻摇动，由此消化样品(蛋白酶K消化)。为进行后续的RNA柱结合，加入100％乙醇至结合混合物中的最终浓度为60％，以便共纯化小RNA。

相同体积的洗脱液在琼脂糖凝胶上进行分析。结果分别示于图6、7和8。可以看出，本发明方法(A)提供的产量显著高于其中不进行分步加入醇的方法。此外，与用水稀释裂解物(B)相比，也表明本发明方法所见的有益效果是分步加入醇所致，而非简单的裂解物稀释效果。再次证实了就可得的RNA产量而言，按照本发明教导可以获得极大改善。该洗脱物还作为模板在定量实时RT-PCR测定中分析了miRNA(miR-25)和较大mRNA(madh-7基因)。结果证实(参见madh-7的结果)本发明方法产生的总RNA产量更高。miRNA的产量相当。在其它组织样品，如脂肪、肌肉和肺中也获得类似的结果。在此，miRNA产量也与基于苯酚/氯仿的miRNeasy方法取得的结果相当(数据未示出)。比较裂解缓冲液中测试的离液剂浓度(3.5MGTC和3M GTC)显示在所测试组织类型的性能中没有差异。图6-8表明在大脑、肝脏和心脏组织中可获得的产量的差异，由此证明了与裂解物不稀释或通过加入H₂O稀释的方法相比，在离液盐(GTC)/乙醇混合物中进行蛋白酶K消化的优点。如果不进行用H₂O的稀释是有利的，因为用H₂O稀释严重增加需要随后处理的液体量，并且因此增加了为实现RNA结合混合物中醇浓度超过50％，优选至少60％而必须要加入的醇量。处理如此大样品体积对于用户不方便，因为结合混合物必须可能多次施加到离心柱以确保整个结合混合物通过该柱。在这方面，本发明方法还提供了显著的优势，因为样品体积的总量保持在较低水平。

优选在裂解缓冲液中使用3.5 GTC的浓度，因为它改善了DNA性能，和由此的DNA除去。由图6-8可以看出，从心脏组织获得的样品没有观察到基因组DNA污染。从脂肪、肌肉或肺分离的RNA中也未发现DNA污染。然而，在分离自脑的RNA中鉴定到少量DNA，自肝脏组织分离RNA时区别也不大。因此，对于各组织，优选进行本文所述的额外柱上DNA酶消化。因此，采用本发明方法还从这些组织提供无DNA的RNA洗脱物。

实施例4：DNA分离步骤的改善

如本文所述，本发明方法可用于从同一样品中平行分离RNA和DNA。分离DNA的一般方法是现有技术中已知的，相应在此实施。关于样品的裂解和DNA结合于离心柱，我们指的是实施例2的描述。将DNA结合到离心柱后，DNA消除的流出物可用于RNA制备。然后可用含有例如离液盐和醇的合适洗涤缓冲液洗涤结合的DNA，并将该以14.000rpm离心1分钟。弃去流出物。

为改善DNA分离，在DNA结合于固相的同时进行蛋白水解消化。相应的柱上的蛋白水解消化是现有技术中已知的(参见例如WO 2009/016110)。实施例4表明，如果在包含离液剂和醇的溶液中进行蛋白水解消化，DNA产量可以显著改善。甚至能够在室温下进行蛋白水解消化，从而无需在蛋白水解消化过程中保持高温，例如56℃。其中柱上蛋白水解消化在离液/醇环境中进行的本发明具体实施方式甚至显示出超过在56℃下、水中进行消化的标准方法的改善结果。

以下实验证明了这些有利的结果：

采用本发明方法(见实施例2)纯化DNA。在DNA结合于柱的同时进行柱上蛋白酶K消化(UAP)。在56℃下、水中(A)或在室温下、离液剂-乙醇环境中(B)进行柱上蛋白酶K消化。为建立离液剂-乙醇环境，将20μl蛋白酶K与包含3 MGTC和约60％乙醇的溶液混合。

作为对照，进行传统方法(Allprep DNA/RNA)，这基本与DNA结合步骤相同，但其中未在柱上进行蛋白酶K消化(AP旧)。

不同组织类型的结果示于图9。其中，用相同体积的洗脱液实施凝胶电泳。

结果可以看出，如本文所教导的，如果在离液剂/醇环境中实施消化，在DNA结合于核酸结合固相的同时引入蛋白酶K消化导致对于某些组织类型，例如肺、脂肪和肾的DNA产量增加。

此外，测试了在DNA结合到核酸结合固相的同时，蛋白水解过程中的温育是否可在不同的“室温下”可靠地进行，这情况可能会在不同的实验室中出现。因此，测试了15到25℃和30℃的温度。采用本发明方法，在所示不同的室温下，在DNA制备步骤期间进行柱上蛋白酶K消化，从各种RNALater稳定化大鼠组织纯化DNA(+PK)。作为对照，实施传统Allprep方法(AP旧)，而不作柱上蛋白酶K消化。DNA产量通过NanoDrop测量来确定。

结果示于图10a)至c)。测试的所有温度显示相当的产量，表明蛋白水解消化良好起作用。此外，这些实施例表明，如果在DNA结合到核酸结合固相的同时不作额外的蛋白水解消化，某些组织，例如肌肉的DNA产量可能特别低。因此，如本文教导的，在离液剂/醇混合物中实施柱上蛋白水解消化具有显著的优点。

此外，为了节省时间，分析了在DNA结合到核酸结合固相的同时作蛋白水解消化所需的温育时间是否可以减少。采用本发明的新方法从RNALater稳定化大鼠心脏和肌肉组织纯化DNA，包括在DNA结合步骤中进行柱上蛋白酶K消化5、10、20和30分钟。作为对照，进行传统的Allprep方法(AP旧)，而不作柱上蛋白酶K消化。DNA产量通过NanoDrop测量来确定。结果示于图11a和11b。5至30分钟的温育时间表明可比产量远高于与在DNA结合于核酸结合固相的同时不作蛋白水解消化的旧方法得到的产量。因此，可能采用很短的温育时间，例如5分钟或更少。

实施例5：采用分步加入乙醇和蛋白酶K消化分离RNA

采用本发明方法从10mg RNALater稳定化的大鼠肌肉组织中分离RNA，包括小RNA，其中将DNA选择性结合于合适的核酸结合固相而消除了DNA的Allprep迷你离心流出物，对其进行蛋白酶K消化(细节参见实施例2)。首先，将50μl蛋白酶K加入裂解物，然后在该混合物移入(A)产生60％的RNA结合条件所需的全体积乙醇或(B)只有其一半并设定浓度为46％，然后在21℃进行15分钟的温育以供蛋白酶K消化。进行蛋白酶K消化后，向后者(B)加入所需的第二部分乙醇以达到RNA柱结合的60％最终浓度。因此，设置B对应于本发明的方法，其中，逐步加入构建结合条件所需的醇。

总RNA得率通过NanoDrop测量来确定。相同体积的洗脱液用作miRNA测定miR-16中的模板。用相同体积的洗脱液进行凝胶电泳。该结果示于图12、13和14，再次确认本发明方法实现的优点。

此外，采用本发明方法，对消除了DNA的Allprep迷你离心柱流出物进行蛋白酶K消化，从10mg RNALater稳定化的大鼠肌肉组织中纯化RNA，包括小RNA。加入50μl蛋白酶K后，向混合物中加入36％最终浓度的乙醇等分试样(B)或不加乙醇(C)，随后在室温下温育15分钟以便蛋白酶K消化。然后，将所有样品中结合到RNeasy离心柱所需的乙醇体积调节至60％的终浓度。所以，改变形式B仍对应于本发明方法。RNA产量仍通过NanoDrop测量测定。相同体积的洗脱液作为miRNA测定miR-25中的模板。此外，用相同体积的洗脱液进行凝胶电泳完成。结果示于图15、16和17，再次证实了分步加入醇的优点。

此外，分析了提供蛋白水解消化最佳效果的温育时间。在此，采用本发明方法，在加入第一乙醇体积(将混合物中的浓度调节为37％(v/ⅴ))后进行蛋白酶K消化5、10、15或30分钟，从RNALater稳定化的大鼠脂肪和肌肉组织中纯化RNA，包括miRNA。所得到的产量由NanoDrop测量来确定。相同体积的洗脱液在miRNA测定miR-25和较长mRNA扩增子madh-7的RT-PCR分析中用作模板。

作为对照，使用miRNeasy试剂盒纯化RNA。

在优选的实施方式中，在处理高脂肪含量的组织，例如脂肪和脑时，优选进行额外的氯仿提取步骤。为此目的，DNA消除之后获得的流出物与氯仿混合并剧烈振荡10到15秒。然后，将混合物在4℃下全速离心3分钟。然后将上清液(水相)转移到新容器中，从而提供包含RNA和离液盐的组合物用于本发明RNA分离方法的步骤A。然后采用本文所述的方法从相应的水相分离RNA。因此，作为下一步骤，加入蛋白酶K。

脂肪(图18)和肌肉(图19)组织的结果显示5至30分钟的温育时间导致下游应用分析无显著差异；ct值相似，产量相当。然而，5分钟的温育时间显示肌肉组织的mRNA测定(MADH-7)中的Ct值较高，优选使用至少7.5分钟，更优选10分钟的温育时间。

如果使用更高量的原料，例如20mg的新鲜或冷冻组织，而非10mg组织，蛋白酶K的浓度应该增加。

在大多数方法中，在规定的温度下，在热振荡器中进行的蛋白酶K消化伴有恒定振荡。然而，对于客户，最好不使用热振荡器进行蛋白酶K消化，此外，还能将本方法整合入自动化系统。因此，研究了蛋白酶K消化期间是否可以采用室温(15-25℃)，而不损失性能，以及消化过程中的振荡是否会带来优点或没有。为此目的，采用本发明方法从20mg RNALater稳定化的大鼠肌肉组织中纯化RNA，包括miRNA，其中在加入第一用量的乙醇后，在不同温度下(15℃、18℃、20℃、25℃、30℃)进行蛋白酶K消化，伴有或不伴有1.000rpm的振荡。产量通过NanoDrop测量来确定。相同体积的洗脱液在miRNA测定miR-25和较长mRNA扩增子madh-7的RT-PCR测定中用作模板。

结果表明RNA得率和Ct值相当，与蛋白酶K消化条件，例如温度或振荡无关(数据未显示)。因此，可能在室温下进行蛋白水解消化而不作振荡。

实施例6：采用柱上DNA酶消化和再结合过程分离RNA

特别是对于富含DNA的特定组织，在RNA分离过程中包括DNA酶消化是有利的，即使基因组DNA被预先除去。在RNA分离期间实施相应的DNA酶消化能够去除残留的DNA污染。然而，如果实施柱上DNA酶消化，有小RNA丢失的风险。因此，实施例6中包括了再结合步骤，其中在DNA酶消化后，回收溶液流通过柱，然后收集流出物。相应所收集的流出物包含在DNA酶消化过程可能已释放的小RNA。然后将相应收集的部分再施加到柱中，以便将小RNA再结合于柱上。可以由此实现的改善指出显示于图20-22。在此，采用本发明的教导从不同的RNALater稳定化的大鼠组织和Jurkat细胞纯化RNA(具体见实施例2)，然而，其中在RNA结合于柱后进行DNA酶消化。进行DNA酶I消化后，进行普通的洗涤步骤，或利用本文教导的回收溶液进行再结合步骤(FRN-再结合)。相同体积的洗脱液在miRNA测定miR-16和miR-25中用作模板。所用的回收溶液包含高浓度的离液盐，即，5M胍盐。

结果表明，其中利用回收溶液的方法产生的Ct值显著低于其中DNA酶消化后进行普通洗涤步骤的方案。附图显示这样的操作是有利的，即，将包含回收溶液和可能逃脱的小RNA的收集流出物再施加于柱以确保相应逃脱的小RNA再结合于柱，因此小RNA在纯化过程中不会丢失。

优选在进行DNA酶消化之前，首先使用合适的缓冲液，例如含有醇的洗涤缓冲液洗涤结合的RNA。由此，确保了DNA酶活性不会因包含在柱中的残留量离液剂和蛋白酶K而受到抑制。通过在DNA酶处理之前进行洗涤步骤，确保了DNA酶以完全的效率起作用，并可以完全消化任何剩余的基因组DNA污染物。

实施例7：从细胞培养物分离RNA和DNA

采用本发明的方案(分步加入醇和在第一次加入醇后进行蛋白酶K消化-UAP+PK)，或者在分离过程中不包括蛋白酶K消化并在一步中加入醇(UAP-PK)来平行分离RNA和DNA。通过采用或不采用DNA酶消化来进行RNA分离。测试了以下细胞系：K562(悬浮液中)、Hela细胞(贴壁)、COS-7(贴壁)、CHO-K1(贴壁)、HEPG-2(贴壁)、MCF-7(贴壁)。结果示于图23。可以看出，在所有测试的细胞系中，当以分步方式加入醇并在加入第一用量的醇之后在温育步骤期间进行蛋白水解消化时，结果极大改善。对相同体积的样品洗脱液的mRNA扩增子肌动蛋白或miRNA miR-16进行实时RT-PCR也证实了改善的结果。在所有的情况下，本发明的方案实现了较好的Ct值(数据未示出)。结果表明，当采用本发明方法分离RNA时，大多数细胞系显示出明显更好的性能，其中醇分步加入并在加入第一用量的醇之后进行蛋白酶K消化。此外，当如本文所教导的，在DNA结合到固相的同时在离液剂/醇环境中进行蛋白水解消化时，还发现DNA产率可以得到改善。

实施例8：从全血样品中分离RNA和DNA

首先用红细胞裂解缓冲液处理抗凝剂(EDTA)稳定的全血样品，以裂解红细胞。白细胞作为沉淀物收集，采用本发明教导的方法从沉淀物中纯化RNA和DNA，其中分步加入醇并在加入第一用量的醇后进行蛋白水解消化(UAP+PK)。为作比较，进行相同的方案，然而，在RNA分离中不包括蛋白水解消化，并且不以分步方式加入醇(UAP-PK)。进行包括柱上DNA酶消化的或不作相应的DNA酶消化的实验。将等量的洗脱物施加在1％甲醛凝胶上来分析得到的洗脱物。

从两个不同供体的EDTA稳定血液获得的结果示于图24a和24b。作为对照，进行miRNeasy方案(包括苯酚/氯仿提取步骤)。结果表明，当采用本发明方法时可以改善RNA产量(见图24a和24b)。

实施例9：从脑分离RNA

按照实施例2所述的方案从脑样品分离RNA，但有以下改变。由于脑具有非常高的脂肪含量，对DNA消除的流出物进行实施例5所述的氯仿提取步骤。此外，如实施例6所述进行柱上DNA酶消化和随后的再结合步骤。为作比较，采用基于苯酚-氯仿的miRNeasy方案分离RNA。相同体积的洗脱液在miRNA(miR-25和miRNA 16)的定量、实时RT-PCR分析中用作模板。结果示于图25a和25b，并确认即便对于困难的样品，例如脑，采用本发明方法实现的分离结果与基于苯酚-氯仿的方法相当。

Claims (39)

1.一种从样品分离RNA，包括长度为200nt或更少的小RNA的方法，包括以下步骤：

a)提供包含RNA和离液剂的组合物；

b)加入醇；其中

i)步骤b)中醇的加入量相当于为在步骤e)中进行结合而加入的总醇浓度的40％至80％，和/或

ii)步骤b)中醇的加入量，使得所得混合物包含的醇浓度范围选自：25％(v/v)至45％(v/v)；

c)温育步骤b)的混合物至少2分钟；

d)将额外的醇加入步骤c)的温育的混合物以将混合物中的总醇浓度调节至≥50％v/v；

e)将该混合物中所含的RNA结合至核酸结合固相，其中在步骤e)之后，RNA，包括小RNA结合于该同一核酸结合固相；

f)任选地洗涤该结合的RNA；和

g)任选地从固相洗脱RNA；

其中，所述醇选自：甲醇、乙醇、丙醇和它们的混合物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，利用蛋白水解酶进行蛋白水解消化。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

i)步骤b)中醇的加入量相当于为在步骤e)中进行结合而加入的总醇浓度的55％至65％；和/或

ii)步骤b)中醇的加入量，使得所得混合物包含的醇浓度范围选自：30％至40％(v/v)。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，

i)步骤b)中醇的加入量相当于为在步骤e)中进行结合而加入的总醇浓度的55％至65％；和/或

ii)步骤b)中醇的加入量，使得所得混合物包含的醇浓度范围选自：30％至40％(v/v)。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中：

i)在15℃至30℃的温度下进行温育；和/或

ii)温育至少2.5分钟。

6.如权利要求5中所述的方法，其特征在于，在步骤c)中：ii)温育至少3分钟。

7.如权利要求5中所述的方法，其特征在于，在步骤c)中：ii)温育至少5分钟。

8.如权利要求5中所述的方法，其特征在于，在步骤c)中：ii)温育至少为7.5分钟。

9.如权利要求5中所述的方法，其特征在于，在步骤c)中：ii)温育至少10分钟。

10.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中温育的混合物包含：

-RNA；

-离液盐，浓度选自：1-5M；

-蛋白水解酶；和

-醇，其浓度选自：≥25％(v/v)和≤42.5％(v/v)。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离液盐的浓度为1.5-4.5M。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离液盐的浓度为2-4 M。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离液盐的浓度为2.5M-3.75M。

14.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤c)中温育的混合物包含：

-RNA；

-离液盐，浓度选自：1-5M；

-蛋白水解酶；和

-醇，其浓度选自：≥25％(v/v)和≤42.5％(v/v)。

15.如权利要求1-4和14中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)和步骤d)中加入的醇具有一种以下特征：

ii.其选自：甲醇、乙醇、异丙醇和它们的混合物；

iii.其选自：异丙醇和乙醇；

iv.其是乙醇。

16.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，通过实施至少以下步骤获得在步骤a)中提供的组合物：

-获得含有RNA的生物学样品；

-裂解所述样品，其中所述裂解涉及使用至少一种离液盐；

-任选地均质化裂解物；

-任选地净化裂解物。

17.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过实施至少以下步骤获得在步骤a)中提供的组合物：

-获得含有RNA的生物学样品；

-裂解所述样品，其中所述裂解涉及使用至少一种离液盐；

-任选地均质化裂解物；

-任选地净化裂解物。

18.如权利要求10所述的方法，其特征在于，通过实施至少以下步骤获得在步骤a)中提供的组合物：

-获得含有RNA的生物学样品；

-裂解所述样品，其中所述裂解涉及使用至少一种离液盐；

-任选地均质化裂解物；

-任选地净化裂解物。

19.如权利要求1-4、14、17和18中任一项所述的方法，其特征在于，通过实施至少以下步骤获得步骤a)中提供的组合物：

-获得含有RNA和DNA的生物样品；

-裂解该样品，其中裂解涉及使用至少一种离液盐；

-任选地均质化裂解物；

-任选地净化裂解物；

-除去裂解物中的DNA。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，通过实施一个或多个以下步骤从裂解物中除去DNA：

-在裂解物中进行DNA酶消化；

-将DNA选择性结合于核酸结合固相并将结合的DNA与剩余样品分离，藉此为权利要求1所述方法的步骤a)提供DNA消除的含RNA组合物。

21.如权利要求1-4、14、17和18中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸结合固相

i.包含在柱中；

或

ii.由颗粒提供；

和其中所述核酸结合固相为含硅材料。

22.如权利要求1-4、14、17和18中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤e)中，利用包含在柱中的核酸结合相，并且在RNA结合后，进行柱上DNA酶消化；其中，在所述DNA酶消化后进行以下步骤：

-收集在DNA酶消化过程中可能作为流出物从核酸结合固相释放的小RNA；

-使包含小RNA的所述流出物与含核酸结合固相的回收溶液混合，以便将所含的小RNA结合于所述核酸结合固相。

23.如权利要求1-4、14、17和18中任一项所述的方法，其特征在于，磁性颗粒用作核酸结合固相，其中所述方法具有一个或多个以下特征：

i)磁性颗粒在步骤a)到e)之一加入，

ii)在有离液剂存在下裂解含有RNA和DNA的样品，从而为权利要求1的步骤a)提供含RNA的组合物，进行步骤b)至d)，步骤e)之后，RNA和DNA，包括小RNA结合到磁性颗粒，结合之后，进行一个或多个洗涤步骤和DNA酶消化，进行DNA酶消化后，加入离液剂和醇以将DNA酶消化期间可能释放的RNA再结于磁性颗粒，任选进行一个或多个洗涤步骤并将该RNA从磁性颗粒洗脱。

24.如权利要求1-4、14、17和18中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是为平行分离RNA和DNA，其中所述方法包括以下步骤：

-获得含有RNA和DNA的生物学样品；

-裂解所述样品，其中裂解涉及使用至少一种离液盐；

-任选地均质化裂解物；

-任选地净化裂解物；

其中，所述DNA的分离包括以下步骤：

a1)通过将DNA选择性结合于核酸结合固相并将结合的DNA与剩余样品分离以除去裂解物中的DNA，藉此提供包含离液盐的DNA消除的含RNA组合物，从而可用于RNA分离的步骤a2)；

b1)洗涤结合的DNA；

c1)在DNA结合到核酸结合固相的同时进行蛋白水解消化；

并且，其中RNA的分离包括以下步骤：

a2)在DNA分离方法的步骤a1)后获得DNA消除的含RNA组合物，其中所述组合物包含离液盐；

b2)加入醇，藉此提供包含醇的混合物，其中醇浓度为≥25％(v/v)和≤42.5％(v/v)；

c2)在有蛋白水解酶存在下，温育该混合物至少2分钟；

d2)将额外的醇加入该混合物，以将该混合物中的总醇浓度调节至≥55％；

e2)将该混合物中所含的RNA和小RNA结合至核酸结合固相。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，在DNA分离过程中，在DNA结合到核酸结合固相的同时，在步骤c1)中进行蛋白水解消化，并且其中所述的蛋白水解消化具有以下一个或多个特征：

i)利用蛋白水解酶，并在有醇和离液盐存在下进行蛋白水解消化；

ii)为进行蛋白水解消化，加入蛋白水解组合物，其包含蛋白水解酶、醇和离液盐；

iii)蛋白水解消化是在15℃至30℃的温度下进行；和/或

iv)蛋白水解消化的时间选自：3分钟至45分钟。

26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，在RNA分离过程中，在步骤e2)中RNA结合到核酸结合固相之后，进行DNA酶消化，并且其中DNA酶消化期间，可能释放的小RNA与结合固相再结合。

27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，在RNA分离过程中，在步骤e2)中RNA结合到核酸结合固相之后，进行DNA酶消化，并且其中DNA酶消化期间，可能释放的小RNA与结合固相再结合。

28.如权利要求1-4、14、17、18、25、26和27中任一项所述的方法，其特征在于，具有一个或多个以下特征：

i)该核酸结合固相是含硅材料；

ii)该样品是包含细胞的样品。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，该样品是组织样品。

30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，该样品是纤维组织样本。

31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述含硅材料是二氧化硅、聚硅酸材料、硼硅酸盐、硅酸盐或无机玻璃。

32.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，

ii)步骤b)中醇的加入量，使得所得混合物包含的醇浓度范围选自：32.5％至38％(v/v)。

33.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述蛋白水解酶为蛋白酶K；和

所述醇的浓度≥32.5％(v/v)且≤40％(v/v)。

34.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述的蛋白水解酶为蛋白酶；和/或

iv)蛋白水解消化的时间选自：5分钟至30分钟。

35.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述颗粒为磁性颗粒；

和含硅材料为二氧化硅、聚硅酸材料、硼硅酸盐、硅酸盐或无机玻璃。

36.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述DNA的分离还包括以下步骤：

d1)洗涤结合的DNA；

e1)洗脱结合的DNA。

37.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述RNA的分离还包括以下步骤：

f2)洗涤结合的RNA；

g2)从固相洗脱RNA。

38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述RNA的分离还包括以下步骤：

f2)洗涤结合的RNA；

g2)从固相洗脱RNA。

39.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，利用蛋白水解酶进行蛋白水解消化，其中所述蛋白水解酶在步骤b)之前加入。