CN105385681B - 一种用于鲆鲽鱼类血液rna提取的裂解液 - Google Patents
一种用于鲆鲽鱼类血液rna提取的裂解液 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适应于鲆鲽鱼类血液RNA提取的裂解液,由盐酸胍、异硫氰酸胍、甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、水饱和酚、三(2‑羧乙基)膦、8－羟基喹啉、枸橼酸钠、乙二胺四乙酸、甘油、乙酸钠、氯化钠和DEPC水按照比例配制而成。使用本发明裂解液提取的鲆鲽鱼类血液RNA浓度高、完整性好、OD260/OD280比值均在2.0以上，OD260/OD230比值均在2.2以上，裂解液在室温下具有良好的稳定性。应用本发明所提供的裂解液提取的鲆鲽鱼类血液RNA，可以完全满足下游鱼类分子生物学及鱼类免疫学各项实验的质量要求。
Description
技术领域
本发明属于RNA提取试剂技术领域，具体涉及一种用于鲆鲽鱼类血液RNA提取的裂解液。
背景技术
鱼类是目前已知兼具固有与获得性免疫最低等的脊椎动物,也具有完全的体液和细胞免疫应答。鱼类血液作为各种免疫细胞的载体，在鱼类整体免疫系统研究中具有十分重要的作用。
近年来随着qPCR、miRNA、RNA-seq等新兴分子生物学研究技术的不断发展，在RNA水平对生命事件进行更为深入的研究已逐渐成为生命科学领域的焦点。在此类研究中，组织样品中RNA的提取是最为基础和关键的步骤，RNA提取的浓度、纯度、完整性都直接决定着后续研究工作的成功与否。RNA作为一种极不稳定的高分子化合物，可因温度变化、紫外线照射和PH值改变等理化因素的影响而发生降解。并且由于自然界中极难灭活的RNA酶的广泛存在，对实验过程中提取RNA的完整性和产量造成严重影响。鱼类血液因其RNA含量低且富含RNA酶等特点，提取的RNA总量往往不能满足后续实验要求，一直被认为是鱼类RNA提取的难点。
为了提取高质量的鱼类血液RNA，裂解液的成分至关重要。目前针对RNA提取的方法主要有酚-SDS法、异硫氰酸胍-苯酚法、AGPC法等。每种提取方法的核心是采用了不同的裂解液配方。但上述方法在进行鱼类血液RNA提取时，总RNA得率较低、杂质污染较为严重，不能满足下游鱼类分子生物学及鱼类免疫学各项实验的质量要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种适应于鲆鲽鱼类血液RNA提取的裂解液，应用本发明所提供的裂解液提取的鲆鲽鱼类血液RNA，可以完全满足下游鱼类分子生物学及鱼类免疫学各项实验的质量要求。
本发明提供的鲆鲽鱼类血液RNA提取的裂解液是在DEPC(焦碳酸二乙酯)处理后的水中添加盐酸胍、异硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、水饱和酚、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、8－羟基喹啉、枸橼酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘油、乙酸钠和氯化钠制成的。
上述裂解液中盐酸胍的浓度为50-350g/L，优选地，其使用浓度为100-300g/L，更优选地为250g/L。
本发明中异硫氰酸胍，其浓度为50-300g/L，优选地，其使用浓度为100-250g/L，更优选地为200g/L。
本发明中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，其浓度为2-30g/L，优选地，其使用浓度为5-20g/L，更优选地为10g/L。
本发明中十二烷基硫酸钠(SDS)，其浓度为2-20g/L，优选地，其使用浓度为5-10g/L，更优选地为8g/L。
本发明中水饱和酚，其体积百分含量为1％-10％，优选地，其使用的体积百分含量为2％-8％，更优选地为5％。
本发明中三(2-羧乙基)膦(TCEP)，其体积百分含量为0.5％-5％，优选地，其使用的体积百分含量为1％-3％，更优选地为2.5％。
本发明中8－羟基喹啉，其体积百分含量为0.05％-1％，优选地，其使用的体积百分含量为0.1％-0.5％，更优选地为0.2％。
本发明中枸橼酸钠，其使用浓度为25mmol/L。
本发明中乙二胺四乙酸(EDTA)，其浓度为30mmol/L。
本发明中甘油，其体积百分含量为3.5％。
本发明中乙酸钠，其浓度为0.1mol/L。
本发明中氯化钠，其浓度为50g/L。
本发明提供的鲆鲽鱼类血液RNA提取裂解液通过各成分的有效配比，使提取的鲆鲽鱼类血液RNA浓度高、完整性好、OD260/OD280比值均在2.0以上，OD260/OD230比值均在2.2以上，同时该裂解液具有良好的稳定性，可以完全满足下游鱼类分子生物学及鱼类免疫学各项实验的质量要求。
附图说明
图1为使用本发明提供的裂解液提取的鲆鲽鱼类血液组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为使用本发明提供的裂解液提取的鲆鲽鱼类血液组织总RNA经反转录后，对β-actin基因进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。
图3：实施例2的荧光定量PCR图。
具体实施方式
申请人经过对组分和配比的长期优化，使该裂解液提取的鲆鲽鱼类血液RNA浓度高、完整性好、杂质污染极少，且裂解液具有良好的稳定性；从而促成了本发明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：裂解液的制备(1L)
本实施例的裂解液，其制备步骤如下：
1)在RNase-free的超净工作台中，量取500ml的DEPC(焦碳酸二乙酯)水加入2L烧杯中；
2)将250g的盐酸胍加入烧杯中；
3)将200g的异硫氰酸胍加入烧杯中；
4)将10g的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入烧杯中；
5)将8g的十二烷基硫酸钠(SDS)加入烧杯中；
6)将50ml的水饱和酚加入烧杯中；
7)将25ml的三(2-羧乙基)膦(TCEP)加入烧杯中；
8)将2ml的8－羟基喹啉加入烧杯中；
9)将7.35g的枸橼酸钠加入烧杯中；
10)将8.76g的乙二胺四乙酸(EDTA)加入烧杯中；
11)将35ml的甘油加入烧杯中；
12)将8.2g的乙酸钠加入烧杯中；
13)将50g的氯化钠加入烧杯中；
14)搅拌溶解，加DEPC(焦碳酸二乙酯)水定容至1L。
裂解液配制完成后，需封口室温或冷藏(-4℃)备用。
使用本发明提供的裂解液提取的鲆鲽鱼类血液RNA的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，28s条带亮度是18s亮度的二倍，同时测得的鱼类血液RNA浓度为800-1100ng/μl，吸光度OD260/OD280比值均在2.0以上，OD260/OD230比值均在2.2以上，说明获得的RNA浓度高、纯度佳、完整性好、无DNA和蛋白质污染。
使用本发明提供的裂解液提取的鲆鲽鱼类血液RNA经反转录后，对β-actin基因进行PCR扩增，琼脂糖电泳凝胶检测结果如图2，其电泳条带完整、清晰、特异性好，说明此RNA能满足后续的Real Time RT-PCR、Northern blot、基因克隆等下游鱼类分子生物学及鱼类免疫学各项实验的质量要求。
实施例2：荧光定量PCR(qPCR)检测血液中免疫基因表达
采用实施例1中制备的本发明的裂解液进行鲆鲽鱼类感染细菌0h、1h、3h、5h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、110h后血液RNA提取，反转录cDNA之后，以18s为内参基因进行IL-1β基因的荧光定量PCR，结果如图3所示，在感染细菌8h时IL-1β基因与0h对照组相比有一个800倍左右的显著上调过程，8h之后IL-1β基因的表达量逐渐随着时间增加而减少。由以上结果可知，使用本发明裂解液提取得到的RNA完全满足下游鱼类分子生物学及鱼类免疫学实验的质量要求。
实施例3：本发明裂解液配方与各种裂解液配方对鲆鲽鱼类血液RNA提取效果的比较
裂解液1：250g/L的盐酸胍、200g/L的异硫氰酸胍、10g/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、8g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积百分含量5％的水饱和酚、体积百分含量2.5％的三(2-羧乙基)膦(TCEP)、体积百分含量0.2％的8－羟基喹啉、25mmol/L的枸橼酸钠、30mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、体积百分含量3.5％的甘油、0.1mol/L的乙酸钠、50g/L的氯化钠和DEPC(焦碳酸二乙酯)水。
裂解液2：200g/L的异硫氰酸胍、10g/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、8g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积百分含量5％的水饱和酚、体积百分含量2.5％的三(2-羧乙基)膦(TCEP)、体积百分含量0.2％的8－羟基喹啉、25mmol/L的枸橼酸钠、30mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、体积百分含量3.5％的甘油、0.1mol/L的乙酸钠、50g/L的氯化钠和DEPC(焦碳酸二乙酯)水。
裂解液3：250g/L的盐酸胍、10g/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、8g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积百分含量5％的水饱和酚、体积百分含量2.5％的三(2-羧乙基)膦(TCEP)、体积百分含量0.2％的8－羟基喹啉、25mmol/L的枸橼酸钠、30mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、体积百分含量3.5％的甘油、0.1mol/L的乙酸钠、50g/L的氯化钠和DEPC(焦碳酸二乙酯)水。
裂解液4：250g/L的盐酸胍、200g/L的异硫氰酸胍、8g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积百分含量5％的水饱和酚、体积百分含量2.5％的三(2-羧乙基)膦(TCEP)、体积百分含量0.2％的8－羟基喹啉、25mmol/L的枸橼酸钠、30mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、体积百分含量3.5％的甘油、0.1mol/L的乙酸钠、50g/L的氯化钠和DEPC(焦碳酸二乙酯)水。
裂解液5：250g/L的盐酸胍、200g/L的异硫氰酸胍、10g/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、体积百分含量5％的水饱和酚、体积百分含量2.5％的三(2-羧乙基)膦(TCEP)、体积百分含量0.2％的8－羟基喹啉、25mmol/L的枸橼酸钠、30mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、体积百分含量3.5％的甘油、0.1mol/L的乙酸钠、50g/L的氯化钠和DEPC(焦碳酸二乙酯)水。
裂解液6：250g/L的盐酸胍、8g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积百分含量5％的水饱和酚、体积百分含量2.5％的三(2-羧乙基)膦(TCEP)、体积百分含量0.2％的8－羟基喹啉、25mmol/L的枸橼酸钠、30mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、体积百分含量3.5％的甘油、0.1mol/L的乙酸钠、50g/L的氯化钠和DEPC(焦碳酸二乙酯)水。
裂解液7：250g/L的盐酸胍、200g/L的异硫氰酸胍、10g/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、8g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积百分含量5％的水饱和酚、25mmol/L的枸橼酸钠、30mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、体积百分含量3.5％的甘油、0.1mol/L的乙酸钠、50g/L的氯化钠和DEPC(焦碳酸二乙酯)水。
裂解液8：200g/L的异硫氰酸胍、10g/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、8g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积百分含量5％的水饱和酚、体积百分含量2.5％的三(2-羧乙基)膦(TCEP)、体积百分含量0.2％的8－羟基喹啉、体积百分含量3.5％的甘油、0.1mol/L的乙酸钠、50g/L的氯化钠和DEPC(焦碳酸二乙酯)水。
血液RNA提取效果检测：紫外分光光度计分别检测样品浓度、OD260/OD280、OD260/OD230，以此评判RNA提取质量。
结果如下表：
本发明的鲆鲽鱼类血液RNA提取裂解液配方具有最佳的RNA提取效果，去掉本发明裂解液配方中的一种或几种之后，对鲆鲽鱼类血液RNA的提取均有较大程度的影响。
Claims (2)
1.一种用于鲆鲽鱼类血液RNA提取的裂解液，其特征在于，所述的裂解液是在DEPC处理的水中添加盐酸胍、异硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、水饱和酚、三(2-羧乙基)膦、8－羟基喹啉、枸橼酸钠、乙二胺四乙酸、甘油、乙酸钠和氯化钠制成的；
所述的裂解液中盐酸胍的浓度为50-350g/L；
异硫氰酸胍的浓度为50-300g/L；
十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2-30g/L；
十二烷基硫酸钠的浓度为2-20g/L；
水饱和酚使用的体积百分含量为1％-10％；
三(2-羧乙基)膦使用的体积百分含量为0.5％-5％；
8－羟基喹啉使用的体积百分含量为0.05％-1％；
枸橼酸钠的使用浓度为25mmol/L，
乙二胺四乙酸的浓度为30mmol/L，
甘油使用的体积百分含量为3.5％，
乙酸钠的使用浓度为0.1mol/L，
氯化钠的使用浓度为50g/L。
2.一种提取鲆鲽鱼类血液中RNA的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的裂解液来进行提取的。
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