CN113430292A - 用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物检疫技术领域，公开了用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组，包括引物组一和引物组二中的任意一组或两组，所述引物组一包括正向引物B.d‑17和反向引物B.d‑393，所述引物组二包括正向引物B.d‑84和反向引物B.d‑472；还公开了应用。本发明可快速检测猕猴桃中的葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea，检测准确度高，特异性高。

Description

用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用

技术领域

本发明涉及植物检疫技术领域，具体涉及用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用。

背景技术

猕猴桃原产于我国，因其果实营养丰富，富含维生素C和多种矿质元素及氨基酸等而广受人们喜爱。猕猴桃产业发展迅速，其栽培面积由1978年的零起步，到2017年达到250,000公顷，超过世界其他所有猕猴桃生产国种植面积总和。猕猴桃属于呼吸跃变型果实，有明显的生理后熟过程，采后极易变软腐烂，不耐贮藏。猕猴桃软腐病是发生在果实贮藏期的一种最为常见的真菌性病害，分布广，发病快，发病率高，易造成严重的经济损失，且有逐年加重的趋势，对猕猴桃产业发展产生了严重威胁。目前报道的猕猴桃软腐病病原菌有葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、拟茎点霉菌Phomopsis spp.(有性态Diaporthe spp.)、灰霉菌Botrytis cinerea、链格孢菌Alternaria spp.、青霉菌Penicillium spp.等，其中葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和拟茎点霉菌Phomopsis spp.(有性态Diaporthespp.)为主要致病菌。

目前，猕猴桃软腐病病原菌的检测鉴定主要依赖于传统的病原菌分离鉴定，主要包括症状观察、病原菌分离、显微形态观察及分子鉴定等，耗时较长，极不利于猕猴桃软腐病的早期检测及预防。PCR检测是最常用的一种分子生物学检测方法，可通过快速扩增病原微生物的特异性核酸序列，实现病原菌的快速检测，近年来已在传染病、食源性致病菌污染、环境污染、肿瘤遗传标记等领域广泛应用，是比较成熟且应用范围最广的检测技术。因此，研究开发适于猕猴桃软腐病病原菌的快速检测特异性引物及方法，对于猕猴桃软腐病的早期检测，预防和控制具有非常重要的意义和经济意义。

发明内容

基于以上问题，本发明提供用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用，本发明可快速检测猕猴桃中的葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，检测准确度高，特异性高。

为解决以上技术问题，本发明提供了用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组，包括引物组一和引物组二中的任意一组或两组，所述引物组一包括正向引物B.d-17和反向引物B.d-393，所述B.d-17和B.d-393的核苷酸序列分别见SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2；所述引物组二包括正向引物B.d-84和反向引物B.d-472，所述B.d-84和B.d-472的核苷酸序列分别见SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

进一步的，所述引物组用于PCR扩增时的扩增反应体系如下：采用25μLPCR反应体系，具体如下：10×Taq PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌ddH₂O 18μL；

所述引物组用于PCR扩增时的扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃总延伸5min。

为解决以上技术问题，本发明还提供了引物组在制备用于检测猕猴桃软腐病病原菌Botryosphaeria dothidea的试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可快速检测猕猴桃中的葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，检测准确度高，特异性高。

附图说明

图1为本发明的实施例的引物组特异性的PCR检测结果图；

图2为本发明的实施例的引物组准确性的PCR检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

本实施例用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组，包括引物组一和引物组二中的任意一组或两组，引物组一包括正向引物B.d-17和反向引物B.d-393，引物组一可针对葡萄座腔菌特异性扩增出376bp的产物，其序列分别为：

B.d-17：5′-GCCCGATCCTCCCACCCTT-3′；

B.d-393：5′-GAGGCGCGCCCGCAAAGGACGGT-3′；

所述B.d-17和B.d-393的核苷酸序列分别见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

引物组二包括正向引物B.d-84和反向引物B.d-472，引物组二可针对葡萄座腔菌特异性扩增出388bp的产物，其序列分别为：

B.d-84：5′-GGCCGCCCCCCTCCCCGG-3′，

B.d-472：5′-CTGCGCTCCTAAGCGAGATGTATG-3′；

所述B.d-84和B.d-472的核苷酸序列分别见SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

上述引物组可应用于制备用于检测猕猴桃软腐病病原菌Botryosphaeriadothidea的试剂盒中。

本实施例还提供了用于快速检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的方法，包括以下步骤：

(1)待检测样品DNA提取

采用改良CTAB法进行提取，具体步骤如下：

a.称取待检测样品1g左右，加液氮在研钵中用研磨棒研磨成细末，将细末转移至2ml离心管中，加入600μl预热至65℃的2×CTAB(含2％巯基乙醇和2％PVPP)，颠倒混匀，65℃水浴45min-1h；

b.取出离心管冷却至室温，加入600μl氯仿：异戊醇溶液(24：1)，振荡混匀，10000rpm离心10min；取上清液至另一1.5ml离心管中，再加入等体积氯仿：异戊醇溶液(24:1)，10000rpm离心10min；

c.取上清液至另一1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置1h，10000rpm离心10min；

d.去上清，加入70％无水乙醇清洗2次，室温干燥后用适量无菌ddH₂O溶解沉淀的DNA，-20℃保存备用；

(2)以待测样品DNA为模板，分别采用两对引物进行PCR扩增

PCR扩增程序如下：

a.采用25μL PCR反应体系，具体如下：

10×Taq PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌ddH₂O 18μL；

b.PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃总延伸5min；

(3)扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析

琼脂糖凝胶电泳采用1％的琼脂糖凝胶，采用120v恒压电泳15min。

本实施例以葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、扩展青霉菌Penicilliumexpansum、链格孢菌Alternaria alternata、灰霉菌Botrytis cinerea、节菱孢菌Arthrinium saccharicola、枝孢霉菌Cladosporium sp.、拟隐壳属Cryptosporiopsisspp.、拟茎点霉菌Diaporthe sp.、黑附球菌Epicoccum nigrum、新壳梭孢菌Neofusicoccumparvum、镰刀菌Fusarium spp.和毛霉菌Mucor spp.等共计12个种属的16个真菌DNA为模板，采用前文所述的方法、扩增程序和扩增体系，通过PCR扩增验证本实施例的引物组的特异性。结果见附图1，其中a为引物组B.d-17/B.d-393的引物特异性验证条带，b为引物组B.d-84/B.d-472的引物特异性验证条带，引物组B.d-17/B.d-393(图1a)和引物组B.d-84/B.d-472(图1b)均只在葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea中扩增出条带(第1和第2泳道)，其他种属中未扩增出条带，且两对引物的目标条带单一，无杂带，说明本实施例的两对引物组的特异性非常好。

本实施例为了验证本实施例的引物组在猕猴桃果实上检测病原菌的准确性，从市场上购买了16个猕猴桃软腐病病果，取病果果肉组织提取DNA，分别用上述两组引物组进行PCR检测，并以健康果实的DNA作为空白对照，以人工接种已知病菌的果实DNA作为阳性对照，进行PCR验证。同时对发病猕猴桃进行传统的病原菌分离鉴定，将PCR结果与分离鉴定结果对比，验证PCR检测结果准确性。

见附图2，其中a为引物组B.d-17/B.d-393的引物准确性验证条带，b为引物组B.d-84/B.d-472的引物准确性验证条带，可推测第1个和第16个病果的致病菌为葡萄座腔菌，其余为其他致病菌引起。

同时对病果进行病原菌分离，并进行ITS测序，在NCBI网站对测序结果进行BLAST分析，以初步判定病原菌的分类，见表1，为从16个病果上分离得到的病原菌ITS序列比对结果。由表1可知，ITS测序结果与PCR检测结果一致，第1个和第16个病果的致病菌为葡萄座腔菌，第2、3、7、8、9、10、13、14、15个果实的致病菌为拟茎点霉菌，第4、5、6和第12个果实的软腐病分别由灰霉菌、青霉菌和链格孢菌所引起。由此证明，本实施例的引物组的检测结果与病原菌分离结果一致，检测结果准确可信。

表1 16个病果的病原菌ITS序列比对结果

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用

<130> DLXZL210521017

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gcccgatcct cccaccctt 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gaggcgcgcc cgcaaaggac ggt 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggccgccccc ctccccgg 18

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ctgcgctcct aagcgagatg tatg 24

Claims (3)

1.用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组，其特征在于，包括引物组一和引物组二中的任意一组或两组，所述引物组一包括正向引物B.d-17和反向引物B.d-393，所述B.d-17和B.d-393的核苷酸序列分别见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述引物组二包括正向引物B.d-84和反向引物B.d-472，所述B.d-84和B.d-472的核苷酸序列分别见SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组用于PCR扩增时的扩增反应体系如下：采用25μLPCR反应体系，具体如下：10×TaqPCRbuffer2.5μL，2.5mmol/LdNTP2μL，Taq酶0.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，无菌ddH₂O18μL；

所述引物组用于PCR扩增时的扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃总延伸5min。

3.权利要求1-2中任意一项所述的引物组在制备用于检测猕猴桃软腐病病原菌Botryosphaeriadothidea的试剂盒中的应用。

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