CN112210619A - 用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用，所述用于检测二尖梅奇酵母的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明的特异性实验结果表明该本发明的引物对只在二尖梅奇酵母中有特异性片段，而与其他常见的几种酵母菌、细菌均无交叉反应，具有良好的特异性。灵敏度实验表明，该引物组检测二尖梅奇酵母的最低限度为8.62×10个/μL，具有良好的敏感性。本发明的提出为二尖梅奇酵母病的检测或诊断提供了一种有效技术手段，通过本发明的方法，使二尖梅奇酵母的检出方法更简便，诊断更精确，对于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、大鳞大麻哈鱼(Chinook salmon)等经济养殖物种的二尖梅奇酵母病的防控具有重要意义。

Description

用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用。

背景技术

二尖梅奇酵母是水产动物致病酵母菌的一种，可以侵染多种经济养殖物种，如中华绒螯蟹、罗氏沼虾、大鳞大麻哈鱼等。二尖梅奇酵母可以在多种水生动物体内各组织中大量繁殖发育，并引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变，造成其机体细胞肿胀、糜散、坏死，严重时会导致其死亡。严重威胁经济水生动物的健康养殖，给其养殖产业造成了很大影响。

目前，水生动物感染二尖梅奇酵母通过临床诊断难以确诊。目前常规的检测方法是形态学检测，而二尖梅奇酵母个体微小，不易于观察，无特异性引物，其他酵母通用引物灵敏性和特异性均较低，容易造成误检。

综上，目前缺乏对二尖梅奇酵母检测的方法，亟待进一步改进。

发明内容

为此，本发明提供用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用，以解决现有技术中二尖梅奇酵母过程复杂，灵敏度、特异性低的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

用于检测二尖梅奇酵母的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的一个实施例中，所述引物对用于检测核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示的二尖梅奇酵母HYR3基因。

本发明还提供上述特异性引物对在如下任一中的应用，

(1)制备PCR扩增二尖梅奇酵母HYR3基因片段的试剂或试剂盒；

(2)制备检测二尖梅奇酵母的试剂或试剂盒。

本发明的一个实施例中，所述试剂或试剂盒的PCR体系为：反应体系15μL：2×TaqMaster Mix，13μL；上游引物及下游引物，各0.5μL；模板，1μL。

本发明的一个实施例中，所述试剂或试剂盒的PCR反应条件为：预变性94℃，10min；变性94℃，1min；退火50℃，45s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为30个循环。

本发明的一个实施例中，所述试剂或试剂盒的最低检测限度为8.62×10¹个/μL。

本发明具有如下优点：

本发明根据针对二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidate)的特异性片段IFF11、HYR3、IFF8的基因保守序列，分别设计并筛选出三对特异引物，并筛选出第一特异性引物对，其具有特异性、灵敏性良好的优点，用于二尖梅奇酵母的检测或诊断。并建立了相关检测方法，通过PCR检测，可以快速准确地检测虾蟹中二尖梅奇酵母的感染情况，使二尖梅奇酵母的检出率极大提高，诊断更精确，具有广阔的应用前景，对于各种水产动物二尖梅奇酵母病的防控和水产健康养殖都具有重要意义。

本发明的特异性实验结果表明该本发明的引物对只在二尖梅奇酵母中有特异性片段，而与其他常见的几种酵母菌、细菌均无交叉反应，具有良好的特异性。灵敏度实验表明，该引物组检测二尖梅奇酵母的最低限度为8.62×10个/μL，具有良好的敏感性。本发明的提出为二尖梅奇酵母病的检测或诊断提供了一种有效技术手段，通过本发明的方法，使二尖梅奇酵母的检出方法更简便，诊断更精确，对于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、大鳞大麻哈鱼(Chinook salmon)等经济养殖物种的二尖梅奇酵母病的防控具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明的尖梅奇酵母HYR3基因的PCR扩增结果；

其中：1泳道为含二尖梅奇酵母的河蟹组织样本的扩增结果；N泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker；

图2为本发明的尖梅奇酵母的IFF11基因的PCR扩增结果；

其中：1-5泳道为含二尖梅奇酵母的河蟹组织样本的扩增结果；P泳道为阳性对照；N泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker；

图3为本发明的尖梅奇酵母IFF8基因的PCR扩增结果；

其中：1-5泳道为含二尖梅奇酵母的河蟹组织的扩增结果；P泳道为阳性对照；N泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker；

图4为本发明的尖梅奇酵母不同扩增温度下HYR3基因的PCR扩增结果；

其中：1-3泳道分别为退火温度为45℃、50℃以及55℃时的扩增结果；N泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker；

图5为本发明的尖梅奇酵母HYR3基因的灵敏性PCR扩增结果；

其中：1-9泳道对应的细菌数分别为8.62×10⁹、8.62×10⁸，8.62×10⁷，8.62×10⁶，8.62×10⁵，8.62×10⁴，8.62×10³，8.62×10²，8.62×10¹；P泳道为阳性对照；N泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker；

图6为本发明的尖梅奇酵母的HYR3基因的特异性引物对的特异性检测结果；

其中：1-9泳道是细菌分别为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri、保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus、植物乳杆菌lactobacillus plantarum、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、纳豆芽孢杆菌Bacillusnatto、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、霍乱弧菌V.cholera、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida；酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae；近平滑假丝酵母菌Candidaparapsilosis；季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii；生丝毕赤酵母属Hyphopichia burtonii；长孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus；芽枝状枝孢霉Cladosporium cladosporioides；木贼镰刀菌fusarium equiseti；P泳道为阳性对照；N泳道为阴性对照；M泳道为DNAmarker。

图7为本发明的尖梅奇酵母的特异性引物对的临床样本的结果；

其中：1-4泳道为含二尖梅奇酵母的河蟹组织的扩增结果；P泳道为阳性对照；N泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。

实施例1、本发明的用于检测二尖梅奇酵母的特异性引物的设计

一、材料与方法

1.1样本质粒和菌株

PMD19T载体购自宝日医生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自全式金生物科技有限公司；二尖梅奇酵母阳性样本采自辽宁盘锦，后经实验室分离纯化获得。

1.2样品及试剂

DNA提取试剂盒购自天根(北京)生化科技有限公司、PCR Mix和PCR产物回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒等均购鼎国生物技术有限公司。

1.3二尖梅奇酵母DNA的提取与目的基因片段纯化

按照各试剂盒的说明书，提取、回收、纯化、提质粒。

1.4引物的设计

根据GenBank中二尖梅奇酵母的基因组序列(HYR3、IFF11、IFF8)，用Primer 5.0软件设计引物，设计三对引物第一特异性引物对P1/P2、第二特异性引物对P3/P4、第三特异性引物对P5/P6，引物组的名称及序列见表1。通过特异性分析后，选取400-500bp区域设计一对特异性引物P1/P2，用于二尖梅奇酵母特异性核酸的诊断，如图1至图3所示。

表1

实施例2、二尖梅奇酵母的第一特异性引物PCR扩增退火温度

以二尖梅奇酵母的核酸为模板，进行PCR扩增，反应体系为：2×PCR Mix 13μL，特异性引物对(nmol/L)1μL，二尖梅奇酵母的DNA模板1μL。

引物进行退火温度的确定，根据引物合成后的参考温度，选取45℃、50℃、55℃进行PCR扩增。PCR的扩增程序如下：预变性94℃，10min；变性94℃，1min；退火45℃/50℃/55℃，45s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为30个循环。待PCR反应结束后，取5μLPCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析。

试验结果：设置不同退火温度，待PCR反应结束后，取5μL PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示不同退火温度下均得到单一明亮条带，位置与预期大小相符，如图4所示。因此PCR退火温度选取45℃、50℃或55℃均可以。

实施例3、二尖梅奇酵母特异性引物对的敏感性鉴定

对实施例1切胶回收的PCR产物提取质粒，进行浓度测定，根据DNA拷贝数计算公式分别计算每个样品的拷贝数，结果见表2。

表2

拷贝数＝(6.02×10¹⁴×浓度ng/μL)/(DNA长度×660)

选择二尖梅奇酵母DNA模板3进行稀释，拷贝数分别稀释至约8.62×10⁹、8.62×10⁸，8.62×10⁷，8.62×10⁶，8.62×10⁵，8.62×10⁴，8.62×10³，8.62×10²，8.62×10¹。分别从中取1μL作为模板，利用本发明的第一特异性引物对P1/P2引物进行PCR扩增，反应条件同实例2，退火温度为50℃。结束后，分别取5μL PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析。

实验结果：经根据DNA拷贝数计算公式计算的拷贝数结果显示，原DNA浓度约为8.62×10⁹个/μL，作10倍梯度稀释后作为PCR扩增的模板，如图5所示，1-9泳道依次细菌数为8.62×10⁹～8.62×10¹个/μL。经PCR扩增后，电泳结果显示，最低检测限度为8.62×10¹个/μL，如图5中，第9泳道所示。

实施例4、本发明的二尖梅奇酵母的第一特异性引物对的特异性鉴定

分别以二尖梅奇酵母、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、恶臭假单胞菌、酿酒酵母、近平滑念珠菌、茶叶籽酵母、毕赤氏酵母、长孢洛德酵母、哥伦比亚枝孢菌、黑酵母菌的核酸为模板，利用第一特异性引物对P1/P2引物进行PCR扩增，反应条件同实例2，退火温度为50℃，模板为1μL。结束后，分别取5μL PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析。

试验结果：分别以二尖梅奇酵母、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、恶臭假单胞菌、酿酒酵母、近平滑假丝酵母菌、季也蒙毕赤酵母、生丝毕赤酵母、长孢洛德酵母、芽枝状枝孢霉、木贼镰刀菌的核酸为模板，进行二尖梅奇酵母的PCR扩增，结果显示除二尖梅奇酵母以外，而与其他常见的几种酵母菌、细菌均未获得特异性的目的条带，如图6所示，第1-16泳道、P泳道为二尖梅奇酵母，N泳道为阴性对照，由此证明P1/P2引物具有良好的特异性。

实施例5、二尖梅奇酵母的第一特异性引物对临床样本的PCR诊断

以P1/P2为引物，对2019年收集的部分感染二尖梅奇酵母的样品进行PCR鉴定，并对数据进行统计分析。

结果：对不同时间收集的临床样本，分别采用酵母通用引物送测方法以及本发明建立的二尖梅奇酵母特异性PCR检测方法进行酵母菌鉴定。对于盘锦河蟹乳化病组织，酵母通用引物送测方法及二尖梅奇酵母PCR检测方法的二尖梅奇酵母检出率均为100％，如如图7所示；证明本发明完全可以代替传统的方法，大大节省了检测的时间。

将河蟹组织中本发明建立的二尖梅奇酵母特异性PCR鉴定为阳性的扩增产物，分别选取5份进行测序分析，序列分析证实均为二尖梅奇酵母。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用

<130> GG20839232A

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agcctggtct ttgtaatg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

actcccttgt tggtgata 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gatgattagc cacgacac 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tacctattgc cacgaaca 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctgtcttagg cgatactctg 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgaacctctt tccaccag 18

<210> 7

<211> 1047

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atggccgcca cgttactagg cattcgtgcg gcggcaatct cgtaccttct cagcctggtc 60

tttgtaatga ttataagaaa cgacacagtt gagagtgacc ctggcgcaaa atccttagag 120

ggacttctca tttgtacgag cgtttcttac tcgattatca atagccccag tcttactttg 180

caaagtaacg tttacaacgg tggcaggttt tctgtttcaa gtactgacga attgggggct 240

tcggtgcaca tgaccgggcg tcgctttgac aattatggat tgattgtctt caattcactg 300

tgtgtccaag cagattgtct ctacgatatt gacgctaaag aagctttttt gaacaatggc 360

acaatgtttt ttggtttctt tggggcttct cccaagtcgt caaatatgta tgttacatct 420

gtggtgtcat gggagaacac cggtacgatg attttcatgc agtcacctgg actttctacc 480

agcttgttga tcggtgactt tcagcgcctg actagagatt ttagtatcac caacaaggga 540

gtgatttgtt ttcgaaacct tgtttggcta gtaaccacac ccataggggg agatggatgt 600

attaatgtgg ggtctggctc aatattggag atgcactttc cggatttctc tcctaaacca 660

aatcagatta tcaacttgga ttcatcggac tcagtattgc gggctctggg gcttgaggaa 720

ttgctggatg taattccggt catcaagatc accggcctag gaggggggaa ttcaattgag 780

atagatcttc cttacgaaga aagtatctca actgggtatt gcacaagtac gggaagatta 840

tctcttggca ttgcacacaa aaatcgagtg ttttttgaag ttggcccagg gtacaatgta 900

agtgatttta agactcaaaa aactctagtt ggtactaaga ttactgttga tgacccttct 960

ccccacgagc ccccacttgc ttgcaagtgt gataccgact tttatagtgc cccagcagct 1020

aactcttcgc aagttttctc tatctga 1047

Claims (6)

1.用于检测二尖梅奇酵母的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的于检测二尖梅奇酵母的特异性引物对，其特征在于，

所述引物对用于检测核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示的二尖梅奇酵母HYR3基因。

3.如权利要求1或权利要求2所述的特异性引物对，在如下任一中的应用，

(1)制备PCR扩增二尖梅奇酵母HYR3基因片段的试剂或试剂盒；

(2)制备检测二尖梅奇酵母的试剂或试剂盒。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，

所述试剂或试剂盒的PCR体系为：反应体系15μL：2×Taq Master Mix，13μL；上游引物及下游引物，各0.5μL；模板，1μL。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，

所述试剂或试剂盒的PCR反应条件为：预变性94℃，10min；变性94℃，1min；退火50℃，45s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为30个循环。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，

所述试剂或试剂盒的最低检测限度为8.62×10¹个/μL。

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