CN109735659A - 一种利用rpa检测克氏原螯虾小rna病毒的引物及试剂盒与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物及试剂盒与检测方法，其中所述RPA检测的引物是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对，用于检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒。以该引物对克氏原螯虾待测样本进行检测，若RPA扩增产物含有大小为151bp的片段，则所述待测克氏原螯虾中含有小RNA病毒。检测方法包括引物合成、待测样品中RNA的提取、反转录、RPA扩增及扩增产物分析等步骤，该检测方法操作简单，稳定性好，为有效检测和鉴定克氏原螯虾小RNA病毒提供一种成本低、快速、特异的现场诊断方法。

Description

一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物及试剂盒与检 测方法

技术领域

本发明属于水产动物病毒的分子检测技术领域，涉及到一种利用重组酶介导等温扩增技术检测克氏原螯虾小RNA病毒的方法以及检测专用引物。

背景技术

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，俗称小龙虾，隶属于节肢动物门、甲壳纲、原螯虾属。原产于美国南部和墨西哥北部，后由日本引进入中国。由于其较高的营养价值及其独特的风味，目前已成为一种重要淡水经济水生动物，是我国水产增养殖的重要对象。

然而近年来，随着克氏原螯虾人工养殖面积的不断扩大，克氏原螯虾病害频发，导致产量降低，品质下滑，农户受损严重，其中，以克氏原螯虾“五月瘟”，或称“五月魔咒”，最为严重。目前，有关克氏原螯虾“五月瘟”病原的研究报道并不多，一般认为白斑综合征病毒（WSSV）是引起“五月瘟”的主要病原。在对克氏原螯虾“五月瘟”病原研究过程中，我们新发现了一种小RNA病毒，此病毒与“五月瘟”密切相关，可能是导致克氏原螯虾“五月瘟”的另一重要病原。

小RNA病毒（Picornaviridae）为22～30纳米的二十面体，无包膜，基因组为连续线型单链RNA。大多数已知的小RNA病毒常感染哺乳动物和鸟类，但也有一些在两栖动物、节肢动物和水产鱼类中检测到。感染此病毒可引起中枢神经系统、心脏、肝脏、皮肤、胃肠道或上呼吸道疾病。目前，虾蟹病毒病尚无有效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一种简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。

目前应用较多病毒检测方法有聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。但这些方法均需要昂贵的PCR仪或特殊仪器设备和专业的试验场地，同时 PCR扩增的过程，需要有特殊的热循环设备、低温保 存的试剂和避免交叉污染的技术操作要求, 且操作复杂繁琐、耗时长，时效性低，同时也需要具有一定分子生物学基础及操作技术诊断的需求限制了PCR在现场诊断中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物及试剂盒与检测方法，以建立克氏原螯虾小RNA病毒的快速检测方法。

本发明的技术方案如下：

本发明首先针对克氏原螯虾小RNA病毒的基因保守区域提供了一对用于RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物：

RPA PcPV-1F:5’-CTGATGAGGAATTAGACGATCTTATCGTTG-3'；（SEQ ID NO.1）

RPA PcPV-1R:5’-CAGAATTAAAGACCGACGTTAGTAGATGAC-3'。（SEQ ID NO.2）

本发明又提供了一种利用RPA检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒的试剂盒，该试剂盒包括以上SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物。

进一步地，该试剂盒还可以包括Rehydration Buffer，ddH₂O和醋酸镁溶液。

其中所述醋酸镁溶液的浓度可以为280 mM。

本发明又提供了一种基于上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

步骤一，从待测克氏原螯虾上提取病毒RNA，并反转录成cDNA备用；

步骤二，以步骤一得到的cDNA为模板，SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2为引物进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小；

步骤三，对检测结果进行判定，如RPA扩增产物含有大小为151bp的片段，则所述待测克氏原螯虾中含有小RNA病毒，反之则不含有小RNA病毒。

进一步地，步骤二中RPA扩增可以包括以下步骤：

步骤1，配制47.8μl的混合反应液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10 μM的上游引物2.4μl，10 μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和 ddH₂O 12.5μl；

步骤2，将混合反应液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280 mM 醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，37℃反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应30min。

本发明提供的SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物以及试剂盒在检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：

1、本发明所设计的RPA检测专用引物对长度在30-35bp，比一般的PCR检测引物长。引物过短会降低重组率，影响RPA反应的扩增速度和检测灵敏度。

2、本发明提供了一组使用于克氏原螯虾小RNA病毒RPA检测的引物对，将该引物对应用于河蟹布尼亚病毒的RPA检测中，具有简单便捷，快速检测，特异性强，灵敏度高等优点。

3、本发明检测方法无需对病毒进行分离纯化及培养，反应在37℃左右的恒温条件下即可实现模板核酸的扩增，也不需要通过高低温循坏实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备，非常适合基层对病原菌的快速检测需要。

4、本发明用于克氏原螯虾组织中小RNA病毒的快速检测，只需约2.5h即可完成从病毒提取到获得检测结果的所有过程，是一种用于检测克氏原螯虾感染小RNA病毒的有效手段。

5、本发明检测方法用于克氏原螯虾“五月瘟”发病前期检测及病害预测预防，对于确定防治期、有效防治病害具有非常重要的意义。

附图说明

图1是RPA引物扩增凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker500，1为引物RPA PC-PV-1R-1F， 2为阴性对照，3为控制对照。

图2是不同RPA反应温度下的凝胶电泳图。其中，泳道为Marker500、1为35℃、2为37℃、3为39℃、4为41℃。

图3是不同RPA反应时间下的凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker500、1为10min、2为20min、3为30min、4为40min、5为50min。

图4是RPA与PCR反应灵敏度检测凝胶电泳图。其中，A为RPA反应、B为PCR反应；泳道为Marker500、1为1400pg/μL、2为100pg/μL、3为10pg/μL、4为1pg/μL、5为100fg/μL。

图5是RPA检测特异性凝胶电泳图。其中，M为Marker500、1为克氏原螯虾小RNA病毒（PcPV）、2为河蟹呼肠孤病毒（EsRV）、3为河蟹呼肠孤-816病毒（EsRV-816）、4为河蟹呼肠孤-905病毒（EsRV-905）、5为河蟹诺达病毒（EsNV）、6为对虾白斑病毒（WSSV）、7为阴性对照。

具体实施方式：

下列实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

若未特别指明，以下实施例均照常规实验条件进行操作，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中使用RPA试剂盒为 Basic试剂盒，购自英国TwistDxInc公司；其中，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶是以冻干粉状态存在于试剂盒所提供的RPA反应管中，使用时直接用试剂盒所带的反应缓冲液稀释。整个RPA反应是在RPA反应管中进行。

实施例1

根据克氏原螯虾小RNA病毒的序列，设计了SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的由上下游引物组成的RPA引物对。

上游引物RPA PcPV-1F:5’-CTGATGAGGAATTAGACGATCTTATCGTTG-3'（SEQ IDNO.1）；

下游引物RPA PcPV-1R: 5’-CAGAATTAAAGACCGACGTTAGTAGATGAC-3'（SEQ ID NO.2）。

实施例2

采用TRIzol法，从已知感染小RNA病毒的克氏原螯虾中提取病毒RNA并反转录为cDNA。具体操作过程如下。

克氏原螯虾肝胰腺取适量（0.02g-0.05g）放入EP管中，并在管中放入小磁珠（每个EP管中加入2颗），加入RNA Plus 1ml，放入匀浆机中2-3min，结束后静置5分钟。

将样品放入到4℃冷冻离心机内，12000r pm离心5min，取上清液600μL。

加200 μL氯仿，大力摇晃15s，室温静置2-3min。

4℃，12000r pm离心15min，取上清液200μL，

加入500μL 100%异丙醇，上下颠倒5次混匀，室温放置10min，

4℃，12000r pm离心10min，去除上清液，

用1ml 75%乙醇洗涤RNA颗粒，用枪头吹打RNA颗粒，使洗涤充分，

4℃，7500r pm 离心5min ,去除上清液，重复上述步骤。

最后，向EP管中加入12-20μL DEPC水。

使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit（Beijing Cwbiotech Company, Beijing,China）将提取的RNA反转录为cDNA。

实施例3

以实施例2得到的cDNA 为模板，采用实施例1设计的RPA引物，在下述反应体系中进行RPA反应。

样品检测：配制47.5μl的混合反应液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10 μM的上游引物2.4μl，10 μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和 ddH₂O 12.5μl。混合液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，其中冻干酶粉里包括能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280 mM 醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，在37℃金属浴反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应30min。

阴性对照：操作步骤同样品检测，将1μl模板cDNA改为加入1μl灭菌ddH₂O。

控制对照：操作步骤同样品检测，将将1μl模板cDNA改为加入1μl控制样cDNA。

RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀后11,000×g离心3min，取上清液10μL于1.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上，根据条带大小判断结果。

电泳检测结果如图1所示。以实施例1设计的引物进行RPA扩增反应后，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示该引物对能检测到大小为151bp的目标片段（泳道1），目标条带清晰且没有杂带，能有效检测出克氏原螯虾小RNA病毒。

泳道2的阴性对照未扩增出条带，泳道3的控制对照出现控制组的目标条带。

实施例4

采用实施例1设计的RPA引物，以实施例2提取的DNA为模板，按照实施例3反应体系进行RPA反应，并设定反应温度分别为35℃、37℃、39℃和41℃，检测不同温度对反应结果的影响。实验结果如图2所示，表明反应温度为37℃时条带明亮清析，因此最适宜的反应温度为37℃。

实施例5

采用实施例1设计的RPA引物，以实施例2提取的DNA为模板，按照实施例3反应体系进行RPA反应，设定反应温度为37℃，反应时间分别为10min、20min、30min、40min和50min，检测不同时间对反应结果的影响。实验结果如图3所示，表明最适宜的反应时间为30min。

实施例6

使用Nanodro 2000微量分光光度计测定出实施例2提取DNA的浓度为1000pg/μL。

将其依次稀释为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL和100fg/μL，根据上述实施例采用的引物对、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行RPA和PCR检测。

实验结果如图4所示，结果表明RPA检测浓度为100pg/μL（图A），而PCR检测浓度为100fg/μL时仍能看到目标条带（图B），说明PCR检测的灵敏度高于RPA，但是通过PCR检测出的条带暗、不清晰且杂带较多，而RPA检测条带亮、清晰且无杂带。同时PCR检测过程需要2.5h，而RPA检测时间仅需30min，且不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。

实施例7

为了验证本发明建立的RPA检测方法对于克氏原螯虾小RNA病毒的特异性，本实施例以多种不同病毒作为供试材料，提取病毒的RNA并反转录为cDNA，进行RPA反应。

选择PcPV、EsRV、EsRV-816、EsRV-905、EsNV、WSSV（提取DNA）6种进行特异性检测。

以上述六中病毒的cDNA，根据上述实施例1设计的引物，实施例4筛选出的反应温度和实施例5筛选出的反应时间，用实施例3方法进行RPA反应，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，所述检测条件为电压180V，电流250A，检测时间20 min，检测RPA反应的特异性。若所述RPA扩增产物含有151bp的片段，则所述待测样品中含有小RNA病毒，若所述RPA扩增产物不含有151bp的片段，则所述待测样品中不含有小RNA亚病毒。

实验结果如图5所示，克氏原螯虾小RNA病毒的RPA扩增产物含有151bp的片段（泳道1），而其他病毒cDNA扩增后在151bp位置均没有条带（泳道2-7），该方法能特异性扩增出小RNA病毒的目标片段，具有很好的特异性。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物及试剂盒与检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgatgagga attagacgat cttatcgttg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagaattaaa gaccgacgtt agtagatgac 30

Claims (8)

1. 一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物，其特征在于，包括SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的引物对在检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒中的应用。

3.一种利用RPA检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物对。

4. 根据权利要3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Rehydration Buffer，ddH₂O和醋酸镁溶液。

5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述醋酸镁溶液的浓度为280 mM。

6.权利要求4所述的试剂盒检测克氏原螯虾小RNA病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，从待测克氏原螯虾上提取病毒RNA，并反转录成cDNA备用；

步骤二，以步骤一得到的cDNA为模板，SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2为引物进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小；

步骤三，对检测结果进行判定，如RPA扩增产物含有大小为151bp的片段，则所述待测克氏原螯虾中含有小RNA病毒，反之则不含有小RNA病毒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤二中RPA扩增包括以下步骤：

步骤1，配制47.8μl的混合反应液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10 μM的上游引物2.4μl，10 μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和 ddH₂O 12.5μl；

步骤2，将混合反应液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280 mM 醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，37℃反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应30min。

8.权利要求3-5任一项所述的试剂盒在检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒中的应用。