CN114672589A - 一种用于检测对虾hinv病毒的靶序列、引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测对虾HINV病毒的靶序列、引物及其应用。本发明在所述用于检测凡纳滨对虾HINV病毒的靶序列的基础上，设计了检测对虾HINV病毒的巢氏PCR引物并建立了相应的检测方法，所述巢氏PCR方法的检测特异性好，灵敏度高，其第一轮PCR的最低检测限为40fg/μL，第二轮PCR的最低检测限为40ag/μL，适用于对虾HINV病毒的检测，用于筛选无病毒携带的虾苗进行标粗，降低养殖中对虾发病的风险。

Description

一种用于检测对虾HINV病毒的靶序列、引物及其应用

技术领域

本发明属于水产病毒检测技术领域。更具体地，涉及一种用于检测对虾HINV病毒的靶序列、引物及其应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)又称南美白对虾，或俗称白对虾，是原产于中南美洲的一种广温广盐性热带虾类。我国于1988年从夏威夷群岛引进凡纳滨对虾，并于1992年人工繁殖成功，2000年开始批量育苗生产。凡纳滨对虾在我国从研究到推广至今，已形成了从引种、育苗到养殖、加工、销售的完整产业链，成为我国水产养殖业的支柱性品种。

病害是限制凡纳滨对虾养殖产业发展的重要因素，病毒、细菌、真菌、立克次氏体及寄生虫等病原都能导致对虾发病，其中以病毒性病原的危害性最大。能感染凡纳滨对虾并引发病害的病毒包括：白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)、桃拉病病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)、黄头病病毒(Yellow Head Virus，YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)以及传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV)等，这些病毒目前也都建立了相应的检测方法，可用于病毒的检测及病害的防治。例如，中国专利CN107868849A公开了一种检测对虾IHHNV病毒的引物组及其应用。

近期，凡纳滨对虾养殖中出现了“玻璃”虾苗，主要表现为标苗困难、标苗成功率低，虾苗空肠空胃、体色透明，易在标粗淡化过程中死亡。该病害一般在标苗的第二天出现，严重时第四天死亡率就接近100％，发病虾苗表现为身体褪色呈透明状，肝胰腺和消化道坏死。而导致“玻璃”虾苗出现的病原目前尚未完全明确，因此，针对“玻璃”虾苗进行检测鉴定，确立病原，并建立相应的检测方法至关重要，将有助于剔除带毒虾苗，避免病害的发生。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种用于检测对虾HINV病毒的靶序列、引物及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测凡纳滨对虾HINV病毒的靶序列。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测凡纳滨对虾HINV病毒的引物。

本发明的第三个目的是提供所述靶序列及检测引物在制备检测凡纳滨对虾HINV病毒的产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种重组载体。

本发明的第五个目的是提供一种检测凡纳滨对虾HINV病毒的试剂盒。

本发明的第六个目的是提供一种检测凡纳滨对虾HINV病毒的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过对富集纯化到的病毒粒子进行宏病毒组测序，在凡纳滨对虾的“玻璃”虾苗中发现了一种新的小RNA病毒，暂命名为肝胰腺和消化道坏死病毒(Hepatopancreaticand intestine necrosis virus，HINV)。同时发现HINV对虾苗的感染、致病性强；对大虾感染性虽弱，不会引起爆发性死亡，但仍会导致对虾缓慢死亡，给对虾养殖业带来了巨大的经济损失。

本发明根据宏病毒组测序得到的HINV病毒的基因组序列(如SEQ ID NO.1所示)，以基因组中第7855～8791位的核苷酸序列为靶序列，设计并开发了HINV病毒的检测引物、试剂盒和方法。

本发明首先提供了一种用于检测凡纳滨对虾HINV病毒的靶序列，靶序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的实验表明，利用此靶序列设计的巢氏PCR引物，可检测样本中是否存在HINV病毒。因此，本发明申请保护所述靶序列在制备检测凡纳滨对虾HINV病毒的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于检测凡纳滨对虾HINV病毒的引物，用于扩增SEQ IDNO.2所示靶序列。

优选地，所述引物为巢氏PCR引物，引物序列如SEQ ID NO.3～6所示。

鉴于上述引物可用于扩增凡纳滨对虾HINV病毒的靶序列，因此，本发明还申请保护所述引物或所述巢氏PCR引物在制备检测凡纳滨对虾HINV病毒的产品中的应用。

本发明还提供了一种含有SEQ ID NO.2所示靶序列的重组载体。

本发明同时申请保护所述重组载体在制备检测凡纳滨对虾HINV病毒的产品中的应用。

优选地，所述重组载体为pMD-19T，见实施例1。

本发明还提供了一种检测凡纳滨对虾HINV病毒的试剂盒，其含有检测SEQ IDNO.2所示靶序列的试剂。

优选地，所述检测SEQ ID NO.2所示靶序列的试剂中包含上述引物。

优选地，所述试剂盒中还含有所述重组载体作为阳性对照，见实施例1。

本发明还提供了一种检测凡纳滨对虾HINV病毒的方法，通过提取待测样本的RNA并反转录为cDNA，利用上述巢氏PCR引物进行PCR扩增，若第一轮出现大小为937bp的特异性条带，或第二轮出现大小为603bp的特异性条带，则表示所检样本中含有HINV病毒。

优选地，选取组织样本时，若为虾苗则取甲壳下组织，若为大虾则取肝胰腺，亲虾取游泳足，见实施例1。

优选地，反转录成cDNA时，20μL的反转录体系中加500～800ng的RNA，见实施例1。

具体地，巢氏PCR第一轮反应的体系为：2×Accurate Taq Master Mix 10μL，浓度为5μM的正反向引物各1μL，1μL的cDNA模板，灭菌水7μL。

具体地，巢氏PCR第一轮反应的程序为：98℃预变性5min；98℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

具体地，若第一轮巢氏PCR扩增未检测出阳性条带，则将产物用灭菌水稀释50倍后作为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系及扩增程序同第一轮巢氏PCR。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种用于检测凡纳滨对虾HINV病毒的靶序列，在此序列的基础上，本发明设计并建立了一种高特异性和敏感性的HINV病毒的PCR检测方法，可用于凡纳滨对虾养殖中对HINV病毒的检测，用于种虾筛选中及时淘汰携带病毒的亲虾切断纵向传播，用于虾苗标粗初期，淘汰携带病毒的虾苗以减少标粗过程中大量爆发引起的损失，也可以用于投苗养殖前的HINV病毒检测，淘汰携带病毒的虾苗，以减少养殖过程中的损失。

(2)本发明所设计的巢氏PCR检测引物具有较高的灵敏性和特异性，PCR灵敏度测试结果显示，其第一轮PCR最低检测限为40fg/μL，第二轮PCR最低检测限为40ag/μL，灵敏度高；特异性实验结果显示，针对5种病毒病原的样品中，只有HINV阳性样品有单一条带，含有其他病原的样品无扩增条带，表明本发明设计的巢氏PCR检测引物具有较高特异性。

附图说明

图1为巢式PCR引物HINV-1-F/R的一扩产物电泳图，其中M为DS2000 Marker，泳道1为HINV病毒的cDNA模板，泳道2为阴性对照。

图2为巢式PCR引物HINV-2-F/R的二扩产物电泳图，其中M为DS2000 Marker，泳道1为一扩产物稀释后的模板，泳道2为阴性对照一扩产物稀释后的模板。

图3为巢式PCR引物HINV-1-F/R的灵敏度检测结果，其中M为DS2000 Marker，C为阴性对照，泳道1～10对应的模板浓度依次为40ng/μL、4ng/μL、0.4ng/μL、40pg/μL、4pg/μL、0.4pg/μL、40fg/μL、4fg/μL、0.4fg/μL和40ag/μL。

图4为巢式PCR引物HINV-2-F/R的灵敏度检测结果，其中M为DS2000 Marker，C为阴性对照，泳道1～10对应的模板浓度依次为40ng/μL、4ng/μL、0.4ng/μL、40pg/μL、4pg/μL、0.4pg/μL、40fg/μL、4fg/μL、0.4fg/μL和40ag/μL。

图5为巢式PCR引物HINV-1-F/R的特异性检测结果，其中M为DS2000 Marker，泳道1～6分别为HINV、MCRV、MrPV-1、MrDV-3、MrFV和NNV病毒阳性模板。

图6为巢式PCR引物HINV-2-F/R的特异性检测结果，其中M为DS2000 Marker，泳道1～6分别为HINV、MCRV、MrPV-1、MrDV-3、MrFV和NNV病毒阳性模板。

图7为巢式PCR引物HINV-1-F/R检测凡纳滨对虾成虾与虾苗样品中携带HINV的结果，其中M为DS2000 Marker，泳道1～6分别对应6只成虾样品的cDNA，泳道7～14分别对应8只虾苗样品的cDNA，N为阴性对照，P为HINV阳性模板。

图8为巢式PCR引物HINV-2-F/R检测凡纳滨对虾成虾与虾苗样品中携带HINV的结果，其中M为DS2000 Marker，泳道1～6分别对应6只成虾样品的cDNA，泳道7～14分别对应8只虾苗样品的cDNA，N为阴性对照，P为HINV阳性模板。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1巢式PCR引物的设计及重组载体的制备

1、引物设计

本发明通过富集纯化病毒粒子以及宏病毒组测序，在“玻璃”虾苗中发现了一种新的小RNA病毒，暂命名为肝胰腺和消化道坏死病毒(Hepatopancreatic and intestinenecrosis virus，HINV)，其基因组序列如SEQ ID NO.1所示。本发明根据所测宏病毒得到的序列，在病毒的ORF区域内采用Primer Premier 6设计得到了一组巢氏PCR引物，并通过Lasergene 7.1的Primer select对设计的引物进行筛选检验，从中筛选出能在富集后的病毒模板中扩增出单一条带的PCR引物。

本发明以HINV病毒基因组中第7856～8791位的核苷酸序列为靶序列，靶序列如SEQ ID NO.2所示。

最终筛选得到的第一轮巢氏PCR的引物序列如下所示：

HINV-1-F(SEQ ID NO.3)：TGAGTCTAAGTGGCAGAATCCCGTAG

HINV-1-R(SEQ ID NO.4)：GGCGAAATGGTAGATAGTGGTGTTATC

引物HINV-1-F长26bp，从5'起，其位于HINV-1病毒基因组的第7855～7880位，引物HINV-1-R长27bp，其位于病毒基因组序列的第8765～8791位，产物长度为937bp。

第二轮巢氏PCR的引物序列如下所示：

HINV-2-F(SEQ ID NO.5)：CGGACCGATGAATACGACAGAGAA

HINV-2-R(SEQ ID NO.6)：CGTGGTACGAACCCAATAGCAAGG

引物HINV-2-F长24bp，从5'起，其位于HINV病毒基因组的第8120～8143位，引物HINV-2-R长24bp，位于病毒基因组序列的第8669～8722位，产物长度为603bp。

2、重组载体的制备

(1)RNA的提取

本发明采用Trizol法提取样品中的总RNA，具体步骤如下：

取0.03g组织样品，用匀浆器加1mL Trizol进行重复研磨，然后转移至RNase free离心管，混匀后室温放置5min；每管加入200μL氯仿，重复混匀，室温放置10min，4℃、1200rpm离心15min；将上层水相移到新的RNase free离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃放置10min以上；4℃、1200rpm离心10min，弃上清液；沉淀加入1mL预冷75％的乙醇洗涤一次，1200rpm离心10min，小心弃去上清液、风干沉淀；管内加入适量体积的DEPC处理水溶解RNA，直接用于反转录或-20℃冻存备用。

选取组织样本时，若为虾苗则取甲壳下组织，若为大虾则取肝胰腺，或亲虾取游泳足。

(2)RNA反转录成cDNA

反转录使用艾科瑞公司的Evo M-MLV反转录预混型试剂盒(货号AG11728)，参照产品说明书进行。在20μL的反转录体系中加入500～800ng提取的RNA，加入5×Evo M-MLV RTMASTER MIX 4uL，用水补至20uL。37℃水浴15min后，85℃水浴5s灭活，反转录产物置于-20℃冻存备用。

(3)阳性对照重组载体的制备及阴性对照

pMD-19T-HINV阳性对照重组载体通过以下制备方法获得：

以HINV病毒的cDNA为模板，用HINV病毒的巢氏PCR引物HINV-1-F/R进行扩增，得到扩增产物。将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD-19T载体，转入DH5α大肠杆菌中，通过筛选及测序，选取含有构建成功的重组载体的菌，提取质粒即得阳性重组载体。

阴性对照为pMD-19T空载体。

实施例2巢氏PCR方法的建立及灵敏度、特异性检测

1、PCR扩增方法的建立

(1)PCR扩增体系

以反转录合成的cDNA为模板，进行巢式PCR检测，第一轮PCR扩增使用的引物为HINV-1-F/R，所用PCR酶为艾科瑞公司的2×Accurate Taq预混液(含染料)(货号AG11019)。PCR反应采用20μL体系：2×Accurate Taq Master Mix 10μL，浓度为5mΜ的正反向引物各1μL，1μL的cDNA模板，灭菌水7μL。

(2)PCR反应程序

将装有反应体系的PCR管放入TaKaRa PCR Thermal C PCR仪中，设置如下程序：98℃预变性5min；98℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；再72℃延伸10min，最后4℃保存。

PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，引物HINV-1-F/R所扩增片段的大小为937bp。若样品第一轮PCR扩增未检测出阳性条带，则将产物用灭菌水稀释50倍后作为模板，进行第二轮PCR扩增，使用引物为HINV-2-F/R。PCR反应的体系及扩增程序同第一轮PCR反应。

巢氏PCR第一轮和第二轮引物的扩增结果分别如图1和2所示。由图1可知，巢氏PCR第一轮引物HINV-1-F/R的扩增产物的条带单一。将一扩产物稀释50倍后作为模板，用巢氏PCR第二轮引物HINV-2-F/R进行扩增，结果如图2所示，由图2可知，出现了单一明亮的条带，阴性对照皆无条带。上述结果表明本发明所设计的巢氏PCR引物可成功检测HINV病毒。

2、灵敏度检测

为检测所设巢氏PCR引物的灵敏度，分别使用引物HINV-1-F/R和HINV-2-F/R，以不同浓度的阳性重组载体为模板，进行了PCR扩增。将浓度为40ng/μL的pMD-19T-HINV阳性对照重组载体按10倍比稀释9次，稀释后的浓度分别为40ng/μL、4ng/μL、0.4ng/μL、40pg/μL、4pg/μL、0.4pg/μL、40fg/μL、4fg/μL、0.4fg/μL和40ag/μL。依照建立的PCR反应体系和条件进行扩增反应。

引物HINV-1-F/R的灵敏度检测结果如图3所示，引物HINV-2-F/R的灵敏度检测结果如图4所示，二者所使用的Marker和模板浓度均相同。其中，所使用的Marker为DS2000Marker，泳道1～10对应的阳性对照重组载体的浓度依次为40ng/μL、4ng/μL、0.4ng/μL、40pg/μL、4pg/μL、0.4pg/μL、40fg/μL、4fg/μL、0.4fg/μL和40ag/μL。由图3可知，浓度为40fg/μL以上的样本均有明显的目的条带，表明第一轮PCR的最低检测限为40fg/μL。由图4可知，浓度为40ag/μL以上的样本均有明显的目的条带，表明第二轮PCR的最低检测限为40ag/μL。由上述结果可知，本发明所述引物建立的检测HINV病毒的PCR方法具有极高的灵敏度。

3、特异性检测

为检测所设巢氏PCR引物的特异性，选取分别含有HINV病毒、青蟹呼肠孤病毒(mudcrabreovirus，MCRV)、罗氏沼虾小RNA样病毒-1(Macrobrachiumrosenbergiipicorna-likevirus1，MrPV-1)、罗氏沼虾双顺反子样病毒-3(MacrobrachiumrosenbergiiDicistro-likevirus3，MrDV-3)、罗氏沼虾黄病毒(Macrobrachiumrosenbergiiflavivirus，MrFV)和神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)的不同病料组织进行RNA提取，随后反转录为cDNA模板，分别使用引物HINV-1-F/R和HINV-2-F/R进行PCR扩增，RNA提取及反转录方法参照实施例1，PCR扩增依照建立的PCR反应体系和条件进行扩增反应。

巢氏PCR引物HINV-1-F/R的特异性检测结果如图5所示，M为DS2000 Marker，泳道1～6分别为HINV、MCRV、MrPV-1、MrDV-3、MrFV和NNV病毒的阳性cDNA模板。巢氏PCR引物HINV-2-F/R的特异性检测结果如图6所示，其所用Marker以及泳道对应的模板图5相同。由图5和图6可知，针对HINV设计的巢式PCR引物只能在含有HINV病毒cDNA的模板中扩增出大小相符的单一条带，表明所设计的巢式PCR引物具有较高的特异性。

实施例3凡纳缤对虾中HINV病毒检测

为进一步验证所建立的巢氏PCR方法，能否适用于对虾中HINV病毒的检测，我们从有“玻璃”虾出现的养殖塘中选取了6只成虾和8只虾苗，并分别取成虾的肝胰腺和虾苗的甲壳下组织，提取RNA并反转录成cDNA，采用所建立的巢氏PCR方法进行HINV检测。

(1)RNA的提取：参照实施例1中的RNA提取方法；

(2)RNA反转录成cDNA：参照实施例1中的反转录方法；

(3)PCR扩增：PCR扩增体系和反应程序参照实施例2，PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测。

巢氏PCR第一轮和第二轮引物的扩增结果分别如图7和8所示。由图7可知，第一轮PCR在6只成虾中未检测出条带，在8只虾苗中，有5只检测到大小相符的条带，但条带较暗；以第一轮PCR产物稀释50倍后作为第二轮PCR模板进行扩增，结果如图8所示，6只成虾中有3只在第二轮PCR中检测到了大小相符的条带，8只虾苗有7只在第二轮中检测到大小相符的条带，其中包括第一轮检测到条带的5只虾苗。两轮PCR的阴性对照皆无条带，阳性均检测出条带。上述结果表明，本发明所设计的巢氏PCR引物及检测方法可成功检测对虾中的HINV病毒，可用于HINV病毒的实际检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

南方海洋科学与工程广东省实验室（珠海）

<120> 一种用于检测对虾HINV病毒的靶序列、引物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10488

<212> DNA

<213> 肝胰腺和消化道坏死病毒(Hepatopancreatic and intestine necrosisvirus)

<400> 1

caagcgaaga gctgaataag ctacccgctg cacaagcgaa gagctgaata agctacccgc 60

tgcacaagcg aagagctgaa taagctaccc gctgtacaag cgaagagctg aataagctac 120

ccgctgcaca agcgaagagc tgaataagct acccgctgca caagcgaaga gctgaacaag 180

cttagcgctg cataagcgtc aatcctgaac aaggatgacc ccccacccaa caaacctcaa 240

gcccctccct gacctagacg ccctcgctga cgccaacatc caggaagcga cccttgaata 300

tttcgaagag gatttcccct gccttcagca caccccctcc tcttccgacc tagacttgct 360

agccgacgat gaatctgcgc gagctctttg cgagtcaatg gacgaaatgc aagaacatct 420

ttgccccccg gctgttgaac accttgatca agtcccttat ttcttcccag aacagaattt 480

acgacctgcc acttcagctt ggcaggctct tcttctcgat gaacacatct ccagatgggc 540

tctcgttcca cttcgatacc gaactctggc tagatggaat tcaaccttcc acgagacctg 600

tgctgacctc aaccttcccc cttatttcac acccgatgta caatatcagt ctatcagtga 660

cattatactt gacgtcatca aatcagaatt ggtggacaca gtaaaagaat cagccaagaa 720

cttcgcaaag tccgttaact gggttgaagt gacaagcaaa accatccagt ttgtcgccgc 780

ctgtgacgct ctcgcaaatg ccgtccgtac ccgaggtaag gcagcagtgg cgcttcacgt 840

cgctagcttc gtctctcacc tcctgccctt tgccgtcttc gtctgcgatc ttgccggaat 900

cctcccagaa caaggcctgt ttaccttctt caaagaaaag gccacggagt ttttcaaccc 960

gaagaacctc tcggagttgt cgcattccgc taccgtagac acagactacc tcttcaacga 1020

gctcacatca caaccagtac atcagaaact cgactggtca gccgttctca agcccgaata 1080

catcttcagg gccgctgtcg tactagtcct ctccatcttc gcaggtacta gtttcgccaa 1140

gagcaagaac atgaatgccg gaatgctgta taccgcaatc aacgcaggta ccaccctcgc 1200

gtccaaggct accacagctg gttcattcct catctgttcc ctcttcggca ttgaaatgcc 1260

tcacgagacc ctagaaaaga aggcagaaga gctcgagacc aaggtcacaa agatcaccca 1320

ctccgactac gccactcaag ccgcatatga tgatgcttct ctcaaggagt acatcacaca 1380

gtgcgatctc gctctcaaga aatgcaagac acctgaaact gtgacattga aaagtcgctt 1440

ccagaccatc aagcgagaca ttgaagccgt ccgtaccaac ctcggccaga tttccgctcc 1500

catgtacctc cagatggtgc agtggaatga gtacaccttc ccttccgaga aggatttgaa 1560

tttcgctagc tggacccaag acacactaga gaagtgcata caattcaaca ctttcatgga 1620

cagtgtgaca gctcttattc cggagcgaca tccagtttca cccctttacc gctcactcaa 1680

agccaagagc gaagtggtga ggcgaattct cgaaagccga cagcgttgga taaccgaagg 1740

tggagatctt tgcacacaac cgtacgacag aatcctagcg aagctcgact cttggttgca 1800

gaccaccgca gctgcattcc acactgagcc atcccgctat catgacttcg acgccgactt 1860

gaacatggcc caggctttgc tcaagaaccc gatcaacgac catacccgac atgcccactc 1920

catgctgact tcctcctacg tgaaagccaa acaacacctg gctgagctag tgaaggacgc 1980

agctcaagca tcccgtcccc cgacagttgt catccaactc gttagcgagt ttggccatgg 2040

caagtcccgc ctgaccacag atcatctcat cccagacgtt gccaaccttc tcggcatctc 2100

tccatccacg tacttcatta acatctcaga gaatggacac tggtctaggt atctcggaca 2160

aaatttcgcc atctgtgacg agtaccttcg ttgcatgtcc aaagatgcgc tcttcaagca 2220

catcgccgag atcgcctcca acgcccgttt cgacgtcaat tctgccgaaa tcgcaggcaa 2280

gggagtacct ttccagtcca aagtgctatt cctcaattcc aaccagacga ggtgcacttt 2340

tccagagttg tcccctgatc acgtagatgc aatccactct cgcatcatga ccattcaggt 2400

tttcaaccct gagtgggcaa agtacgtcgc cgactgcaag cagcgcggga cagttcccat 2460

aaggacccat cctgtcaaca gagaccccaa gagagtgaaa tttgctctct gctccttcgg 2520

aactgccaac gagatagtct ccaaaaagcc cctcgactat gacaacctcg taaaattcat 2580

cgcgagactc atccaagaca acgacacaca gcgctccacc gctctcacta ccattgacga 2640

cctcgctgac cagatcacac aagtcacccc cactcctgtg aactaccagt tccgtcctga 2700

catgtcacgc cagggcgtag ccgagttccc tgatcttcga cccgtcacca tgatcgaagc 2760

aaagaacaag accgttaaga acggtgctct ctcttgcatc ttctgcaagg gggcgcatct 2820

ttctgagacg tgcactcagt tcgtccaggg acccgaacac gctcctcgct ggcaggccgg 2880

acccattgac agctgtgtca accacctcgt attccatctt tacgggaaac caggattcgg 2940

gaaaagccac accaccatca accacgtcat cccagcatta cagacactca ccaagttgcg 3000

ctcagtgaaa cttgactcct tcgatgaagt cttagagact cccatgatcg tgttcatcga 3060

cgacatggta cttgatgacc aagcaggata ccttcgctgg tggtccgctc agcctgtatc 3120

acacatcgtt gtgctctgtt ccaacatgaa ggcaaagagc gacaagtgga agactcgtaa 3180

ggactacttc cggagagccc tttccaagtc caaagaagac agccgcttct tcaagatcaa 3240

ggaactgaaa gtccctggtg ttgtccgcag actcggcatc aacggctacg tcaaattcga 3300

cgacaactgg gaatccaccc aaagtggccg ctgctatcac gtcaagtctg gttgcataac 3360

taccatggat gatcagctca ttgatctcga caaggagatt caagagttcg ctgtgctgtg 3420

gcacaaattc accaacacag tctacaccat cctcccttcc acagacatcc ccaacaaagc 3480

tgacatcatg ctcatgttcg actcatacga cgaagtcacc aaggcgttcg cctcctccat 3540

gagcgtctta aaagcagcct cgaagggaaa gatcgttgtg cgtcccggac ttacaggatg 3600

tactgccaac gttgacctct ctgagatgaa gctgcctgag gagtatccca tctccaacct 3660

ggagtggact agattcgcct cagtcgtctc ccgtgtctac acttctgcca agagtgtttt 3720

cgtctccatc ggggacgaca tcatcttcgc agatttggcc acgaggaaga ttctgaagaa 3780

ttctaatctc tctccagtcc agatttacac ctctagtgac aagaaacaag tctacgtcaa 3840

ggatgcctct ggaaagcgat atacctatga cagtgagaag ttcatcactc gcgtgaccac 3900

cacccttcaa gacgtcagct actggcaggg tctcccgcta gaagccatca tctacctcat 3960

gaagaatcac caagtcatca tcgaagagca ctttcccctc accttcctca aactcaagaa 4020

gaaggcccgc cgagatagaa acatgcagat cgtccaacag atcactaact ccaaggcctt 4080

ccaggttggg ttccccatcg ctgtgatcgg agttgctgct acagcaatct tcgggatcgc 4140

gaaactctcc tccaagaaag aaaagtcccc aaagaaaccc tcccgacctg acagcgacag 4200

ctcttcaagc gagtccgaat cagacgaaga acaatctgcc cctcagaagt ctgagaagtc 4260

tcagacgcga gttgctagga aatccaagca atccgcaccc gagaagaagg aacgatctaa 4320

caccaaggtc ctccgcaagc agaaacagtc tgagcctgag cacaacccca agtcttcaac 4380

taaggttgcc aggaagaagc cccaatcaga gccccaaaaa tctgacaaat cctccaccaa 4440

agtcgctcga aagctgatgc agaccatcct tgaagaagac gaagaagtgc accagtctct 4500

ttatgacttc gaagttactt ccagaaaccc agagtctgtt gacacaacca tccgccttct 4560

cgcggagaat tatgtcaaag tcaaaggatt cggatccaac ttcggaatca ttcttgggaa 4620

tggtttcatc ctcaccaccc ttcacacagt tcggatgaac accatcgatt ccctaattga 4680

gattgattca gacacgctct tcagcgcccc tgccaccatc cataccacct gggaaggtag 4740

cgacctcgca ctcctcaagt gccctaaagc cacaggaaag accctcctca agcactgggt 4800

gacgaacgat gacattcaca agctgtacga aggtgccatg atatccccca actcatcccg 4860

gggggttgat accttcaatg gccggttcat cctcttcccc cagaagcgcc gcctgggaca 4920

gtatcatgac gaacgcacag tttccatcga cttcgtccgt tctgatattg tcacacgcgc 4980

cggagactgt ggctccgcgt acatttccac ccagaaagac gtccgaggcc atatcttcgc 5040

tctacacgct tgtctgcaaa acgggcgcag ccacggagca tacattggca gggaagacct 5100

gcaagacgcg atgcaaagca cacctcgtcg catcccccag tcctccccta cccctgctga 5160

gggagtctcg cacatcgaga tcaacggcca cgaaatactt ggaaccacct ctcaggtgga 5220

tttccttgta cagaagttcg gaagctccga cgctccccga atgccgctcc ctaaagacgc 5280

aattgagcta ggaagactag ccaagacccc tcccgagacc accaagtccc gaaagatccc 5340

gatcactcag cctggcatga agaccacatg ctccaaagtg ccagtttcca ctgacctcta 5400

ccgagttctc gaattcgacc agatggccac ggagctgaac gggaagccct cccatcttgc 5460

gacgcagatt gccaagcatg gcatgacccc cgacctcaac atcgacgagg gatgcctccg 5520

tcgtgctact tccctcgtgg cgtaccgcta cgttagcgcg atggcaaaga atggccgcca 5580

gctgtccaca ctgtcactcc aacagacctt cggtgggatt aaggcaaaag gcaaagtgac 5640

gctagacaag ctcacaaacg acacctctgc cggtttcctt tctctctacc tcaacaaggc 5700

cccccttaag gatgcctacg tgaaggtcta tgacgacgga cgagttgagc ctacagaact 5760

aggcatcaag actttccaag acgcgaacaa catcctagct cgcggcaaag actacccgaa 5820

tgcgacactc ctttcgatag gacactgcaa gctcaaatct gagcttctcc ctgcccagaa 5880

aatcgagcag ggccagctac gttgcttcgt tgctgaggga atcgagagca ttattccgtg 5940

ccgttccaag cttggttcct tcgtagctat gcaaaacgag ctgcgacaag acctcttccc 6000

gtgcatcggg attgactttg agaccgaatc atcctacctg ttgcatcgcc ttctctctgt 6060

caacgacacc atccaacagg gagacttcaa gcgcttcgac aagacaatgc caatcgagct 6120

gaagagagca gcgtgcgaag tagtcgagaa gtgttacatg cgtaaccctc ttaaccgcta 6180

tgacgccccc gcccggagag tgctttacaa cacctggtgc tcccctctct accttgccag 6240

agatcttctc atgaccactg gcaacggaca gccgtctggc aatgccatga cagccactct 6300

taatagcatc gtctcagaaa ttgcctacac gtactgccta ttcaggcatg cggatgagca 6360

taatctgcgc ctcaacaccg gcgacttcac catgatcatc tatggcgatg actgggttgc 6420

tgctactaag actgagctca tgcctagcgc tgacaaactc atctcataca tgtccgaaat 6480

cggactcacc ctcacctcac ccatcaagac agagcccttg aaggacttct atcccattga 6540

ggaaatggag ttctgctcga ggacttttca tgagcacact tcactagttg tgcttgctcg 6600

cctcaagaaa tcatccatcg aggcgctgct gcattactgc tactcgctca catcagaagc 6660

cgttcaggac aacgtacgga ctgcactcca gttcgctgtg tcgtacgatg aagagtatta 6720

caacctcatc cttcacgacg cacagatcct agttgcccac tacggcggga cgcttcctca 6780

agactacccg aatgcgacac tcctgccata cgagatggct ttcagcgcct tgcttggcaa 6840

gatcatcaac aagaccaaca ccaagcgcga attcaaaaga gcgacagaga agcaatcgtt 6900

accccgaaag gatccacgga acgatctcag cagtagctgc cctgacctca caaaactcac 6960

actcacgaca tcacactcca cgattccttg cacgcaagtc attgtggacg atcccccgca 7020

aacctctctt ccaaatgaac ccccagccaa caacatttgt gctgaagagt ccgagagagt 7080

tcatcatcca gtacagcaag tactgctata ccccaaccaa aactgcgaat cagttcatca 7140

acgagttgat ccagggaagg ataatatgcc aggacaagcc cctcacgccc taccaaaggg 7200

aaatcccagg gaatttccga ttccaggcag tcgtcaagtc gacctgtctt cagcctacgc 7260

tgcactcaca ccacccgaac aagaaacacg cattacaagc cgtgtcagca agggtggtga 7320

tgtaccttct gaaggaagca gcacgcgaag acctgacagt gctcgatcta acatgccagc 7380

ctcatcccca aggtctgccc cgcttaactc taagcagaga agactaaaaa ggcgcgctgc 7440

acaacgacaa ctggctcttc caacttacca tcaattctct tcctccctca ctggagtaga 7500

agacgacgga gccattgcca catcttcccc cgcagagaaa catggtgccc ttccaacagc 7560

ttggaacaag ctgagggtta ccccacttcc tgagagtccc gccgaaaagc aatcgcttgg 7620

agctcccagc gctgatgcag ttccccagat ggagtctggt gcaccagcag gtggaaatgg 7680

cccagccccc gccatcgggc cagtccaccc cccttcactc ctccaaggca tgatcactct 7740

tgccggcaca gctcagaacc tcctgaactg cgccatggag tttgtgatgg gtactccgct 7800

acaaatcgac ccatccattg ctgcttggac cgtgatcaag gaagtctcct tacatgagtc 7860

taagtggcag aatcccgtag ctcgtctgtt ctaccagctc cacaagaacc gttcccccgc 7920

catcgacatc aaggtggagg ttacaggagc agtattcgat gtaggcaagc ttgccacatg 7980

catcgtctac ggacctcccg ccaatggcga gaagtactca gacttagagc tgcaacagca 8040

ttacctcacc ctgtacgcca cgaacgagaa caacaccgtc gtgactactc tcaccgacag 8100

gcgcacatca cacttcgctc ggaccgatga atacgacaga gaactagaga gccattatcc 8160

caagcttctc gtctttgtcg ctgtcccgat ctacaacacg tcgggagcag acaccccacg 8220

catccgaatc cgagtcggag atcgccttca tccctcatcc atcttcacca tgcctaatct 8280

tcctctagtc cgctccctga cttcctcagg aactggcatg catcaaacca tccctcaagc 8340

ataccgcgac ctgaagatcg tcgttgacgg agcctactac attgcttcaa ccgctgggag 8400

acaccttggc cctgacatta acggatatct cgtccgaggg ccctcagtcg cagttgatat 8460

catacctcat gctggagctc tcacgtattc tttcgtcaac gccaacggaa ctgaacactt 8520

ttccgtctat tatggtgcca tgaccctcga tgaagccgct aactcctata aggacgaggt 8580

gagtgtcatt tacgaccgta acaacggcct catttccttc gaagctaccg aaggcgacat 8640

cttagacgtt caccagttca acggcactct acagcatggc ttgggcactc atatacgacc 8700

ttgctattgg gttcgtacca cgcgatcccc tttcctagca gtccagccag ctgatggtca 8760

ccacgataac accactatct accatttcgc cgggatgtca ggattacttc cagttcttat 8820

aggcgccaaa gatcctctag ttccgactgg agagtctagg tgtctcttcc agcaattttc 8880

ttcctctatc actcccggca actatgctgg agagaactct cttcccttcg ctggcactct 8940

tgactatgct tttgctcaag agcttggaat agaagatgat gaagccattg ttgcactcac 9000

agaccgcacc actgactcca ccctctgcta tctgcgctgg tctgggacct tcaagtcctg 9060

gtccatccgc gcaactccct accttgccag caacttcaac ctctcctcat gctacatttc 9120

tcacatcacc cgagaattct ccgggaaact gcccgacact gacctttcca acttttcatc 9180

ccgtgtcgcc tcccagggaa ccccccagaa aattgttcgc tgtcgcactg accttgctga 9240

gccccccgcc gagcgtcaag gaaatctcat ctcaaccagc atgcaaatcc atgcacaaca 9300

aaatatgctt gataaacaac tcgagcagca agcatggcag aatgagttga accgagaata 9360

taatgcttgg aatgcccagc aaagccgtca gcatactgaa tttcttcaga cgcgcgacca 9420

gcacttcaaa gcccagatgc gaggactccg actcggaaac ctcgatggga gagatattcc 9480

agcaggaacc caactttctg tcctccctcc cgcttattct gagcatgacc ccttcacctc 9540

ctccgacaag cctaaggaag gcaattcctc ctccgcccag cctaaggaag gcaattcctc 9600

ccctcccaag cctgaggaag gcaagtaccc cctcatccct tttgtgaagg aaggcacttt 9660

tgacgacatg tctttgagca ccttcctatc agaatccact cctgaggatg aagaaaatct 9720

agccatgtcc gatcccccca tctactccga acaatcccaa gctatcatga agcaaatggg 9780

acacaaggaa ggtgagggat tggggaagca gtcacaagga attacatcac ccatccagcc 9840

tgactattca gacctcgctg gcggcaaaag ataccccgtc ctaggttctg atcctacccc 9900

cgctaatccc tcagggaccg gactcaagag cacgaaagcc agtatccccc ctcctgcctc 9960

attgacaggg ggaactgctg gtcgggttgc cgccaggtct gccgccaaga cagcccttaa 10020

agcagcctcc aaagtgcatc ctgcccttat tgccgcagac gttgccacag aagttatctc 10080

agcaaaccct acatcattgg gacaccttgc tcctgtgcag ccgatgcagc ccaccgtgag 10140

cttagacgga cggtgaagtg aacgcccgta cagctctaga aagaatttga tttcacttta 10200

gaattaagtt tctcattcta tcttgatttc cgcgttgtag ccagtatacg ttgaattgcg 10260

ttgcttcgta tatgctcata actagcctga aaactagtct cgagtctact ttatctcctc 10320

gattttgcta agaccatgtc gatggggaac gcccttcttt cttttctata tacttcatat 10380

acaacatatg atttaaataa aattaaatta actaaactaa acataacaaa ttacacaaat 10440

acaaacataa acataacata acataattac attacacata cccctaca 10488

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> 肝胰腺和消化道坏死病毒(Hepatopancreatic and intestine necrosisvirus)

<400> 2

gagtctaagt ggcagaatcc cgtagctcgt ctgttctacc agctccacaa gaaccgttcc 60

cccgccatcg acatcaaggt ggaggttaca ggagcagtat tcgatgtagg caagcttgcc 120

acatgcatcg tctacggacc tcccgccaat ggcgagaagt actcagactt agagctgcaa 180

cagcattacc tcaccctgta cgccacgaac gagaacaaca ccgtcgtgac tactctcacc 240

gacaggcgca catcacactt cgctcggacc gatgaatacg acagagaact agagagccat 300

tatcccaagc ttctcgtctt tgtcgctgtc ccgatctaca acacgtcggg agcagacacc 360

ccacgcatcc gaatccgagt cggagatcgc cttcatccct catccatctt caccatgcct 420

aatcttcctc tagtccgctc cctgacttcc tcaggaactg gcatgcatca aaccatccct 480

caagcatacc gcgacctgaa gatcgtcgtt gacggagcct actacattgc ttcaaccgct 540

gggagacacc ttggccctga cattaacgga tatctcgtcc gagggccctc agtcgcagtt 600

gatatcatac ctcatgctgg agctctcacg tattctttcg tcaacgccaa cggaactgaa 660

cacttttccg tctattatgg tgccatgacc ctcgatgaag ccgctaactc ctataaggac 720

gaggtgagtg tcatttacga ccgtaacaac ggcctcattt ccttcgaagc taccgaaggc 780

gacatcttag acgttcacca gttcaacggc actctacagc atggcttggg cactcatata 840

cgaccttgct attgggttcg taccacgcga tcccctttcc tagcagtcca gccagctgat 900

ggtcaccacg ataacaccac tatctaccat ttcgcc 936

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagtctaag tggcagaatc ccgtag 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcgaaatgg tagatagtgg tgttatc 27

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggaccgatg aatacgacag agaa 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtggtacga acccaatagc aagg 24

Claims (10)

1.一种用于检测凡纳滨对虾HINV病毒的靶序列，其特征在于，靶序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种用于检测凡纳滨对虾HINV病毒的引物，其特征在于，所述引物用于扩增SEQ IDNO.2所示靶序列。

3.根据权利要求2所述引物，其特征在于，所述引物为巢氏PCR引物，引物序列如SEQ IDNO.3～6所示。

4.权利要求1所述靶序列在制备检测凡纳滨对虾HINV病毒的产品中的应用。

5.权利要求2或3所述引物在制备检测凡纳滨对虾HINV病毒的产品中的应用。

6.一种含有权利要求1所述靶序列的重组载体。

7.一种检测凡纳滨对虾HINV病毒的试剂盒，其特征在于，含有检测SEQ ID NO.2所示靶序列的试剂。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂包含权利要求2或3所述引物。

9.根据权利要求7或8所述试剂盒，其特征在于，还含有权利要求6所述重组载体作为阳性对照。

10.一种检测凡纳滨对虾HINV病毒的方法，其特征在于，提取待测样本的RNA并反转录为cDNA，用权利要求3所述巢氏PCR引物进行PCR扩增，若第一轮出现大小为937bp的特异性条带，或第二轮出现大小为603bp的特异性条带，则表示所检样本中含有HINV病毒。

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