CN117224669A - 非洲猪瘟病毒mgf360-21r蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒免疫学领域，具体涉及非洲猪瘟病毒MGF360‑21R基蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用，同时涉及该蛋白的功能鉴定。具体如：ASFV MGF360‑21R蛋白能够作为免疫应答诱导剂或者佐剂进行应用；ASFV MGF360‑21R可作为炎症应答的激动剂进行应用。本发明构建ASFV MGF360‑21R蛋白的重组慢病毒并感染小鼠后，发现小鼠血清和动物组织的炎性细胞因子产生且分泌上调。本发明为ASFV的防控以及MGF360‑21R蛋白可以作为佐剂激活炎症反应提供了新的支持。

Description

非洲猪瘟病毒MGF360-21R蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和病毒免疫学领域，尤其涉及非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus,ASFV)的MGF360-21R蛋白的新功能，即ASFV MGF360-21R蛋白诱导炎性细胞因子的转录和分泌上调；同时ASFV MGF360-21R诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的成熟。

背景技术

炎症是身体对于受损细胞、组织或者外来刺激反应的一种自我保护机制，通常伴随着局部组织红、肿、热、痛和功能障碍等症状。炎症的背景包括感染、创伤、化学物质、放射线、自身免疫等多种因素。炎症分为急性炎症和慢性炎症两种类型，其机制和生理反应不同。急性炎症通常是短暂的，在几天到数周内会自行缓解；而慢性炎症持续时间较长，可能导致永久性组织损伤和功能障碍。炎症对身体健康有极大的影响，长期慢性炎症还可能增加患癌、糖尿病、心血管疾病等疾病的风险。炎症的生物标志物是用来诊断和监测炎症疾病的生物分子指标。常见的生物标志物包括以下几类：炎症因子，全身性炎症标志物细胞表面分子，例如肿瘤坏死因子，如(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、红细胞沉降率(ESR)、CD14、CD11b/CD18等。细胞因子是由不同类型的细胞合成并分泌的多肽、蛋白质，是免疫系统中的重要分子。细胞因子分泌后，可以通过间接或直接作用于细胞，调节和控制细胞增殖、分化、凋亡和调节免疫细胞功能等多种生物学功能。不同的细胞因子在免疫系统中发挥着不同的生物学作用。IL-1(白细胞介素-1)是一种重要的炎症因子，由多种免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞等产生。它是炎症反应信号转导过程中的关键分子，参与了细胞外环境和局部免疫反应的调节，同时也参与了免疫途径的许多生理和病理过程。IL-1包括两种不同分子：IL-1α和IL-1β，它们的亚型在结构上略有不同。IL-1α主要是由细胞内释放而引起炎症，而IL-1β主要是由细胞外释放，是一种典型的急性炎症信号分子，可以刺激其他细胞合成出许多炎症介质，如白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α等。

病毒感染时会调节宿主免疫应答以确保其生存和繁殖。研究表明，病毒可以通过多种机制调节炎症小体的活化和IL-1的产生，包括：(1)抑制炎症小体活化：病毒能够直接抑制炎症小体活化，例如乙肝病毒的HbX蛋白就能够通过抑制NLRP3的表达和翻译后修饰过程，来降低炎症小体的活化水平；甲型流感病毒NS1蛋白抑制NLRP3炎症小体活化，最终抑制IL-1β的产生。麻疹病毒V蛋白也结合NLRP3，阻遏NLRP3介导的IL-1β的产生。脊髓灰质病毒3C通过其蛋白酶活性切割NLRP3抑制IL-1β的产生。(2)促进炎症小体活化：对于一些病毒而言，促进炎症小体活化和IL-1产生是其能够潜伏和复制的必要条件。例如流感病毒通过其衣壳蛋白与细胞表面分子结合，诱导炎症小体活化和IL-1产生，从而促进病毒DNA复制；脊髓灰质炎病毒的基因组能够激活IL-1β的产生；登革热病毒的2A、2B以及M蛋白激活NLRP3炎性小体，诱导IL-1β的产生。(3)模拟炎症小体激活：一些病毒通过模拟炎症小体激活，增加IL-1的产生。例如，腺病毒可以通过宿主细胞IDUCD/Caspase-1通路，导致炎症小体的招募和活化，同时增加IL-1的产生。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性出血热疫病。感染家猪后死亡率高达100％，给全球的养猪业造成了巨大的打击。目前无针对强毒株对宿主产生高效保护力的疫苗或抗病毒药物。非洲猪瘟病毒侵入宿主后，可引起多种炎症反应，包括以下几个方面：(1)细胞因子释放：病毒感染后，宿主免疫细胞会释放多种炎症因子，如IL-6、TNFα-释、IL-1β释等，进一步提高炎症反应的程度；(2)活性氧的产生：病毒感染还会导致宿主免疫细胞中活性氧和一氧化氮等有毒代谢产物的大量积累，导致自身氧化应激反应的损伤；(3)白细胞活化：病毒感染还会引起黑色素细胞和巨噬细胞等免疫细胞的大量积聚，其分泌的多种炎症因子引起了瞬间的炎症反应。一旦非洲猪瘟病毒感染机体诱导大量炎症因子的释放，导致宿主机体组织器官的氧化应激损伤、白血细胞凋亡等病理反应，引发“细胞因子风暴”，导致宿主产生如脾脏充血肿大易碎、淋巴结肿大、各器官出血等系统性器官损伤和宿主死亡。研究证实，ASFV感染细胞诱导TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子介导的“细胞因子风暴”，对内皮细胞造成严重损伤。ASFV感染也诱导趋化因子显著增加。以上研究说明，ASFV可能利用自身组分在感染后期诱导炎性应答，导致机体组织功能发生紊乱。我们推测ASFV早期免疫抑制严重，但后期能够形成“炎症因子风暴”，可能是病毒大量复制以及宿主致病和病理损伤机制的重要原因之一。由于且ASFV存在基因重组现象，敲除毒疫苗可能存在返强风险，因此ASFV的炎性诱导蛋白的抑制剂或者亚单位疫苗的研发成为一种重要的选择，而亚单位疫苗的缺点是缺少诱发免疫应答的组分，ASFV亚单位疫苗的免疫诱导剂或者佐剂的研发也至关重要。ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，其基因组DNA长大约150～190kb，编码150多种蛋白质，其中约五十多种蛋白质为结构蛋白，大多数蛋白仍未被鉴定。因此，对其功能的研究有利于疫苗以及动物炎症相关药物的研发。

发明内容

本发明揭示了ASFV的MGF360-21R蛋白的新功能，即MGF360-21R蛋白促进炎性细胞因子的转录与分泌，同时ASFV MGF360-21R诱导NLRP3炎症小体介导的Caspase-1和IL-1β的活化。

本发明构建了ASFV MGF360-21R过表达系统，通过转染猪BMDMs，发现MGF360-21R诱导炎性细胞因子的大量产生。本发明构建了ASFV MGF360-21R慢病毒表达系统，将ASFVMGF360-21R重组慢病毒接种BALB/c小鼠后，发现IL-1β、TNF-α、IFN-β、IL-6等炎性细胞因子的转录和分泌显著增加。因此，为了控制非洲猪瘟病毒诱导炎症反应，可以设计ASFVMGF360-21R的抑制药物或ASFV MGF360-21R缺失减毒活疫苗；同时在亚单位疫苗设计中，为促进机体免疫应答，ASFV MGF360-21R蛋白可以作为诱导剂或者佐剂使用，帮助疫苗更好产生抗体。

其中，ASFV MGF360-21R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码该氨基酸的DNA如SEQ ID NO:2所示。

本发明构建了ASFV MGF360-21R基因过表达系统，具体构建策略如下：

(1)以Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018为模板，用引物MGF360-21R-F和MGF360-21R-R扩增含有MGF360-21R基因CDS的片段，将扩增片段与pMD20 T载体连接，获得阳性克隆PMD-MGF360-21R，测序，结果显示正确；

(2)将PMD-MGF360-21R进行XhoI和EcoRI双酶切，连接到pcDNA3.1载体；

ASFV MGF360-21R过表达载体转染BMDMs后，通过ELISA和qPCR检测，发现MGF360-21R表达后，MGF360-21R诱导IL-1β的分泌，IL-1β、IFN-β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的转录显著上调。MGF360-21R重过表达载体质粒转染BMDMs后，通过NLRP3炎症小体抑制剂MCC950处理，证实MGF360-21R促进NLRP3炎症小体介导的Caspase-1和IL-1β的活化。

本发明构建了ASFV MGF360-21R基因慢病毒表达系统，具体构建策略如下：

(1)以Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018为模板，用引物MGF360-21R-F和MGF360-21R-R扩增含有MGF360-21R基因CDS的片段，将扩增片段与pMD20 T载体连接，获得阳性克隆PMD-MGF360-21R，测序，结果显示正确；

(2)将PMD-MGF360-21R进行XhoI和EcoRI双酶切，连接到慢病毒载体(pHBLV-CMV-MCS-3Flag-EF1-T2A-Zsgreen-puro)；

(3)将慢病毒载体进行病毒包装，收获ASFV MGF360-21R重组慢病毒R-lenti-MGF360-21R(LV-MGF360-21R)。

同时将空载体慢病毒(empty-lenti)进行包装作为对照，空载体慢病毒的包装同ASFV MGF360-21R重组慢病毒包装策略相同。

本发明发现，ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠后，小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IFN-β和IL-6的分泌上调。

ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠后，小鼠组织中IL-1β、TNF-α、IFN-β、IL-6等炎性细胞因子表达量显著上升；MGF360-21R诱导小鼠肝脏、脾脏、肺脏、心脏、肾脏的IL-1β和Caspase-1蛋白成熟表达。这说明MGF360-21R基因表达后，MGF360-21R蛋白激活炎性细胞因子的转录和分泌。

另外，ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠后，MGF360-21R引起小鼠脾脏的肿大充血，能够引发组织发生促炎性应答。

本发明具有以下有益效果：

本发明发现ASFV的MGF360-21R蛋白能够诱导炎性细胞因子的转录和分泌，并通过NLRP3信号通路激活IL-1β的分泌。本发明为进一步阐明ASFV的基因功能以及MGF360-21R的新功能提供理论基础，同时，本发现能够为控制病毒诱导炎症反应，设计MGF360-21R的抑制药物提供新的视角，同时在疫苗设计中，为促进机体免疫应答，ASFV MGF360-21R蛋白可以作为诱导剂或佐剂使用，帮助更好产生抗体。

附图说明

图1：构建的MGF360-21R重组慢病毒过表达载体质粒的鉴定。图1中，M；DNA laddermarker；1：含MGF360-21R基因的重组慢病毒载体；2：MGF360-21R基因重组慢病毒载体的XhoI和EcoRI双酶切产物鉴定；3：重组慢病毒MGF360-21R基因的PCR扩增产物鉴定；4：慢病毒空载体质粒的XhoI和EcoRI双酶切对照。

图2：ASFVMGF360-21R重组慢病毒的包装(左)和表达鉴定(右)。图2左荧光图中Mock表示空细胞对照，LV-MGF360-21R表示MGF360-21R重组慢病毒过表达载体质粒包装病毒感染。右侧Western blotting中Mock表示空细胞对照，LV-MGF360-21R表示MGF360-21R重组慢病毒过表达载体质粒包装病毒感染HEK293T细胞后，蛋白表达检测。

图3：ASFV MGF360-21R转染BMDMs，诱导细胞(A)IL-1β分泌的以及(B)细胞因子IL-1β、IFN-β、IL-6、TNF-α的转录。

图4：ASFV MGF360-21R诱导NLRP3炎症小体介导的Caspase-1和IL-1β的活化，图(A)中Mock为pCDNA3.1空载体转染细胞，LPS+Nig为阳性对照，细胞使用脂多糖(LPS)与尼日利亚菌素(Nigericin)共同孵育处理细胞，MGF360-21R为MGF360-21R过表达载体转染细胞；图(B)中Mock、LPS+Nig、MGF360-21R组分别使用DMSO或NLRP3抑制剂MCC950孵育后，ASFVMGF360-21R诱导的N-GSDMD(焦亡标志物)，IL-1β和Caspase-1表达降低。

图5：ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠，不同组织C7171R的表达情况，图5中，blank：无任何处理的小鼠；PBS：注射PBS的小鼠；LV-Vector表示空载体包装的慢病毒感染小鼠，LV-MGF360-21R表示ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠。

图6：ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠后，小鼠的血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-β、IL-6分泌上调。

图7：ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠后，小鼠的组织中炎性细胞因子分泌表达上调。

图8：中小鼠脏器从左至右依次为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏。

保藏信息

Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018：

保藏时间：2020年12月21日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:V202096；

保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学；

分类命名：Ⅱ型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS2018。

具体实施方式

实施例中所用ASFV CN/GS2018为非洲猪瘟基因II型野生毒株，保存于中国农业科学院兰州兽医研究所。公众通过其他途径获取的ASFV野生毒株也可以实现本发明。

实施例中小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所，均进行过安全检疫。

其他所用细胞和试剂均为市售产品。

实施例1重组慢病毒过表达载体质粒构建

(1)ASFV总DNA提取

取500μL病毒(ASFV CN/GS2018)平衡至室温，使用TIANGEN的病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒(DP315-F)进行提取。样品加入40μL Proteinase K、500μL裂解液RLC，涡旋振荡混匀后，56℃孵育5分钟，冷却至室温。

加入500μL异丙醇，涡旋振荡混匀。

将上述溶液全部转移至吸附柱CR4(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，13,400rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

小心打开吸附柱盖子，加入600μL已加入无水乙醇的漂洗液PWT，13,400rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。重复该步骤1次。

将吸附柱放回收集管中，12,000rpm～13,400rpm离心2min，弃废液。

将吸附柱放入一个RNase-Free离心管中，室温放置1分钟。向吸附膜的中间部位悬空滴加50～150μL无RNA酶的室温平衡后的ddH₂O，室温放置，2分钟后，13,400rpm离心1分钟。

(2)ASFV MGF360-21R基因CDS片段的扩增

根据GenBank中MGF360-21R的基因序列(登录号：MN172368.1)设计扩增引物，进行MGF360-21R基因CDS片段的扩增。上游引物：5’-CCGCTCGAGATGTCTACTCCACTTTCTCTACA-3’(含XhoI酶切位点)，下游引物：5’-CGGAATTCTCAATGAGATAATTCTTCATACATTAACAT-3’(含EcoRI酶切位点)，以ASFV总DNA为模板，扩增获得MGF360-21R基因的CDS片段。

该MGF360-21R基因的CDS为如SEQ ID NO:2所示。

该MGF360-21R基因的CDS所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

扩增体系如下(总50μL体系)：

反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分15秒，35个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

然后进行核酸电泳，利用Promega公司的DNA纯化回收试剂盒纯化回收ASFVMGF360-21R基因的CDS扩增片段。

使用XhoI酶和EcoRI酶，对纯化DNA和pcDNA3.1载体在37℃下酶切1小时。

双酶切体系如下：

反应程序：37℃30min。

然后进行核酸电泳，利用的DNA纯化回收试剂盒(Promega公司)回收酶切产物。将回收产物进行连接，反应体系及程序如下：

ddH₂O补充至10μL，16℃过夜连接。

连接产物通过DH-5α转化，挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的LB液体培养基培养，利用Promega质粒提取试剂盒提取重组质粒，送样华大基因有限公司测序鉴定。

其余所需蛋白基因NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、pro-IL-1β均按照相似方法扩增测序。

NLRP3：

上游引物：5'-ATGAGCATGGCAAGCGTCC-3'，

下游引物：5'-CTACTGGGAAGGCTCAAAGACAA-3'；

pro-Caspase-1：

上游引物：5'-5'ATGGCCGACAAGGT 3'-3'，

下游引物：5'-TTAATGTCCTGGGAAGAGGT-3'；

ASC：

上游引物：5'-ATGCCAGCTCTGCCCCTGGA-3'，

下游引物：5'-TCAGGATGGGATCATGCCTTTGCTC-3'；

pro-IL-1β:

上游引物：5'ATGGCAGAAGTACCTGAGCTCG 3'，

下游引物：5'TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGA3'。

(3)过表达载体和慢病毒过表达质粒构建

XhoI和EcoRI酶切pcDNA3.1载体(发明人所在实验室保存)或慢病毒过表达空载体pHBLV-CMV-MCS-3Flag-EF1-T2A-Zsgreen-Puro(购自上海汉恒生物)及MGF360-21R基因的CDS，并用1％核酸凝胶电泳检测并回收目的基因，然后用T₄ DNA连接酶16℃过夜连接MGF360-21R基因的CDS和pcDNA3.1载体或pHBLV-CMV-MCS-3Flag-EF1-T2A-Zsgreen-Puro。将连接产物转化入感受态细胞DH5α，将菌液送公司测序。

酶切体系为20μL，分别是：

空载体或MGF360-21R基因的CDS：3μL；

XhoI：2μL；

EcoRI：2μL；

酶切Buffer：2μL；

H₂O：11μL。

连接体系为10μL，分别是：

载体：2μL；

MGF360-21R基因的CDS：1μL；

T4连接酶：1μL；

10×连接Buffer：1μL；

H₂O：5μL。

结果如图1所示，MGF360-21R基因的CDS成功插入慢病毒载体pHBLV-CMV-MCS-3Flag-EF1-T2A-Zsgreen-Puro，即得到了MGF360-21R重组慢病毒过表达载体质粒。

实施例2ASFV MGF360-21R重组慢病毒包装

实施例1得到的MGF360-21R重组慢病毒过表达载体带有Flag标签、绿色荧光EGFP基因(Zsgreen)和puro药物筛选基因。

分别将过表达MGF360-21R重组慢病毒过表达载体质粒和空载体慢病毒质粒分别与辅助包装质粒共同转染HEK-293T细胞。分别于48h和72h收集细胞培养液上清，通过超速离心浓缩病毒，空载体慢病毒和MGF360-21R重组慢病毒滴度分别为9.24×10⁸、7.09×10⁸。

结果如图2所示，MGF360-21R重组慢病毒产生绿色荧光，说明该慢病毒成功包装。包装病毒感染HEK293T细胞后，通过Flag抗体检测，发现在MGF360-21R蛋白(42KD)的位置出现条带，说明MGF360-21R能够正常表达。

实施例3ASFV MGF360-21R诱导炎性细胞因子的转录和分泌

ASFV MGF360-21R转染前，将BMDMs的营养液弃之，用冰冷PBS清洗三遍，然后使用脂质体2000转染pcDNA3.1-MGF360-21R质粒，转染6h后，加入含10％ FBS的营养液培养，48h收取待检细胞样品。细胞上清通过冷冻干燥进行ELISA方法检测IL-1β蛋白分泌水平。收取细胞样品时，使用冰冷PBS清洗细胞三次，收集细胞样品提取RNA，进行IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的mRNA转录水平检测。

引物序列如下：

IL-6：

上游5’-TGGCTACTGCCTTCCCTACC-3’，下游5’-CAGAGATTTTGCCGAGGATGT-3’；

IL-1β：

上游5’-GACGGGCTTTTGTTCTGCTT-3’，下游5’-GGACATGGAGAAGCGATTTGT-3’；

TNF-α：

上游5’-CCCTCTGGCCCAAGGACTCAGATCA-3’，

下游5’-CGGGCTTATCTGAGGTTTGAGA-3’；

IFN-β：

上游5’-TTGTTGAGAACCTCCTGGCT-3’，下游5’-TGACTATGGTCCAGGCACAG-3’；

GAPDH：

上游5’-ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA-3’，

下游5’-GATCGAGTTGGGGCTGTGACT-3’。

结果如图3所示，与对照mock相比，MGF360-21R诱导IL-1β的分泌(图3A)与炎性细胞因子(IL-1β、IFN-β、IL-6、TNF-α)转录(图3B)。

实施例4ASFV MGF360-21R诱导NLRP3炎症小体介导的Caspase-1和IL-1β的活化，加入NLRP3抑制剂MCC950后，ASFVMGF360-21R诱导的IL-1β和Caspase-1表达降低

BMDMs经MGF360-21R过表达载体质粒转染，24h后，Western blot检测IL-1β、IL-1β前体和Caspase-1的表达水平。检测结果如图4A所示，MGF360-21R过表达载体质粒单独转染细胞后，GSDMD、IL-1β和Caspase-1的蛋白成熟体表达明显增加，这说明MGF360-21R诱导IL-1β的产生。

MCC950是NLRP3的抑制剂，如图4B所示，MGF360-21R转染BMDMs后，加入MCC950，抑制IL-1β和Caspase-1的表达降低。这说明，MGF360-21R诱导的IL-1β和Caspase-1表达通过NLRP3信号通路。

实施例5ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠，不同组织MGF360-21R表达以及不同细胞因子转录和分泌水平测定

1、BALB/c小鼠感染实验

使用PBS、空载体慢病毒、ASFV MGF360-21R重组慢病毒分别于BALB/c小鼠尾静脉部位注射，接种9天后，采集小鼠血清以及组织样品。

2、(1)小鼠组织MGF360-21R mRNA表达检测

采集小鼠1立方厘米大小心、肝、脾、肺、肾组织样本，研磨，PBS冲洗收集研磨后的细胞，提取蛋白后检测MGF360-21R的蛋白表达水平变化。

结果如图5所示，小鼠接种ASFV MGF360-21R重组慢病毒后，小鼠心、肝、脾、肺、肾组织MGF360-21R mRNA均有表达。

(2)小鼠血清中的炎性细胞因子的ELISA检测

采集的小鼠血液样本于37℃放置30分钟，然后4℃过夜凝集，2000rpm、10分钟离心，收集上清，-80℃待用。检测小鼠血清中炎性细胞因子的含量。

结果如图6所示，小鼠感染ASFV MGF360-21R重组慢病毒后，相对于对照组，小鼠血清中的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-β和IL-6分泌上调。

(3)小鼠组织炎性细胞因子的表达检测

将第7天采集的小鼠组织如肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏组织用于炎性细胞因子的mRNA以及ELISA检测。取1立方厘米大小小鼠组织，研磨，PBS冲洗收集研磨后的细胞，提取RNA，反转录后检测炎性细胞因子的mRNA表达水平变化。

qPCR引物序列：

MGF360-21R：

上游5’-ATGTCTACTCCACTTTCTCTACA-3’，

下游5’-TCAATGAGATAATTCTTCATACATTAACAT-3’；

IL-6：

上游5’-TGGCTACTGCCTTCCCTACC-3’，下游5’-CAGAGATTTTGCCGAGGATGT-3’；

IL-1β：

上游5’-GACGGGCTTTTGTTCTGCTT-3’，下游5’-GGACATGGAGAAGCGATTTGT-3’；

TNF-α：

上游5’-CCCTCTGGCCCAAGGACTCAGATCA-3’，

下游5’-CGGGCTTATCTGAGGTTTGAGA-3’；

GAPDH：

上游5’-ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA-3’，

下游5’-GATCGAGTTGGGGCTGTGACT-3’。

结果如图7显示，ASFV MGF360-21R重组慢病毒的接种动物相对于无MGF360-21R表达的接种动物，小鼠肝脏、脾脏、肺脏、心脏、肾脏的炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-β的mRNA表达水平显著上升。

实施例6ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染小鼠，诱导组织产生炎症应答

采集ASFV MGF360-21R重组慢病毒感染的小鼠脏器，从左至右依次为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏。如图8所示，MGF360-21R作为潜在免疫增强剂不引起组织肿大出血等。

以上所有的实施例结果表明，ASFV MGF360-21R蛋白表达能够诱导细胞产生大量的炎性细胞因子，同时，MGF360-21R能够通过NLRP3炎症小体促进IL-1β的炎症应答水平。在动物水平也证实了MGF360-21R诱导小鼠产生炎症应答。

以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

Claims (8)

1.ASFV MGF360-21R蛋白或ASFV MGF360-21R蛋白的同源蛋白在制备免疫应答诱导剂或佐剂中的应用，其特征在于，ASFV MGF360-21R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，ASFV MGF360-21R蛋白促进炎性细胞因子的转录与分泌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子包括IL-1β、IFN-β、IL-6、TNF-α。

4.ASFV MGF360-21R蛋白或ASFV MGF360-21R蛋白的同源蛋白在制备炎症应答的激活剂中的应用，其特征在于，ASFV MGF360-21R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，ASFV MGF360-21R蛋白通过诱导NLRP3炎症小体活化Caspase-1和IL-1β。

6.ASFV MGF360-21R蛋白或ASFV MGF360-21R蛋白的同源蛋白在制备Caspase-1或IL-1β激活剂中的应用，其特征在于，ASFV MGF360-21R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.ASFV MGF360-21R蛋白在制备ASFV疫苗佐剂中的应用，其特征在于，ASFV MGF360-21R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

8.ASFV MGF360-21R蛋白在控制ASFV诱导炎症反应中的应用，其特征在于，通过ASFVMGF360-21R的抑制药物或ASFV MGF360-21R缺失减毒活疫苗来控制ASFV诱导炎症反应。