CN108912217B - 一种促进WSSV感染的前纤维蛋白基因Cq-Pfn1及其制备方法与应用 - Google Patents

一种促进WSSV感染的前纤维蛋白基因Cq-Pfn1及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种促进WSSV感染的前纤维蛋白基因Cq‑Pfn1及其制备方法与应用，涉及基因克隆和基因工程表达。将Cq‑Pfn1基因连接到pMD18‑T载体上，并分析获得ORF阅读框，得Cq‑Pfn1ORF基因序列，再进行序列比对分析，与其他物种相比，Cq‑Pfn1具有高度的保守性；构建红螯螯虾前纤维蛋白pGEX‑4T‑1‑Cq‑Pfn1基因工程重组表达载体；将所得重组原核表达载体pGEX‑4T‑1‑Cq‑Pfn1导入宿主细胞中诱导表达，得表达产物，再通过亲和层析获得较高纯度的重组蛋白GST‑Cq‑Pfn1。红螯螯虾前纤维蛋白Cq‑Pfn1在白斑综合征病害靶向防治以及防治白斑综合征药物中应用。

Description

一种促进WSSV感染的前纤维蛋白基因Cq-Pfn1及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的基因克隆和基因工程表达，尤其是涉及红螯螯虾前纤维蛋白基因扩增、基因敲降、基因表达载体的构建及其在宿主细胞中表达产物对病毒感染的功能活性分析，即一种促进WSSV感染的前纤维蛋白基因Cq-Pfn1及其制备方法与应用。
背景技术
白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是导致虾类养殖尤其是对虾养殖的头号病毒性病原，该病毒对对虾和螯虾等水产甲壳动物的经济养殖造成了极大的威胁，因此，提高虾类抵抗WSSV感染能力是目前研究的重点和难点。目前虾类没有可用于研究的细胞系，这对虾类抵抗WSSV感染的分子机制研究以及后期的防治工作造成了极大的阻碍。红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)是淡水养殖经济虾种之一，其造血组织(Hematopoietic tissue，Hpt)干细胞可体外培养，因此以红螯螯虾作为研究模式虾，通过培养其Hpt细胞开展虾类对抗WSSV感染分子机制的研究具有重要的科学意义和潜在应用价值。
前纤维蛋白(Profilin)是1976年由Carlsson等人第一次在小牛的脾脏中发现的能够影响actin聚合的小分子蛋白(MW:12-15kDa)，命名为前纤维蛋白[1]。该研究获得红鳌螯虾Profilin1基因序列，其ORF框为378bp，编码125个氨基酸，其蛋白大小预测值为13.6kDa。Profilin广泛存在于原核生物、植物和哺乳动物等几乎所有生物体内，且在进化上高度保守，都具有保守的多聚脯氨酸结合位点、肌动蛋白结合位点以及磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)结合位点[2-8]，这些特异性结合位点在与其他蛋白相互作用过程中扮演着重要角色。Profilin最初被认为是一种体外肌动蛋白解聚因子，它通过结合单体肌动蛋白(G-Actin)，与G-Actin形成1︰1的复合物，起到隔离肌动蛋白，抑制其成核，从而使其无法聚合[1]。在与肌动蛋白相互作用的过程中，Profilin作用于微丝的两个末端，分别称为延长端(barbed ends)和解聚端(pointed ends)。Profilin的多聚脯氨酸结合位点与G-Actin结合形成Profilin-G-Actin复合物，隔离G-Actin，在一定程度上延缓G-Actin添加到微丝延长端，从而抑制微丝的延伸[9-11]。后来发现在肌动蛋白单体上Profilin可明显加快ADP与ATP之间核苷酸的交换，提升了稳态下单体的浓度以便在随后的聚合作用中有更多的可利用的单体[12]。Profilin是重要的肌动蛋白结合蛋白之一，其与肌动蛋白相互作用可调节哺乳动物、寄生虫等细胞中的膜运输与核传输。Profilin在病毒与宿主相互作用过程中具有一定的功能，例如，Harpen等[13]在研究呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)时发现Profilin与Actin共同作用于负链RNA模板和RNA依赖型RNA聚合酶(RdRP)，从而激活呼吸道合胞病毒RNA的转录，推测Profilin与Actin的相互作用在病毒的转录复制过程中可能发挥了极为重要的功能。研究发现，在病毒与宿主相互作用过程中，宿主Profilin的表达量也会发生变化，如中国对虾、凡纳滨对虾在WSSV感染后，其Profilin的表达量显著高于感染前[14-15]。关于Profilin与Actin之间相互作用在WSSV感染中的具体机制目前还不清楚，因此开展红螯螯虾Profilin(Cq-Pfn1)蛋白的表达纯化以及生物学功能方面的研究对阐释WSSV感染机制及其潜在防御靶点设计具有重要意义。
参考文献：
[1]Carlsson L,Nystrom LE,Lindberg U,et al.Crystallizationof a non-muscle actin.J MolBiol,1976,105(3):353-66.
[2]Reichstein E,Korn E D.Acanthamoebaprofilin.A protein of lowmolecular weight from Acanpthamoebacastellanii that inhibits actin nucleation[J].J Biol Chem,1979,254(13):6174.
[3]Cooley L,Verheyen E,Ayers K.chickadee encodes a profilin requiredfor intercellular cytoplasm transport during Drosophila oogenesis[J].Cell,1992,69(1):173-84.
[4]Valenta R,Ferreira F,Grote M,et al.Identification of profilin asan actin-binding protein in higher plants[J].J Biol Chem,1993,268(30):22777.
[5]Staiger C J,Goodbody K C,Hussey P J,et al.The profilin multigenefamily of maize:differential expression of three isoforms.[J].Plant Journal,1993,4(4):631-641.
[6]Witke W,Podtelejnikov AV,Di Nardo A,et al.In mouse brain profilinI and profilin II associate with regulators of the endocytic pathway andactin assembly.[J].The EMBO journal,1998,17(4):967.
[7]Blasco R,Cole N B,Moss B.Sequence analysis,expression,and deletionof a vaccinia virus gene encoding a homolog of profilin,a eukaryotic actin-binding protein.[J].J Virol,1991,65(9):4598-608.
[8]Suetsugu S,Miki H,Takenawa T.The essential role ofprofilin in theassembly of actin for microspikeformation.MBO J,1998,17(22):6516-26.
[9]Pollard TD,Cooper JA.Quantitative analysis of theeffectofAcanthamoebaprofilin on actin filament nucleationandelongation.Biochemistry,1984,23(26):6631-41.
[10]Kaiser DA,Sato M,Ebert RF,et al.Purification andcharacterizationof two isoforms of acanthamoebaprofilin.J Cell Biol,1986,102(1):221-6.
[11]Romero S,Didry D,Larquet E,et al.How ATP hydrolysiscontrolsfilament assembly from profilin-actin:implicationforforminprocessivity.JBiolChem,2007,282(11):8435-45.
[12]Paul AS,Pollard TD.The role of the FH1domain andprofilin informin-mediated actin-filament elongation andnucleation.CurrBiol,2008,18(1):9-19.
[13]Harpen M,Barik T,Musiyenko A,et al.Mutationalanalysis reveals anoncontractile but interactive role ofactin and profilin in viral RNA-dependent RNA synthesis.JVirol,2009,83(21):10869-76.
[14]Kong HJ,Hong GE,Cho HK,et al.Cloning of profiling(FcPFN)from theshrimp Fenneropenaeuschinensis,ahighly expressed protein in white spotsyndrome virus(WSSV)-infected shrimp.J Appl Genet,2009,50(3):245-50.
[15]Clavero-Salas A,Sotelo-Mundo RR,Gollas-Galván T,etal.Transcriptome analysis of gills from the white shrimpLitopenaeusvannameiinfected with White Spot SyndromeVirus.Fish Shellfish Immunol,2007,23(2):459-72.
发明内容
本发明的第一目的在于提供红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的基因序列。
本发明的第二目的在于提供红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的氨基酸序列。
本发明的第三目的在于提供红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的制备方法。
本发明的第四目的在于提供红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的应用。
所述红螯螯虾前纤维蛋白命名为Cq-Pfn1。
所述红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的基因序列为：
Figure BDA0001734290660000031
所述红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的氨基酸序列为：
Figure BDA0001734290660000032
所述红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的制备方法包括以下步骤：
1)将Cq-Pfn1基因连接到pMD18-T载体上，并分析获得ORF阅读框，得Cq-Pfn1ORF基因序列；
2)将步骤1)所得到的Cq-Pfn1ORF基因序列进行序列比对分析，与其他物种相比，所述Cq-Pfn1具有高度的保守性；
3)构建红螯螯虾前纤维蛋白pGEX-4T-1-Cq-Pfn1基因工程重组表达载体；
在步骤3)中，所述构建红螯螯虾前纤维蛋白pGEX-4T-1-Cq-Pfn1基因工程重组表达载体的具体方法可为：将Cq-Pfn1基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中，即构建红螯螯虾前纤维蛋白pGEX-4T-1-Cq-Pfn1基因工程重组表达载体。
4)将步骤3)所得重组原核表达载体pGEX-4T-1-Cq-Pfn1导入宿主细胞E.coli(BL21:DE3)中，再进行诱导表达，获得表达产物；
在步骤4)中，所述表达的条件可用0.1mM硫代半乳糖苷(IPTG)28℃诱导10h。
5)将步骤4)所得的表达产物通过亲和层析获得较高纯度的重组蛋白GST-Cq-Pfn1。
所述红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1在研究白斑综合征病害靶向防治以及防治白斑综合征药物中应用。
本发明涉及首次获得一种新的基因工程产品：源于红螯螯虾前纤维蛋白的重组表达及其制备方法，重组Cq-Pfn1蛋白能够促进WSSV在红螯螯虾Hpt干细胞中的感染复制，是一种具有生物活性的基因工程产物，在研究白斑综合征病害靶向防治方面具有重要意义。
本发明在分离得到rCq-Pfn1的基础上，根据Cq-Pfn1基因序列特征成功构建原核重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达、纯化获得rCq-Pfn1蛋白，分析发现该重组蛋白具有促进WSSV感染的作用，在WSSV感染进程中具有重要的生物活性功能，因此，重组基因工程产品rCq-Pfn1在揭示WSSV感染机制及其病害防治中具有重要的研究价值。
附图说明
图1为pGEX-4T-1-Cq-Pfn1原核表达载体构建图。
图2为SDS-PAGE分析pGEX-4T-1-Cq-Pfn1重组载体克隆子诱导表达的电泳图谱。在图2中，M为标准蛋白Marker，1为诱导前菌液上清，2为诱导后菌液上清，可见约38kDa的明显蛋白条带。
图3为SDS-PAGE电泳检测纯化后的rCq-Pfn1。在图3中，可见约为38kDa的明显蛋白条带。
图4为利用双链RNA干扰技术敲降细胞内源Cq-Pfn1后的干扰效率检测。图4结果表明，所合成的双链RNA可显著敲降Hpt细胞内Cq-Pfn1。
图5为利用双链RNA干扰技术敲降细胞内源Cq-Pfn1后，WSSV IE1基因相对表达量(以MOI＝1，WSSV感染6h)。
图6为利用双链RNA干扰技术敲降细胞内源Cq-Pfn1后，WSSVVP28基因相对表达量(以MOI＝1，WSSV感染6h)。
由图5和6可知，WSSV基因表达水平显著性下降，说明Cq-Pfn1敲降后WSSV的复制量明显降低。
图7为rGST、rCq-Pfn1转染Hpt细胞4h后Western blot鉴定。
图8为rGST预先处理Hpt细胞4h，感染WSSV(MOI＝1)6h，检测IE1的表达水平。
图9为rCq-Pfn1预先处理Hpt细胞4h，感染WSSV(MOI＝1)6h，检测VP28的表达水平。
由图8和9，rCq-Pfn1转染Hpt细胞后，检测发现WSSV重要极早期基因IE1复制显著增加，晚期表达基因VP28也显著性增加，说明体外重组表达的rCq-Pfn1具有促进WSSV在Hpt细胞复制的功能。
具体实施方式
以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1基因克隆
提取红螯螯虾Hpt细胞RNA，一部分经RT-PCR逆转录成cDNA作为基因扩增的模板，根据实验室前期构建的红螯螯虾造血组织转录组里的部分Cq-Pfn1基因序列设计特异性基因扩增引物进行扩增。
上游引物F：5′-ATGTCTTGGAATACATACGT-3′；
下游引物R：5′-TCAGAGATTCTGGCTCTTC-3′。
PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，重复30个循环；72℃延伸10min。
利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收PCR产物，回收的PCR产物，经与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，测序后比对分析以确定所得基因序列为Cheraxquadricarinatus的Pfn1基因即Cq-Pfn1。
实施例2红螯螯虾Cq-Pfn1基因原核表达载体的构建
设计扩增编码Cq-Pfn1(cDNA)基因ORF的特异性上游引物F1和下游引物R1，在上游引物F的5′端添加Sma I酶切位点；在下游引物R的5′端添加Not I酶切位点，并对其ORF进行PCR扩增。
上游引物F：5′-TCCCCCGGGATGTCTTGGAATACATACGTAG-3′；
下游引物R：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAGAGATTCTGGCTCTT-3′。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸10min。
利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收PCR产物，回收的PCR产物经Sma I和Not I酶切后纯化回收，与Sma I和Not I双酶切线性化pGEX-4T-1载体连接，构建好重组表达载体pGEX-4T-1-Cq-Pfn1，测序鉴定读码框准确无误。
pGEX-4T-1-Cq-Pfn1载体构建图参见图1。
实施例3pGEX-4T-1-Cq-Pfn1重组质粒在大肠杆菌E.coli(BL21:DE3)中的诱导表达
1.将构建好的重组表达载体转化E.coli BL21，并用IPTG诱导表达。
2.挑取单克隆菌落，接种于5ml含Amp+的LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养12h。
3.以1︰100的比例接种至200ml含Amp+的LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养至OD600为0.3～0.5。
4.加入IPTG至终浓度0.1mM，28℃下150rpm诱导10h。
结果显示，与诱导前相比，pGEX-4T-1-Cq-Pfn1重组质粒转化到大肠杆菌中在诱导后获得明显的重组蛋白表达，大小约为38kDa，说明该条件可以获得较高比例的表达产物如图2。
实施例4pGEX-4T-1-Cq-Pfn1重组质粒在大肠杆菌中诱导后的表达产物纯化
1.收集菌体：诱导后菌液8000g离心10min，重悬于PBS；超声破碎，并于4℃，12000g离心30min，收集上清。
2.如上菌体超声破碎上清再次离心10min，以充分去除不溶菌体团块，并用0.45μm微孔滤膜过滤，即可进行亲和层析纯化。
3.取200μL Glutathione Sepharose琼脂糖珠，Mili-Q清洗3遍以除去乙醇，再用PBS清洗2遍以平衡Glutathione Sepharose琼脂糖珠，然后加入到过滤好的上清中，于4℃旋转孵育过夜。
4.洗杂：收集珠子并用PBS清洗珠子以除去非特异结合的杂蛋白。
5.洗脱：利用洗脱液(50mM Tris-HCl[pH7.4]，500mM NaCl，20mM还原型谷胱甘肽)进行洗脱。
6.收集：收集洗脱蛋白，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定。
7.透析：鉴定后的蛋白溶液于PBS(pH7.4)中4℃透析48h，期间换液4～5次，透析后的蛋白溶液分装后于-80℃保存以备后续实验使用。
结果显示，纯化透析后蛋白条带单一(图3)，说明经亲和层析纯化后可以得到纯度较高的重组表达蛋白。
实施例5Cq-Pfn1基因敲降对WSSV感染Hpt细胞的影响
按照表1合成Cq-Pfn1双链RNA(dsRNA)用于干扰。制备培养红螯螯虾hpt细胞于24孔细胞培养板中培养(5×105cells/孔)。取1μg dsRNA、2μL cellfectin与17μL DEPC水轻弹混匀后室温孵育10min，补L15培养基至100μL加至24孔细胞培养板每孔培养细胞中，24h后更换1/2培养基，参照上述方法再次添加dsRNA，对照所用dsRNA为dsGFP RNA。基因干扰36h后以MOI＝1感染WSSV，感染6h后收集细胞，提取细胞总RNA，取1μg DnaseI处理后总RNA反转录成cDNA。应用qPCR的方法检测上述样品中Cq-Pfn1的干扰效率(图4)以及WSSV病毒极早期基因IE1(见图5)和晚期基因VP28(见图6)的转录表达，以16s rRNA基因为内参，所用引物如表1。
实施例6重组表达Cq-Pfn1蛋白体外调控WSSV感染实验
rCq-Pfn1蛋白促进WSSV感染的活性鉴定：
首先将红螯螯虾造血组织干细胞制备分离于24和96孔细胞培养板，置于20℃培养箱中培养，按照24孔板每孔1μg、96孔板每孔0.3μgrCq-Pfn1蛋白量计算，将重组蛋白与转染试剂室温共孵15min，再加入到培养细胞中，26℃共孵4h，去除培养液，96孔板细胞收集样品进行Western blot鉴定，rGST处理作为对照组(见图7)；24孔板按照每孔MOI＝1进行WSSV感染，在WSSV感染6h时收集细胞，提取细胞总RNA，取1μg DnaseI处理后总RNA反转录成cDNA。应用qPCR的方法检测上述样品中WSSV病毒极早期基因IE1(见图8)和晚期基因VP28(见图9)的转录表达，以16s rRNA基因为内参，所用引物如表1。
表1
Figure BDA0001734290660000071
结果显示，红螯螯虾Hpt细胞内Cq-Pfn1基因敲降后感染WSSV，其及早期基因IE1和晚期基因VP28的复制水平均明显下降，当rCq-Pfn1蛋白体外转染处理Hpt细胞时，其IE1和VP28的mRNA表达水平较对照组明显升高，该结果说明rCq-Pfn1具有促进WSSV复制的功能。
本发明获得红螯螯虾rCq-Pfn1基因工程表达产品，并对其在WSSV感染红螯螯虾Hpt细胞中所发挥的活性作用进行了鉴定，以期用于水产动物抗WSSV感染靶点设计研究中。本发明成功构建了红螯螯虾rCq-Pfn1基因工程表达重组质粒pGEX-4T-1-Cq-Pfn1及相应的原核表达系统，在获得rCq-Pfn1重组表达蛋白后，进一步验证了重组蛋白的生物学活性，即蛋白转染Hpt细胞后，显著促进了WSSV的感染复制，为其作为研究WSSV病害防治新药物靶点奠定关键基础。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种促进WSSV感染的前纤维蛋白基因Cq-Pfn1及其制备方法与应用
<130> 1
<141> 2018-01-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 378
<212> DNA
<213> 红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)
<400> 1
atgtcttgga atacatacgt agaaaacctg gagaacacca acaatgttgc caaggcagct 60
atctgtgggc aagacggctc aacatgggct tgttcacaag gctggaacat ctctccacaa 120
gaagcccaaa cactggccgc agccttcaaa gattcctcag tgctcgtcga gaaaggcatg 180
tttgtaggcg gtgaaaggtt cgtctacttg agcggcgatg atgaagttct aaggggaaga 240
aaaggtcaaa ctggactcca tgtttcaaag actaaatctg ccatcataat cggcttctac 300
caggatccca cccaaccaag ccagtgtgcc aaggaggtgg ataatgtagc agagtatctg 360
aagagccaga atctctga 378
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)
<400> 2
Met Ser Trp Asn Thr Tyr Val Glu Asn Leu Glu Asn Thr Asn Asn Val
1 5 10 15
Ala Lys Ala Ala Ile Cys Gly Gln Asp Gly Ser Thr Trp Ala Cys Ser
20 25 30
Gln Gly Trp Asn Ile Ser Pro Gln Glu Ala Gln Thr Leu Ala Ala Ala
35 40 45
Phe Lys Asp Ser Ser Val Leu Val Glu Lys Gly Met Phe Val Gly Gly
50 55 60
Glu Arg Phe Val Tyr Leu Ser Gly Asp Asp Glu Val Leu Arg Gly Arg
65 70 75 80
Lys Gly Gln Thr Gly Leu His Val Ser Lys Thr Lys Ser Ala Ile Ile
85 90 95
Ile Gly Phe Tyr Gln Asp Pro Thr Gln Pro Ser Gln Cys Ala Lys Glu
100 105 110
Val Asp Asn Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ser Gln Asn Leu
115 120 125

Claims (6)

1.红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的基因序列为：
Figure FDA0003141504970000011
2.红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的氨基酸序列为：
Figure FDA0003141504970000012
3.红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1基因连接到pMD18-T载体上，并分析获得ORF阅读框，得Cq-Pfn1ORF基因序列；
2)将步骤1)所得到的Cq-Pfn1ORF基因序列进行序列比对分析，与其他物种相比，所述Cq-Pfn1具有高度的保守性；
3)通过引物5′-TCCCCCGGGATGTCTTGGAATACATACGTAG-3′和5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAGAGATTCTGGCTCTT-3′在Cq-Pfn1的cDNA两侧引入Sma I和Not I酶切位点，通过Sma I和NotI酶切连入pGEX-4T-1载体后获得重组表达载体pGEX-4T-1-Cq-Pfn1；
4)将步骤3)所得重组原核表达载体pGEX-4T-1-Cq-Pfn1导入宿主细胞E.coli(BL21:DE3)中，再进行诱导表达，获得表达产物；
5)将步骤4)所得的表达产物通过亲和层析获得较高纯度的重组蛋白GST-Cq-Pfn1。
4.如权利要求3所述红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述构建红螯螯虾前纤维蛋白pGEX-4T-1-Cq-Pfn1基因工程重组表达载体的具体方法为：将Cq-Pfn1基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中，即构建红螯螯虾前纤维蛋白pGEX-4T-1-Cq-Pfn1基因工程重组表达载体。
5.如权利要求3所述红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述表达的条件是用0.1mM硫代半乳糖苷28℃诱导10h。
6.如权利要求1所述的红螯螯虾前纤维蛋白Cq-Pfn1在制备防治白斑综合征药物中应用。
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